HerzSupplement - Pentalong von Actavis

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases 35. Jahrgang · Supplement II · März 2010 · ISSN 0946–1299
Vasorelaxierende, protektive, antioxidative Eigenschaften
von PETN im Vergleich zu anderen Nitraten –
Forschungsergebnisse und ihre Bedeutung für die Praxis
Symposium, Jena, 18. August 2009 unter der Leitung von Jochen Lehmann
Bundesverband
Niedergelassener
Kardiologen e.V.
Organ des
Bundesverbandes
Niedergelassener
Kardiologen (BNK)
ALDH
S S
TxA2
Prot-SH
Antioxidanzien
Nitroglyzerin
Liponsäure
PETN
www.herz-cardivascular-diseases.de
ALDH
HS SH
TxA2
Prot-SH
Antioxidanzien
Herausgeber
Raimund Erbel
Karl-Heinz Kuck
Bernhard Maisch
Otmar Pachinger
Werner Rudolph

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Herausgeber/Editors
Univ.-Prof. Dr. med. Raimund Erbel,
FAHA, FESC, FACC
Professor für Innere Medizin
und Kardiologie
European Cardiologist
Westdeutsches Herzzentrum Essen
Klinik für Kardiologie
Universitätsklinikum Essen
Universität Duisburg-Essen
Hufelandstraße 55
D-45122 Essen
E-Mail: erbel@uni-essen.de
www.uni-essen.de/cardio
Internationaler Wissenschaftlicher Beirat/
International Editorial Board
S. Achenbach, Erlangen
D. Andresen, Berlin
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G. Breithardt, Münster
A.J. Buda, New Orleans
P.G. Camici, London
W.G. Daniel, Erlangen
P. Dominiak, Lübeck
E. Erdmann, Köln
G. Ertl, Würzburg
Herz Supplement II · 2010
Beilage in Herz Nr. 2/2010
Redaktion:
Dr. Melanie Leshel
Layout:
Maren Krapp
Titelbild: Wenzel et al. JPET 2009
Prof. Dr. med. Karl-Heinz Kuck
Ltd. Arzt der II. Medizinischen Abteilung
Asklepios Klinikum St. Georg
Lohmühlenstraße 5
D-20099 Hamburg
E-Mail: k.kuck@asklepios.com
Prof. Dr. med. Bernhard Maisch,
FESC, FACC
European Cardiologist
Direktor der Klinik für Innere Medizin –
Kardiologie der Philipps-Universität
Marburg, Baldingerstraße
D-35043 Marburg
E-Mail: maisch@mailer.uni-marburg.de
E. Falk, Aarhus
F. Fedele, Rom
E. Fleck, Berlin
T. Gerber, Knoxville
G. Görge, Saarbrücken
M.G. Gottwik, Nürnberg
M. Halle, München
R. Hambrecht, Bremen
P. Hanrath, Aachen
A. Haverich, Hannover
J. Hermann, Rochester
J. Hess, München
R. Hoffmann, Aachen
V. Hombach, Ulm
G. Kamensk´y, Bratislava
Bundesverband Niedergelassener Kardiologen (BNK)
Verantwortlich für Cath Lab
Hotline: Prof. Dr. med.
Sigmund Silber (FACC, FESC)
Kardiologische Praxis und
Praxisklinik
Am Isarkanal 36
81379 München
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www.sigmund-silber.com
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T. Meinertz, Hamburg
O. Pachinger, Innsbruck
H.-G. Predel, Köln
G. Riegger, Regensburg
W. Rutsch, Berlin
H. Schelbert, Los Angeles
J.D. Schipke, Düsseldorf
A. Schmermund, Frankfurt
H.-P. Schultheiss, Berlin
Verantwortlich für die
BNK-Mitteilungen: Dr. med. Rolf Dörr
Praxisklinik Herz und Gefäße
Kardiologie, Angiologie, Radiologie, Nuklearmedizin
Herzkatheterlabor und Nuklearkardiologie
Heinrich-Cotta-Straße 12
D-01324 Dresden
E-Mail: doerr@praxisklinik-dresden.de
www.praxisklinik-dresden.de
Leitung Corporate Publishing München
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Auflage: 9000
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R. Simon, Kiel
A. Stang, Halle
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U. Tebbe, Detmold
H. Tillmanns, Gießen
D. Tschöpe, Bad Oeynhausen
K. Werdan, Halle
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Mit freundlicher Unterstützung der
Actavis Deutschland GmbH & Co. KG,
Langenfeld
Springer Medizin,
© Urban & Vogel GmbH München,
März 2010
Ausdrücklich wird darauf hingewiesen, dass trotz sorgfältiger redaktioneller Bearbeitung bei Angaben über Dosis und Applikation von
Medikamenten Fehler auftreten können. Jeder Leser wird daher aufgefordert, diese Angaben in eigener Verantwortung zu überprüfen.
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

Vorwort
PETN- und PETN-Verwandtes
Im Mittelpunkt des von Jochen Lehmann
am 18. August 2009 am Lehrstuhl für
Pharmazeutische/Medizinische Chemie,
Friedrich-Schiller-Universität Jena, organisierten
Symposiums standen die protektiven,
antioxidativen Eigenschaften von
Pentaerithrityltetranitrat (PETN), aber
auch andere neuartige Nitrate sowie innovative
Nitrat-Hybridmoleküle.
Organische Nitrate sind keine homogene
Wirkstoffklasse
Beim Vergleich des Wirkprofils von PETN
mit dem anderer Nitrate beobachteten
mehrere Arbeitsgruppen signifikante Unterschiede.
Schon dies legt nahe, dass die
organischen Nitrate nicht als homogene, in
sich austauschbare Wirkstoffklasse gesehen
werden können, sondern eine beachtliche
Diversität aufweisen. Neue Befunde vertiefen
diesen Eindruck. So folgen Aminoalkylnitrate
nicht den bisher für Nitrate postulierten
Regeln. Statine wiederum zeigen
nach der Kopplung mit einer Nitratgruppe
zu einem Hybridmolekül neue Eigenschaften
und Hinweise auf breitere Anwendbarkeit,
z.B. für die Behandlung der
Alzheimer’schen Krankheit. Daneben drehte
sich das diesjährige Symposium um die
Bioaktivierung von PETN an der isolierten
ALDH-2, seine antioxidativen Eigenschaften
in einem tierexperimentellen Diabetes-mellitus-(Typ
1)-Modell sowie genregulatorischen
Wirkungen von PETN.
Weiterhin wurden die Anwendbarkeit von
PETN bei pulmonal arterieller Hypertonie
diskutiert und neue Verfahren zur Erfassung
des Nitrat-induzierten oxidativen
Stresses vorgestellt. Im vorliegenden Supplement
werden diese antioxidativen Eigenschaften
von PETN weiter im Detail
diskutiert, neue protektive Wirkmechanismen
identifiziert und diese Forschungsergebnisse
sowie deren klinische Relevanz
als Übersicht vorgestellt.
Wissenschaftliche Untersuchungen von
Nitraten in biologischen Systemen, im Besonderen
In-vivo-Untersuchungen und klinische
Studien stellen Anforderungen an die
analytische Methodik, die über das Übliche
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
hinausgehen. Deshalb erschien es auch sinnvoll,
hierzu zielführende methodische Weiterentwicklungen
vorzustellen. Es ist außerordentlich
problematisch, die geringen Mengen
an Nitraten und die noch geringeren
Mengen an nitrathaltigen Abbauprodukten
– z.B. von PEtriN, PEdiN und PEmonoN
nach Gabe von PETN – nachzuweisen oder
gar zu quantifizieren. Die empfindliche Gaschromatografie
scheitert an der grundsätzlichen
thermischen Instabilität von Nitraten
– immerhin sind es Explosivstoffe – bei normaler
Flüssigkeitschromatografie (HPLC)
oder auch Kapillarelektrophorese mit UV-
Detektion ist die Nachweisempfindlichkeit
viel zu gering, da die Nitratgruppe alleine
kein sehr sensitiver Chromophor ist. Es
konnte aber gezeigt werden, dass die HPLC,
gekoppelt mit massenspektrometrischer Detektion
(LC-MS), eine zwar aufwendige,
aber geeignete Methode darstellt, auch sehr
kleine Mengen an PETN-Metaboliten aus
biologischen Proben zu erfassen (Brettschneider,
Seeling, Lehmann, Jena).
Hybridmoleküle als Chance für neue
therapeutische Ansätze
Interessante Aspekte bieten die Nitrate
auch bei der Einführung als NO liefernde
Gruppe in andere Arzneistoffe. Die daraus
resultierenden Hybridmoleküle können
bessere Verträglichkeit, aber auch ganz
neue therapeutische Eigenschaften aufweisen.
Beispiele in der Vergangenheit sind
Nitroaspirin, das vor allem eine bessere Magenverträglichkeit
besitzen soll oder Nicorandil,
ein Kaliumkanalöffner mit Nitratfunktion.
In einer kürzlich vorgestellten
Studie konnten Lengfelder und Lehmann
(Jena) zeigen, dass die Einführung einer
Nitratgruppe in ein Statin dessen hemmende
Wirkung auf die ß-Amyloid-Aggregation
dramatisch steigert. Basierend auf
diesen Befunden könnte dieses „Nitrostatin“
ein grundsätzlich neuartiges Therapeutikum
für die Alzheimer’sche Erkrankung
darstellen. Es gibt derzeit zahlreiche Bestrebungen,
um etablierte Medikamente
durch die Kombination mit einer Nitratgruppe
zu verbessern und sich die therapeu-
Universitäts-Professor,
Dr. rer.nat. et med.
habil. Andreas Daiber,
Mainz, Leiter des
Labors für Molekulare
Kardiologie
Universitäts-Professor,
Dr. rer. nat. Jochen
Lehmann, Jena,
Lehrstuhl für Pharmazeutische/Medizinische
Chemie
Vorwort

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
tischen Erfahrungen und Vorteile einer
Freisetzung von Stickstoffmonoxid
zunutze zu machen.
Mit dem 2-Aminoethylnitrat wurde
ein Mononitrat vorgestellt, das ähnlich
potent wie Nitroglyzerin ist, aber
dessen negativen Nebeneffekt wie die
Induktion des oxidativen Stresses und
der Nitrattoleranz nicht teilt (Roegler
und Lehmann, Jena). Diese Substanz
stellt eine Substruktur des Nitratteils
im Nicorandil dar. Dagegen wurde ein
niedrig potentes Trinitrat (Triethylamintrinitrat)
synthetisiert, das eine
vergleichbare Potenz wie ISDN aufweist,
aber durch die ALDH-2 bioaktiviert
wird sowie oxidativen Stress
und Toleranz induziert. Diese Daten
haben gezeigt, dass die bisherigen Kriterien
für eine ALDH-2-abhängige
Bioaktivierung nochmals überdacht
werden müssen. Nachdem mit PETN
bereits ein toleranzfreier Nitrovasodilatator
in klinischer Verwendung ist,
stellt sich andererseits die Frage, ob
die Entwicklung von neuartigen organischen
Nitraten noch attraktiv und
sinnvoll ist. Zukünftige Studien werden
zeigen, ob es klinisch-pharmakologische
Gründe für die Neueinführung
derartiger Substanzen gibt.
ALDH- – valider Marker für die
Nitrattoleranz ...
Die antioxidativen Eigenschaften von
PETN wurden in der Vergangenheit
durch eine Vielzahl von Zellkulturen
und tierexperimentellen Studien untermauert.
Daneben zeigen mehrere
klinische Probandenstudien mit
kleinem Kollektiv, dass PETN keine
Toleranz induziert und die Spiegel der
reaktiven Sauerstoffspezies nicht erhöht
(meist gemessen anhand der
Marker für oxidativen Stress wie Malondialdehyd
oder Isoprostane). Eine
erste modernen Maßstäben entsprechende
klinische Studie (die PENTA-
Studie unter der Leitung von Ascan
Warnholtz, Mainz) zeigte, dass die
chronische PETN-Therapie bei KHK-
Patienten keine Verschlechterung der
Endothelfunktion bewirkte und sogar
die antiischämische Wirksamkeit von
Nitroglyzerin verbesserte. Aktuell konnte
in einer Human-Studie mit einem
kleinen Kollektiv Freiwilliger erstmals
gezeigt werden, dass die ALDH-2-
Aktivität in weißen Blutzellen ein valider
Marker für die Nitrattoleranz ist
und PETN im Gegensatz zu Nitroglyzerin
nach einmaliger oraler Gabe
keine akute Nitrattoleranz (Tachyphylaxie)
induziert und die ALDH-2-
Aktivität intakt lässt (Wenzel und
Daiber, Mainz).
... und zu erwartende ischämische
Schäden nach Myokardinfarkt
Aktuelle Studien an der isolierten, rekombinanten
humanen ALDH-2 unterstützen
diese In-vivo-Beobachtungen
und deuten auf verschiedene Bioaktivierungsmechanismen
für Nitroglyzerin
und PETN am Enzym hin
(Daiber und Kleinert, Mainz). So bewirkte
Nitroglyzerin eine signifikante
Inhibition der ALDH-2, wohingegen
diese in Anwesenheit von PETN deutlich
geringer ausfiel. Diese Befunde
könnten vor dem Hintergrund einer
letztes Jahr in Science erschienenen
Arbeit von besonderem Interesse sein:
Dort wurde gezeigt, dass die ALDH-
2-Aktivität direkt mit den ischämischen
Schäden (Infarkt-Fläche) in
einem experimentellen Infarkt-Modell
korreliert. Die Hemmung der
ALDH-2-Aktivität durch Nitroglyzerin
führte zu einer Zunahme der
Infarkt-Fläche. Dementsprechend
sollte PETN im Gegensatz zu Nitroglyzerin
nicht zu einer Prognoseverschlechterung
führen.
Nachdem in einer früheren Studie
gezeigt wurde, dass die Toleranz durch
Induktion der Hämoxygenase-1 aufgehoben
werden kann, stellte sich die
Frage, ob die PETN-abhängige Induktion
der Hämoxygenase-1 auch die
vaskuläre Pathogenese der arteriellen
Hypertonie bzw. des Diabetes mellitus
(Typ 1) positiv beeinflussen kann.
Wie die Daten einer gerade abgeschlossenen
Studie eindrucksvoll belegten,
führt die chronische PETN
Therapie im Tiermodell der arteriellen
Hypertonie zu einer Verbesserung
der Endothelfunktion, zu einer Absenkung
des oxidativen Stresses und
einer positiven Beeinflussung der
Funktionalität der NO-Synthase (Oelze
und Daiber, Mainz). Dieser Befund
ist von besonders großem Interesse,
da er erstmalig zeigt, dass ein organisches
Nitrat den prognostisch-bedeutsamen
Parameter „Endothelfunktion“
positiv beeinflusst. In einer Folgestudie
wurden diese Parameter
ebenfalls in einem tierexperimentellen
Modell des Diabetes mellitus (Typ 1)
verbessert. Da Diabetiker zur Hochrisikogruppe
bzgl. kardiovaskulärer
Ereignisse gehören, wäre die antiischämische
Therapie mittels PETN sicher
wünschenswert und hilfreich – vor
allem wenn diese PETN-Therapie zusätzlich
zu anderen kardiovaskulär
wirksamen Medikamenten eine Verbesserung
der Prognose bewirken
würde. Auf diesem Hintergrund und
unter Berücksichtigung der vielseitigen
antioxidativen Eigenschaften
von PETN wurde dessen Anwendbarkeit
bei der pulmonal arteriellen Hypertonie
(PAH) diskutiert (Daiber,
Mainz). Experimentelle Befunde lassen
vermuten, dass die Komplikationen
der PAH sehr gut auf eine Induktion
der Hämoxygenase-1 ansprechen.
Nachdem die PETN Therapie eine
vermehrte Expression der Hämoxygenase-1
bewirkt, erscheint dieser Ansatz
für die Therapie der PAH sehr
attraktiv.
Neues Verfahren zur Messung des
nitratinduzierten oxidativen Stresses
Basierend auf den Daten einer pharmakologischen
Doktorarbeit konnte
ein neues HPLC-basiertes Verfahren
vorgestellt werden, um nitratinduzierten
oxidativen Stress zu messen
(Bauer und Rösen, Köln). Dihydrorhodamin
(DHR) wurde als Fluoreszenzfarbstoff
für die nitratinduzierte
Bildung reaktiver Sauerstoff- und
Stickstoffspezies in Endothelzellen
validiert und speziell für die Verwendung
in Mitochondrien getestet. Es
konnte gezeigt werden, dass das Oxidationsprodukt
von DHR, Rhodamin
(Rh), nicht wie bisher postuliert als
geladenes Molekül in den Mitochondrien
bleibt, sondern dass Rh sowohl
durch die mitochondriale Permeabilitäts-Transitions-Pore
(mPTP), als
auch durch den Transporter p-Glycoprotein
aus der mitochondrialen Matrix
ins Zytosol gelangen kann. Wenn
diese Transportwege durch Cyclospo-
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

in A gehemmt wurden, dann fand
kein Efflux des oxidierten Rh mehr
statt und das oxidative Stresssignal
nach Nitroglyzerin-Behandlung blieb
stabil in den Mitochondrien. Für
PETN wurde eine deutlich geringere
mitochondriale reaktive Speziesbildung
in den Mitochondrien beobachtet
und für Isosorbiddinitrat (ISDN)
wurde hauptsächlich zytosolisches Rh
detektiert, ein Hinweis, dass ISDN-induzierter
oxidativer Stress nicht mitochondrial
lokalisiert ist.
Nitratauswahl beeinflusst Expression
kardioprotektiver Gene
Das positive Wirkprofil von PETN
wird durch seine genregulatorischen
Eigenschaften unterstrichen, die weit
über die Induktion der Hämoxygenase
und des Ferritins hinausgehen. Einen
interessanten Ansatz stellt die
Analyse der totalgenomischen RNA
mittels Microarrays dar (Kleinert und
Pautz, Mainz). Eine erste Auswertung
der Genexpressionsprofile zeigt, dass
die Nitroglyzerin-Behandlung in der
Erhöhung der Expression von Genen
resultiert, die als Marker für kardiotoxische
Prozesse angesehen werden.
Weiterhin verringert die Nitroglyzerin-
Behandlung die Expression von Genen,
die als kardioprotektiv beschrieben
wurden, wohingegen die PETN-
Behandlung die Expression als kardioprotektiv
beschriebener Gene erhöht.
In einer Folgestudie in Endothelzellen
konnte ein tiefer Einblick in die Mechanismen
der Genregulation durch
diese Nitrate gewonnen und erste
Transkriptionsfaktoren identifiziert
werden, die am differenziellen Genexpressionsprofil
ursächlich beteiligt
sind (Kleinert und Pautz, Mainz).
Translation in die Klinik
Es ist nun von großer Bedeutung, diese
Befunde aus überwiegend zellbiologischen
bzw. tierexperimentellen
Untersuchungen in klinischen Studien
zu verifizieren, um dann die durchweg
positiven Beobachtungen für PETN in
den klinischen Alltag zu translatieren.
Die Weichen hierfür sind gestellt und
die Vorbereitungen für die CAESAR
und CLEOPATRA Studie laufen. Im
Rahmen der randomisierten, kontrol-
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
lierten CAESAR-Studie („ClinicAl
Efficacy Study of Pentalong ® for PulmonAry
Hypertension in HeaRt Failure“
wird die Wirksamkeit und Sicherheit
von PETN bei Patienten mit
chronischer Herzinsuffizienz und pulmonal
venöser Hypertonie untersucht,
der bei Weitem häufigsten Form von
Lungenhochdruck. An der Phase-II-
Studie CAESAR werden sich voraussichtlich
15 Universitätskliniken unter
der Leitung von Erland Erdmann,
Köln, beteiligen. Die CLEOPATRA-
Studie („Clinical Efficacy Of Pentalong
® in stable Angina patients after
Twelve weeks of Routine Administration“)
soll den geänderten Anforderungen
zum Nachweis der Wirksamkeit
Rechnung tragen. Insbesondere
wird heute von den Arzneimittelbehörden
ein Nachweis für eine Besserung
der Belastbarkeit und Lebensqualität
des Patienten gefordert. Bei
CLEOPATRA handelt es sich um eine
multinationale, randomisierte, doppelblinde
und placebokontrollierte
Phase-III-Studie, bei der 778 Patienten
mit stabiler Angina pectoris eingeschlossen
werden sollen.
Mainz und Jena, im Dezember 2009
A. Daiber und J. Lehmann
Vorwort

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Vasorelaxierende, protektive, antioxidative Eigenschaften
von PETN im Vergleich zu anderen Nitraten –
Forschungsergebnisse und ihre Bedeutung für die Praxis
Vasorelaxant, protective, antioxidative properties of PETN – research results and their implications
for clinical practice
Symposium*, Jena, 18. August 2009 unter der Leitung von J. Lehmann
Inhalt 7 Entwicklung einer LC-MS-Methode zur Quantifizierung von PETN
und seinen vasodilatatorisch wirksamen Metaboliten
Juliane Brettschneider, Katrin Erler, Bernd Luckas, Jochen Lehmann, Andreas Seeling, Jena
12 Nitrat-Statin-Hybride – eine neue Option zur Therapie der Alzheimer‘schen Krankheit?
Claudia Lengfelder1, Heidi Traber,Carolin Roegler, Khaled Abuzid, Martin Westermann,
Markus Fändrich, Jochen Lehmann, Jena, Kairo und Halle
18 Aminoalkylnitrate – eine neue Klasse von Nitraten?
Carolin Roegler, Andreas König, Andreas Daiber, Jochen Lehmann, Jena und Mainz
24 Neues zu antioxidativen Eigenschaften von PETN und zum Nitratmetabolismus
an der isolierten ALDH-2
Andreas Daiber, Matthias Oelze, Jens Kamuf, Richard Schell, Andrea Pautz, Philip Wenzel,
Hartmut Kleinert, Mainz
36 Vergleich der Wirkungen von PETN, ISMN und ISDN im experimentellen Diabetes mellitus Typ 1
und in der arteriellen Hypertonie
Matthias Oelze, Swenja Schuhmacher, Maike Knorr, Christian Otto, Tjebo Heeren, Jens Kamuf,
Philip Wenzel, Dirk Stalleicken, Thomas Münzel, Andreas Daiber, Mainz und Langenfeld
45 Pulmonale Hypertonie – ein weiteres Anwendungsgebiet für PETN?
Matthias Oelze, Swenja Schuhmacher, Alexander Scholz, Sebastian Steven,
Andreas Daiber, Mainz
50 Vergleichende Untersuchung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch organische Nitrate
mit dem Indikator Dihydrorhodamin 123
Tim Bauer, Renate Rösen, Köln
56 Regulation der Genexpression durch organische Nitrate
Andrea Pautz, Peter Rauschkolb, Julia Art, Cornelia Voss, Susanne Karbach, Philip Wenzel, Matthias
Oelze, Ulrich Förstermann, Andreas Daiber, Hartmut Kleinert, Mainz
* Das Symposium wurde ausgerichtet mit freundlicher Unterstützung
der Actavis Deutschland GmbH & Co. KG, Langenfeld
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

Entwicklung einer LC-MS-Methode zur
Quantifizierung von PETN und seinen vasodilatatorisch
wirksamen Metaboliten
Juliane Brettschneider 1 , Katrin Erler 2 , Bernd Luckas 2 , Jochen Lehmann 1 , Andreas Seeling 1
Zusammenfassung: Pentaerythritoltetranitrat
(PETN) ist ein hochpotentes organisches
Nitrat mit vasodilatatorischer Wirkung
an der glatten Gefäßmuskulatur und
wird in der Therapie der Herzinsuffizienz
bzw. der Anfallskupierung bei Angina pectoris
eingesetzt. Die Bioaktivierung durch
die mitochondriale Aldehyddehydrogenase
(ALDH­2) und auch andere Abbauwege
führen zu nitratärmeren Polyolen, die Anteil
an der vasodilatatorischen Wirkung der
Muttersubstanz haben. Die schrittweise
Metabolisierung des PETN führt zu Pentaerythritoltrinitrat
(PEtriN), Pentaerythritoldinitrat
(PEdiN) und Pentaerythritolmononitrat
(PEmonoN). Um eine Möglichkeit
zu schaffen, die Compliance im Rahmen
pharmakologischer Studien zu belegen
und auch die bei der Inkubation des PETN
mit Enzymen ablaufende Reaktionskinetik
beurteilen zu können, muss eine sehr empfindliche
Analytik, wie es sie bisher nicht
gab, verfügbar sein. Unsere Arbeitsgruppe
entwickelte nun eine RP­HPLC­ESI­MS­
Methode unter Verwendung einer C18­
Trennsäule auf der Basis des Wissens, das
1. Geschichte der Analytik von PETN und
PETN-Metaboliten
Zu Beginn des 20. Jahrhunderts wurden
erste Bemühungen unternommen, in ihrer
Zusammensetzung unbekannte Nitro­Explosivstoffgemische
bezüglich ihrer Inhaltsstoffe
zu charakterisieren. Zunächst bediente
man sich einfacher analytischer Methoden
wie der Papierchromatografie, dann
der Dünnschichtchromatografie unter Verwendung
nitratspezifischer Sprühreagenzien,
wodurch bei ausreichenden Substanzmengen
schon semiquantitative Aussagen
möglich wurden.
Durch Nutzung der durch die DC­
Sprühreagenzien entwickelten Farbreaktionen
wurden dann colorimetrische Assays
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
in vorangegangenen HPLC­UV­Messungen
gewonnen worden war [1, 2]. Problematisch
sind hier die sehr geringen Konzentrationen
von PETN und seinen nitratärmeren Metaboliten
in biologischen Proben. Um auch
diese erfassen zu können, wurde die Bildung
von stabilen Formiat­Addukten [3]
zur Erhöhung der Empfindlichkeit genutzt,
was zu LOD­(limit of detection­)Werten
von maximal 10 ­8 M für PETN, PEtriN und
PEdiN führte. Für diese Nitrate konnte dadurch
über den gesamten Arbeitsbereich
von 10 ­5 bis 10 ­8 M ein linearer Zusammenhang
zwischen Nitratkonzentration und
Signalintensität im HPLC­MS­Chromatogramm
belegt werden. Lediglich die Empfindlichkeit
der PEmonoN­Bestimmung
reichte mit einer LOQ von 5 x 10 ­5 M nicht
für eine Quantifizierung in biologischen
Proben aus, was möglicherweise an der zu
geringen Stabilität des PEmonoN­Formiat­
Adduktes liegt.
Schlüsselwörter: Organische Nitrate – Quantifizierung
– Formiat­Addukt – LC­MS
entwickelt. Doch diese zeigten, ebenso wie
densitometrische und photometrische Methoden
zur Gehaltsbestimmung organischer
Nitrate, zu geringe Empfindlichkeiten
und Selektivitäten, vor allem als in
den 1960­er Jahren im Rahmen der kardiovaskulären
Therapie vermehrt pharmakokinetische
Fragestellungen aufkamen
und die Quantifizierung von organischen
Nitraten sowie deren Metaboliten beabsichtigt
war. Auch alle nachfolgenden
Analysemethoden bis hin zur Flüssigchromatografie
(HPLC) mit UV­Detektion
oder Gaschromatografie erreichten nie die
für eine Gehaltsbestimmung von Nitraten
in biologischen Proben erforderliche Sensitivität.
Organische Nitrate
1 Lehrstuhl für Pharmazeutische/Medizinische
Chemie,
Pharmazeutisches Institut
der Friedrich-Schiller-Universität
Jena, Deutschland
2 Lehrstuhl für Lebensmittelchemie,
Institut für Ernährungswissenschaften
der
Friedrich-Schiller-Universität
Jena, Deutschland

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Eine Empfindlichkeitssteigerung sollte
durch massenspektrometrische Detektion
möglich werden, d.h. an das chromatographische
Trennmodul wird ein Massenspektrometer
angeschlossen, das die aus
der chromatografischen Säule kommenden
Moleküle selektiv und sensitiv erfasst. Aufgrund
der bekannten Thermolabilität organischer
Nitrate unter GC­MS­Bedingungen
wandte sich unsere Arbeitsgruppe der
schonenderen HPLC­MS­Analytik zu.
2. HPLC-UV als Ausgangspunkt für die
Entwicklung einer HPLC-MS-Analytik
Zur Vorbereitung auf die HPLC­MS­Methode
wurde zunächst die flüssigchromatografisches
Trennung mit UV­Detektion
bei 215 nm entwickelt [1, 2]. Verschiedene
Reversed­Phase­Trennsäulen wurden in
Kombination mit Fließmitteln unterschiedlicher
Zusammensetzung, basierend
auf Wasser­Methanol­ und Wasser­Aceto­
Organische Nitrate
Organisches Nitrat Molare Masse [g/mol] Molare Masse des Formiat-Adduktes [g/mol]
PETN
PEtriN
PEdiN
PEmonoN
316,14
271,14
226,14
181,14
Tab. 1: Übersicht der molaren Massen von PETN und seinen Metaboliten sowie der molaren Massen
entsprechender Formiat-Addukte. Die Differenz aus molarer Masse des organischen Nitrates und
des aus ihm gebildeten Formiat-Adduktes ergibt in jedem Fall die molare Masse des Formiates
(45,03 g/mol).
Organisches
Nitrat
PETN
PEtriN
PEdiN
PEmonoN
Zeit des Scannens
[msec]
250
250
250
250
DP
[Volt]
Tab. 2: Darstellung experimentell ermittelter MS-Potenziale, die die maximale Signalintensität der
Nitrat-Formiat-Addukte in den Massenspektren liefern. Die Abkürzungen der Potenziale stehen
hierbei für: DP = Entclusterungspotenzial, FP = fokussierendes Potenzial, EP = Eingangspotenzial.
Die Optimierung der Ionenspray-Spannung ergab für jedes organische Nitrat einen Wert von
–4000 V. Um die thermische Belastung der Nitrate so gering wie möglich zu halten, wurde mit einer
für die Vernebelung minimal möglichen MS-Temperatur von 300 °C gearbeitet.
­–­8
–­40
–­20
–­40
361,17
316,17
271,17
226,17
FP
[Volt]
–­90
–­50
–­100
–­50
EP
[Volt]
nitril­Gemischen, im isokratischen Modus
getestet. Die beste Auftrennung von PETN
und seinen nitratärmeren Metaboliten
wurde durch eine C18­Trennsäule (Phenomenex
® Gemini 5u C18 110A, 250 x 4,60
mm) sowie das Fließmittelgemisch Acetonitril
: Wasser im Verhältnis 60 : 40 (V/V)
erzielt.
Ein weiterer wichtiger Anhaltspunkt
konnte der Publikation von Zhao und Yinon
entnommen werden, die die Bildung
von Addukten kurzkettiger organischer
Säuren mit den untersuchten Nitraten beschreibt
[3]. Tatsächlich erzeugten die Formiate,
Acetate und Propionate der Nitrate
die entsprechenden Molpeaks, welche bei
den reinen Nitraten in der Regel wegen ihrer
Instabilität fehlen. Dementsprechend
wurde den beiden Fließmittel­Komponenten,
aus denen der eigentliche Eluent binär
gemischt wurde, ein Ameisensäure­Ammoniumformiat­Puffer
zugesetzt, um die
–­2
–­4
–­4
–­3
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

Bildung von Formiat­Addukten zu gewährleisten.
Die wässrige Fließmittel­Komponente
A beinhaltete Konzentrationen an
Ameisensäure und Ammoniumformiat von
je 10 mM, während Fließmittel­Komponente
B ein Gemisch an Acetonitril und
Wasser im Verhältnis 80:20 (V/V) darstellt
und 2 mM Ameisensäure sowie 5 mM Ammoniumformiat
enthielt.
Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die
molaren Massen der untersuchten organischen
Nitrate sowie ihrer zugehörigen
Formiat­Addukte, deren Bildung unter
den angegebenen Bedingungen erwartet
wurde. Die Differenz der molaren Massen
von organischem Nitrat und korrelierendem
Formiat­Addukt entspricht in jedem
Fall der molaren Masse des Formiat­
Anions (45,03 g/mol).
Um die Bildung der postulierten Formiat­Addukte
zu untersuchen, wurde an dem
Single­Quadrupol­Massenspektrometer
API 165TM für jedes organische Nitrat unter
Verwendung der beschriebenen Ameisensäure­Ammoniumformiat­Puffer
das
Massenspektrum im negativen Ionenmodus
aufgenommen. Alle Massenspektren
zeigten beständig bei der Massenzahl des
entsprechenden Nitrat­Formiat­Adduktes
sogar einen Basispeak (stärkster Peak im
Spektrum), was die Bildung sehr stabiler
Formiat­Addukte belegt. Um die Intensität
des jeweiligen Addukt­Peaks weiter zu
erhöhen, wurden für jedes der organischen
Nitrate optimale Werte für Eingangs­ und
Entclusterungspotenzial sowie für das fokussierende
Potenzial gesucht und gefunden.
In Tabelle 2 sind diese drei optimierten
Potenziale für jedes der organischen
Nitrate wiedergegeben.
3. Entwicklung und Optimierung der
HPLC-MS-Methode
Die optimierten MS­Potenziale wurden
ebenso wie die zu erwartenden molaren
Massen der Nitrat­Formiat­Addukte in die
Messmethodik der MS­Komponente übernommen.
Unter den optimierten Bedingungen
wurde für jede fixierte Massenzahl
(Massenchromatogramm) das HPLC­MS­
Chromatogramm aufgezeichnet. Abbildung
1 zeigt das HPLC­MS­Chromatogramm mit
der entsprechenden Massenzahl des PETN­
Formiat­Adduktes von 361,17 g/mol. PETN
hatte die längste Verweildauer auf der
RP­Säule mit einer Retentionszeit von 27,70
min (Abb. 1). Seine nitratärmeren Metabo­
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Intensität
Intensität
2e+6
2e+6
1e+6
8e+5
4e+5
0
3e+6
3e+6
2e+6
2e+6
1e+6
5e+5
0
PETN
m/z 361,17 amu
Rt 27,70 min
Organische Nitrate
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Zeit [min]
Abb. 1: HPLC-MS-Chromatogramm der Massenzahl 361,17 amu. Durch Aufnahme
von Massenspektren kann die Massenzahl eindeutig auf eine Addukt-Bildung von
PETN und Formiatanion zurückgeführt werden. Wie dem Chromatogramm zu
entnehmen ist, eluiert das PETN-Formiat-Addukt bei 27,70 min (Konzentration der
PETN-Standardlösung: 10 -4 M).
Intensität
Intensität
2e+6
2e+6
1e+6
8e+5
4e+5
0
1e+5
8e+4
6e+4
4e+4
2e+4
0
PEtriN
m/z 316,17 amu
Rt 25,47 min
0 5 10 15 20
Zeit [min]
25 30 35 40
PEdiN
m/z 271,17 amu
Rt 16,72 min
0 5 10 15 20
Zeit [min]
25 30 35 40
PEmonoN
m/z 226,17 amu
Rt 5,15 min
0 5 10 15 20
Zeit [min]
25 30 35 40
Abb. 2: HPLC-MS-Chromatogramme der Massenzahlen der Formiat-Addukte von
PEtriN, PEdiN und PEmonoN. Die Chromatogramme bestätigen das in den HPLC-
UV-Messungen beobachtete Retentionsverhalten der PETN-Metaboliten (Konzentration
der Standardlösungen: je 10 -4 M).

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Tab. 3: Übersicht über die prozentualen Gehalte des Fließmittels an Komponente A
bzw. B in Abhängigkeit des zeitlichen Verlaufs einer chromatografischen Messung
(Zusammensetzung Komponente A: 100 % Wasser, 10 mM Ameisensäure,
10 mM Ammoniumformiat; Zusammensetzung Komponente B: Acetonitril : Wasser
80:20 (V/V), 2 mM Ameisensäure, 5 mM Ammoniumformiat).
10
Anteil der Komponenten [%]
Zeit
[min]
5
8
18
20
29
30
40
Flussrate
[µl/min]
200
200
200
200
200
200
200
Zeit [min]
Anteil A
[%]
95
55
55
0
0
95
95
Anteil B
[%]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
Komponente A
10
0
Komponente B
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Abb. 3: Grafische Darstellung der veränderten Zumischung der Fließmittel-Komponenten
A und B während eines chromatografischen Laufes. Im Vergleich verschiedener
Methoden mit binärem Gradienten zeichnete sich die ausgewählte durch
eine gute Trennung der Analyten und eine frühe Retention des zuletzt eluierenden
PETN aus. Die Methode wurde im Folgenden für die Entwicklung einer Methode
zur Quantifizierung von PETN und seinen Metaboliten verwendet.
liten sollten aufgrund höherer Hydrophilie
zu früheren Zeiten eluieren, PEmonoN aufgrund
seines geringsten Nitratgehaltes als
Erstes, gefolgt von PEdiN und schließlich
PEtriN. Diese Überlegung wurde im Experiment
(HPLC­MS­Chromatogramme, Abb.
2) bestätigt. Für alle Chromatogramme wurde
ein optimierter binärer Gradient beider
Fließmittel­Komponenten benutzt. Die im
Vergleich verschiedener Methoden ermit­
5
45
45
100
100
5
5
Organische Nitrate
telte optimale Zufuhr der Fließmittel­Komponenten
A und B ist tabellarisch (Tab. 3)
wiedergegeben. Die entsprechende grafische
Darstellung findet sich in Abbildung
3. Für die Wahl der Methode war entscheidend,
dass die Trennung von PETN und seinen
nitratärmeren Metaboliten gut gelingt
und für das zuletzt eluierende PETN eine
vergleichsweise niedrige Retentionszeit
möglich wird.
Die ermittelten MS­Bedingungen, die
Bildung von Nitrat­Formiat­Addukten sowie
der gefundene Fließmittelgradient
wurden im Folgenden bei der Entwicklung
einer Methode zur Quantifizierung von
PETN und seinen nitratärmeren Metaboliten
zusammengeführt. Die Kalibrierung
mithilfe von Standardlösungen im Konzentrationsbereich
von 10 ­5 bis 10 ­8 M verdeutlichte
den linearen Zusammenhang
von Nitratkonzentration und Signalintensität
im HPLC­MS­Chromatogramm über
den gesamten Arbeitsbereich. Ein Beispiel­
Chromatogramm der Kalibrierung ist in
Abbildung 4 für ein Gemisch von PETN
und PETN­Metaboliten mit einer jeweiligen
Konzentration von 10 ­6 M dargestellt.
Während PETN, PEtriN und PEdiN in
der vorliegenden Konzentration deutliche
Signale zeigen, ist der PEmonoN­Peak leider
nur undeutlich erkennbar. Es könnte
sein, dass nur eine Nitratgruppe für die Bildung
eines Formiat­Adduktes unzureichend
ist oder zu einer geringeren Stabilität
des Adduktes führt.
Die ermittelten Werte für die jeweiligen
Nachweis­ und Bestimmungsgrenzen sind
in Tabelle 4 gegenübergestellt. Während
die niedrigsten quantifizierbaren Konzentrationen
für PETN, PEtriN und PEdiN bei
maximal 5 x 10 ­8 M liegen, ist die LOQ von
PEmonoN mit einem Wert von 5 x 10 ­5 M
für eine Quantifizierung in biologischen
Proben nicht brauchbar. Dessen ungeachtet
konnte die entwickelte HPLC­MS­
Quantifizierungsmethode bereits erfolgreich
zur Bestimmung der Gehalte von
PETN und PETN­Metaboliten nach Extraktion
aus Humanplasma und Vollblut
sowie im Rahmen kinetischer Untersuchungen
nach der Inkubation der Nitrate
mit ALDH­2 eingesetzt werden. Ebenso
lassen die Nachweisgrenzen von PETN,
PEtriN und PEdiN die Gehaltsbestimmung
der Nitrate im Vollblut von Probanden
nach oraler Gabe von PETN zu, was letztlich
das Ziel unserer Bemühungen war. n
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

Summary
Pentaerythritol tetranitrate (PETN) is a
high potency nitrovasodilator and is used in
the treatment of cardiomyopathy and angina
pectoris. Bioactivation via mitochondrial
aldehyde dehydrogenase (ALDH­2)
and other biodegradations go along with a
stepwise loss of the 4 nitrate functions and
result in pentaerythritol trinitrate (PEtriN),
pentaerythritol dinitrate (PEdiN) and pentaerythritol
mononitrate (PEmonoN). All
of them contribute to the vasodilatory action.
In order to confirm compliance in the
field of pharmacological studies and also in
order to monitor reactions of PETN with
regard to enzyme kinetics, a highly sensitive
analytical method, which has not been
available so far has to be found. Based on
previous investigations via HPLC­UV [1,
2], we developed a RP­HPLC­ESI­MS (reversed
phase high performance liquid chromatography
electrospray ionization mass
spectrometry) method using a C18 column,
which showed to be sensitive enough to determine
the concentrations of PETN and its
denitrated metabolites in biological samples.
The formation of stable formiate adducts
[3] further increased sensitivity and
lead to LOD (limit of detection) of 10 ­8 M
in maximum for PETN, PEtriN and PEdiN.
Linearity could be shown within the whole
working range for concentrations from 10 ­5
till 10 ­8 M. But a comparable detection of
PEmonoN could not be achieved by this
protocol.
Key Words: organic nitrate – quantification
– formiate adduct – LC­MS
Danksagung
Ein herzliches Dankeschön soll an dieser
Stelle dem Kollegium des Lehrstuhls für
Lebensmittelchemie, Institut für Ernährungswissenschaften
der Friedrich­Schiller­
Universität Jena ausgesprochen werden,
welches das für die Messungen verwendete
LC­MS­Gerät zur Verfügung stellte und
stets hilfsbereit bei der Beantwortung technischer
Fragen war.
Darüber hinaus ist zu danken Katrin Fischer
sowie Monika Listing, Kolleginnen
des Lehrstuhls für Pharmazeutische/Medizinische
Chemie an dem Institut für Pharmazie
der Friedrich­Schiller­Universität
Jena, für die Synthese der verwendeten
Standards PEtriN, PEdiN und PEmonoN.
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Organisches Nitrat
PETN
PEtriN
PEdiN
PEmonoN
Retentionszeit
[min]
27,70
25,47
16,72
5,15
Literatur
1. Cavazzutti C, Gagliardi L, Amato A, Gattavecchia E,
Tonelli D. Separation and quantitation of polynitrate
esters in pharmaceutical preparations by reversedphase
high-performance liquid chromatography.
J Chromatogr 1982;244:391–395
2. Seeling A, Lehmann J. NO-donors, part X [1]: Investigations
on the stability of pentaerythrityl tetranitrate
(PETN) by HPLC-chemoluminescence-N-detection
(CLND) versus UV-detection in HPLC. J Pharm Biomed
Anal 2006;40:1131–1136
3. Zhao X, Yinon J. Identification of nitrate ester explosives
by liquid chromatography-electrospray ionization
and atmospheric pressure chemical ionization mass
spectrometry. J Chromatogr 2002; A 977:59–68
LOD
[mol/l]
1­x­10 -8
7,5­x­10 -9
1­x­10 -8
1­x­10 -6
Organische Nitrate
LOQ
[mol/l]
5­x­10 -8
2­x­10 -8
5­x­10 -8
5­x­10 -5
Tab. 4: Übersicht der experimentell ermittelten Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
für PETN und seine Metaboliten. Der angegebenen LOD liegt ein Signal-
Rausch-Verhältnis mit einem Mindestwert von 3 zugrunde, während die LOQ ein
Signal-Rausch-Verhältnis von mindestens 10 erfordert (LOD = „limit of detection“,
Nachweisgrenze; LOQ = „limit of quantification“, minimale quantifizierbare Konzentration
des Analyten).
Intensität
8000
6000
4000
2000
0
PEmonoN
PEdiN
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Zeit [min]
PEtriN
PETN
Abb. 4: HPLC-MS-Chromatogramm eines Gemisches der Standardlösungen von
PETN, PEtriN, PEdiN und PEmonoN. Während PETN, PEtriN und PEdiN deutliche
Peaks hoher Intensität zeigen, ist das PEmonoN-Signal wesentlich schwächer
ausgeprägt, was ggf. auf eine geringere Stabilität des Formiat-Adduktes zurückgeführt
werden kann und die Empfindlichkeit im Rahmen der Quantifizierung
deutlich mindert (Konzentration der Analyten: je 10 -6 M).
Für die Verfasser:
Jochen Lehmann
Pharmazeutisches Institut
der Friedrich-Schiller-
Universität Jena
Lehrstuhl für Pharmazeutische/Medizinische
Chemie
Philosophenweg 12
07747 Jena, Germany
Tel.: +49 (0)3641 949825
Fax: +49 (0)3641 949802
E-Mail: juliane.
brettschneider@uni-jena.de
oder: j.lehmann@uni-jena.de
11

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
1 Lehrstuhl für Pharmazeutische/Medizinische
Chemie
Pharmazeutisches Institut der
Friedrich-Schiller-Universität
Jena
2 Lehrstuhl für Pharmazeutische
Chemie, Ain Shams Universität,
Abbasia-Kairo, Ägypten
3 Elektronenmikroskopisches
Zentrum am Universitätsklinikum
Jena
4 Max-Planck-Forschungsstelle
„Enzymologie der Proteinfaltung“,
Halle
12
Nitrat-Statin-Hybride – eine neue Option zur
Therapie der Alzheimer‘schen Krankheit?
Claudia Lengfelder 1 , Heidi Traber 1 ,Carolin Roegler 1 , Khaled Abuzid 2 ,
Martin Westermann 3 , Markus Fändrich 4 , Jochen Lehmann 1
Zusammenfassung: Statine werden klassisch
für die Behandlung und zur Vorbeugung
der Hypercholesterinämie eingesetzt
aufgrund ihrer Eigenschaft, die Cholesterinsynthese
zu reduzieren. Sie wirken durch
eine Blockierung der HMG­CoA­Reduktase,
welche das geschwindigkeitsbestimmende
Enzym bei der Cholesterinsynthese ist. Allerdings
lassen einige Studien vermuten, dass
Statine auch für die Behandlung der
Alzheimer’schen Krankheit günstig sein
können. Neben ihrer HMG­CoA­Reduktase­inhibierenden
Wirkung wurden noch einige
weitere Mechanismen in den Raum gestellt.
Es konnte gezeigt werden, dass Statine
die Freisetzung des β­Amyloid­Peptids beeinflussen,
das durch Aggregation die sogenannten
senilen Plaques bildet, das pathologische
Charakteristikum der Alzheimer’schen
Krankheit. Obwohl der exakte Mechanismus
noch nicht aufgeklärt wurde, könnte
diese Wirkung auf verringerte Cholesterin­
Die Alzheimer’sche Krankheit (Alzheimer’s
disease = AD), eine zu den Demenzen
zählende neurodegenerativen Erkrankung,
tritt weltweit bei ca. 15 Millionen
Menschen auf. Aufgrund der stetig steigenden
Lebenserwartung wird allein in
Deutschland für das Jahr 2010 eine Zahl von
etwa 1,8 Millionen Erkrankungen prognostiziert.
Bei den Betroffenen führt AD zu einem
langsam fortschreitenden Abbau von Nervenzellen
und Nervenkontakten im Gehirn.
Charakteristischerweise kommt es zum Auftreten
von intrazellulären neurofibrillären
Bündeln aus Proteinen, neuronalen Degenerationen
und extrazellulären β­Amyloidablagerungen
(senile Plaques), wobei Letztere
Spaltprodukte des Amyloid­Precursor­Proteins
(APP) sind und als wesentliches pathologisches
Merkmal der AD gelten. Aktuelle
Bestrebungen bei der Suche nach neuen Medikamenten
zielen darauf hin, die Bildung
von β­Amyloid­Plaques zu verhindern, indem
spiegel zurückgeführt werden oder auch auf
eine verringerte Isoprenoid­Biosynthese, die
die Prozessierung des β­Amyloidvorläuferproteins
APP beeinflusst. Wir haben den
direkten Effekt verschiedener Statinderivate
auf die Amyloidaggregation gestestet, als
einen weiteren Weg, wie Statine die
Alzheimer’schen Krankheit positiv beeinflussen
könnten. Vor allem haben wir untersucht,
ob die chemische Modifizierung der
freien Lacton­Hydroxy­Gruppe der Statine
zu Verbindungen führen könnte, die eine
direkte Wirkung auf die Amyloidaggregation
aufweisen und so die Plaquebildung unterdrücken.
Erstaunlicherweise zeigten die
Resultate, dass ein Nitro­Acetyl­Statinderivat
(LE­CL11) die Amyloidaggregation potent
reduziert (auf 35% der Kontrolle).
Schlüsselwörter: Statine – organische
Nitrate – Statin­Nitrat­Hybridmolekül –
Alzheimer’sche Krankheit
die Enzyme (Sekretasen) moduliert werden,
welche den ungünstigen Abbau des Amyloid­
Prekursor­Proteins (APP) zu den Polypeptiden
Aβ40­42 katalysieren, aus denen durch
Aggregation die β­Amyloid­Plaques entstehen.
Die Spaltung des integralen Membranproteins
APP kann durch unterschiedliche
Sekretasen erfolgen, wobei die Spaltung
durch die a­Sekretase lediglich lösliche, nicht
pathogene Abbauprodukte freisetzt. Durch
Spaltung von APP durch die β­Sekretase entsteht
pathogenes Aβ(1­40) und Aβ(1­42), welche
dann zu unlöslichen Fibrillen und den senilen
Plaques aggregieren.
Statine als Therapeutika bei der
Alzheimer’schen Demenz?
Weitere Studien belegen, dass es eine direkte
Verbindung zwischen Störungen im Lipidund
Cholesterolstoffwechsel und der Entwicklung
der Alzheimerischen Erkrankung
gibt, was zur Diskussion über die Relevanz
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

von Cholesterolsynthesehemmern (Statinen)
für die Alzheimer­Therapie führte [1]. Es
wurde gezeigt, dass die Reduktion von zellulärem
Cholesterol zu einer erhöhten Aktivität
der a­Sekretase führt, wodurch der nicht
amyloidogene a­Sektrase­Abbau von APP
bevorzugt wird. Zum anderen hemmen die
Statine die De­novo­Isoprenoid­Biosynthese.
Die daraus entstehenden Isoprenoide (z.
B. Farnesylpyrophosphat) sind essenziell für
die Dimerisierung von BACE, welches erst
als Dimer die β­Sekretase aktiviert und somit
den amyloidogenen Abbau von APP bedingt.
Die Inhibition der Isoprenoid­Biosynthese
führt daher zu einer Akkumulation von APP
in der Zelle, jedoch zu einer verringerten
Freisetzung von Aβ, was die Bildung von senilen
Aβ­Plaques verhindern könnte [2, 3].
Generell lässt sich sagen, dass die bisher
eingesetzten Antidementiva vor allem symptomatisch­kompensatorisch
wirken und
nicht gezielt in die Alzheimer­Pathogenese
eingreifen. Sowohl durch die Modulation
der an der APP­Spaltung beteiligten Sekretasen
als auch durch die direkte Inhibition
der Aβ­Aggregation ließe sich die Ablagerung
von senilen Plaques vermindern.
Lovastatin zeigte bei früheren Untersuchungen
in einem Zell­Assay [4] eine direkte
Inhibition der Aβ40­Aggregation (senile
Plaques) von 35%. Dies ist bemerkenswert,
wobei allerdings der hier angewandte Makrophagen­Zell­Assay
sicher gut geeignet
ist, um im Screening Leitstrukturen zu identifizieren,
aber nicht unbedingt einen Rückschluss
zur humanen In­vivo­Situation erlaubt.
Bei der Durchführung des Assays
wurde lösliches Aβ mit Monozyten inkubiert
und die sich dabei bildenden Aβ­Plaques
mithilfe von Kongorot in einem Polarisationsmikroskop
detektiert.
Zusammenfassend kann man spekulieren,
dass Statine über unterschiedliche, bisher
noch nicht umfassend geklärte Mechanismen
Effekte in der Alzheimer­Therapie zeigen
könnten. Die direkte Hemmung der Aβ­Aggregation
ist ein neuer Ansatz, mögliche Alzheimer­Therapeutika
zu entwickeln.
Es wurde ein „reines Aβ40“­Assay etabliert,
um Statine und vor allem neue Statinderivate
auf eine direkte Wirkung auf die
Bildung von aggregiertem ß­Amyloid zu testen.
Unter Verwendung von Thioflavin T
(spezifischer Aβ­Fibrillen Marker) lässt sich
über die zunehmende Fluoreszenzintensität,
die mit der Aggregation einhergeht, letztere
zeitlich verfolgen.
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Aggregation [%]
140
120
100
80
60
40
20
0
Auf diese Weise konnte zunächst für Lovastatin
eine nur sehr mäßige Aggregationsinhibition
von 15% nachgewiesen werden,
andere getestete Statine zeigten jedoch keine
Wirkung auf die Aβ­Aggregation (Abb. 1).
Mit dem Ziel, Statine chemisch­strukturell
so zu modifizieren, dass sie potentere
Aβ­Aggregationshemmer sind, wurde die
Struktur des Lovastatins abgewandelt. Unter
Bewahrung des „Grundgerüstes“ wurde
im ersten Versuchsansatz Lovastatin durch
Hydrolyse zum Dihydroxyheptansäurederivat
entacyliert, an der reaktiveren Hydroxylgruppe
vorübergehend geschützt und danach
reacyliert.
Organische Nitrate
Kontrolle Lovastatin Pravastatin Simvastatin Atorvastatin
Abb. 1: Maximale Aβ-Aggregation nach 96 h unter dem Einfluss verschiedener
Statine.
Relaxation [%]
0
20
40
60
80
100
Nitratopivalinsäure
CL L 10
–6 –5 –4 –3
Konzentration [logM]
Abb. 2: Vasorelaxierende Effekte der Nitratopivalinsäure und des Nitrato-Simvastatin-Derivats
LE-CL10 (in vitro) an PGF2 vorkontrahierten Pulmonalarterien des
Schweins.
13

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Vorrangig wurde das nitrooxylierte Simvastatin­Derivat
LE-CL10 synthetisiert, also
ein Simvastation­NO­Donor­Hybridmolekül.
Das heißt, dem Statin wurde mit einem
organischen Nitrat eine zweite bioaktive,
die NO/sGC/cGMP­Signaltransduktion regulierende
Struktur im Molekül zur Seite
gestellt.
Erwartungsgemäß zeigte dieses Hybridmolekül
einen vasodilatatorischen Effekt.
An isolierten Pulmonalarterien des Schweins
(Organbadexperimente) zeigten wir, dass
die vasodilatatorische Wirkstärke des organischen
Nitrates durch die Einführung des
großen organischen Statingerüstes nicht gemindert
wird. Die Nitratopivalinsäure allein
und das Simvastatin­Nitrat­Hybrid zeigen
beide eine ähnliche, moderate vasodilatatorische
Wirkung (Abb. 2). Eine ausgeprägte
Inhibition der Amyloidaggregation konnten
wir jedoch nicht feststellen.
Fluoreszenzintensität [%]
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
Obwohl für die Substanzklasse der Statine
strukturell eher untypisch wurde dann
eine Nitratoacylierung an der Hydroxygruppe
des Lovastatin­Lactonringes durchgeführt.
Erfreulicher­ und überraschenderweise
zeigte dieses Statin­Nitrat­Hybrid
LE­CL11 nun eine inhibitorische Wirkung
von bemerkenswerten 65% auf die direkte
Aβ­Aggregation über einen Zeitraum von
über 96 h (Abb. 3). Die Kurvenscharen in
Abbildung 3 demonstrieren die Qualität
dieses Befundes eindrucksvoll.
Dieses Ergebnis gab Anlass zur Synthese
weiterer Statin­ und Nitrato­Statin­Derivate
der allgemeinen Formel (I) (Abb. 4).
Alle weiteren nitratoacylierten Substanzen
zeigten eine inhibitorische Wirkung
auf die direkte Aβ­Aggregation, jedoch
konnte keine der getesteten Substanzen
in ihrer Wirksamkeit an die Verbindung
LE­CL11 heranreichen (Abb. 5).
Kontrolle
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95
Zeit [h]
Abb. 3: Gehemmte Aβ-Aggregation (rot) unter dem Einfluss von LE-CL11.
O
HO
O
O
O
HO
COOH
OH
R1
O
O O
O
O
OH
O
Lovastatin (I)
Abb. 4: Syntheseschema der acylierten und nitratoacylierten Statinderivate, wobei R1, bzw. R2 Acyl-
und/oder Nitratoacyl-Reste sein können.
14 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
R2
O 2 N

Aggregation [%]
120
100
80
60
40
20
0
A-β Lovastatin CL10 CL59 CL11
Um den Einfluss des organischen Nitrates
zu erkennen, wurde nun ein strukturell
analoges Derivat ohne organisches
Nitrat, nämlich LE-CL66, synthetisiert und
getestet. Diese Substanz zeigte tatsächlich
eine deutlich geringere antiaggregatorische
Potenz als das Nitrato­Statin­Hybrid
LE-CL11.
Dies lässt einen positiv­kooperierenden
Einfluss des organischen Nitrates vermuten,
der sich leider durch die Einführung
einer zweiten organischen Nitratgruppe
nicht weiter verbessern ließ. So inhibiert
das Dinitrat LE-CL59 nur auf 56,4% der
Kontrolle und das zu LE-CL59 strukturell
analoge Statinderivat LE-CL 67a ohne organisches
Nitrat zeigt sogar eine stärkere
Inhibition der Aggregation auf 49,8%.
Dies legt nahe, dass die inhibitorische Wirkung
nicht allein von der Anzahl der im
Molekül vorhandenen Nitratgruppen, sondern
stark von der Gesamtstruktur abhängt,
die dann auch ein organisches Nitrat
tragen kann.
Allerdings konnte durch die Einführung
der zweiten Nitratgruppe eine zu erwartende
verstärkte vasodilatatorische Wirkung
bei den In­vitro­Messungen an isolierten
Pulmonalarterien des Schweins demonstriert
werden (Abb. 6).
Grundsätzlich scheinen alle O­acylierten
Verbindungen auch ohne organisches Nitrat
eine hemmende Wirkung auf die Aβ­Aggregation
zu haben, jedoch konnte letztlich keine
der Substanzen an die Wirkpotenz von
LE-CL11 heranreichen (Abb. 7).
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Um zu erhärten, dass die Fluoreszenzveränderungen
durch die Syntheseprodukte
wirklich der verminderten Aggregation
geschuldet sind, wurden Kontrollversuche
durchgeführt, in denen nur der Fluoreszenzindikator
und die zu untersuchenden
Inhibitorsubstanzen zusammen vermessen
wurden. Es zeigten sich hierbei
keine Veränderungen der Fluoreszenzintensitäten,
eine Interaktion lediglich zwischen
Inhibitor und Indikator ist also ausgeschlossen.
Organische Nitrate
Verbindung Rest R1 Rest R2 Aggregation [%]
LE-CL10
LE-CL11
LE-CL59
Abb. 5: Minderung der Aβ-Aggregation unter dem Einfluss verschiedener Nitrato-Statin-Hybridmoleküle.
Relaxation [%]
0
20
40
60
80
100
Nitratopivalinsäure
LE-CL11
LE-CL59
0
0
H
O2NO
O2NO
0
0
0
O2NO
O2NO
97,3
34,6
56,4
–8 –7 –6
Konzentration [logM]
–5 –4 –3
Abb. 6: Vasorelaxierende Effekte der Nitratopivalinsäure und der Nitrato-Simvastatin-Hybride
LE-CL11 und LE-CL59 (in vitro) an PGF2a vorkontrahierten Pulmonalarterien
des Schweins.
15

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Aggregation [%]
120
110
80
60
40
20
0
A-β CL63 CL66 CL67b CL64b CL67a
Verbindung Rest R1 Rest R2 Aggregation [%]
16 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
LE-CL63
LE-CL64b
LE-CL66
LE-CL67a
LE-CL67b
Abb. 7: Vergleich der maximalen Aβ-Aggregation unter dem Einfluss verschiedener Statinderivate.
a b c
d e f
Abb. 8: Elektronenmikroskopische Aufnahmen ohne Inhibitor und mit Inhibitor LE-CL11.
0
0
0
0 0
0 0
0
H
H
67,7
52,8
58,3
49,8
57,4

Der durch Fluoreszenzmessungen erkannte
Einfluss der Substanzen auf die
Amyloidaggregation wurde schließlich
auch durch elektronenmikroskopische
Aufnahmen mit Negativkontrastierung bestätigt,
welche es ermöglichten, die Struktur
und Form der gebildeten β­Amyloid­
Fibrillen zu sehen. Hierbei wurde den Proben
kein Fluoreszenzindikator zugesetzt.
Auch hier wiesen Proben, die 90 Stunden
mit dem Inhibitor LE-CL11 (Abb. 8 a, b, c)
behandelt waren, eine im Vergleich zu unbehandelten
Kontrollproben (Abb. 8 d, e,
f) veränderte und stark reduzierte Aβ40­
Aggregation auf, was wiederum eine verminderte
Plaquebildung in Aussicht stellt.
Resümee
Es ist gelungen, Statine chemisch so zu verändern,
dass diese neuen Substanzen die
Aggregation von amyloidogenem Aß­Polypeptid
signifikant inhibieren. Vor allem
resultierte aus der Nitratoacylierung zu
einem Simvastatin­Nitrat­Hybrid ein besonders
potenter Inhibitor. Der Vergleich
aller getesteten Substanzen lässt bisher keine
deutliche Struktur­Wirkungs­Beziehung
erkennen. Auch bleibt bislang ungeklärt,
ob und gegebenenfalls welchen Einfluss das
organische Nitrat auf die Inhibition der
direkten Aß­Aggregation ausübt.
Eine erste Antwort auf die Frage, ob die
neuen Statinderivate auch klinisch erfolgreiche,
neuartige Alzheimer­Therapeutika
sein können, soll nun durch In­vivo­Untersuchungen
an transgenen Tieren gegeben
werden. n
Summary
Statins are classically used in the treatment
and prevention of hypercholesterolaemia
due to their ability to reduce cholesterol
synthesis. They act by blocking the HMG­
CoA reductase, which is the rate limiting
enzyme in cholesterol synthesis. However,
some studies have suggested the possible
use of statins as potential therapeutics in
the treatment of Alzheimer’s disease. Different
pathways apart from their inhibitory
activity on HMG­CoA reductase have been
explored. It has been shown that statins in­
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
fluence the release of β­amyloid, which aggregates
to senile plaques, a pathological
hallmark of AD. Although the exact mechanism
still remains unknown, this has been
attributed to decreased cholesterol levels,
as well as decreased isoprenoid biosynthesis,
which directly influences APP processing.
We have tested statin derivatives direct
effect on amyloid­aggregation as another
possible pathway of their mode of action.
Moreover we explored the possibility that
modifying chemically the statins at their
free lactonic­hydroxy­group could lead to
compounds with inhibitory potency on direct
Aβ­aggregation and hence prevent
plaque formation. Surprisingly, results
showed that a nitratoacylated­statin derivative
(LE­CL11) potently reduces amyloid
aggregation down to 35% of untreated control.
Keywords: statins – organic nitrates – statin
nitrate hybride molecule – Alzheimer’s
disease
Literatur
1. Jick H, Zornberg GL, Seshadri S, Drachman DA. Statins
and the risk of dementia. The Lancet 2000;356:
1627–31
2. Parson RB, Farrant JK, Price GC, Subramaniam D,
Austen BM. Regulation of the lipodation of β-secretase
by statins. Biochem Soc Trans 2007;35(3):577–582
3. Ostrowski SM, Wilkinson BJ, Golde TE, Landreth G.
Statins reduce Amyloid-β production through inhibition
of protein isoprenylation. J Biol Chem 2007;
282(37):26832–44
4. Gellermann G, Ullrich K, Tannert A, Unger C, Habicht
G, Sauter S, Hortschansky P, Horn U, Möllmann U, Decker
M, Lehmann J, Fändrich M. Alzheimer-like plaque
formation by human macrophages is reduced by
fibrillation inhibitors and lovastatin. J Mol Biol
2006;360:251–257
Für die Verfasser:
Jochen Lehmann
Pharmazeutisches Institut der Friedrich-Schiller-
Universität Jena
Lehrstuhl für Pharmazeutische/Medizinische
Chemie
Philosophenweg 12
07747 Jena, Germany
Tel.: +49 (0) 3641 949825
Fax: +49 (0) 3641 949802
E-Mail: j.lehmann@uni-jena.de
Organische Nitrate
17

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
1 Lehrstuhl für Pharmazeutische/Medizinische
Chemie,
Friedrich-Schiller-Universität,
Jena
2 Universitätsmedizin,
II. Medizinische Klinik, Labor
für Molekulare Kardiologie,
Johannes-Gutenberg-
Universität Mainz
18
Aminoalkylnitrate –
Eine neue Klasse von Nitraten?
Carolin Roegler 1 , Andreas König 1 , Andreas Daiber 2 und Jochen Lehmann 1
Zusammenfassung: Im Mittelpunkt dieser
Studie lagen die Aminoalkylnitrate (kurz:
Aminonitrate), die sich durch die zusätzliche
Aminogruppe chemisch sehr von den gebräuchlichen
Alkylnitraten (Pentaerithrityltetranitrat
[PETN], Nitroglyzerin [GTN],
Isosorbiddinitrat [ISDN] und Isosorbid-5mononitrat
[ISMN]) unterscheiden. Die vasodilatatorische
Potenz dieser Substanzen
korreliert nicht länger mit der Anzahl der
Nitratgruppen im Molekül, wie für die Alkylnitrate
beschrieben. Ein einfach gebautes
Mononitrat wie Aminethylnitrat (AEN)
zeigte erstaunlicherweise eine sehr hohe vasodilatatorische
Potenz, wohingegen ein
Aminotrinitrat (TEAN) eine deutlich geringere
Potenz zeigte als AEN oder GTN. Daneben
hing die Art und Weise der Nitrat-Bioaktivierung
und die Entwicklung der In-
vitro-Toleranz nicht wie üblicherweise
(bei Alkylnitraten) von der Potenz der
Nitrate ab. Die Bioaktivierung des hoch
potenten AEN verlief unabhängig von der
mitochondrialen Aldehyddehydrogenase
(ALDH-2), wohingegen das niedrig potente
TEAN in Abhängigkeit von der ALDH-2
Organische Nitrate werden vielfältig in
der Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen
eingesetzt. Leider können Nebenwirkungen
wie Nitrattoleranz und oxidativer
Stress die Anwendung dieser Medikamente
limitieren. Sowohl die vasodilatatorische
Potenz als auch die Entwicklung
einer Nitrattoleranz korrelierten bei den
bisher untersuchten Nitraten immer mit
der Anzahl der Nitratgruppen im Molekül
[1, 2]. So ist z.B. Glyceroltrinitrat (GTN)
hochpotent, führt im Verlauf der Therapie
aber zu endothelialer und vaskulärer Dysfunktion
und damit zur Toleranz. Von
PETN – in vitro ebenfalls hochpotent – ist
anzunehmen, dass es klinisch nur deshalb
nicht zu Toleranz führt, weil systemisch nur
bioaktiviert wurde. Daneben zeigte das hoch
potente Mononitrat AEN im Gegensatz zu
den hoch potenten Alkylnitraten (PETN
und GTN) keine Tendenz, eine Tachyphylaxie
zu entwickeln. Obwohl dies typisch für
ein Mononitrat ist, wurde dies bisher nicht
für ein hoch potentes Nitrat beobachtet. Erstaunlicherweise
zeigte das niedrig potente
TEAN eine vergleichbare Entwicklung der
Tachyphylaxie, wie es normalerweise nur für
die hoch potenten Alkylnitrate beobachtet
wurde. Zusammenfassend konnten wir zeigen,
dass die Affinität und Reaktivität gegenüber
endogenen nitratbioaktivierenden
Enzymen sowie die daraus resultierende vasodilatatorische
Potenz signifikant durch die
Einführung einer Aminogruppe in Alkylnitrate
moduliert wird. Demnach sollten Aminoalkylnitrate
als eigenständige Klasse der
Nitrovasodilatatoren angesehen werden.
Schlüsselwörter: Aminoalkylnitrate – Bioaktivierung
– mitochondriale Aldehyddehydrogenase
– mitochondrialer oxidativer
Stress – Struktur-Wirkungs-Beziehung –
vaskuläre Funktion
die niederpotenten, „toleranzfreien“ Metabolite
PEdiN und PEmonoN zur Verfügung
stehen bzw. endogene Schutzsysteme
wie die Hämoxygenase-1 und viele weitere
aktiviert werden. Kürzlich jedoch fanden
wir mit 2-Aminoethylnitrat (AEN) einen
Vasodilatator, der trotz nur einer Nitratgruppe
hochpotent ist (pD2 = 7,52) und
trotz seiner Mononitratstruktur sogar an
die Potenz des Trinitrats GTN (pD2 = 7,44)
heranreicht und zudem nicht zur Toleranz
führt [3].
Es stellt sich die Frage, ob für Aminoalkylnitrate
die bisher bei allen Alkylnitraten
gefundenen Gesetzmäßigkeiten keine
Gültigkeit haben, ob sie also nicht nur chemisch,
sondern auch pharmakologisch eine
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

eigene Klasse von Nitrovasodilatatoren
darstellen. Dazu sollten durch In-vitro-Untersuchungen
die Struktur-Wirkungs-Beziehungen
bei Aminoalkylnitraten an isolierten
Pulmonalarterien vom Schwein
(Organbadexperimente) ermittelt werden
und z.B. geklärt werden, welchen Einfluss
die Aminogruppe auf die Wirkstärke von
Nitraten generell hat und ob für Aminoalkylnitrate
andere Gesetzmäßigkeiten als
für die üblichen Alkylnitrate gelten. Neben
verschiedenen Aminoalkylmononitraten
wurden auch Aminoalkyldi- und -trinitrate
getestet. Keine dieser Substanzen, auch
nicht solche, die mehrere Nitratfunktionen
besitzen, reichte jedoch an die hohe Potenz
des Aminoethylnitrates (AEN) heran.
Neben dem hochwirksamen Mononitrat
AEN wurde ein überraschenderweise ungewöhnlich
schwach wirksames organisches
Trinitrat unter den Aminonitraten identifiziert,
nämlich das Triethylaminotrinitrat
(TEAN) (Tab. 1).
Vergleich AEN und TEAN
In Kooperation mit dem Arbeitskreis von
Andreas Daiber, Mainz, wurden mit dem
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
hochpotenten Mononitrat AEN und dem
niedrigpotenten Trinitrat TEAN Untersuchungen
zur In-vitro- und In-vivo-Toleranzentwicklung,
zur Induktion von oxidativem
Stress und zur Bioaktivierung durchgeführt
[4]. Die wichtigsten Ergebnisse sind hier
noch einmal zusammengefasst.
Bioaktivierung
Zur Analyse der Bioaktivierung wurden
die Gefäße vor der Relaxationsmessung im
Organbad mit verschiedenen Inhibitoren
inkubiert (Abb. 1). NS2028 ist ein Blocker
der löslichen Guanylatcyclase (sGC). Bei
PTIO handelt es sich um einen NO Scavenger.
Da beide Substanzen bei der Behandlung
mit AEN einen signifikanten Effekt
ausüben, ist davon auszugehen, dass die
Relaxation NO- und cGMP-(sGC-)vermittelt
ist. Erstaunlicherweise scheinen weder
P450- noch ALDH-Enzyme das AEN zu
bioaktivieren, da weder eine Vorbehandlung
mit Miconazol noch mit Benomyl einen
Einfluss auf die Vasodilatation hatte.
Auch eine AEN-induzierte Aktivierung
der eNOS als möglicher Mechanismus für
die Vasodilatation konnte ausgeschlossen
Organische Nitrate
Struktur pD2 EC 50 [M] Struktur pD2
EC 50 [M]
O2NO
O2NO
O2NO
O2NO
-
+ NO3
H3N
ONO2
O2NO
O2NO
+
NH
+
NH3
ONO2
+ NH3
ONO2
N
+
N
H2
+
NH3
ONO2
ONO2
ONO2
ONO2
ONO2
ONO2
ONO2
ONO2
7,54
(± 0,01)
7,10
(± 0,02)
7,02
(± 0,02)
6,82
(± 0,03)
6,09
(± 0,03)
6,02
(± 0,02)
5,82
(± 0,02)
7,37
(± 0,03)
2,86 • 10 –8
8,01 • 10 –8
9,49 • 10 –8
1,51 • 10 –7
8,08 • 10 –7
9,45 • 10 –7
1,52 • 10 –6
4,24 • 10 –8
O2NO
O2NO
O2NO
+
N3H
HO
+
NH3
+
NH3 O
O2NO
OH
+
NH3
+
NH2
ONO2
O
ONO2
+
NH3
Tab. 1: Strukturen und in vitro vasodilatatorische Effekte (pD2- und EC50-Werte) der Aminoalkylnitrate
an PGF2α-vorkontrahierten Pulmonalarterien des Schweins. pD2 sind Mittelwerte ± SEM.
+
N
H2
O
ONO2
ONO2
ONO2
5,63
(± 0,03)
5,61
(± 0,04)
5,45
(± 0,06)
5,31
(± 0,02)
4,86
(± 0,04)
4,71
(± 0,03)
4,52
(± 0,05)
4,48
(± 0,03)
2,37 • 10 –6
2,48 • 10 –6
3,52 • 10 –6
4,90 • 10 –6
1,38 • 10 –5
1,97 • 10 –5
3,00 • 10 –5
3,32 • 10 –5
19

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
a b
0
Relaxation [%]
10
20
30
40
50
60
70 Kontrolle
80 NS2028
90
100
PTIO
Miconazol
–10 –8 –6 –4
Log (AEN) [M]
Relaxation [%]
70 Kontrolle
80 Benomyl
90
100
L-Name
Allopurinol
–10 –8 –6 –4
Log (AEN) [M]
Abb. 1: Effekte verschiedener Inhibitoren auf den vasodilatatorischen Effekt von AEN.
L-012-Chemilumineszenz [Rate/min]
4–10 4
2–10 4
0–10 4
Kontrolle
H3N +
0
10
20
30
40
50
60
O2NO
ONO2
ONO2
werden, da der NOS-Inhibitor L-NAME
keinen Effekt hatte. Wohl aber kam es nach
der Inkubation mit Allopurinol zu einer
signifikanten Rechtsverschiebung der Kurve,
sodass möglicherweise die Xanthinoxidoreduktase
an der Bioaktivierung beteiligt
sein könnte.
Oxidativer Stress
Untersuchungen zum oxidativen Stress (gemessen
mittels L-012 (Luminol-Analogon)
Chemilumineszenz) in isolierten Mitochondrien
zeigten, dass im Gegensatz zu
anderen hochpotenten Nitraten wie GTN
und PETN durch hochpotentes AEN keine
Bildung reaktiver Sauerstoffspezies indu-
N
AEN TEAN
1000 µM
Abb. 2: Bildung reaktiver Sauerstoffspezies nach Behandlung mit AEN bzw. TEAN.
*
ziert wird. Das schwach wirksame Trinitrat
TEAN hingegen zeigte nach der Inkubation
der Mitochondrien mit 1000 μM Substanz
eine deutliche Erhöhung der Lumineszenz
im Vergleich zur Kontrolle, induziert
also mitochondrialen oxidativen Stress
(Abb. 2).
In-vivo-Toleranz
Erstaunlicherweise zeigt hochpotentes
AEN weder eine Kreuztoleranz zu Acetylcholin
noch zu GTN. Allerdings tritt nach
Vorbehandlung der Versuchstiere mit AEN
eine signifikante Verschiebung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve
auf, was einer
In-vivo-Toleranz gegen sich selbst entspricht
(nicht gezeigt). Die gleichen Versuche
wurden auch mit TEAN durchgeführt.
Bisher galt die Regel, dass niedrigpotente
Nitrate, wie z.B. PEdiN und
PEmonoN keine oder kaum Toleranz entwickeln.
Trotz seiner für ein Trinitrat niedrigen
Potenz kam es mit TEAN sowohl zur
Entwicklung einer In-vitro- als auch Invivo-Toleranz,
einer Kreuztoleranz gegenüber
Acetylcholin und – s. o. – zur Induktion
von oxidativem Stress. Dies war überraschend,
da diese Eigenschaften bislang
den hochpotenten Substanzen zugeschrieben
wurden. Auch scheint die Bioaktivierung
des TEAN wie bei den hochwirksamen
Nitraten ALDH-2-vermittelt zu sein, wie
Versuche mit ALDH-2-Knock-out-Mäusen
bestätigten. AEN zeigt also für eine hochpotente
Substanz ein völlig neues Wirkprofil,
da weder In-vitro-Toleranz noch oxidativer
Stress hervorgerufen werden. Um zu
prüfen, ob sich dieses neue Wirkprofil auf
weitere Aminoalkylnitrate übertragen lässt,
wurde zunächst die In-vitro-Toleranz verschiedener
Aminoalkylnitrate untersucht.
In-vitro-Toleranz
AEN (1) erzeugte auch in unseren Untersuchungen
(wiederholte Relaxation an einem
Gefäß) keine Tachyphylaxie (In-vitro-Toleranz)
(Abb. 3). Zwei N-methylierte Analoga,
die ebenfalls getestet wurden, zeigten
unterschiedliche Eigenschaften (Abb. 3a).
Während die höher potente Substanz (das
N,N-Dimethylaminoethylnitrat, 2) keine Invitro-Toleranz
zeigte, induzierte der moderatere
Vasodilatator (das N-Methylaminoethylnitrat,
3) eine signifikante Rechtsverschiebung
der Konzentrations-Wirkungs-
Kurve (Abb. 3a), also Toleranz. Die Methylierung
der Alkylkette im Sinne einer Ket-
20 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
*
ONO2

tenverzweigung führte zu abgeschwächter
vasodilatatorischer Potenz, bei unterschiedlicher
Entwicklung von Tachyphylaxie (Abb.
3b). Die Methylierung neben der organischen
Nitratfunktion ergab ein in vitro toleranzfreies
Produkt (4), das Aminonitrat,
mit einer der Aminogruppe benachbarten
Methylgruppe (5) zeigte bei der Versuchswiederholung
eine verringerte gefäßrelaxierende
Potenz (Abb. 3b), also In-vitro-Toleranz.
In der Gruppe der Aminoalkyldinitrate
induzierten die beiden Glyzeryldinitrat-
Analoga 6 und 7 keine signifikante In-vitro-
Toleranz. Das Aminodiethyldinitrat 8, eine
Art Dimer von AEN, zeigte wiederum Tachyphylaxie
(Abb. 3c). Erneut stehen diese
Resultate in Kontrast zu früheren Ergebnissen,
da normalerweise die weniger potenten
Nitrate keine Tachyphylaxie induzieren und
nur bei den hochpotenten Nitraten bei mehrmaliger
Gabe eine deutliche In-vitro-Toleranz
beobachtet wurde.
Nachhaltigkeit der Vasorelaxation
Bislang wenig fokussiert wurde in bisherigen
pharmakologischen Untersuchungen
von Nitraten die „Nachhaltigkeit“ der Vasorelaxation,
die Frage also, wie lange eine
herbeigeführte Gefäßdilatation ohne weitere
Nitratgabe anhält bzw. wie rasch die
Wiederkontraktion, gewissermaßen die
„Erholung“ des Gefäßes, erfolgt. Bei den
diesbezüglichen Organbadexperimenten
gaben wir jeweils einen einmaligen Nitratbolus
zu der mit PGF2α-vorkontrahierten
Schweinelungenarterie. Gemessen wurden
dann sowohl die maximale Relaxation als
auch die noch verbleibende Relaxation
nach 20 min. Um eine Abhängigkeit der
„Erholung“ der Gefäße von der zugegebenen
Substanzkonzentration zu erkennen,
wurden Bolusgaben in unterschiedlichen
Konzentrationen eingesetzt.
Bei AEN zeigte sich eine deutliche Abhängigkeit
der Wiedererlangung der Kontraktion
von der zugesetzten Substanzkonzentration.
Nach einer kleinen Konzentrationszugabe
befand sich das Gefäß nach
20 Minuten wieder in der Ausgangssitua-
Abb. 3a–3c: Vasorelaxierende Effekte verschiedener
organischer Aminoalkylnitrate an
PGF2α-vorkontrahierten Pulmonalarterien des
Schweins. Die gestrichelte Kurve zeigt die
Konzentrations-Relaxations-Beziehung für
die zweite Behandlung zur Untersuchung der
In-vitro-Toleranz.
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
a
b
c
Relaxation [%]
Relaxation [%]
Relaxation [%]
0
25
50
75
100
H 3N +
H 3C _ NH H 3C _ +
N H2
CH 1 2 3
3
+
ONO2 ONO2 ONO2
1 4 5
H 3N
CH 3
ONO2
O 2NO
+
NH3
O 2NO
*
+
0
25
50
75
100
*
*
*
*
*
Organische Nitrate
–9 –8 –7 –6 –5 –4 –3
Konzentration [logM]
6 7 8
+
O2NO NH3
ONO2
O2NO
ON O2
+
NH3
O2NO
0
25
50
75
100
*
*
+ NH3
–9 –8 –7 –6 –5 –4 –3
Konzentration [logM]
+
N
H 2
*
CH 3
*
*
ONO2
–9 –7 –6
Konzentration [logM]
–5 –4
*
*
*
*
21

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Konzentration
[M]
1·10 -8
3·10 -8
1·10 -7
3·10 -7
1·10 -6
3·10 -6
H 3N +
Maximale
Relaxation [%]
30,7
48,2
75,9
87,2
93,9
96,0
ONO 2
Relaxation,
20 min [%]
17,8
26,2
54,3
79,2
91,0
97,9
tion. Eine Nitratwirkung war nicht mehr zu
erkennen. Gab man allerdings eine Konzentration
hinzu, die dem EC100 entsprach,
blieb das Gefäß auch noch 20 Minuten nach
der Zugabe vollständig relaxiert. Mit steigender
Konzentration von AEN sinkt also
die Fähigkeit zur Rekontraktion (Tab. 2).
Bei identischen Versuchen mit einem anderen
Aminoalkylnitrat, dem N-Methylaminoethylnitrat
(3), konnte diese Abhängigkeit
der Rekontraktion von der applizierten
Nitratmenge nicht festgestellt werden. Sowohl
bei kleinen Konzentrationen als auch
nach vollständiger Relaxation durch entsprechend
hohe Dosierung kam es zu einer
ähnlich raschen Rekontraktion (Tab. 2).
Schlussfolgerungen
Erholung der
Gefäße [%]
42,0
45,8
28,5
9,2
3,1
0,0
Konzentration
[M]
Gegenstand der Untersuchungen waren
Aminoalkylnitrate (kurz: Aminonitrate).
Bei diesen korreliert die vasodilatatorische
Potenz nicht mehr mit der Anzahl der
Nitratgruppen. Ein Mononitrat wie AEN
kann hochpotent sein, und wir fanden ein
Trinitrat, das vergleichsweise, z.B. zu
GTN, schwach wirkte. Auch Bioaktivierung
und In-vitro-Toleranz sind nicht automatisch
abhängig von der Wirkstärke eines
Nitrates, wie dies bei den Alkylnitraten ohne
Aminogruppe der Fall ist. Die Bioaktivierung
des hochwirksamen AEN ist unabhängig
von der ALDH-2, während das
schwach wirksame TEAN über ALDH-2
bioaktiviert wird. Außerdem ruft das Mononitrat
keine Tachyphylaxie hervor, was
zwar charakteristisch für Mononitrate, allerdings
ungewöhnlich für ein Nitrat dieser
Maximale
Relaxation [%]
Relaxation,
20 min [%]
Erholung der
Gefäße [%]
Wirkstärke ist. Das Aminoalkyltrinitrat
hingegen zeigt die typische Tachyphylaxie
der organischen Polynitrate, die aber wiederum
das TEAN in der Wirkstärke deutlich
übertreffen.
Die Untersuchungsergebnisse zur Invitro-Toleranz
durch Aminoalkylnitrate
sind unterschiedlich. Es wurde keine Abhängigkeit
zwischen Tachyphylaxie und
Wirkstärke festgestellt. Sowohl Mononitrate
als auch Dinitrate induzieren eine
Tachyphylaxie, wobei es überraschenderweise
eher bei schwächer wirksamen Nitraten
zu einer In-vitro-Toleranz kommt als
bei den stärker wirksamen. Erste orientierende
Versuche weisen darauf hin, dass die
Nachhaltigkeit einer nitratinduzierten Relaxation
nach Beendigung der Nitratzufuhr
konzentrationsabhängig ist.
Abschließend kann man sagen, dass es
sich bei den Aminoalkylnitraten um eine
neue Klasse von organischen Nitraten handelt,
die individuelle Eigenschaften und
Struktur-Wirkungs-Beziehungen aufweist.
Die hier präsentierten Resultate über
Aminoalkylnitrate ergänzen die Paradigmenwechsel,
welchen die Bewertung der
organischen Nitrate in den vergangenen
Jahren unterlag. Diese lassen sich verkürzt
wie folgt darstellen:
Vor 1988: Organische Nitrate relaxieren
Blutgefäße, der Wirkmechanismus ist nicht
bekannt. Ein Nitratrezeptor ist anzunehmen.
1988: Stickstoffmonoxid (NO) stimuliert
die lösliche Guanylatzyklase und ist der natürliche
endogene Vasodilatator. Orga-
22 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
1·10 -6
3·10 -6
1·10 -5
3·10 -5
1·10 -4
3·10 -4
H3C _ +
NH2 13,7
40,3
67,3
78,3
85,7
85,0
O NO 2
Tab. 2: Relaxationsdaten nach Bolusgabe an PGF2α-vorkontrahierten Pulmonalarterien des Schweins.
Erholung der Gefäße ist das Verhältnis der Relaxation nach 20 min zur maximalen Relaxation.
6,2
13,4
21,7
21,7
35,6
26,6
54,8
66,8
68,8
72,3
58,5
68,8

nische Nitrate wirken, weil aus ihrer Nitrogruppe,
sehr wahrscheinlich nicht enzymatisch
durch Reaktion mit Thiolen, NO gebildet
wird. Thiolmangel führt zu Toleranz.
Die Struktur des nitrattragenden organisch
chemischen Restes ist eher bedeutungslos,
d.h. alle Nitrate sind grundsätzlich gleich,
alle Nitrate führen zu Toleranz, weil NO zu
Toleranz führt.
Ab 1990: Nicht alle NO-Donoren und auch
nicht alle Nitrate führen zu Toleranz, sind
also unterschiedlich. Bei einer Behandlung
mit PETN bleibt die Toleranzentwicklung
aus.
Ab 2005: Die Bioaktivierung von Nitraten
ist grundsätzlich ein enzymatischer Prozess.
Hochpotente Alkylnitrate werden durch
die mitochondriale Aldehyddehydrogenase
(ALDH-2) bioaktiviert, niedrig potente
durch andere Enzyme. In der ALDH-2-vermittelten
Bioaktivierung liegt der Schlüssel
zur Nitrattoleranz.
Ab 2007: Nitrate sind nicht gleich, erste
Struktur-Wirkungs-Beziehungen werden
gefunden: Die vasodilatatorische Potenz
wie auch die Entwicklung von Toleranz
steigen mit der Anzahl der Nitratgruppen
im Molekül, z.B. PEmonoN < PEdiN < PEtriN
< PETN. Das günstige toleranzarme
klinische Wirkprofil von PETN resultiert
nicht aus systemisch verfügbarem PETN,
sondern aus dem langsamen, sukzessiven
Anfluten der noch nitrathaltigen Metabolite.
Ab 2009: Die Struktur des nitrattragenden
Restmolekül ist doch von hoher Bedeutung.
Die Einführung einer zusätzlichen Aminogruppe
in Alkylnitrate ändert die Eigenschaften
besonders dramatisch: Eines der
Aminoalkylmononitrate (AEN) ist so aktiv
wie GTN, aber sehr viel aktiver als ein Aminoalkyltrinitrat
(TEAN). Die bisher für
Alkylnitrate gefundenen Struktur-Wirkungs-Beziehungen
hinsichtlich Potenz,
Tachyphylaxie und Bioaktivierung gelten
für Aminoalkylnitrate nicht. n
Summary
In the focus of this study were aminoalkylnitrates
(short: aminonitrates), which differ
chemically from the usual alkylnitrates (pentaerithrityl
tetranitrate [PETN], nitroglycerin
[GTN], isosorbide dinitrate [ISDN],
isosorbide-5-mononitrate [ISMN]) by having
an additional amino group. The vasorelaxant
potency of those substances no longer
correlates with the number of nitrate groups
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
in the molecules as it was found for the alkylnitrates.
A simple mononitrate like aminoethylnitrate
(AEN) showed surprisingly high
vasodilator potency and on the other hand
an aminotrinitrate (TEAN) had much lower
potency than AEN or GTN. Furthermore,
the mode of nitrate bioactivation and development
of in vitro tolerance do not depend
as usual (alkylnitrates) on the potency of the
nitrate. Bioactivation of the highly potent
AEN is independent from ALDH-2 while
the low potent TEAN is bioactivated by
ALDH-2. Besides, in contrast to high potency
alkylnitrates, the very potent mononitrate
AEN does not induce tachyphylaxis.
Though this is typical for a mononitrate, it
has not been found yet for a high potency
organic nitrate. However, the low potency
aminoalkyltrinitrate TEAN shows the same
development of tachyphylaxis which is typical
for the high potency alkyltrinitrate GTN.
In conclusion we showed, that the affinities
and reactivities towards endogenous nitratebioactivating
enzymes and subsequently the
vasodilator properties are modulated significantly
by adding an amino group to the
alkylnitrate template. Thus, aminoalkylnitrates
have to be considered as an own individual
class of nitrovasodilators.
Keywords: aminoalkyl nitrates – bioactivation
– mitochondrial aldehyde dehydrogenase
– mitochondrial oxidative stress – vascular
function – structure-property-relationship
Literatur
1. Lange K, Koenig A, Roegler C, Seeling A, Lehmann J.
Bioorg Med Chem Lett 2009;19(11):3141–44
2. Koenig A, Lange K, Konter J, Daiber A, Stalleicken D,
Glusa E, Lehmann J. J Cardiovasc Pharmacol
2007;50:68–74
3. Koenig A, Roegler C, Lange K, Daiber A, Glusa E,
Lehmann J. Bioorg Med Chem Lett 2007;17:5881–85
4. Schuhmacher S, Schulz E, Oelze M, König A, Roegler
C, Lange K, Sydow L, Kawamoto T, Wenzel P,
Münzel T, Lehmann J, Daiber A. Br J Pharmacol
2009;158(2):510–520
Für die Verfasser:
Jochen Lehmann
Pharmazeutisches Institut der Friedrich-Schiller-
Universität Jena
Lehrstuhl für Pharmazeutische/Medizinische
Chemie
Philosophenweg 12
07747 Jena, Germany
Tel.: +49 (0)3641 949825
Fax: +49 (0)3641 949802
E-Mail: j.lehmann@uni-jena.de
Organische Nitrate
23

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
II. Medizinische Klinik, Labor
für Molekulare Kardiologie
und Institut für Pharmakologie
Universitätsmedizin der
Johannes�Gutenberg�Universi�
tät, Mainz, Deutschland
24
Neues zu antioxidativen Eigenschaften
von PETN und zum Nitratmetabolismus an der
isolierten ALDH�2
Andreas Daiber, Matthias Oelze, Jens Kamuf, Richard Schell, Andrea Pautz, Philip Wenzel,
Hartmut Kleinert
Zusammenfassung: Die hämodynamischen
und antiischämischen Effekte von Nitroglyzerin
(GTN) gehen inlolge einer rasch
einsetzenden Nitrattoleranz verloren. Aktuelle
Arbeiten konnten neue Toleranzmechanismen
identifizieren wie die Hemmung
des nitratbioaktivierenden Enzyms,
die Aldehyddehydrogenase (ALDH­2)
sowie die Bildung reaktiver Sauerstoff­
und Stickstoffspezies (RONS) in Mitochondrien,
die die Bioaktivierung von GTN
hemmen. Damit vereint sich erstmals das
Konzept des nitratinduzierten oxidativen
Stresses mit dem Konzept der Desensitivierung
(Inhibition) der Nitratbioaktivierung
auf der Ebene der ALDH­2. Aktuelle tierexperimentelle
Studien legen nahe, dass
reduzierte Liponsäure die oxidative Inhibition
des nitratbioaktivierenden Enzyms,
der mitochondrialen ALDH­2, verhindert
und dass Pentaerithrityltetranitrat (Pentalong
® , PETN) aufgrund seiner intrinsischen
antioxidativen Eigenschaften (Induktion
der Hämoxygenase­1 [HO­1] und des Ferritins)
keine Nitrattoleranz induziert. Die
Tatsache, dass PETN die ALDH­2 Aktivi­
1. Klinische Nitrattoleranz
Organische Nitrate gehören zur Substanzklasse
der Nitrovasodilatatoren und sie finden
auch in heutiger Zeit eine breite klinische
Anwendung bei der Behandlung der
stabilen und instabilen Angina pectoris.
Daneben werden organische Nitrate zur
Dauertherapie der chronischen Herzinsuffizienz
eingesetzt (Isosorbiddinitrat
(ISDN)/Hydralazin und Pentaerithrityltetranitrat
(PETN)), wo sie durch die Senkung
der Vorlast einen positiven Effekt auf
die Morbidität sowie die Lebensqualität
der Patienten zeigen. Ihr Wirkprinzip basiert
auf einer durch Bioaktivierung induzierten
NO­Freisetzung, die durch Aktivie­
tät intakt lässt, ist umso bedeutsamer, als
neben GTN auch PETN und sein Trinitratmetabolit
PETriN durch die ALDH­2 bioaktiviert
werden. In einer gerade abgeschlossenen
Studie zeigte sich, dass PETN
auch an der isolierten humanen ALDH­2
qualitativ anders wirkt als GTN. Interessanterweise
bewirkte GTN eine beachtliche
konzentrationsabhängige Abnahme der
ALDH­2­Aktivität und Zunahme der
RONS (direkt durch die ALDH­2 gebildet),
wohingegen PETN hier nur einen
leichten Effekt zeigte. Detaillierte Studien
zeigten, dass die reaktive Spezies, die hauptsächlich
durch die ALDH­2 gebildet wird,
vermutlich Peroxynitrit ist, das unter anderem
für die Entkopplung der endothelialen
NO­Synthase und damit für die endotheliale
Dysfunktion verantwortlich gemacht
wird.
Schlüsselwörter: Organische Nitrate – Bioaktivierung
– Superoxid – Peroxynitrit –
mitochondriale Aldehyddehydrogenase –
mitochondrialer oxidativer Stress – vaskuläre
Funktion
rung der löslichen Guanylatzyklase (sGC)
und Erhöhung der cGMP­Spiegel zu einer
Verringerung des peripheren Gefäßwiderstandes
führt. Nitroglyzerin (Glyzerintrinitrat,
GTN) wird seit über 100 Jahren aufgrund
seiner potenten antiischämischen
Eigenschaften erfolgreich zur Behandlung
der Anginasymptome eingesetzt [1]. Im
Jahr 1888 wurde von Stewart und Mitarbeitern
erstmals das Phänomen der Nitrattoleranz
beschrieben, das sich in einer
Wirkungsabschwächung des organischen
Nitrats bei Patienten nach einer Dauertherapie
äußerte [2].
Die Entwicklung der Nitrattoleranz
stellt eine maßgebliche therapeutische Li­
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

mitierung der organischen Nitrate dar, die
bei der chronischen Anwendung dieser
Substanzen auftritt. Eine Übersicht bieten
[3] und [4]. Die Mechanismen, die der
Nitrattoleranz zugrunde liegen, sind nur
unzulänglich aufgeklärt und involvieren
eine Vielzahl verschiedener Faktoren.
Für die nitroglyzerininduzierte Toleranz
scheint ein Mechanismus auf der verringerten
Bioaktivierung des organischen Nitrats
zu beruhen [5]. Andere Mechanismen beinhalten
vermutlich neurohumorale Adaptionen
wie z. B. Erhöhung des Plasmavolumens
[6], Aktivierung des Renin­
Angiotensin­Aldosteron­Systems [7] und
gesteigerte Plasmaspiegel von Vasopressin
und Katecholaminen [8]. Die extravaskulären
Effekte dienen der Kompensation
der vasodilatierenden Wirkung von Nitroglyzerin
und der kardialen Vorlastsenkung
durch diese Substanzen. Ein Phänomen,
das mit der nitroglyzerininduzierten Toleranz
assoziiert ist, stellt die Kreuztoleranz
gegenüber anderen Nitrovasodilatatoren,
aber auch endothelabhängigen Vasodilatatoren
(= endotheliale Dysfunktion) dar.
Dies wurde vor allem dann beobachtet,
wenn Nitroglyzerin chronisch in vivo verabreicht
wurde [9, 10], und wird in der Regel
nicht beobachtet, wenn eine Toleranz
(Tachyphylaxie) durch kurzzeitige Bolusinkubation
mit Nitroglyzerin in vitro induziert
wird [11]. Diese letzteren experimentellen
Bedingungen können kritisiert werden,
da sie meist auf suprapharmakologischen
Konzentrationen des Wirkstoffs
beruhen und nicht die chronische Behandlung
in der Klinik widerspiegeln. Die
Kreuztoleranz zu anderen Vasodilatatoren
könnte zum Teil auf Änderungen in der
Aktivität der löslichen Guanylatzyklase
beruhen, die das Zielmolekül für die vasodilatierende
Wirkung von NO darstellt.
Daneben könnten Aktivitätsunterschiede
der cGMP abbauenden Phosphodiesterasen
zur Kreuztoleranz beitragen [9, 10]. Die
Prozesse, die zur Nitrattoleranz und endothelialen
Dysfunktion führen, sind in einem
Übersichtsartikel dargestellt [12].
2. Antioxidative Effekte von
Pentaerithrityltetranitrat (PETN) –
chronische Behandlung
Über die chronische PETN­Behandlung ist
bekannt, dass sie keine Entkopplung der
mitochondrialen Atmungskette bewirkt
[13, 14], keine oder kaum vaskuläre
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
NADPH­Oxidasen aktiviert [15–17] und
langfristig Schutzmechanismen in Form der
Hämoxygenase­1 und Ferritin stimuliert
[14, 18, 19]. Dies hat zur Folge, dass es nicht
zu einer messbaren Freisetzung reaktiver
Sauerstoffspezies [13, 14] oder zu einer Inaktivierung
der mitochondrialen Aldehyddehydrogenase
(ALDH­2) kommt [13, 14],
was zur Vermeidung einer Nitrattoleranz
beiträgt [13, 14]. Daneben induziert die
chronische PETN­Therapie keine endotheliale
Dysfunktion [13, 14], wie sie bei Patienten
mit Bluthochdruck, Atherosklerose
oder schwerem Diabetes beobachtet wird
[12, 20].
Zur PETN­vermittelten toleranzfreien
Therapie, die keinen oxidativen Stress induziert,
gibt es bereits eine Vielzahl klinischer
Studien. Eine Studie aus Kanada zeigte,
dass die PETN­Therapie durch keinen Wirkungsverlust
und fehlende Ausbildung von
oxidativen Stressmarkern (Isoprostane) gekennzeichnet
ist [21]. Vielleicht klinisch und
prognostisch von weit größerem Interesse
zeigte die PETN­Therapie in Probanden
keine Induktion einer endothelialen Dysfunktion
(Abb. 1) [22]. In einer weiteren aus
Kanada stammenden Studie konnte gezeigt
werden, dass die mittels Plethysmografie
gemessene acetylcholininduzierte (sprich
endothelabhängige) Steigerung des Unter­
Blutfluss im Unterarm
(Verhältnis zwischen infundiertem und
nicht infundiertem Arm)
5
4
3
2
1
0
NaCI
p < 0,05
7,5
15
Acetylcholin
Organische Nitrate
PETN
(240 mg/d über sechs Tage)
30 µg/min
GTN
(0,6 mg/h
über
sechs Tage)
Abb. 1: Basaler Unterarm�Blutfluss und Acetylcholin�(ACh�)Antworten nach stei�
gender ACh�Infusionsdosis gemessen mit der Unterarm�Plethysmografie. Diese
Messmethode kann als Indikator für die Endothelfunktion angesehen werden, und
eine abgeschwächte ACh�Antwort bzw. paradoxe Vasokonstriktion zeigen eine
endotheliale Dysfunktion an. Die ACh�Antworten waren in der PETN�behandelten
Gruppe deutlich ausgeprägter. Der Blutfluss ist als Verhältnis zwischen infundiertem
und nicht infundiertem Arm dargestellt (GTN [hellblau] und PETN [blau]).
25
Nach Gori et al [22]

Nach Wenzel et al [30]
Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
B
Abnahme der
Nitratbioaktivierung [%]
0
–10
–20
–30
A
*
ALDH-Aktivität
[µM 2H3N-BA/mg Protein]
800
#
GTN GTN/LA PETN
0
armblutflusses durch eine chronische GTN­
Behandlung abgeschwächt wurde, wohingegen
die langfristige PETN­Therapie keinen
signifikanten Effekt auf diesen Parameter
zeigte. Dies ist von besonders
großem Stellenwert, da neben GTN auch
andere Nitrate (ISDN und ISMN) unter
chronischer Therapie im Patienten/Probanden
eine endotheliale Dysfunktion induzierten
[23, 24]. Eine präklinische Studie
aus der Gruppe um E. Bassenge zeigte sehr
eindrucksvoll, dass GTN in chronisch instrumentierten
Hunden eine Toleranz induzierte,
die durch hoch dosierte Vitamin­C­
Co­Administration komplett und durch
ASS teilweise aufgehoben wurde [16]. Dagegen
zeigte PETN über den gesamten
Verlauf der fünftägigen Behandlung keinerlei
Anzeichen für eine Toleranz.
In einer weiteren tierexperimentellen
Studie zeigte PETN und sein Trinitrat
PETriN, nicht aber ISDN, einen protektiven
Effekt auf die endothelialen Progenitorzellen
(EPC) in einem Infarktmodell [25]. Dabei
steigerte PETN nicht nur die Zahl der
EPCs, sondern verbesserte auch deren
Funktion (Migrationsfähigkeit). Für GTN
wurde ein negativer Effekt auf die EPCs beschrieben
[26]. In einer derzeit im Druck
befindlichen Studie aus unserem Arbeitskreis
konnte gezeigt werden, dass PETN die
durch Angiotensin­II­Behandlung indu­
0000 000000 0 00000 0 00 00
*
Kontrolle GTN GTN/LA PETN
C D
#
80
10
60
Abnahme der antioxidativen
Kapazität des Serums [%]
0000 0 0 00000 0
zierte endotheliale (ACh) und glattmuskuläre
(GTN) Dysfunktion im Rattenmodell
partiell aufheben konnte [26a]. Ähnliche
Beobachtungen wurden bezüglich der Wirkung
von PETN, nicht aber von ISMN, in
einem experimentellen Diabetesmodell gemacht.
Dies wäre der erste Befund, dass ein
organisches Nitrat die Endothelfunktion
positiv beeinflusst und damit zu einer Verbesserung
der Prognose beitragen könnte.
Am Patienten wurde diese Hypothese am
Klinikum der Universität Mainz im Rahmen
der PENTA­Studie verifiziert [26b]. Dagegen
zeigte die Co­Therapie mit ISMN keine
Verbesserung, sondern eher eine Verschlechterung
der Angiotensin­II­induzierten
vaskulären Dysfunktion (nicht gezeigt)
[26a]. Aufgrund der Tragweite dieser
Befunde müssen diese Daten im Diabetes­
Modell erst durch eine Erhöhung der untersuchten
Tierzahlen bestätigt werden. Eine
vor Kurzem veröffentlichte Studie von
Kleinert und Mitarbeitern zeigte eindrucksvoll,
dass die PETN­In­vivo­Therapie bei
Ratten kardioprotektive Gene aktivierte,
wohingegen die Behandlung mit Nitroglyzerin
eher kardiotoxische Gene induzierte
[27]. Aktuell konnten Kojda und Mitarbeiter
zeigen, dass PETN ein essenzielles
Schutzenzym, die Superoxiddismutase
(SOD), auf Proteinebene hochreguliert
und so nachhaltig zum Abbau toxischer re­
Abb. 2: Effekt einer einmaligen oralen Gabe von Nitroglyzerin (GTN), Nitroglyzerin und Liponsäure (LA)
sowie Pentaerithrityltetranitrat (PETN) auf die ALDH�2�Aktivität in weißen Blutzellen (A), die Nitrat�
bioaktivierungskapazität (B), die antioxidative Kapazität des Serums (C) und die Thromboxanspiegel
im Serum (D).
–10
–30
26 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
0 00000 0
#
#
GTN GTN/LA PETN
0 0 00000 0000 0 0 0
Zunahme des
Serumthromboxans [%]
40
20
0
#
*
#
GTN GTN/LA PETN

A 5,5
p = 0,427
B
C
Durchmesser der
A. brachialis [mm]
Veränderung des
Blutdrucks [mmHg]
oder Veränderung der
Herzfrequenz [bpm]
5
4,5
4
3,5
10
5
0
–5
–10
–15
aktiver Sauerstoffspezies beiträgt [28]. Ähnliche
Befunde bzgl. der PETN­Therapie und
SOD­Expression wurden in einer aktuellen
Studie in spontan hypertensiven Ratten gemacht
[29]. Die Befunde unterstreichen mit
Nachdruck die Sonderstellung von PETN
unter den organischen Nitraten.
3. Antioxidative Effekte von PETN –
akute Gabe
Basal 2h 6h 12h 24h 5min 30min
p = 0,209
Vor Kurzem konnten wir eine Studie abschließen,
deren Hauptergebnis war, dass
die einmalige orale Gabe von GTN im Gegensatz
zu PETN ein Absinken der
ALDH­2­Aktivität in weißen Blutzellen
bewirkt sowie die Thromboxanbildung erhöht,
die Nitratbioaktivierungskapazität
einschränkt und die antioxidative Kapazität
des Serums verringert (Abb. 2) [30].
Wichtig war vor allem, identische hämodynamische
Effekte für beide Nitrate zu gewährleisten.
So führten GTN und PETN 30
bzw. 120 min nach oraler Gabe zu vergleichbaren
Absenkungen des Blutdrucks bzw.
Zunahmen der Herzfrequenz (Abb. 3).
Interessanterweise konnten die negativen
Effekte der GTN­Verabreichung
durch gleichzeitige Behandlung mit Liponsäure,
dem essenziellen Kofaktor der
ALDH­2, aufgehoben werden und PETN
zeigte per se keinerlei negative Wirkungen.
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
*
Nach PETN
Sys Dia HR
PETN
*
*
p = 0,113
p = 0,412
*
*
Nach GTN
Sys Dia HR
Abb. 3: Hämodynamische Effekte einer GTN� bzw. PETN�Gabe, 30 bzw. 120 min nach oraler Verabrei�
chung des Nitrats gemessen anhand der Weitung der Arteria brachialis (Ultraschall�Methode) (A und
B) sowie der Blutdrucksenkung bzw. Herzfrequenzerhöhung (C).
GTN
Diese humanen Daten, die in einer Studie
mit freiwilligen Probanden gewonnen wurden,
konnten in einer experimentellen Studie
in Ratten bestätigt und mechanistisch
vertieft werden. Diese Befunde sind im
Schema in Abbildung 4 zusammengefasst.
Vermutlich basiert das positive Wirkungsprofil
von PETN zumindest teilweise auf
dem langsamen Anfluten bei oraler Verabreichung
[31], da in früheren Studien gezeigt
werden konnte, dass eine Bolusverabreichung
von PETN sowohl intravenös als
auch an isolierten Mitochondrien bzw.
Aorten annähernd ähnlich negative Wirkungen
hervorbrachte wie Nitroglyzerin
[16, 32]. Dies legt nahe, das auch PETN bei
zu hoher Konzentration am Wirkort (was
bei oraler Verabreichung im Rahmen der
klinischen Dosierung nicht vorkommen
kann) eine ähnliche „Überlastung“ des zellulären
antioxidativen Schutzsystems bewirken
kann wie Nitroglyzerin und dadurch
die Induktion von oxidativem Stress und
Inaktivierung des Nitratbioaktivierungswegs
nach sich zieht. Dennoch bleibt auch
unter diesen Bedingungen einer „erzwungenen“
Überdosierung eine partielle Überlegenheit
von PETN erhalten, die nur anhand
der Wechselwirkungen auf molekularer
Ebene erklärt werden können (siehe
dazu die nachfolgenden Kapitel).
Organische Nitrate
Vor GTN Nach GTN
Vor PETN Nach PETN
27
Nach Wenzel et al [30]

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Abb. 4: Charakterisierung der
nitratinduzierten Tachyphyla�
xie anhand verschiedener
Blutparameter (vorgeschla�
gener Mechanismus): Die
einmalige orale Gabe von
Nitroglyzerin (GTN, 0,8 mg)
induziert eine akute Abnahme
der ALDH�2�Aktivität in weißen
Blutzellen, aber auch in Gefäß�
gewebe von Aorten und kardia�
len Mitochondrien. Zusätzlich
wurden im Serum die Throm�
boxanspiegel erhöht und die
antioxidative Kapazität verrin�
gert. Diese Parameter charak�
terisieren die nitroglyzerinin�
duzierte Tachyphylaxie (rote
Stoffwechselwege) und die
negativen Effekte der Nitro�
glyzeringabe konnten nahezu
komplett durch eine Co�The�
rapie mit Liponsäure (600 mg)
aufgehoben werden (blaue
Stoffwechselwege). Im Gegen�
satz zu Nitroglyzerin bewirkte
die einmalige orale Behand�
lung mit PETN (80 mg) weder
eine Abnahme der ALDH�2�
Aktivität noch eine signifikante [30]
al
Zunahme der Thromboxan� et
spiegel oder eine Abnahme der
antioxidativen Kapazität im
Wenzel
Serum (grüne Stoffwechsel�
wege). Nach
4. Wechselwirkung organischer Nitrate
mit isolierter humaner mitochondrialer
Aldehyddehydrogenase (ALDH�2)
Aktuelle Studien belegen, dass die Langzeitanwendung
von Mono­ und Dinitraten
bei Patienten mit koronaren Herzkrankheiten
nicht unproblematisch ist und sogar
schädliche Nebenwirkungen haben könnte
[23, 33]. Obwohl die Mechanismen, die der
Nitrattoleranz zugrunde liegen, multifaktoriell
sind, zeigen aktuelle Studien, dass vor
allem zwei Mechanismen, die Stimulie­
rung vaskulärer reaktiver Sauerstoffspezies
(ROS) und die Inhibition des GTN­bioaktivierenden
Enzyms (ALDH­2), als Hauptursache
für die Nitrattoleranz angesehen werden
können [34, 35]. Die Rolle der ALDH­2
als Marker bzw. Verursacher der Nitrattoleranz
wurde in zwei aktuellen Übersichtsartikeln
ausführlich diskutiert [36–38]. Die bisher
postulierte Umsetzung von Nitroglyzerin
durch die ALDH­2 zu Nitrit und 1,2­Glyzeryldinitrat
als essenziellem Mechanismus für
die nitroglyzerinvermittelte Vasodilatation
ALDH
S S
TxA2
Prot-SH
Antioxidanzien
Nitroglyzerin
Liponsäure
wurde durch Mayer und Mitarbeiter hinterfragt.
In ihrer aktuellen Studie zeigen die
Autoren, dass die nitroglyzerinabhängige
Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase
(sGC) in einem In­vitro­System aus isolierten
Mitochondrien und aufgereinigter sGC
nicht nitritabhängig abläuft [39]. Nitrit induzierte
zwar auch eine Aktivierung der sGC,
konnte aber direkt durch Inhibitoren der
mitochondrialen Atmungskette blockiert
werden, wohingegen die nitroglyzerinabhängige
sGC­Aktivierung durch diese Inhibitoren
nicht unterdrückt wurde. In einer
aktuellen Studie wurde die Bioaktivierung
eines neuartigen organischen Mononitrats
(Aminoethylnitrat) untersucht, das eine
ähnliche Potenz wie Nitroglyzerin zeigt, aber
nicht über die ALDH­2 bioaktiviert wird
[40]. Auch wurde die Bioaktivierung von
Nitroglyzerin durch die Glutathion­S­Transferase
und ALDH­2 verglichen [41].
Im letzten Teil dieses Übersichtsartikels
wird auf die Wechselwirkung zwischen organischen
Nitraten und der isolierten ALDH­2
28 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
PETN
ALDH
HS SH
TxA2
Prot-SH
Antioxidanzien

fokussiert. Wir konnten in älteren Arbeiten
zeigen, dass die ALDH­2 in isolierten Mitochondrien
durch Nitroglyzerin oder mitochondriale
reaktive Sauerstoff­ und Stickstoffspezies
(e.g. Peroxynitrit und Superoxid)
oxidativ inaktiviert wird [42]. Ellman’s Reagenz,
eine Thiol oxidierende Substanz zur
Quantifizierung von Thiolgruppen, bewirkte
eine Inaktivierung des Enzyms – ein Hinweis
auf die Beteiligung von Thiolgruppen am
Katalysezyklus [42]. 2008 wurde erstmals an
gereinigter, isolierter, rekombinanter, humaner
ALDH­2 gezeigt, dass dieses Enzym
eindeutig eine Bioaktivierung von GTN katalysiert
[43]. Die Autoren verwendeten als
Nachweissystem für die direkte Bioaktivierung
von GTN durch die ALDH­2 die gereinigte
lösliche Guanylatzyklase (sGC): Der
durch die ALDH­2 und GTN gebildete Vasodilatator
(NO oder eine NO­ähnliche Spezies)
aktiviert die sGC und damit die Bildung
von cGMP – ein elegantes Testsystem. Hier
wurde auch erstmals gezeigt, dass die gereinigte
zytosolische ALDH­1­Isoform ebenfalls
eine Bioaktivierung von GTN bewirkt,
allerdings ist sie um den Faktor 33 weniger
potent als ALDH­2 (Abb. 5) [43].
B
ALDH2-Aktivität
[µM 2-Hydroxy-3-Nitrobenzolsäure]
80
70
60
50
40
30
20
10
0
+ 0,1 mM LA
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
*
A
A340 [a.u.]
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
Ethanol in vivo GTN in vivo
Aus der gleichen Gruppe wurde vor
Kurzem eine Arbeit publiziert, die zeigte,
dass GTN eine teils irreversible Inaktivierung
des isolierten ALDH­2­Enzyms be­
µmol cGMP × min –1 × mg –1
ALDH
7
6
5
4
3
2
1
0
GTN
ALDH-1
ALDH-2
BSA
DTT
0
0 400 800 1200 1600
Zeit [s]
C 120
100
80
* #
60
*
40
20
0
+ 0,1 mM LA
ALDH2-Aktivität
[%]
Kontrolle + 0
Organische Nitrate
10 –8 10 –7 10 –6 10 –5 10 –4 10 –3
GTN [M]
Abb. 5: Die Nitroglyzerin�(GTN�)Bioaktivierung durch gereinigte, isolierte, rekombi�
nante, humane ALDH�1 (50 µg) und ALDH�2 (25 µg) wurde anhand der Aktivierung
einer im System befindlichen löslichen Guanylatzyklase und der daraus resultie�
renden cGMP�Bildung gemessen. Als negative Kontrolle wurde mit dem Effekt von
bovinem Serumalbumin verglichen.
*
*
+ 100
+ 10 µg/ml AA + LA [µM]
Abb. 6a: Messung der ALDH�2�Dehydrogenase�Aktivität (Umwandlung Acetaldehyd) im isolierten Enzym mittels NADH�Bildung bei 340
nm. Nach Beretta et al [44].
Abb. 6b: Messung der ALDH�2�Aktivität in isolierten Mitochondrien mittels HPLC�basierter Methode nach Placebo (Ethanol) bzw. Nitro�
glycerin�(GTN�)In�vivo�Behandlung und Wiederherstellung der ALDH�2�Aktivität durch 100 µM reduzierte Liponsäure (LA). Nach Wenzel et
al [42].
Abb. 6c: Inaktivierung der ALDH�2 in isolierten Mitochondrien durch Ex�vivo�Behandlung mit Antimycin A (AA) und partielle Wiederher�
stellung durch reduzierte Liponsäure (LA). Nach Wenzel et al [42].
29
Nach Beretta et al. [45]

NachWenzel et al [42].
Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Reduktase
NADPH
Oxidierte Liponsäure
S
R
R
Reduzierte Liponsäure
S
ROS
wirkt [44]: Wenn die Umwandlung von
Acetaldehyd anhand der NADH­Bildung
gemessen und GTN zugesetzt wird, so
kommt die Dehydrogenaseaktivität zum Erliegen
(Abb. 6a). Nach Zugabe des
Dithiol­Reagenz (DTT) kommt es zu einer
Reaktivierung (rescue), die allerdings weit
hinter der Aktivität vor der GTN­Gabe zurückbleibt.
Das heißt, dass es eine irreversible
Inaktivierung geben muss. Wir konnten
bereits 2007 zeigen, dass die GTN­
In­ vivo­Behandlung zu einer teils irreversiblen
Inaktivierung der ALDH­2 in
Mitochondrien führt, die nur bedingt durch
die Zugabe von reduzierter Liponsäure wiederhergestellt
werden konnte (Abb. 6b).
Auch Antimycin­A­induzierter oxidativer
Stress bewirkte eine teils irreversible Inaktivierung
der ALDH­2 in isolierten Mito­
R
Gemischtes
Disulfid
S
H
S S
ALDH-2
ALDH-2
chondrien, die durch reduzierte Liponsäure
nicht zurückgeführt werden konnte (Abb.
6c). Das Konzept des durch Liponsäure vermittelten
Schutzes konnten wir auch in einer
Humanstudie verifizieren [30]. Basierend auf
diesen Befunden postulierten wir die Redoxregulation
der ALDH­2 durch GTN und
reaktive Sauerstoff­ und Stickstoffspezies
(RONS) sowie eine irreversible Inhibition
durch Bildung einer Sulfonsäuregruppe
durch oxidierende Spezies (Abb. 7).
Aktuellen Befunden zufolge bildet das
isolierte Enzym selbst freie Radikale, die
besonders gehäuft entstehen, wenn GTN
anwesend ist [45]. Für diese Radikalproduktion
spielt eine Konformationsänderung
durch die Bindung von NAD + eine wesentliche
Rolle, da durch eine Änderung der
Bindungsaffinität von NAD + mittels Muta­
Intermediäres
Thionitrat
Weitere
Bioaktivierung
Relaxation
30 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
ROS
S S
ALDH-2
SO3H
ALDH-2
GTN
O–NO2
O–NO2
NAD +
ALDH-2
NO2
NOx
cGMP
cGK-I
O–NO2
O–NO2
O–H
1,2 GDN
Abb. 7: Nach unseren und anderen Daten postulieren wir die folgende Sequenz von Ereignissen für den Metabolismus organischer
Nitrate durch die ALDH�2: Zwei benachbarte Cystein�Thiol�Gruppen sind essenziell für die Nitratbioaktivierung. In einem ersten Schritt
wird eine dieser Thiolgruppen den Stickstoff des sterisch am besten zugänglichen (und am stärksten aktivierten) Salpetersäureesters
nukleophil angreifen und dabei ein Thionitrat�Intermediat bilden sowie den denitrierten Metaboliten (1,2�GDN). Durch Angriff des
zweiten Thiols an diesem Thionitrat wird eine Disulfidbrücke und Nitrit als die Abgangsgruppe gebildet. Das Disulfid kann auch durch
direkte Oxidation der Thiole durch reaktive Sauerstoff� oder Stickstoffspezies entstehen. Dabei könnten sogar höhere Oxidationen zur
Sulfonsäure (–SO3H) auftreten und eine irreversible Hemmung der ALDH�2 bewirken. Die Wiederherstellung der enzymatischen Aktivi�
tät involviert die Dithiol�Verbindung Dihydroliponsäure, die in Mitochondrien vorkommt und initial ein gemischtes Disulfid bildet.
Nach intramolekularem nukleophilem Angriff dissoziiert dieses gemischte Disulfid zu oxidierter Liponsäure und reaktivierter (redu�
zierter) ALDH�2. Die oxidierte Liponsäure wird durch spezielle Lipoamidreduktasen in Mitochondrien bzw. Glutathionreduktasen im
Zytosol reduziert. Auch dieser letzte Schritt kann Angriffspunkt für eine oxidative Schädigung in der Nitrattoleranz sein. Das anorga�
nische Nitrit, das während des katalytischen Zyklus gebildet wurde, benötigt eine weitere Bioaktivierung, um eine vasodilatierende
Spezies hervorzubringen. Eventuell findet am isolierten Enzym auch direkt eine NO�Freisetzung statt.

Nach Daiber et al. In Vorbereitung
Relative ALDH-2-Aktivität
17,5
15,0
12,5
10,0
7,5
5,0
2,5
0
0 0,033 0,1 0,33 1 10 100
Organische Nitrate [µM]
tion einer Glutaminsäure in der NAD +
Bindungstasche (E268Q) deutlich weniger
Radikale gebildet werden, ohne dass die
Nitratreduktase­Aktivität merklich verändert
wird [45]. So konnte im Wildtypenzym
erst eine NO­Produktion in Anwesenheit
von GTN gemessen werden, wenn Superoxiddismutase
(SOD) zugegeben wurde
(ein Anzeichen für Abbau des NO durch
Superoxid). Dagegen zeigte die E268Q­
Mutante bereits ohne SOD eine messbare
NO­Produktion, die durch SOD­Zugabe
weiter gesteigert wurde. Die Dehydrogenase­
und Esteraseaktivität der ALDH­2 sind
in der E268Q­Mutante nahezu abwesend,
wohingegen die basale Nitratreduktase­
Aktivität kaum verändert wird. Lediglich
die etwa siebenfache Steigerung durch
NAD + im Wildtypenzym entfällt in der
E268Q­Mutante aufgrund der geänderten
NAD + ­Affinität [45]. Die Ersetzung einer
Cysteingruppe im aktiven Zentrum durch
eine Seringruppe (C302S) führte dagegen
zum Verlust von allen drei enzymatischen
Aktivitäten und einem Verlust der
1,2­GDN­ und NO­Bildung aus GTN [45].
Die weitverbreitete ostasiatische Variante
der ALDH­2 (ALDH­2*2) mit der Punktmutation
E487K zeigt eine ähnliche Änderung
der NAD + ­Bindungsaffinität wie die
E268Q­Mutante [46]. Daneben zeigt die
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
GTN
PETN
Abb. 8: Bestimmung der ALDH�2�Dehydrogenase�Aktivität mittels
HPLC�basierter Messung der Umwandlung von 2�Hydroxy�3�Nitro�
benzaldehyd zum Benzoesäureprodukt. Die Inaktivierung durch stei�
gende GTN�Konzentrationen ist deutlich effektiver als die durch PETN.
RONS-Bildung mittels L-012 ECL [RLU]
2,5 × 10 5
2,0 × 10 5
1,5 × 10 5
1,0 × 10 5
0,5 × 10 5
0 × 10 5
GTN
PETN
ALDH­2*2­Variante eine deutlich verringerte
Dehydrogenase­ und Esteraseaktivität
[46] sowie eine abgeschwächte
GTN­Bioaktivierung [47]. Damit geht eine
geringere vasodilatatorische Potenz des
GTN in asiatischen Probanden mit dieser
ALDH­2­Modifikation bzw. gesunden
Freiwilligen nach Behandlung mit dem
ALDH­Inhibitor Disulfiram einher [48]. In
einer gerade publizierten Arbeit konnte
gezeigt werden, dass die isolierte, gereinigte
ALDH­2*2­Variante eine deutlich geringere
Dehydrogenase­, Esterase­ sowie
Nitratreduktaseaktivität im Vergleich zum
Wildtypenzym (ALDH­2*1) aufweist [49].
Dementsprechend führte die ALDH­2*2­
Variante auch mit GTN zu einer deutlich
abgeschwächten 1,2­GDN­ Bildung, NO­
Freisetzung und sGC­Aktivierung. Interessanterweise
bewirkte der kürzlich beschriebene
ALDH­Aktivator Alda­1 [50] nur
eine marginale Steigerung der Dehydrogenase­Aktivität
im Wildtypenzym, wohingegen
die Dehydroge­nase­Aktivität in der
ALDH­2*2­Variante um einen Faktor 4
gesteigert wurde [49]. Der Effekt von Alda­1
auf die Esteraseaktivität war im
ALDH­2*1­Enzym moderat, aber die Esterase­Aktivität
der ALDH­2*2­Variante
wurde achtfach erhöht. Alda­1 hatte lei­
Organische Nitrate
0 0,01 0,1 1 10
Organische Nitrate [µM]
Abb. 9: Die RONS�Produktion aus isolierter ALDH�2 und GTN
bzw. PETN wurde anhand der L�012�Chemilumineszenz gemessen.
Die RONS�Bildung mit PETN ist deutlich geringer als mit GTN.
31
Nach Daiber et al. In Vorbereitung

Nach Wenzel et al [52]
Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Relative RONS-Bildung mittels L-012 ECL [%]
500
400
300
200
100
0
WT = Wildtyp
WT EtOH -/- EtOH WT GTN
(10 µg/h)
*
-/- GTN
(10 µg/h)
WT GTN
(50 µg/h)
-/- GTN
(50 µg/h)
der keinen steigernden Effekt auf die
GTN­Bioaktivierung und daraus resultierende
sGC­Aktivierung und kann daher
offensichtlich nicht in Kombination mit
GTN verwendet werden, um dessen vasodilatatorische
Potenz zu steigern.
In einer gerade abgeschlossenen Studie
aus unserem Labor konnten wir an der isolierten
ALDH­2 zeigen, dass diese sehr effizient
durch GTN, aber deutlich geringer
durch PETN inhibiert wird (Abb. 8). Dieser
Befund könnte neben der Induktion der
Hämoxygenase­1 durch PETN unter chronischer
Therapie [14, 18, 19] und dem kontrollierten
Anfluten mit schonender Aufnahme
bei oraler Gabe [30, 31] eine weitere
Erklärung für die protektiven Effekte von
PETN darstellen. Wenn PETN wirklich
sein Bioaktivierungssystem, die ALDH­2,
intakt lässt, könnte dies die fehlende Toleranzentwicklung
durch PETN erklären.
Wie erwartet war auch die RONS­Bildung
durch die ALDH­2 im Beisein von PETN
deutlich geringer als mit GTN (Abb. 9).
Basierend auf diesen Befunden stellt
sich die Frage, ob die ALDH­2 selbst in der
GTN­induzierten Nitrattoleranz eine signifikante
RONS­Quelle darstellen könnte,
wie von Mayer und Mitarbeitern spekuliert
wird [45]. Dieser Schlussfolgerung widersprechen
zahlreiche ältere Befunde aus
unserem Arbeitskreis. So konnte in Koo­
WT GTN
(100 µg/h)
-/- GTN
(100 µg/h)
WT GTN
(100 µg/h)
Rotenone
-/- GTN
(100 µg/h)
Rotenone
Abb. 10: Messung der mitochondrialen RONS�Bildung in isolierten Mitochondrien von Wildtyp�(WT�) und ALDH�2�Knock�out�Mäusen (�/�)
nach GTN�In�vivo�Behandlung mittels L�012�Chemilumineszenz.
peration mit Szöcs et al. gezeigt werden,
dass die ALDH eher als Radikalfänger
fungiert, den oxidativen Abbau von NO
verhindert und im zellulären System die
Hemmung der ALDH durch Benomyl
einen Anstieg der RONS bewirkt [51]. In
einer nachfolgenden Studie konnten wir
zeigen, dass die In­vivo­Behandlung mit
GTN in ALDH­2­Knock­out­Mäusen zu
höheren RONS­Bildungsraten führt, d.h.
die Wegnahme der ALDH­2 führte zu
einer verringerten antioxidativen Kapazität
und zur vermehrten GTN­induzierten
RONS­Bildung (Abb. 10) [52]. Auch die
akute Verabreichung von GTN zeigte eher
keine signifikanten Unterschiede in Wildtyp­
versus ALDH­2­Knock­out­Tieren
(Abb. 11) [40]. Zusammen mit dem Befund,
dass die ALDH­2 ein wichtiges antioxidatives
Schutzenzym beim Alterungsprozess
darstellt [53] und dass seine pharmakologische
Inhibition die RONS­Produktion
nach Inkubation isolierter Mitochondrien
mit GTN eher erhöhte als verringerte
[54], spricht gegen eine essenzielle
Rolle der ALDH­2 als Quelle für oxidativen
Stress in der Nitrattoleranz und anderen
Komplikationen. Demnach handelt es
sich vermutlich bei der RONS­Bildung
durch die isolierte ALDH­2 eher um ein
Artefakt aufgrund eines fehlenden
Co­Faktors, Schutzsystems etc. Die unter­
32 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
*
*
*

L-012-Chemilumineszenz [min]
1,2 × 10 5
0,8 × 10 5
0,4 × 10 5
0 × 10 5
WT = Wildtyp
B6 WT
schiedliche Wirkung von GTN und PETN
ist jedoch hochinteressant und wird vermutlich
demnächst durch Mayer und Mitarbeiter
aufgeklärt, die eine Konformationsänderung
im Enzym für das unterschiedliche
Verhalten von GTN und PETN
hinsichtlich der Inaktivierung und RONS­
Bildung verantwortlich machen. n
Summary
The hemodynamic and anti­ischemic effects
of nitroglycerin (GTN) are blunted due to
the rapid development of a nitrate tolerance.
Recent studies could identify new tolerance
mechanisms such as the inhibition of the
nitrate­bioactivating enzyme, the mitochondrial
aldehyde dehydrogenase (AL­
DH­2) as well as the formation of mitochondrial
reactive oxygen and nitrogen species
(RONS) leading to inhibition of GTN
bioactivation. Based on these findings there
is a direct link between nitrate­induced oxidative
stress and the concept of desensitization
(inhibition) of the nitrate bioactivation
at the level of ALDH­2. Recent animal studies
suggest that reduced lipoic acid prevents
oxidative inactivation of ALDH­2 and that
pentaerithrityl tetranitrate (Pentalong ® ,
PETN) is devoid of nitrate tolerance induction
due to intrinsic antioxidant properties
(e.g. induction of heme oxygenase­1 and ferritin).
The fact that PETN prevents ALDH­2
inhibition is even more important since besides
GTN also PETN and its trinitrate metabolite
PETriN is bioactivated by ALDH­2.
A just completed study from our laboratory
showed that PETN, in comparison with
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
*
GTN – ALDH -/- GTN
Abb. 11: Messung der mitochondrialen RONS�Bildung in isolierten Mitochondrien von Wildtyp� und
ALDH�2�knockout�Mäusen nach GTN�Inkubation mittels L�012�Chemilumineszenz.
GTN, also acts qualitatively different with
the purified human ALDH­2. Interestingly,
GTN caused a severe concentration­dependent
inactivation of the ALDH­2 activity
and an increase in RONS formation (directly
formed by ALDH­2), whereas PETN only
showed a moderate effect on these parameters.
Detailed studies revealed that the reactive
species formed by ALDH­2 in the presence
of GTN is most probably identical to
peroxynitrite, which is responsible for uncoupling
of endothelial NO synthase and
subsequent endothelial dysfunction.
Keywords: organic nitrates – bioactivation;
superoxide – peroxynitrite – mitochondrial
aldehyde dehydrogenase – mitochondrial
oxidative stress – vascular function
Danksagung
Wir danken der Johannes Gutenberg­
Universität für die finanzielle Unterstützung
durch MAIFOR und Förderfonds
Beihilfen (A.D.) und der Actavis Deutschland
GmbH für ihre fortwährende Unterstützung
(A.D.).
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52. Wenzel P, Muller J, Zurmeyer S, Schuhmacher
S, Schulz E, Oelze M, Pautz A, Kawamoto T,
Wojnowski L, Kleinert H, Munzel T, Daiber A.
ALDH�2 deficiency increases cardiovascular
oxidative stress – evidence for indirect anti�
oxidative properties. Biochem Biophys Res
Commun 2008;367(1):137–143
53. Wenzel P, Schuhmacher S, Kienhofer J, Muller
J, Hortmann M, Oelze M, Schulz E, Treiber N,
Kawamoto T, Scharffetter�Kochanek K, Mun�
zel T, Burkle A, Bachschmid MM, Daiber A.
Manganese superoxide dismutase and alde�
hyde dehydrogenase deficiency increase mi�
tochondrial oxidative stress and aggravate
age�dependent vascular dysfunction. Cardi�
ovasc Res 2008;80(2):280–289
54. Gori T, Daiber A, Di Stolfo G, Sicuro S, Dragoni
S, Lisi M, Munzel T, Forconi S, Parker JD. Ni�
troglycerine causes mitochondrial reactive
oxygen species production: in vitro mechani�
stic insights. Can J Cardiol 2007;23(12):
990–992
Für die Verfasser:
Prof. Dr. Andreas Daiber
Universitätsmedizin der Johannes
Gutenberg�Universität Mainz
II. Medizinische Klinik – Labor für Moleku�
lare Kardiologie
Obere Zahlbacher Str. 63
55101 Mainz, Germany
Tel.: +49 (0)6131 17 9722
Fax: +49 (0)6131 17 9723
E�Mail: daiber@uni�mainz.de
35

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
1 Universitätsmedizin der
Johannes Gutenberg-
Universität, II. Med. Klinik
und Poliklinik, Molekulare
Kardiologie, Mainz
2 Actavis Deutschland GmbH,
Langenfeld
36
Vergleich der Wirkungen von PETN, ISMN
und ISDN im experimentellen Diabetes
mellitus Typ 1 und in der arteriellen Hypertonie
Matthias Oelze 1 , Swenja Schuhmacher 1 , Maike Knorr 1 , Christian Otto 1 , Tjebo Heeren 1 ,
Jens Kamuf 1 , Philip Wenzel 1 , Dirk Stalleicken 2 , Thomas Münzel 1 und Andreas Daiber 1
Zusammenfassung: Vorangegangene Studien
haben gezeigt, dass eine chronische
Behandlung mit Pentaerythrityltetranitrat
(PETN) im Gegensatz zu anderen organischen
Nitraten keine Nitrattoleranz als
auch Cross-Toleranz induziert. Dies ist in
erster Linie auf die Aktivierung von antioxidativen
Mechanismen wie Hämoxygenase-1
(HO-1) und Ferritin zurückzuführen.
In der aktuellen Studie wurden die Effekte
einer Co-Therapie mit PETN im Vergleich
zu Isosorbid-5-mononitrat (ISMN) im
Krankheitsbild der Angiotensin-II-(AT-
II-)induzierten Hypertonie und in spontan
hypertensiven Ratten (SHR) untersucht.
Des Weiteren wurden die Eigenschaften
von PETN in einer Co-Behandlung auf die
Auswirkungen eines durch Streptozotocin
(STZ) induzierten Diabetes mellitus Typ 1
untersucht und mit einer Isosorbiddinitrat-
(ISDN-) und Isosorbid-5-mononitrat-
(ISMN-)Co-Behandlung verglichen. Eine
Hypertonie wurde im Rattenmodell zum
einen pharmakologisch über die Behandlung
mit AT-II und zum anderen genetisch
durch Verwendung von SHR erhalten.
PETN oder ISMN wurde in diesen Tiermodellen
für sieben Tage subkutan verabreicht.
Diabetes wurde in männlichen Wistar-Ratten
über eine einmalige i.v. Injektion
STZ (60 mg/kg) induziert. PETN,
ISDN bzw. ISMN wurden ab dem siebten
Tag nach der STZ-Injektion verabreicht.
Nach acht Wochen wurden die Tiere untersucht
und Diabetes anhand eines drei- bis
vierfachen Anstiegs des Blutzuckerspiegels
und einer dramatisch reduzierten Gewichtszunahme
diagnostiziert. Zusätzlich wurde
ein kleines Kollektiv von STZ-Ratten mit
Insulin co-behandelt. Die Gefäßfunktion
wurde über isometrische Spannungsmessungen
und reaktive Sauerstoffspezies über
Chemilumineszenz, HPLC und/oder Dihydroethidin-Fluoreszenzmikroskopiede-
tektiert. Western Blotting und RT-PCR-
Analysen wurden zur Messung von Protein-
und mRNA-Expression verwendet.
Wie erwartet zeigte sich bei hypertensiven
Ratten in isometrischen Spannungsmessungen
eine ausgeprägte endotheliale und
glattmuskuläre Dysfunktion, die mit der
Ausbildung von oxidativem Stress in Aorta,
Herz-Membranfraktion und Mitochondrien
verknüpft war. Im Gegensatz zu ISMN
zeigte eine Co-Behandlung mit PETN für
alle Messparameter eine Verbesserung, was
vermutlich durch eine Induktion der antioxidativ
wirksamen HO-1- und Tetrahydrobiopterin
synthetisierenden Enzymen
wie GTP-Cyclohydrolase und Dihydrofolat-Reduktase,
welche einer Entkopplung
der NO-Synthase entgegenwirken, ausgelöst
wird.
Im Tiermodell des STZ-induzierten Diabetes
mellitus verbesserte PETN alle gemessenen
Parameter effizienter als ISDN mit
Ausnahme der Endothel- und Gefäßmuskelfunktion,
bei der beide Nitrate gleich
positive Eigenschaften aufzeigten. Im Gegensatz
dazu hatte ISMN keine protektiven
Effekte.
Eine Insulinbehandlung normalisierte alle
gemessenen Parameter vollständig und
schließt damit unspezifisch toxische Nebenwirkungen
von STZ aus. Es zeigte sich in
dieser Studie zum ersten Mal, dass ein organisches
Nitrat bei chronischer Verabreichung
in verschiedenen Tiermodellen mit
kardiovaskulären Beeinträchtigungen einer
endothelialen Dysfunktion und oxidativem
Stress entgegenwirkt.
Diese durchweg positiven tierexperimentellen
Befunde weisen darauf hin, dass auch
Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen
(vor allem koronarer Herzkrankheit) von
einer Medikation mit PETN (für die antiischämische
Therapie) profitieren könnten,
indem die endotheliale Dysfunktion verbessert
wird und so die Progression einer Arte-
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

iosklerose verlangsamt werden könnte. Die
kommenden großen klinischen PETN-Studien
werden zeigen, ob die durchweg positiven
Befunde vom Tiermodell in die Klinik
übertragen werden können.
Hintergrund
Eine arterielle Hypertonie ist assoziiert mit
einer Aktivierung des zirkulierenden und
lokalen Renin-Angiotensin-Systems und
gesteigertem oxidativem Stress in den Gefäßwänden
[1, 2]. Eine Behandlung mit Angiotensin-II
(AT-II) induziert eine endotheliale
Dysfunktion, die vornehmlich
durch einen Anstieg reaktiver Sauerstoffspezies
(ROS) ausgelöst wird [3, 4]. Hierfür
bekannte ROS-Quellen sind die NADPH-
Oxidasen [3], eine entkoppelte endotheliale
NO-Synthase (eNOS) [4] als auch eine
mitochondriale Superoxidproduktion [5].
Die Rolle der NADPH-Oxidasen als ausschlaggebende
Superoxid-Quellen konnte
in Experimenten gezeigt werden, in denen
bei einer AT-II-induzierten Hypertonie
zum einen eine Nox1-Überexpression die
negativen Effekte steigerte [6] und zum anderen
durch eine Nox1-Defizienz der Blutdruck
gesenkt wurde [7]. Interessanterweise
sind eine gesteigerte vaskuläre ROS-
Produktion und eine endotheliale Dysfunktion
mit einem Anstieg der eNOS-Expression
verbunden, wobei allerdings die NO-
Produktion reduziert ist [8]. Dieses Phänomen
scheint zumindest teilweise auf einer
verstärkten Aktivierung der Proteinkinase
C (PKC) zu beruhen, da die Inhibition einer
gesteigerten vaskulären PKC-Aktivität
partiell die Superoxidproduktion reduziert
und die NO/cGMP-Signaltransduktion verbessert
[4]. Vorangegangene Studien konnten
zeigen, dass kardiovaskuläre Komplikationen
bei Diabetes mellitus ebenfalls mit
der Ausbildung von oxidativem Stress verknüpft
sind. Unsere Arbeitsgruppe konnte
kürzlich in einem tierexperimentellen Modell
für Diabetes mellitus demonstrieren,
dass eine pharmakologische Intervention
mit einem Statin oder einem AT1-Rezeptorblocker
eine vaskuläre Dysfunktion und
die Ausbildung von oxidativem Stress unterdrückt
[9, 10]. Ferner konnte eine verringerte
Expression von Tetrahydrobiopterin
(BH4) synthetisierenden Enzymen, GTP-
Cyclohydrolase (GCH-I) und Dihydro-
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Schlüsselwörter: Angiotensin-II – Diabetes
mellitus – oxidativer Stress, endotheliale
Dysfunktion – Isosorbid-5-mononitrat –
Isosorbiddinitrat – Pentaerythrityltetranitrat
– Insulin
folat-Reduktase (DHFR) als ein Schlüsselereignis
für die Entstehung einer endothelialen
Dysfunktion mit entkoppelter eNOS
identifiziert werden [8].
Organische Nitrate wirken als endothelunabhängige
Vasodilatatoren auf das Gefäßsystem.
Nitroglyzerin (Glyceroltrinitrat,
GTN) ist eines der am meisten benutzten
antiischämischen Medikamente seit mehr
als hundert Jahren. Organische Nitrate eignen
sich hervorragend zur akuten Behandlung
verschiedenster kardiovaskulärer Erkrankungen
wie des akuten Koronarsyndroms,
der stabilen koronaren Herzerkrankung
sowie der akuten und chronischen
Herzinsuffizienz. Trotz nachweislich guter
antiischämischer Wirkung bei akuter Gabe
ist die chronische Therapie mit organischen
Nitraten durch zwei Nebenwirkungen limitiert:
die Entwicklung einer Nitrattoleranz
und die endotheliale Dysfunktion. Neuere
Daten zeigen, dass dem eine GTN-induzierte,
gesteigerte ROS-Produktion zugrunde
liegt, da sich diese Phänomene
durch den Einsatz von Antioxidanzien unterdrücken
ließen [11, 12]. Eine chronische
Behandlung mit Mono- und Dinitraten
führt ebenfalls zur Ausbildung einer Toleranz
und endothelialen Dysfunktion [13],
obwohl diese Nitratgruppen nachweislich
nicht über die mitochondriale Aldehyddehydrogenase
(ALDH-2) bioaktiviert
werden [14]. Diese Ergebnisse könnten die
gesteigerte Mortalitätsrate einer Meta-Studie
erklären, in der Myokardinfarktpatienten
mit Mono- und Dinitraten behandelt
wurden [15]. Zu den medizinisch
am meisten verwendeten organischen Nitraten
gehören GTN, Pentaerythrityltetranitrat
(PETN, in Deutschland), Isosorbiddinitrat
(ISDN) und Isosorbid-5-mononitrat
(ISMN, in den USA).
Sowohl unsere als auch andere Arbeitsgruppen
konnten zeigen, dass verschiedene
organische Nitrate unterschiedliche pharmakologische
Effekte haben bezüglich ihrer
Bioaktivierung und ihrer Kapazität, die
vaskuläre Superoxidproduktion zu stimu-
Organische Nitrate
37

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
A B
Relaxation [%]
Anteil Kontrolle/DMSO [%]
0
20
40
60
80
ACh-Relaxation GTN-Relaxation
0
Relaxation [%]
100
100
–9,0 –8,5 –8,0 –7,5 –7,0 –6,5 –6,0 –5,5 –9,0 8,5 –8,0 –7,5 –7,0 –6,5 –6,0 –5,5 –5,0 –4,5
Log M (ACh) Log M (GTN)
250
200
150
100
50
0
Kontrolle/DSMO
lieren. Beispielsweise induziert PETN, obwohl
über die ALDH-2 bioaktiviert, keine
Toleranz und keine vaskuläre Superoxidproduktion
[12]. Während GTN eine über
oxidativen Stress mediierte Inhibition der
ALDH-2 auslöst, induziert PETN eine Expressionserhöhung
des antioxidativ wirksamen
Enzyms Hämoxygenase-1 (HO-1)
und erhält damit die ALDH-2-Aktivität.
Diese experimentellen Daten aus Tierstudien
werden unterstützt von klinischen Befunden
an Patienten, die zeigen, dass PETN
keine Toleranz [16] und keine endotheliale
Dysfunktion [17] verursacht.
Anhand dieser Betrachtungen sollten in
der aktuellen Studie die Effekte von verschiedenen
organischen Nitraten wie PETN
und ISMN im Krankheitsbild der Angiotensin-II-induzierten
Hypertonie, in spontan
hypertensiven Ratten (SHR) sowie in
STZ-induziertem Diabetes mellitus Typ 1
im Hinblick auf die Entstehung von oxidativem
Stress, endothelialer und vaskulärer
Dysfunktion untersucht werden. Im letzte-
38 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
20
40
60
80
Kontrolle/DMSO
Ang-II/DMSO
Ang-II+PETN
Ang-II+ISMN
Abb. 1a, 1b: Effekte einer In-vivo-PETN- und ISMN-Therapie auf die Gefäßfunktion in Aortenringen von
AT-II-behandelten Ratten: Relaxation gegenüber steigenden Konzentrationen des endothelabhängigen
Vasodilatators Acetylcholin (A) (ACh: endotheliale Dysfunktion) und des endothelunabhängigen
Vasodilatators Glyceroltrinitrat (B) (GTN: glattmuskuläre Dysfunktion).
ROS-Produktion in der Aorta
* #
*
NADPH-Oxidase-Aktivität Mitochondriale ROS (Herz)
* #
* #
* #
AT-II / DMSO AT-II + ISMN AT-II + PETN
Abb. 2: Effekte einer In-vivo-PETN- und -ISMN-Therapie auf die ROS-Produktion bei AT-II behandelten
Ratten in Herz, Aorta und Mitochondrien: basale Superoxidproduktion in Aorten (Luzigenin-[5 µM]-
Chemilumineszenz, weiß), NADPH-Oxidase-Aktivität in Herz-Membranfraktionen (Luzigenin-[5 µM]-
Chemilumineszenz, schwarz) und mitochondriale Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (L-012-[100
µM]-Chemilumineszenz, grau); p < 0,05: * vs. Kontrolle/DMSO; # vs. AT-II+PETN.
* #
*
*
Nach Schuhmacher et al. Hypertension 2010
(DOI: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.109.149542)
Nach Schuhmacher et al. Hypertension 2010
(DOI: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.109.149542)

L-NAME Puffer
Nicht bestimmte Einheiten [IOD]
Kontrolle/DSMO AT-II / DMSO AT-II + PETN
AT-II + ISMN
30.000
25.000
20.000
15.000
10.000
5.000
ren Tiermodell sollten zusätzlich ISDN, als
Vergleich zu seinem Mononitrat-Derivat
ISMN, und Insulin, um eventuelle toxische
Nebeneffekte des STZ zu analysieren, als
Co-Therapie in die Untersuchungen mit
einbezogen werden.
Ergebnisse und Diskussion
0
Für die Versuchsdurchführung wurden
Wistar-Ratten (230-250 g) mit je zwei osmotischen
Minipumpen behandelt, die zum
einen mit AT-II (1 mg/kg/d) und zum anderen
entweder mit PETN (15 mg/kg/d) oder
ISMN (75 mg/kg/d) befüllt waren. Kontrolltiere
erhielten in gleicher Form die entsprechenden
Lösungsmittel (DMSO für die
Nitrate bzw. 0,9% NaCl für AT-II). SHR
wurden in gleicher Form mit entsprechender
Dosis PETN oder ISMN behandelt.
Nach einer Behandlungsdauer von sieben
Tagen zeigten sich bereits äußerlich
durch einen deutlich geringeren Gewichtsverlust
positive Effekte in der AT-
II+PETN-Gruppe (keine Gewichtsveränderung
nach sieben Tagen (1±6% Gewichtszunahme))
gegenüber den AT-II/
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
*
* #
* *
Kontrolle/DSMO AT-II / DMSO AT-II + PETN AT-II + ISMN
Abb. 3: Effekte einer In-vivo-PETN- und ISMN-Therapie auf die eNOS-abhängige ROS-Produktion bei
AT-II-behandelten Ratten in der Aorta. Oben: Dihydroethidin-gefärbte Kryoschnitte zeigen die ROS-
Produktion in den Aorten als rote Fluoreszenz (grün = Autofluoreszenz der Lamina, E = Endothelium).
Um den Einfluss von PETN und ISMN auf eine Entkoppelung der NO-Synthase zu analysieren, wurden
die Aortenringe mit dem NO-Synthase-Inhibitor L-NAME [500 µM] inkubiert. Unten: Densitometrische
Quantifizierung der endothelabhängigen ROS-Produktion (schwarz: ohne L-NAME; weiß: mit L-NAME);
p < 0,05: * vs. ohne L-NAME + vs. Kontrolle/DMSO; # vs. AT-II+PETN.
DMSO-Tieren (24±7% Gewichtsverlust
gegenüber Ctr/DMSO mit ca. 20±2% Gewichtszunahme).
In diesem Fall zeigte allerdings
auch eine Co-Behandlung mit
ISMN bei den mit AT-II behandelten Tieren
eine leichte Verbesserung, die allerdings
nicht stark ausgeprägt war (5±8%
Gewichtsverlust). Nachfolgende Untersuchungen
an Herz und Aorta bestätigten
dann einen eher negativen Einfluss einer
Langzeittherapie mit ISMN gegenüber
dem mit PETN: In den Aorten der mit AT-
II/DMSO behandelten Tiere zeigte sich in
isometrischen Spannungsmessungen erwartungsgemäß
eine ausgeprägte endotheliale
Dysfunktion (= Verschlechterung der
konzentrationsabhängigen Relaxation gegenüber
Acetylcholin) sowie eine deutlich
reduzierte, endothelunabhängige Relaxation
gegenüber GTN, die mit der Ausbildung
von vaskulärem oxidativem Stress, einer
stark gesteigerten NADPH-Oxidase-
Aktivität und einer erhöhten ROS-Produktion
in kardialen Mitochondrien verknüpft
war (Chemilumineszenz: Luzigenin
[5 µM], L-012 [100 µM]; Fluoreszenzmikroskopie:
Dihydroethidin-Färbung (DHE,
* #
Organische Nitrate
w/o L-NAME
L-NAME [500 µM]
39
Nach Schuhmacher et al. Hypertension 2010
(DOI: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.109.149542)

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
A
B
mRNA-Expression
(Fold Change)
Anteil
Kontrolle/DMSO [%]
3,0
1,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
3,0
1,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0
α-Actinin -
HO-1 -
Kontrolle/
DMSO
Kontrolle/
DMSO
*
AT-II/
DMSO
*
AT-II/
DMSO
HO-1
*
AT-II
+ PETN
HO-1-Protein
*
AT-II
+ PETN
1 µM) an Kryoschnitten, HPLC: 2-Hydroxyethidium)
[18]. Eine Co-Behandlung mit
PETN zeigte eine Verbesserung der Endothelfunktion
(Abb. 1a), eine nahezu vollständig
wiederhergestellte Relaxation gegenüber
GTN (Abb. 1b) und eine signifikante
Reduktion der Superoxidproduktion in der
Aorta, der NADPH-Oxidase-Aktivität und
den mitochondrialen ROS (Abb. 2).
Um den Einfluss von PETN und ISMN
auf eine entkoppelte NO-Synthase zu analysieren,
wurden Aortenringe mit dem NO-
Synthase-Inhibitor N G -Nitro-L-Arginin
Methylester (L-NAME, 500 µM) inkubiert
und mittels Fluoreszenzmikroskopie
(DHE) untersucht (Abb. 3). L-NAME erhöht
in Aorten von Kontrolltieren die
DHE-Fluoreszenz ausschließlich innerhalb
des Endothels (E in Abb. 3), was auf eine
basale Superoxidproduktion zurückgeführt
werden kann, der durch die Inhibition der
eNOS nicht mehr durch NO entgegengewirkt
werden kann. Demgegenüber nimmt
die Fluoreszenz in Aorten von AT-II-behandelten
Tieren durch eine NOS-Inhibi-
#
AT-II
+ ISMN
* #
AT-II
+ ISMN
tion ab, was die eNOS als ROS-Quelle
identifiziert. In der AT-II+PETN-Gruppe
erhöht L-NAME die DHE-Fluoreszenz im
Endothel vergleichbar mit den Ergebnissen
der Kontrollgruppe und zeigt damit,
dass durch PETN eine eNOS-Entkopplung
unterdrückt werden kann. In Aorten von
AT-II+ISMN-behandelten Tieren zeigte
sich kein Unterschied zur AT-II-Gruppe,
woraus deutlich wird, dass ISMN im Gegensatz
zu PETN einer Entkopplung der
eNOS nicht entgegenwirken kann.
In Expressionsuntersuchungen konnte
auf Protein- und mRNA-Ebene ein Anstieg
der HO-1 in der AT-II/DMSO-Gruppe
gemessen werden [19], der durch PETN
tendenziell gesteigert und durch ISMN verringert
wurde (Abb. 4a u. 4b). Weiterhin
konnte, wie in vorangegangenen Untersuchungen,
ein Anstieg der eNOS in AT-IIbehandelten
Tieren gemessen werden [4].
Dieser wurde weder durch PETN noch
durch ISMN beeinflusst (Abb. 4c), wobei
aber zu berücksichtigen wäre, dass in der
AT-II+PETN-Gruppe eine funktionelle
40 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
C
Anteil
Kontrolle/DMSO [%]
D
Anteil
Kontrolle/DMSO [%]
E
Anteil
Kontrolle/DMSO [%]
250
150
100
50
0
250
150
100
50
0
250
150
100
50
0
eNOS-Protein
*
*
Kontrolle AT-II + PETN + ISMN
GCH-1-Protein
#
Kontrolle AT-II + PETN + ISMN
#
*
DHFR-Protein
*
Kontrolle AT-II + PETN + ISMN
Abb. 4: Effekte einer In-vivo-PETN- und ISMN-Therapie auf die Expression der HO-1, eNOS, GCH-I und
DHFR bei AT-II-behandelten Ratten in der Aorta; p < 0,05: * vs. Kontrolle/DMSO; # vs. AT-II+PETN.
*
#
#
Nach Schuhmacher et al. Hypertension 2010
(DOI: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.109.149542)

Nach Schuhmacher et al. Hypertension 2010
(DOI: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.109.149542
A
Relaxation [%]
C
0
20
40
60
80
NO-Synthase in ihrer Expression erhöht
ist. Durch die AT-II-Behandlung wurde
die Expression von BH4 synthetisierenden
Enzymen GCH-I und DHFR tendenziell
erniedrigt bzw. signifikant reduziert (Abb.
4d u. 4e). Eine PETN-Co-Therapie erhöht
die Expression beider Enzyme über den
Wert in Kontrolltieren hinaus, woraus sich
eine weitere Eigenschaft von PETN zeigt,
die zu einer Aufrechterhaltung der NO-
Produktion durch eine nicht entkoppelte
eNOS beiträgt. Diese Effekte von PETN
auf die BH4-Synthase (GCH-I) und die
BH2-Reduktase (DHFR) konnten bei
ISMN nicht beobachtet werden.
Die Ergebnisse, die von SHR stammen,
gehen im Wesentlichen einher mit denen
der AT-II-behandelten Tiere. Bei SHR
zeigte sich in isometrischen Spannungsmessungen
gegenüber ihren entsprechenden
Kontrollen (Wistar-Kyoto-Ratten) eine
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
ACh-Relaxation
0
GTN-Relaxation
SHR-Kontrolle , n = 12
B
Relaxation [%]
20
40
60
80
stark ausgeprägte endotheliale Dysfunktion
sowie eine reduzierte, endothelunabhängige
Relaxation gegenüber GTN. Durch eine
Behandlung der Tiere mit PETN konnten
zwar tendenziell nur leichte Verbesserungen
der Endothel- und Gefäßfunktion erreicht
werden, welche im Gegensatz dazu aber
durch ISMN deutlich weiter verschlechtert
wurden (Abb. 5a u. 5b). Über Luzigenin-
[5µM]-Chemilumineszenz-Messungen als
auch über die DHE-Fluoreszenz konnte in
Aorten von SHR ein signifikanter Anstieg
der ROS-Produktion gemessen werden,
der durch eine PETN-Behandlung, nicht
aber durch ISMN reduziert wurde (Abb.
5c).
Diabetes wurde in männlichen Wistar-
Ratten (250–300 g) über eine einmalige
i.v. Injektion STZ (60 mg/kg) induziert.
Ab dem siebten Tag nach STZ-Injektion
wurden PETN bzw. ISDN als Futterbeimi-
Organische Nitrate
SHR-Kontrolle, n = 12
SHR + PETN, n = 12
SHR + ISMS, n = 12
WKY-Kontrolle, n = 8
100
100
– 9,0 – 8,5 – 8,0 – 7,5 – 7,0 – 6,5 – 6,0 – 5,5 – 9,0 – 8,5 – 8,0 – 7,5 – 7,0 – 6,5 – 6,0 – 5,5 – 5,0 – 4,5
Log M (ACh) Log M (GTN)
Anteil
Kontrollle WKY [%]
350
300
250
200
150
100
50
0
SHR + PETN, n = 12
SHR + ISMS, n = 12
WKY-Kontrolle, n = 7
WKY- Kontrolle SHR-Kontrolle
DHE-Fluoreszenz
Luzigenin [5 µM]
Abb. 5: Gefäßfunktion und ROS-Produktion in Aorten von spontan hypertensiven Ratten (SHR).
A + B: Relaxation von Aortenringen gegenüber steigenden Konzentrationen des endothelabhängigen
Vasodilatators Acetylcholin (A) (ACh: endotheliale Dysfunktion) und des endothelunabhängigen
Vasodilatators Glyceroltrinitrat (B) (GTN: glattmuskuläre Dysfunktion). C: ROS-Produktion
gemessen mittels Luzigenin-[5 µM]-Chemilumineszenz und Dihydroethidin-Färbung (DHE, 1 µM) an
Kryoschnitten; p < 0,05: * vs. WKY/Kontrolle; # vs. SHR + PETN.
* #
* #
* #
* #
SHR + PETN SHR + ISMN
41

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Anteil Kontrollle [%]
300
250
200
150
100
50
0
Herz: NADPH-Oxidase-Aktivität
(Luzigenin [5 µM] ECL)
Kontrolle
*
*
* #
* #
*
Aorta: Superoxid-Produktion
(DHE-Kryoschnitte)
* #
STZ + PETN + ISDN + ISMN + Ins
schung (15 bzw. 10 mg/kg/d) und ISMN
über Trinkwasser (75 mg/kg/d) verabreicht.
Nach acht Wochen wurden die
Tiere untersucht und Diabetes anhand
eines drei- bis vierfachen Anstiegs des
Blutzuckerspiegels und einer dramatisch
reduzierten Gewichtszunahme diagnostiziert.
Zusätzlich wurde ein kleines Kollektiv
von STZ-Ratten mit Insulin (2,5 U/d
für zwei Wochen über osmotische Minipumpen)
behandelt. Reaktive Sauerstoffspezies
(ROS) wurden über Chemilumineszenz,
HPLC und Fluoreszenzmikroskopie
von Dihydroethidin-(DHE-)gefärbten
Kryoschnitten detektiert. Die Proteinexpression
wurde über Westernblot ermittelt
und für Endothel- und Gefäßmuskelfunktion
wurden isometrische Spannungsmessungen
durchgeführt. Zusätzlich wurde
die antioxidative Kapazität im Blutserum
über die Reduktion des DPP-Radikals
photometrisch bei 517 nm bestimmt. Nach
acht Wochen zeigte sich bei den STZ-behandelten
Ratten eine dramatische Steigerung
des Blutzuckerspiegels, eine reduzierte
Gewichtszunahme, ein Erhöhung
der vaskulären und kardialen ROS-Produktion
(Mitochondrien und NADPH-
Oxidase), ein annähernd kompletter Verlust
der antioxidativen Kapazität des Serums
und eine gestörte Endothel- und
*+
* +
Gefäßmuskelfunktion. PETN verbesserte
alle gemessenen Parameter effizienter als
ISDN mit Ausnahme der Endothel- und
Gefäßmuskelfunktion, bei der beide Nitrate
die gleichen positiven Eigenschaften
aufzeigten. Im Gegensatz dazu und in
Übereinstimmung mit den vorangegangenen
Untersuchungen im Hypertoniemodell
hatte ISMN, was als Vergleich zu seinem
Dinitrat-Derivat ISDN in die Untersuchungen
einbezogen wurde, keine protektiven
Effekte. Eine Insulinbehandlung
über die letzten zwei Wochen vor Versuchsbeginn
normalisierte alle gemessenen
Parameter vollständig (Abb. 6).
Somit konnte in der aktuellen Studie
zum ersten Mal gezeigt werden, dass ein
organisches Nitrat wie PETN in einer
Langzeittherapie bei gut etablierten Modellen
für oxidativen Stress die Endothelfunktion
verbessern und den oxidativen
Stress reduzieren kann, anstatt über die
Ausbildung einer Toleranz den Zustand zu
verschlechtern. Obwohl ISMN als Mononitrat
nachweislich nicht über die mitochondriale
Aldehyddehydrogenase biotransformiert
wird [14], was eines der entscheidenden
Kriterien der GTN-induzierten
Toleranz ist [20], kommt es unter
ISMN-Langzeittherapie zur Ausbildung
einer Nitrattoleranz. Ebenso wie bei GTN
ist diese Toleranz verknüpft mit der Ausbildung
von oxidativem Stress [13], der
hierbei vermutlich als maßgebende Ursache
der Toleranz- und Kreuztoleranz anzusehen
ist und den negativen Befund bei
AT-II-induzierter Hypertonie erklären
könnte. Wie wir schon in einer früheren
Arbeit zeigen konnten, spielt die antioxidative
Kapazität der HO-1 eine Schlüsselrolle
bei der Unterdrückung einer durch
organische Nitrate ausgelösten Toleranz
[21]. Somit lassen sich die vorwiegend positiven
Ergebnisse einer PETN-Co-Therapie
zum einen mit der Aktivierung von
antioxidativen Mechanismen wie HO-1 sowie
der damit verknüpften Aufrechterhaltung
der vasodilatatorischen Nitratwirkung
erklären und zum anderen mit der Induktion
von BH4-synthetisierenden Enzymen
GCH-I und DHFR, die einer eNOS-Entkopplung
entgegenwirken.
Da die Entstehung einer Arteriosklerose
im Wesentlichen mit kardiovaskulärem oxidativem
Stress sowie einer eNOS-Entkopplung
verknüpft ist [22, 23], deutet sich an,
dass sich PETN aufgrund seines anti-
42 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
# #
Abb. 6: Effekte einer In-vivo-PETN-, ISDN-, ISMN- und Insulin-Therapie auf die ROS-
Produktion bei mit Streptozotocin (STZ) behandelten Ratten in Herz und Aorta:
NADPH-Oxidase-Aktivität in Herz-Membranfraktionen (Luzigenin-[5 µM]-Chemilumineszenz,
weiß) und basale Superoxidproduktion in Aorten (dihydroethidingefärbte
Kryoschnitte, schwarz); p < 0,05: * vs. Kontrolle; # vs. STZ; + vs. STZ+PETN;
^ vs. STZ+ISDN.
Vorläufige Daten, unveröffentlicht

oxidativen Spektrums nicht nur ausschließlich
zur Behandlung von symptomatischen
Erkrankungen der Koronararterien einsetzen
lässt, sondern auch in Form einer zusätzlichen
Medikation als Prävention gegen
Arteriosklerose verwendet werden könnte.
Des Weiteren zeigt die Normalisierung aller
gemessenen Parameter im Tiermodell des
STZ-induzierten Diabetes mellitus Typ 1
mittels Insulin, dass eine STZ-bedingte vaskuläre
Dysfunktion abhängig von der Insulinproduktion
ist und nicht über unspezifisch
toxische Nebenwirkungen des Präparates
ausgelöst wird, womit letztendlich
auch die klinische Relevanz dieses Tiermodells
hervorgehoben werden konnte. n
Summary
In contrast to other organic nitrates pentaerithrityl
tetranitrate (PETN)-treatment in
Wistar rats induces neither nitrate tolerance
nor cross-tolerance, what can be explained
by induction of antioxidant mechanisms
like heme oxygenase-1 (HO-1) and
ferritin. With the present studies we tested
in an animal model of angiotensin-II (AT-
II) induced hypertension, whether chronic
treatment with PETN will preserve it’s beneficial
effects compared to effects of chronic
treatment with isosorbide-5-mononitrate
(ISMN). Additionally we tested in a
rat model of streptozotocin (STZ) induced
diabetes mellitus, whether chronic treatment
with PETN, isosorbide dinitrate
(ISDN) or ISMN improves diabetesassociated
vascular oxidative stress and
dysfunction. Therefore male Wistar rats
(230–250 g) were treated with AT-II (1 mg/
kg/d) alone or together with PETN (15 mg/
kg/d) or ISMN (75 mg/kg/d) via subcutaneous
osmotic minipumps for 7 days. Control
pumps were applied with the solving
reagent, respectively. Diabetes was induced
by a single i.v. injection of STZ (60 mg/kg)
in male wistar rats (220–250 g). PETN,
ISMN and ISDN therapy started 7 d after
STZ-Injection (dose: 15 mg/kg/d, 75 mg/kg/
d and 10 mg/kg/d, respectively). The rats
were sacrificed after 8 weeks. A small collective
of STZ-rats was treated with insulin
(2.5 U/d) for the 2 weeks before sacrifice.
Reactive oxygen species (ROS) were
detected by chemiluminescence, HPLC or
fluorescent microtopography, protein expression
was measured by Western blotting
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
and vascular function was assessed by isometric
tension studies. Additionally the antioxidative
capacity of blood serum was
measured photometrically by reduction of
the DPP-radical. Ang-II infusion caused
endothelial dysfunction and reduced endothelial
independent relaxation, indicated by
a decreased vasodilator potency of acetylcholine
and nitroglycerin in isolated aortic
rings, an increase of reactive superoxide
species (ROS) in aortic vessels and in
NADPH oxidase activity in heart membrane
fractions, as detected by lucigenin (5µM)
derived chemiluminescence (LDCL). Staining
of aortic sections and HPLC-derived
measurements with the fluorescent dye dihydroethidine
showed O2-formation
throughout the vessel wall. In addition, expression
of HO-1 was increased in aorta. In
contrast to ISMN, co-treatment with PETN
normalized in part vascular function and
ROS-formation. Furthermore, HO-1 expression
was further enhanced by PETN,
not by ISMN. STZ-treated rats showed a
dramatically increase in blood glucose levels,
decrease in weight gain, increased vascular
and cardiac ROS production (mitochondria,
NADPH oxidase activity), decreased
antioxidative capacity of serum and
impaired endothelial and smooth muscle
function. PETN therapy improved almost
all parameters more efficiently than ISDN,
except endothelial and smooth muscle function,
where both nitrates showed identical
beneficial effects. ISMN, which was used to
examine differences to its dinitrate derivative
ISDN, had no protective effects. Insulin
normalized all parameters completely.
Thus, the beneficial effects of PETN on
AT-II induced hypertension may be also
explained by induction of antioxidant mechanisms
and thereby it’s preserved nitrovasodilatory
action. The study shows for the
first time that chronic treatment with an organic
nitrate can improve endothelial dysfunction
and oxidative stress in different
diseased animal models. Insulin completely
normalized all tested parameters in STZinduced
diabetes and thereby identified the
underlying mechanism of cardiovascular
dysfunction to strictly depend on insulin levels
highlighting the clinical importance of
this experimental animal model. In summary,
these so far completely positive animal
experimental data point towards potential
beneficial effects for patients as well. Patients
with coronary artery disease could take
Organische Nitrate
43

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
44
profite from anti-ischemic PETN therapy
by normalizing endothelial dysfunction in
these patients and thereby slowing down
the progression of atherosclerosis. The upcoming
big clinical PETN trials will demonstrate
whether these completely positive
animal experimental data may be translated
to the clinics.
Keywords: angiotensin-II – diabetes mellitus
– oxidative stress – endothelial dysfunction
– isosorbide-5-mononitrate – isosorbide
dinitrate – pentaerythrityl tetranitrate – insulin
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of the renin-angiotensin system. Circulation.
1999 Apr 20;99(15):2027–33
Für die Verfasser:
Dr. M. Oelze
Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-
Universität
II. Med. Klinik und Poliklinik, Molekulare
Kardiologie
Obere Zahlbacher Str. 63
55101 Mainz, Germany
Tel.: +49 (0)6131 17 9722
Fax: +49 (0)6131 17 9723
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

Pulmonale Hypertonie – ein weiteres
Anwendungsgebiet für PETN?
Matthias Oelze, Swenja Schuhmacher, Alexander Scholz, Sebastian Steven,
Andreas Daiber
Zusammenfassung: In früheren zellkulturbasierten,
tierexperimentellen und klinischen
Studien konnte gezeigt werden,
dass sich Pentaerithrityltetranitrat (PETN)
von anderen organischen Nitraten unterscheidet:
Es ist frei von jeglichen Toleranzerscheinungen
unter chronischer Therapie
und ist gekennzeichnet durch seine pleiotropen
antioxidativen Eigenschaften. Hier
wurde diskutiert, ob die pulmonale arterielle
Hypertonie (PAH) ein weiteres Indikationsgebiet
für PETN darstellen könnte.
Vor allem die gute Beeinflussbarkeit der
PAH durch die Induktion des körpereigenen
Schutzenzyms, der Hämoxygenase­1
(HO­1), spricht für einen erfolgreichen
Einsatz von PETN bei der PAH. Es wird
davon ausgegangen, dass ein Großteil der
protektiven Wirkungen von PETN auf der
1. Sonderstellung von PETN
unter den organischen Nitraten
Das Tetranitrat PETN (Pentalong ® ) wurde
als toleranzfreies organisches Nitrat beschrieben,
das im Gegensatz zu Nitroglyzerin
(GTN) keinen oxidativen Stress
induziert [1–7]. Die protektive Wirkung
wird dabei hauptsächlich der Induktion der
beiden protektiven Proteine Hämoxygenase­1
und Ferritin zugeschrieben [8, 9]. Die
protektiven Eigenschaften von PETN gehen
sogar so weit, dass eine bereits manifeste
Atherosklerose positiv beeinflusst und
die Endothelfunktion aufrechterhalten
wird [10]. In einer gerade abgeschlossenen
Kooperation konnte gezeigt werden, dass
PETN und PETriN, nicht aber ISDN die
Funktion und Anzahl der endothelialen
Progenitorzellen steigert [11]. In zurückliegenden
Studien konnte unsere Gruppe zeigen,
dass die Nitrattoleranz maßgeblich
durch vaskulären [12], speziell mitochondrialen
oxidativen Stress induziert wird (Beweis
auf molekularer Ebene gelang in Mn­
SOD +/­ ­Mäusen – einem genetischen Tier­
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Induktion der HO­1 beruhen. Weiterhin
normalisierte PETN in verschiedenen Tiermodellen
für kardiovaskuläre Erkrankungen
(z. B. Diabetes, arterielle Hypertonie)
die endotheliale Dysfunktion und den
vaskulären oxidativen Stress, was ebenfalls
für einen erfolgreichen Einsatz bei der
PAH spricht, da auch diese durch dysfunktionelle
Lungengefäße und erhöhten pulmonalen
oxidativen Stress charakterisiert
ist. Aufgrund dieser Betrachtungen erscheint
die Therapie der PAH durch PETN
sehr vielversprechend.
Schlüsselwörter: Organische Nitrate – Pentaerithyltetranitrat
– Monocrotalin – pulmonale
arterielle Hypertonie – oxidativer Stress
– vaskuläre Funktion
modell für mitochondrialen oxidativen
Stress) [13–15, 19]. Wir konnten weiterhin
zeigen, dass PETN wie andere hochpotente
Nitrate durch die mitochondriale Aldehyddehydrogenase
(ALDH­2) bioaktiviert
wird, in vitro weniger oxidativen Stress als
GTN macht und die ALDH­2 weniger inaktiviert
als GTN [7, 13, 16]. In einer gerade
publizierten Arbeit wurde überzeugend gezeigt,
dass eine akute Bolus­Behandlung
von isolierten Aorten­Ringsegmenten mit
PETN oder PETriN wie bei GTN in einer
In­vitro­Toleranz bzw. Tachyphylaxie resultierte
[17]. Es war dabei unerheblich, ob
die Gefäße mit 300 µM Bolus, der EC90 oder
EC100 behandelt wurden. Diese Befunde
bestätigen unsere früheren Beobachtungen,
dass PETN als Bolus Radikale und In­vitro­
Toleranz induziert (wenn auch weniger als
GTN), aber zu einer signifikanten Erhöhung
des oxidativen Stresses an isolierten
Mitochondrien führte [13]. Basierend auf
diesen Ergebnissen haben wir uns in einer
zurückliegenden Studie mit der Fragestellung
beschäftigt, ob PETN auch bei einma­
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
II. Medizinische Klinik, Labor für
Molekulare Kardiologie, Universitätsmedizin
der Johannes-
Gutenberg-Universität, Mainz,
Deutschland
45

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Proteinexpression [%]
200
175
150
125
*
100
75
50
25
0
*
Kontrolle GTN Kontrolle PETN Kontrolle GTN Kontrolle PETN
kDa
52 -
ALDH-2
HO-1
kDa
- 32
liger akuter Gabe in humanen Probanden
protektive Eigenschaften besitzt oder eine
Tachyphylaxie induziert, und vergleichen
die Wirkung von PETN mit der von GTN.
Dies ist eine interessante Fragestellung, da
bei einer akuten, kurzzeitigen Behandlung
die Hämoxygenase­1­ und Ferritin­vermittelten,
schützenden Effekte von PETN
nicht aktiv sind. Die Induktion dieser
Schutzenzyme beginnt erst nach mindestens
sechsstündiger Behandlung.
Im Gegensatz zu Nitroglyzerin induzierte
eine In­vivo­Behandlung mit PETN
(verabreicht durch osmotische Minipumpe
oder Schlundfütterung) in Wistar­Ratten
keine Nitrattoleranz oder Kreuztoleranz.
Daneben wurde keine signifikante Erhöhung
des mitochondrialen und vaskulären
oxidativen Stress und auch keine vermehrte
Inaktivierung des GTN/PETN­bioaktivie­
renden Enzyms ALDH­2 beobachtet. Eine
mögliche Erklärung der antioxidativen/protektiven
Effekte von PETN könnte in der
verstärkten Expression der HO­1 sowie von
Ferritin bestehen. Unsere Befunde zu diesem
Thema sind in den folgenden Diagrammen
dargestellt (Abb. 1) und wurden 2007
publiziert [18]. Auch in Endothelzellen war
die HO­1­mRNA­Expression unter PETN­
Therapie erhöht (Abb. 2). Daneben konnten
wir zeigen, dass PETN sogar in Mäusen
mit partieller Mangan­Superoxiddismutase­Defizienz
(Mn­SOD +/­ ­Mäuse) keine Toleranz
induziert, obwohl diese Mäuse aufgrund
ihrer erhöhten mitochondria­
len Superoxidspiegel anfälliger für die
Entwicklung einer Nitrattoleranz sind
[19]. Auch die endotheliale Dysfunktion
wurde unter PETN­Therapie in diesen
Mn­SOD +/­ ­Mäusen nicht beobachtet.
46 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
mRNA-Expression [%]
200
175
150
125
100
75
50
25
0
*
Kontrolle GTN Kontrolle PETN Kontrolle GTN Kontrolle PETN
HO-1 Ferritin
Abb. 1: Effekt einer In-vivo-Behandlung mit PETN (in DMSO) bzw. mit GTN (in Ethanol) auf die vaskuläre
Proteinexpression der ALDH-2 und HO-1 (links) und HO-1 sowie Ferritin mRNA-Expression rechts).
HO-1 mRNA-Expression [%]
350
300
250
200
150
100
50
0
Kontrolle 10 µM PETN 50 µM PETN
Abb. 2: Induktion der HO-1-mRNA-Expression in Endothelzellen (EA.hy 926) durch PETN.
*
*
Nach Wenzel et al [18]
Nach Mollnau et al [19]

2. Pulmonale Hypertonie –
klinische Aspekte
Die pulmonale Hypertonie wird in fünf
Hauptgruppen eingeteilt: pulmonale Hypertonie
bei Linksherzerkrankung, pulmonale
Hypertonie assoziiert mit Hypoxie (COPD),
pulmonale Hypertonie aufgrund chronischer
thrombotischer und/oder embolischer Erkrankungen,
sonstige Ursachen (Sarkoidose)
und die pulmonal arterielle Hypertonie
(IPAH, PVOD). Unter dem Begriff einer
pulmonal arteriellen Hypertonie (PAH) fasst
man verschiedene Formen eines Lungengefäßhochdruckes
zusammen, die entweder
ohne bekannte Ursache (wie die idiopathische
pulmonal arterielle Hypertonie –
IPAH) auftreten oder aber sich im Rahmen
einer anderen Erkrankung wie z. B. einer Leberzirrhose,
einer Bindegewebserkrankung,
einer HIV­Infektion oder bestimmter angeborener
Herzerkrankungen manifestieren. In
den letztgenannten Situationen spricht man
von einer assoziierten pulmonal arteriellen
Hypertonie (APAH). Die PAH ist letztlich
eine Erkrankung unbekannter Ätio logie.
Durch eine zunehmende Obliteration (Verengung)
der Lungenstrombahn kommt es zu
einer progredienten Belastung des rechten
Herzens, die schlussendlich zu einem Rechtsherzversagen
führen kann. Während es für
die PAH noch vor wenigen Jahren außer der
Lungentransplantation keine Behandlungsmöglichkeit
gab, können die meisten Patienten
heute mit Endothelinantagonisten
(Bosentan, Tracleer ® , Ambrisentan, Volibris
® oder Sitaxentan, Thelin ® ), Phosphodiesterase­Inhibitoren
(Sildenafil, Revatio ®
sowie in Zukunft auch Tadalafil, Adcirca ® )
und/oder Prostanoiden (z.B. Iloprost) wirksam
behandelt werden. Die hohe Sterblichkeit
bei PAH ist vor allem durch das Herzversagen
bedingt. Bis zu 90% der Patienten mit
chronischen obstruktiven Lungenerkrankungen
(laut Hochrechnungen weltweit die
dritthäufigste Todesursache bis zum Jahr
2020) haben eine moderate bis bedenkliche
PH. Im Hinblick auf die öffentliche Gesundheit
ist die PAH eine wichtige Herausforderung
aufgrund der späten Diagnose und der
lediglich symptomatischen Therapie, die keine
dauerhafte Heilung verspricht [20].
3. Pulmonale Hypertonie –
experimentelle Modelle
Experimentell kann die pulmonal arterielle
Hypertonie neben chronischer Haltung der
Tiere unter hypoxischen Bedingungen [21,
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
22] auch durch Injektion von Monocrotalin
(MCT) induziert werden, einem hoch toxischen
Alkaloid aus Crotalaria spectabilis.
Die Symptome entsprechen denen der klinischen
PH: Die MCT­Behandlung bewirkt
eine Verdickung der pulmonalen Arterienwand
mit stark erhöhtem rechtsventrikulärem
Druck in Kombination mit pulmonaler
Entzündung (detektiert durch erhöhte
Expression des Tumor­Nekrose­Faktors
und vermehrte Infiltration von Neutrophilen
im Lungengewebe) [23]. Diese negativen
Effekte konnten durch eine HO­1­
Induktion normalisiert werden [23]. Dies
stellt einen interessanten Ansatzpunkt für
die Co­Therapie mit dem HO­1 induzierenden
Nitrat PETN dar. Aufgrund der
inflammatorischen Natur der MCT­induzierten
PAH spielt oxidativer Stress (iNOS,
NADPH­Oxidasen) eine wichtige Rolle in
der Pathogenese der Krankheit. Die PAH
ist eine häufige Begleiterscheinung beim
Diabetes mellitus [24]. Auch die Pathogenese
der chronisch hypoxischen PAH wird
maßgeblich durch oxidativen Stress bestimmt
und konnte durch endogene Hochregulation
der HO­1 deutlich verbessert
werden [21, 22]. Für die experimentelle
PAH in Lämmern konnte eine Schlüsselrolle
der NADPH­Oxidase gezeigt werden
[25]. Es wurde weiterhin gezeigt, dass die
BH4­Defizienz mit der Entwicklung einer
PAH assoziiert ist und durch das Fehlen
dieses wichtigen Co­Faktors der eNOS eine
endotheliale Dysfunktion induziert wird
[26]. Daher ist zu erwarten, dass eine antioxidative
Co­Therapie jeglicher Art (z. B.
durch PETN­induzierte HO­1­Expression)
den Verlauf der Krankheit positiv beeinflusst
und sich die Wiederherstellung der
vaskulären BH4­Spiegel (z. B. durch PETNinduzierte
GTP­CH­1 Expression) besonders
positiv auswirkt. Es bleibt zu bemerken,
dass es sich bei der MCT­induzierten
PAH um ein sehr gut etabliertes Tiermodell
handelt, das den chronischen Verlauf und
die Langzeitauswirkungen der PAH sehr
zuverlässig im Zeitraffer abbildet. Binnen
vier bis sechs Wochen können die schweren
Begleiterscheinungen einer PAH beobachtet
werden (Abb. 3). Ein ähnliches Bild
bzgl. der Protein­Tyrosin­Nitrierung wie in
den Pulmonalarterien ergab sich auch in
Lungengewebe (nicht gezeigt), wohingegen
kein systemischer oxidativer Stress in der
thorakalen Aorta bzw. im Herzmuskel beobachtet
werden konnte (nicht gezeigt). Zu
Organische Nitrate
47

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Relaxation [%]
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
MCT-Kontrolle
MCT, 2 Wochen
MCT, 4 Wochen
MCT, 6 Wochen
– 9 – 8 – 7
log (ACh) [M]
– 6
den Suchworten „monocrotaline“ und „pulmonary
hypertension“ findet man über 660
Treffer in PubMed.
4. Pulmonale Hypertonie und PETN
Die Rationale für die Therapie der PAH
mit PETN liegt klar auf der Hand. Aufgrund
des guten Ansprechens der PAH­Begleiterscheinungen
auf eine vermehrte HO­
1­Induktion [21–23] erscheint eine Therapie
mit PETN sehr vielversprechend. Für
PETN wurde wiederholt gezeigt, dass dieses
Nitrat die HO­1 und das Ferritin sowohl in
Zellkultur als auch in Ratten unter chronischer
Behandlung hochreguliert [8, 9, 18,
19, 27]. Daneben besitzt PETN die bereits
oben beschriebenen potenten antioxidativen
Eigenschaften, die höchstwahrscheinlich
der endothelialen Dysfunktion und
dem oxidativen Stress in der PAH entgegenwirken
würden. Basierend auf diesen
Überlegungen erscheint der Therapieansatz
der PAH mit PETN naheliegend. n
Summary
Previous cell culture­based, animal experimental
or clinical studies have demonstrated
that pentaerithrityl tetranitrate (PETN)
is different from other organic nitrates in
many aspects: PETN is devoid of tolerance
development under chronic therapy and is
characterized by its pleiotropic antioxidant
properties. We here discussed whether the
pulmonary arterial hypertension (PAH)
could be another indication for PETN
therapy. Especially the highly reliable responsiveness
of the PAH to the induction of
the intrinsic antioxidant enzymatic system,
the heme oxygenase­1 (HO­1), argues for a
successful therapy of the PAH by PETN.
It was assumed that an appreciable part
of the protective effects of PETN is based
on the induction of HO­1 and ferritin. Moreover,
PETN normalized endothelial dysfunction
and vascular oxidative stress in
several animal models of cardiovascular disease
(e.g. Diabetes, arterial hypertension),
also pointing to an effective treatment of
PAH by PETN. PAH is also characterized
by dysfunctional pulmonary vessels and increased
pulmonary oxidative stress. Based
on these considerations, the therapy of PAH
with PETN looks very promising and represents
a straightforward concept.
Keywords: organic nitrates – pentaerithrityl
tetranitrate – monocrotaline – pulmonary
arterial hypertension – oxidative stress –
vascular function
Danksagung
Wir danken der Johannes Gutenberg­Universität
für die finanzielle Unterstützung
durch MAIFOR und Förderfonds Beihilfen
(A.D.) und der Actavis Deutschland GmbH
für die fortwährende Unterstützung.
48 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
3-Nitrotyrosin-Gehalt [%]
200
150
100
50
0
Kontrolle MCT
Abb. 3: Die Manifestation der pulmonalen arteriellen Hypertonie (PAH) wurde anhand der endothelabhängigen
(ACh-induzierten) Relaxation isolierter Pulmonalarterien nach einer zwei-, vier- und
sechswöchigen Behandlung mit Monocrotalin (MCT) gemessen (links). Die Manifestation des MCTinduzierten
oxidativen Stresses wurde anhand der Protein-Tyrosinnitrierung in Pulmonalarterien
nach vierwöchiger Behandlung erfasst (rechts).
Nach Oelze und Daiber, nicht publizierte Daten

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Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
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Für die Verfasser:
Prof. Dr. Andreas Daiber
Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-
Universität Mainz
II. Medizinische Klinik – Labor für Molekulare
Kardiologie
Obere Zahlbacher Str. 63
55101 Mainz, Germany
Tel.: +49 (0)6131 17 9722
Fax: +49 (0)6131 17 97 23
E-Mail: daiber@uni-mainz.de
Organische Nitrate
49

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Institut für Pharmakologie,
Uniklinik Köln, Köln,
Deutschland
50
Vergleichende Untersuchung der Bildung
reaktiver Sauerstoffspezies durch organische
Nitrate mit dem Indikator Dihydrorhodamin 123
Tim Bauer und Renate Rösen
Zusammenfassung: Die potente und rasche
antianginöse Wirkung der organischen
Nitrate macht diese zur wichtigsten Substanzklasse
zur Kupierung des akuten Angina­pectoris­Anfalls.
Die Langzeittherapie
wird allerdings durch eine schnell eintretende
Toleranzentwicklung gegenüber dieser
Gruppe von Vasodilatatoren limitiert.
Der Zusammenhang zwischen der Toleranzentwicklung
und der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies,
die u. a. in der Lage sind, das
metabolisierende Enzym, die mitochondriale
Aldehyddehydrogenase (ALDH­2),
zu inhibieren, gilt heute als gesichert.
Um Ursachen für die unterschiedlich ausgeprägte
Toleranzentwicklung gegenüber
verschiedenen organischen Nitraten zu untersuchen,
haben wir deren Einfluss
auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspe­
zies (ROS) in humanen Endothelzellen
(EA.hy.926) und isolierten Mitochondrien
mit dem Indikator Dihydrorhodamin 123
(DHR123) untersucht. Dieser wird zum
fluoreszierenden Rhodamin 123 (R123)
oxidiert, welches intrazellulär akkumuliert.
Im Fall der Inkubation humaner Endothelzellen
mit Glyceroltrinitrat (GTN) wurde
mittels Fluoreszenzfotografie mit steigender
Inkubationszeit allerdings eine Abnahme
der intrazellulären Rhodaminfluoreszenz
beobacht, sodass R123 in folgenden
Experimenten intra­ und extrazellulär
quantifiziert werden musste, um die ge­
Die organischen Nitrate sind bereits seit
über 150 Jahren Bestandteil der symptomatischen
Therapie von Koronarerkrankungen.
Es handelt sich bei diesen Substanzen,
deren wohl bekanntester Vertreter Glyceroltrinitrat
(GTN) ist, um Ester der Salpetersäure,
aus denen reduktiv NO abgespalten
wird. Die durch NO induzierte
samte Stoffmenge des gebildeten Rhodamins
zu erfassen. Das bedeutet, dass bei
der Verwendung von DHR123 als Indikator
für ROS ein verändertes Fluoreszenzsignal
nicht ausschließlich auf eine Verschiebung
des intrazellulären Redoxgleichgewichts
zurückgeführt werden kann, sondern
auch Prozesse wie aktiver Transport
oder die Öffnung der Transitionsporen der
Mitochondrien eine Rolle spielen können.
Mit DHR123 als Indikator konnte gezeigt
werden, dass Isosorbitdinitrat, Glyceroltrinitrat
und Pentaerithrityltetranitrat die
Bildung reaktiver Sauerstoffspezies in
EA.hy.926 und isolierten Mitochondrien in
unterschiedlichem Ausmaß beeinflussen.
Da die Inhibition der ALDH­2 mit Benomyl
bzw. Chloralhydrat sowie die Inkubation
isolierter Mitochondrien mit einem Aldehyd
ebenfalls zu einer gesteigerten Bildung
reaktiver Sauerstoffspezies führte,
kann die nach GTN­Inkubation beobachtete
starke ROS­Bildung durch dessen inhibitorischen
Effekt auf die ALDH­2­Aktivität
erklärt werden, sodass die Entstehung reaktiver
Sauerstoffspezies in direktem Zusammenhang
mit der ALDH­2­Aktivität zu
stehen scheint.
Schlüsselwörter: Organische Nitrate – reaktive
Sauerstoffspezies – Dihydrorhodamin
123 – mitochondriale Aldehyddehydroge­
nase
Signalkaskade resultiert in einer Dilatation
der glatten Muskulatur und somit der Gefäße.
Besonders über die so erreichte Vorlastsenkung
wird der Sauerstoffbedarf am
Herzen vermindert.
Der den Wirkungsmechanismus betreffenden
Homologie stehen allerdings verschiedene
heterologe Eigenschaften dieser
Substanzklasse gegenüber:
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

Klinisch von Bedeutung sind vor allem eine
sich rasch entwickelnde Tachyphylaxie, die
die Anwendung der organischen Nitrate in
der Dauertherapie limitiert und in Verbindung
damit die Verschiebung des Redoxgleichgewichts,
d.h. die Bildung reaktiver
Sauerstoffspezies. Erste Hinweise auf einen
Zusammenhang zwischen der Bildung reaktiver
Sauerstoffspezies und der Toleranzentstehung
wurden 1995 von Münzel
und Kollegen veröffentlicht [1]. Heute gibt
es zahlreiche Publikationen, die das Modell
des oxidativen Stresses in Bezug auf die Toleranzentstehung
stützen [2, 3].
In den vergangenen Jahrzehnten wurden
verschiedene – nicht enzymatische und
enzymatische – Wege zur Bioaktivierung
der organischen Nitrate diskutiert, aber
nachdem 2002 Chen et al. die mitochondriale
Aldehyddehydrogenase (ALDH­2)
als Glyceroltrinitrat (GTN) metabolisierendes
Enzym identifizierten, gibt es mehrere
Publikationen, die einen klaren Zusammenhang
zwischen dem Metabolismus
der organischen Nitrate und diesem Enzym
aufzeigen [4]. Die ALDH­2 weist im katalytischen
Zentrum Cysteinreste auf, die in
vitro nach Exposition isolierter Mitochondrien
mit verschiedenen reaktiven Sauerstoffspezies
(ROS) oxidiert werden konnten,
was in einer Inaktivierung der ALDH­2
resultierte [5]. Basierend auf diesen Erkenntnissen
findet sich ein Erklärungsansatz
für die Entstehung der mechanismusbasierten
Toleranz, sodass wir GTN als
Leitsubstanz der organischen Nitrate im
Vergleich zu Pentaerithrityltetranitrat
(PETN) sowie Isosorbitdinitrat (ISDN) bezüglich
ihrer Wirkung auf die Bildung reaktiver
Sauerstoffspezies nach Inkubation
von u.a. humanen Endothelzellen sowie
isolierten Mitochondrien getestet haben.
Als Indikator für den Nachweis reaktiver
Sauerstoffspezies wurde dazu Dihydrorhodamin
123 (DHR123) verwendet,
das im ungeladenen Zustand über die Zellmembran
diffundiert und in der Zelle mit
reaktiven Sauerstoffspezies zum fluoreszierenden
Rhodamin 123 (Rh123) abreagiert
[6]. Die positive Ladung sowie die
Akkumulation von Rhodamin in Mitochondrien
[7] lassen erwarten, dass Rh123
intrazellulär verbleibt. Der Literatur zufolge
bleibt das Signal eine Stunde stabil. Eine
Abnahme der Fluoreszenz, die auf diffusionskontrollierte
Prozesse zurückzuführen
ist, sollte in einem zeitlichen Rahmen
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
ablaufen, der größer ist als die von uns gewählten
Inkubationszeiten [6].
Ergebnisse und Diskussion
Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
nach GTN­Inkubation wurde bereits in verschiedenen
Geweben nachgewiesen [8–11].
Daher haben wir zunächst untersucht, ob
dieser Effekt auch auf die humane Endothelzelllinie
EA.hy.926 übertragbar ist. Diese
Zellen wurden gewählt, da das Endothel
eine bedeutende Rolle bei der pathophysiologischen
Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
spielt [1, 12].
Die Quantifizierung der intrazellulären
Fluoreszenz erfolgte dabei zunächst an
Hand von Fluoreszenzfärbungen und Mikroskopiebildern
[13, 14]. Abbildung 1A
zeigt, dass nach GTN­Inkubation der
EA.hy.926­Zellen die erwartete Zunahme
der detektierten Fluoreszenz im Vergleich
zu unbehandelten Zellen beobachtet wer­
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
–20
–40
140
120
100
80
60
40
20
0
50 µM
5 10
Zeit [Minuten]
Organische Nitrate
Abb. 1: Determination reaktiver Sauerstoffspezies mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Dargestellt ist die relative Änderung der 123-Rhodaminfluoreszenz in EA.
hy.926 Zellen in Abhängigkeit von der Inkubationsdauer nach Stimulation mit 50
und 500 μmol/l GTN (A) sowie nach 60 min Inkubation mit 2 μmol/l Cyclosporin A
bzw. 500 μmol/l GTN allein oder zusammen (B). Dargestellt sind die Δ%-Werte
bezogen auf unstimulierte Zellen (*: signifikant gegenüber unstimulierten Zellen).
a
B
132-Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
132-Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
*
*
Cyclo A
*
500 µM
20 5 10 20
*
GTN
*
*
* #
*
Cyclo A + GTN
51

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Abb. 2: Funktioneller Nachweis
eines spezifischen
Rh123-Transportes mittels
Durchflusszytometrie. Die
Auswertung der Daten erfolgte
über den geometrischen
Mittelwert der Histogramme.
Dargestellt sind die
prozentualen Unterschiede
bezogen auf die Kontrolle
(*: signifikant gegenüber
unstimulierten Zellen;
#: signifikant gegenüber
Efflux).
Abb. 3: Die Determination
reaktiver Sauerstoffspezies
mittels HPLC. EA.hy.926-
Zellen wurde 60 min mit 500
μmol/l GTN ± 2 μmol/l Cyclosporin
inkubiert. Rh123
wurde aus dem Zelllysat (A)
und dem Inkubationsüberstand
(B) extrahiert und die
Fluoreszenz nach chromatografischer
Trennung quantifiziert
(*: signifikant gegenüber
unstimulierten Zellen;
#: signifikant im Vergleich zu
mit GTN-stimulierten Zellen).
Abb. 4: EA.hy.926-Zellen wurden
30 min mit 10 μmol/l des
jeweiligen Nitrats inkubiert.
Nach der Extraktion aus
Zelllysat (A) und Inkubationsüberstand
(B) wurde Rh123
mittels HPLC quantifiziert
(*: signifikant gegenüber
unstimulierten Zellen).
∆% zur Kontrolle
0
–10
–20
–30
–40
–50
–60
* *#
Efflux CycloA
den konnte. Der Unterschied war nach fünf
Minuten am stärksten ausgeprägt. Nach
zehn und 20 Minuten war zwar ebenfalls
ein Anstieg der Fluoreszenz nachweisbar,
jedoch nahm das detektierte Signal überraschenderweise
mit steigender Inkubationszeit
ab.
Da Rh123 als Substrat für p­Glycoprotein
und andere Transporter der ABC­Familie
beschrieben worden ist [15, 16], ka­
a
123-Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
a
123 Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
50
40
30
20
10
0
50
40
30
20
10
0
men Zweifel bezüglich der diffusionskontrollierten
Stabilität des Fluoreszenzsignals
auf, sodass EA.hy.926­Zellen mittels
Durchflusszytometrie auf einen Rhodamin­Efflux
untersucht wurden. Die in
Abbildung 2 dargestellten Ergebnisse zeigen,
dass ein solcher nachgewiesen und
dieser wie in der Literatur beschrieben
durch Cyclosporin A gehemmt werden
konnte [17]. Eine weitere Ursache für die
Abnahme der intrazellulären Fluoreszenz
könnte der in der Literatur beschriebene
Einfluss von GTN auf die Öffnung der mitochondrialen
Transitionsporen sein, die
ebenfalls zu einer Abnahme der intrazellulären
Rhodaminkonzentration beitragen
könnte [18, 19]. Die Öffnung der Poren
kann ebenfalls durch Cyclosporin A inhibiert
werden [20].
Dementsprechend führte die Stimulation
der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
mit GTN bei gleichzeitiger Inkubation
mit Cyclosporin A dazu, dass das intrazelluläre
Fluoreszenzsignal auch nach
60­minütiger Inkubation mit GTN iden­
–40
Cyclo A GTN Cyclo A + GTN
Cyclo A GTN Cyclo A + GTN
52 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
* #
B
123-Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
B
123 Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
0
ISDN GTN PETN
ISDN GTN PETN
80
60
40
20
0
–20
80
60
40
20
*
*

a
123-Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
50
40
30
20
10
0
0
ISDN GTN PETN
Beno Ch
PA
tisch mit dem für nach fünfminütiger Inkubation
war (Abb. 1b). Aus diesen Ergebnissen
kann gefolgert werden, dass erstens
ein Rh123­Efflux aus EA.hy.926­Zellen
stattfindet und zweitens, dass dieser Prozess
durch Cyclosporin A gehemmt werden
kann. Aus Letzterem ergibt sich, dass wenn
Dihydrorhodamin 123 als Indikator für reaktive
Sauerstoffspezies verwendet wird,
bedacht werden muss, dass eine Veränderung
der intrazellulären Fluoreszenz nicht
nur auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
zurückzuführen sein muss, sondern
auch durch weitere Prozesse wie einen
Auswärtstransport oder einen veränderten
funktionellen Zustand von Mitochondrien
begründet werden kann.
Um die gezeigten Ergebnisse zu verifizieren
und zu gewährleisten, dass die gesamte
durch Oxidation entstandene Rhodaminkonzentration
erfasst wird, d. h. auch
die aus den Zellen heraustransportierte,
war es notwendig, eine Methode zu etablieren,
die es ermöglicht, Rhodamin zusätzlich
im Inkubationsüberstand zu quantifizieren,
was im Fall der Fluoreszenzaufnahmen
nicht möglich war. Rh123 wurde dazu
mittels einer organischen Phase sowohl aus
Zelllysat als auch aus dem Inkubationsmedium
extrahiert und die Fluoreszenz nach
chromatografischer Trennung ermittelt.
Die Abbildungen 3a und 3b zeigen, dass
Cyclosporin A die Rh123­Fluoreszenz verändert.
Nach 60­minütiger Inkubation der
Zellen mit 500 µmol/l GTN wurde die intrazelluläre
Rh123­Fluoreszenz gesteigert
(Abb. 3a), wobei, wie Abbildung 3b zeigt,
die extrazelluläre Konzentration anstieg
und zwar stärker als intrazellulär. In Gegenwart
von Cyclosporin A war der intrazelluläre
Anstieg der Rh123­Bildung signi­
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
*
B
123-Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
100
80
60
40
20
*
fikant gegenüber dem ungehemmten Efflux
gesteigert. Dementsprechend wurde
extrazellulär weniger Rh123 gegenüber ungehemmtem
Efflux detektiert. Die Tatsache,
dass nach der Inkubation der Zellen
mit GTN und Cyclosporin extrazellulär eine
höhere Konzentration als unter Kontrollbedingungen
gefunden wurde, muss
nicht bedeuten, dass der Efflux nicht vollständig
inhibiert war, sondern lässt sich
dadurch erklären, dass verschiedene Prozesse
an der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
durch GTN beteiligt sind und diese
von membranständigen Proteinen auch
nach extrazellulär abgegeben werden können
[21–23]. Durch solche Prozesse veränderte
extrazelluläre Rh123­Konzentrationen
können im Fall der Fluoreszenzaufnahmen
nicht detektiert werden [13, 14].
Zum Vergleich der Wirkung verschiedener
organischer Nitrate wurden EA.
hy.926 30 min mit 10 µmol/l ISDN, GTN
bzw. PETN inkubiert. ISDN und GTN
führten sowohl extra­ als auch intrazellulär
zu einer verstärkten Bildung von Rh123
(Abb. 4), wobei signifikante Ergebnisse
nur für die Extraktionen aus dem Überstand
erhalten wurden. Im Gegensatz dazu
war durch PETN keine signifikante Induktion
der Rh123­Bildung nachweisbar.
Die für GTN gezeigte initiale Zunahme
der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
legt den Schluss nahe, dass ein direkter Zusammenhang
mit der Metabolisierung besteht
(Abb. 1). Daher wurde die oxidative
Wirkung der organischen Nitrate im Folgenden
ebenfalls mit isolierten Mitochondrien
untersucht, deren Beteiligung an der
gesteigerten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
in mehreren Arbeiten gezeigt werden
konnte [8, 11, 24].
*
*
Organische Nitrate
Abb. 5: Nachweis der Bildung
reaktiver Sauerstoffspezies
in Mitochondrien. Dargestellt
sind der Anstieg der
Oxidation von DHR zu Rh123
in Rattenlebermitochondrien
nach 30 min Inkubation mit
10 μmol/l des jeweiligen
organischen Nitrates (A)
sowie die Rhodaminbildung
nach Inkubation mit 10
μmol/l Benomyl, 1 mmol/l
Chloralhydrat bzw. 5 mmol/l
Propionaldehyd (B) (*: signifikant
gegenüber unstimulierten
Zellen).
53

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Ein signifikanter Anstieg der Rhodaminfluoreszenz
konnte dabei nur nach
GTN­Inkubation beobachtet werden (Abb.
5), während in der Literatur eine gesteigerte
Bildung reaktiver Sauerstoffspezies auch
nach Mitochondrieninkubation mit ISMN,
ISDN und PETN beschrieben ist [11]. Die
dabei von den Autoren verwendeten Konzentrationen
der organischen Nitrate lagen
allerdings um den Faktor 5–500 höher als
die für unsere Arbeiten verwendeten Konzentrationen,
von denen unter unseren
Versuchsbedingungen nur GTN eine
inhibitorische Wirkung auf die ALDH­2­
Aktivität aufweist. Dementsprechend resultierte
auch die Inkubation isolierter Mitochondrien
mit den ALDH­Inhibitoren
Benomyl und Chloralhydrat sowie die
Zugabe eines Aldehyds in einer signifikanten
Steigerung der Rhodaminbildung
(Abb. 5).
Diese Ergebnisse zeigen, dass eine
Hemmung der Aldehyddetoxifizierung
durch Hemmung oder Überlastung der
ALDH­2 zu einer vermehrten Rhodaminbildung
führt. Im Einklang damit bewirkte
GTN nach Überexpression der ALDH­2
eine verminderte Rhodaminbildung (Daten
nicht gezeigt). Dies erlaubt den Schluss,
dass die vorhandene ALDH­2­Aktivität
entscheidend die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
beeinflusst.
Damit konnte gezeigt werden, dass GTN
von den getesteten organischen Nitraten
die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies am
stärksten steigert, wohingegen PETN unter
unseren Versuchsbedingungen weder nach
Inkubation von Zellen noch nach Inkubation
isolierter Mitochondrien zu einer signifikanten
Zunahme der Rhodaminbildung
im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen
führte. Diese Beobachtung liefert eine Erklärung
für die unter GTN­Therapie beobachtete
starke Toleranzentwicklung, die im
Fall von PETN so gut wie gar nicht beobachtet
wird [4]. Hierbei scheint im Besonderen
die mitochondriale Bildung reaktiver
Sauerstoffspezies von Bedeutung zu sein,
die durch die starke Inhibition der ALDH­
2­Dehydrogenaseaktivität durch GTN begünstigt
zu werden scheint. Reaktive Sauerstoffspezies
könnten durch die Peroxidation
von Lipiden (LPO) intrazellulär zur
Akkumulation toxischer Aldehyde führen,
die zum einen kompetitiv die Aktivierung
der organischen Nitrate inhibieren und
zum anderen selbst zu einer weiteren Stei­
gerung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
beitragen [25, 26], sodass diese Veränderung
des Redoxgleichgewichts zur
Oxidation des enzymatischen Zentrums
der ALDH2 führt und diese so inhibiert
wird [5]. Gestützt wird diese Theorie durch
die Arbeit von Jurt et al, in der gezeigt wurde,
dass es im Plasma von gesunden Patienten
zu einem Konzentrationsanstieg von
toxischen Aldehyden kommt, wenn diesen
über einen Zeitraum von sieben Tagen
eine Dosis von 0,6 mg/h GTN appliziert
wurde [27]. n
Summary
Organic nitrates are very potent antianginal
pharmaceuticals in the treatment of acute
angina pectoris, but long­term therapy is
limited due to the development of nitrate
tolerance. Tachyphylaxis is associated with
an increased formation of reactive oxygen
species (ROS). The observation that the
metabolizing enzyme of organic nitrates,
the mitochondrial aldehyde dehydrogenase
(ALDH2), is inhibited by oxidation links
mechanism­based tolerance to the oxidative
stress concept.
In order to explain the difference in the
tolerance to distinct nitrates, we measured
their ability to induce ROS formation in
endothelial cells (EA.hy.926) and mitochondrial
preparations, using dihydrorhodamine
123 (DHR123) as indicator.
DHR123 is oxidized by ROS to the fluorescent
dye rhodamine 123 (R123), which was
reported to accumulate intracellularly.
We found that increasing incubation
time led to a decrease in the fluorescence
intensity of cells exposed to glycerol trinitrate
and we decided therefore to measure
the extracellular concentration of R123 to
exclude diffusion of the dye. The detection
of R123 outside of the cells suggests that
results must be interpreted carefully when
using R123 intracellular concentrations as
an indicator of ROS formation, because
processes like active transport or opening
of mitochondrial permeability transition
pores can influence the localization of the
dye. With this method we could show that
isosorbide dinitrate, glycerol trinitrate and
pentaerythrityl tetranitrate affect ROS formation
to a different extent in EA.hy.926
and mitochondria. Since ALDH2 inhibition
with benomyl and chloral hydrate or
incubation with an aldehyde leads to increased
ROS formation in mitochondria,
54 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

we speculate that GTN affects ROS formation
more than other nitrates due to its
strong inhibitory effect on ALDH2­dehydrogenase
activity.
Keywords: organic nitrates – reactive oxygen
species – dihydrorhodamine 123 –
mitochondrial aldehyde dehydrogenase
Literatur
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Für die Verfasser:
Dr. Tim Bauer
Uniklinik Köln, Institut für Pharmakologie
Gleueler Straße 24
50931 Köln, Germany
Tel.: +49 (0) 221 4786038
Fax: +49 (0) 221 4785022
E-Mail: tim.bauer@uk-koeln.de
Organische Nitrate
55

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
1 Institut für Pharmakologie,
Universitätsmedizin der
Johannes Gutenberg-
Univer-sität, Mainz,
Deutschland
2 II. Medizinische Klinik, Universitätsmedizin
der Johannes
Gutenberg-Universität, Mainz,
Deutschland
56
Regulation der Genexpression
durch organische Nitrate
Andrea Pautz 1 , Peter Rauschkolb 1 , Julia Art 1 , Cornelia Voss 1 , Susanne Karbach 1 ,
Philip Wenzel 2 , Matthias Oelze 2 , Ulrich Förstermann 1 , Andreas Daiber 2 , Hartmut Kleinert 1
Zusammenfassung: Stickstoffmonoxid
(NO) hat weitreichende Effekte auf die
Genexpression. Dabei werden Wirkungen
auf die Aktivität von Genpromotoren
(Transkription) sowie die Stabilität und
Translatierbarkeit von mRNAs und die
Stabilität von Proteinen (posttranskriptionelle
Effekte) beschrieben. Auch die Induktion/Änderung
posttranslationaler Modifikationen
von Proteinen durch NO ist
bekannt.
Seit mehr als 100 Jahren werden organische
Nitrate (wie Nitroglycerin, NTG und Pentaerithrityltetranitrat,
PETN) als Therapeutika
zur Behandlung der Angina pectoris, des
Herzinfarkts und der Herzinsuffizienz eingesetzt.
Organische Nitrate werden als (indirekte)
Donoren für NO angesehen und
ihre kardiovaskulären Effekte werden der
NO-Freisetzung zugeschrieben.
Es gibt nur wenig Berichte der expressionellen
Effekte von organischen Nitraten,
wobei zumeist die Wirkungen von NTG
analysiert wurden. Neuere Daten zeigen,
dass unterschiedliche Nitrate (wie z.B.
NTG oder PETN) unterschiedliche Wirkungen
auf die Genexpression haben können.
So erhöht PETN z.B. die Expression
Ebene der Regulation der Genexpression
Alle Informationen, die zur Ausbildung
und Aufrechterhaltung eines Organismus
notwendig sind, finden sich in der DNA (in
den Genen), die bei tierischen Zellen im
Zellkern zu finden ist (Ausnahme mitochondriale
DNA). Die Regulation der Expression
der Gene bestimmt daher das Aussehen
und die Fähigkeiten jeder einzelnen
Zelle und mithin des Gesamtorganismus.
Dabei kann die Genexpression auf verschiedenen
Ebenen reguliert werden (Abb.
1). Ein wichtiger Schritt ist die Regulation
der Aktivität der DNA-Abschnitte, die als
Promotoren über die Transkription der
nachfolgenden Gensequenzen entscheiden.
der antioxidativ wirkenden Hämoxygenase
I (HO-1) oder der schweren Kette des Ferritins
(FeHc) in Endothelzellen, während
NTG dies nicht vermag.
Unsere Analysen der durch NTG bzw.
PETN bewirkten Veränderungen der totalgenomischen
Expressionsprofile im Rattenherz
zeigen deutliche Unterschiede der
Effekte, die durch diese beiden Nitrate induziert
werden. Eine genaue Auswertung
dieser Genexpressionsprofile legt nahe,
dass eine NTG-Behandlung die Induktion
kardiotoxischer Expressionsnetzwerke bedingt,
die zur Aktivierung pathophysiologischer
Prozesse führen. Dagegen scheint
eine PETN-Behandlung Expressionsnetzwerke
zu induzieren, die eine kardioprotektive
Funktion haben.
Diese Daten erklären vielleicht teilweise
den Befund, dass Langzeit-Behandlung mit
NTG anscheinend mit einem erhöhten kardiovaskulären
Todesfallrisiko verbunden
ist.
Schlüsselwörter: Nitroglyzerin (NTG) –
Pentaerithrityltetranitrat (PETN) – Genexpression
– totalgenomische Expressionsprofile
– Microarray-Technik – Kardiotoxizität
Dabei hat neben dem Verpackungsgrad der
DNA (Histonmodifikationen etc.) auch die
An- bzw. Abwesenheit von Transkriptionsfaktoren
(TF), die an diese Promotorsequenzen
binden, eine zentrale Bedeutung
[1]. Die Transkription ergibt dann eine
Vorläufer-RNA (hnRNA), die durch komplexe
und z.T. stark regulierte Reifungsschritte
(Capping, Splicing, Polyadenylierung)
eine reife Boten-RNA (mRNA) ergibt.
Dabei wird die hnRNA in Protein/
RNA-Komplexe verpackt, die für die Prozessierungsschritte
eine wichtige Rolle
spielen. Schon im Zellkern kann auch die
Stabilität der mRNA reguliert werden. Die
reife mRNA muss nun in das Zytoplasma
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

der Zellen exportiert werden. Auch die Lokalisation
von mRNAs (Kern/Zytoplasma)
kann die Expression der kodierten Proteine
beeinflussen. Im Zytoplasma kann nun die
Stabilität sowie die Translatierbarkeit der
mRNA eine Regulation unterliegen, wobei
an spezifische RNA-Sequenzen binden
RNA-bindende Proteine (RNA-BP) eine
zentrale Rolle spielen [2]. Diese posttranskriptionellen
Prozesse spielen z.B. bei
der Regulation der Expression vieler immunmodulatorischer
Proteine eine sehr
wichtige Rolle. Die entstehenden Proteine
unterliegen hinsichtlich ihrer Stabilität und
Lokalisation in der Zelle auch vielfachen
Kontrollmechanismen.
Regulation der Genexpression
durch Stickstoffmonoxid (NO)
In der Literatur finden sich viele Beispiele
für eine Modulation der Genexpression
durch NO [3, 4] (Abb. 2). Dabei sind sowohl
transkriptionelle wie posttranskriptionelle
NO-abhängige Mechanismen beschrieben
worden. Einmal kann NO über dieAktivierung
der löslichen Guanylatcyclase
(sGC) die Menge an zyklischem Guanosinmonophosphat
(cGMP) erhöhen und damit
über die Aktivierung der cGMP-abhängigen
Proteinkinasen (PKGs) in die Regulation
der Genexpression eingreifen. Die
PKGs können dann posttranslationale
Modifizierungen von für die Regulation der
Expression wichtigen Proteinen wie TF
oder an die RNA-BP induzieren. Es wurden
aber auch cGMP-unabhängige Effekte
von NO auf die Genexpression beschrieben.
Hier führt NO direkt zu einer posttranslationalen
Modifizierung der TF und RNA-
BP, wobei Nitrierungen und S-Nitrosylierungen
dieser Proteine beschrieben wurden.
Die transkriptionelle Regulation NOregulierter
Gene beruht einmal auf der
cGMP-mediierten Modulation der Aktivität
von TF wie z.B. CREB (cAMP-response
element binding protein) oder NFAT (nuclear
factor of activated T cells) [5]. Zum
anderen kann NO auch cGMP-unabhängig
die Aktivität verschiedener TF wie NF-πB
(nuclear factor-πB), AP-1 (activating protein
1), NRF2 (NF-E2-related factor 2)
oder Egr-1 (early growth response 1) [6]
beeinflussen. Neben der Regulation der
Promotoraktivität sind aber auch posttranskriptionelle
Mechanismen für die
NO-modulierte Genexpression von ent-
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Transkriptionsfaktoren
Promotor
Nukleus
Zytoplasma
hnRNA
Cap
Genomische DNA
I 1 I 2 I 3 I 4
Translation
(Initiation, Elongation)
Capping, poly A
Protein
RNA Splicing
scheidender Bedeutung [3]. So reguliert
NO die Gen-Expression (zumindest teilweise)
auf der Ebene der mRNA-Stabilität
wie z.B. die Expression der Matrixmetalloproteinase
9 (MMP9 [7]) oder der Hämoxygenase-1
(HO-1 [8]). Daneben wurde
auch eine NO-abhängige Regulation der
Translation beschrieben wie z.B. bei der
Translation der mRNA für die schwere
Kette des Ferritins (FeHc [9]). Diese Regu-
E 1
E 2 E 3 E 4 E 5
RNA Export
mRNA AAAAA
Translation RNA
Initiation, Elongation bindende
Proteine
Ubiquitinligasen
Proteasom
Organische Nitrate
poly A
AAAAA
Degradation
Degradation
Degradation
Abb. 1: Ebene der Regulation der Genexpression bei Eukaryoten. Dargestellt sind
die verschiedenen Ebenen, auf denen die Genexpression in eukaryoten Zellen
reguliert werden kann.
Enzyme
sGC
Mitochondriale
Funktion
mRNA-Stabilität
HO1
MMP9
TfR
NF-κB
AP1
Zinkfinger-TF
NO Transkription
Translation
FeHc
NRF2
Membranproteine
Transporter, Kanäle
Hemmung
Aktivierung
Abb. 2: Regulation der Genexpression durch NO. NO kann über die Aktivierung der
sGC und damit folgend durch Erhöhung der cGMP-Konzentration oder direkt
durch Wechselwirkungen mit vielfältigen Proteinen (Enzyme, Kanäle, Transporter,
Transkriptionsfaktoren, RNA bindende Proteine) verschiedene zelluläre Prozesse
wie auch die Genexpression beeinflussen.
57

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
A
% mRNA in der Aorta von
mit EtOH behandelten Tieren
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
FeHc
ns
HO-1
ns
EtOH NTG EtOH NTG
% mRNA in der Aorta von
mit DMSO behandelten Tieren
300
250
200
150
100
50
0
FeHc
DMSO PETN DMSO PETN
Abb. 3: Die Wirkung von NTG bzw. PETN auf die Expression der Hämoxygenase I
(HO-1) und der schweren Kette des Ferritins (FeHc) in Aorten von Ratten. Männliche
Wistar-Ratten wurden für vier Tage mithilfe von mikroosmotischen Pumpen
(Alznet) mit NTG (6,6 μg/kg/min) oder PETN (10,5 μg/kg/min; bzw. den zugehörigen
Lösungsmitteln EtOH oder DMSO) behandelt. Dann wurden die Tiere getötet
und Organe (Aorta, Herz etc.) entnommen. Die RNA wurde aus den Organen
isoliert und für DNA-Microarray-Analysen oder qRT-PCR-Untersuchungen eingesetzt.
Gezeigt sind Ergebnisse der qRT-PCR-Analysen mit RNA aus den Aorten.
Dabei wurde die mRNA-Expression der Hämoxygenase I (HO-1) bzw. der schweren
Kette des Ferritin (FeHc) auf die Expression des Haushaltsgens GAPDH bezogen
(*: p < 0,05, ns: nicht signifikant verschieden vs. mit Lösungsmittel behandelte
Tiere).
B
lation der mRNA-Stabilität bzw. -Translation
erfolgt dabei über Modulation der
Aktivität/Expression von RNA-BP wie
HuR (human antigen R) oder dem IRP-1
(iron responsive element binding protein-
1). Schließlich kann NO auch die Stabilität
von Proteinen regulieren, wie am Beispiel
des Hypoxie-induzierten Faktors-1 (HIF-
1) beschrieben wird [10].
Wirkungen von organischen Nitraten
auf die Genexpression
Organische Nitrate werden als indirekte
NO-Donatoren angesehen. Daher ist es
sehr wahrscheinlich, dass auch organische
Nitrate (zumindest bei längerer Anwendung)
Effekte auf die Expression multipler
Gene haben (Tab. 1). So wurde gezeigt, dass
NTG z. B. die c-fos-, COX-2-, Bcl2- und
nNOS-Expression im Gehirn und der eNOS
in Aorten von Ratten erhöht. Mithilfe von
DNA-Microarray-Analysen zeigten Wang
et al eine NTG-abhängige Regulation der
Expression von 290 Genen in Aorten von
NTG-behandelten Ratten [11].
Es gibt auch einige Analysen zu den expressionellen
Wirkungen des organischen
Nitrats PETN (Tab. 1). PETN, aber nicht
NTG, erhöht in humanen Endothelzellen
und Aorten von Schweinen die Expression
*
von antioxidativ wirkenden Proteinen wie
HO-1 und FeHc [12]. Auch in den Aorten
von Ratten konnte dieser Unterschied der
beiden organischen Nitrate auf die FeHc-
bzw. HO-1-Expression von den Autoren
beobachtet werden (Abb. 3). Diese Unterschiede
in der Wirkung von PETN bzw.
NTG auf die Expression antioxidativer
Proteine könnte die Unterschiede in der
Produktion reaktiver Sauerstoffspezies
(ROS) durch diese organischen Nitrate zumindest
zum Teil erklären.
Die molekularen Mechanismen, die
hinter diesen unterschiedlichen Effekten
stehen, sind noch nicht vollständig klar.
Vergleicht man die DNA-Sequenzen der
5’-flankierenden genomischen Bereiche
(die Promotoren; 10 kb) des HO-1-Gens in
verschiedenen Spezies (Ratte, Maus, Rhesus-Affe,
Schimpanse und Mensch), so
erkennt man Sequenzbereiche, die zwischen
diesen Spezies hoch konserviert sind
(Abb. 4). Solche Sequenzbereiche sind mit
hoher Wahrscheinlichkeit an der Regulation
der HO-1-Promotoraktivität beteiligt.
So findet sich in einem solchen Homologiebereich
auch die Konsensussequenz für die
Bindung des TF NRF2. So konnte z. B.
gezeigt werden, dass die Erhöhung der
HO-1-Expression in humanen SH-Sy5y-
Neuroblastom-Zellen durch Behandlung
mit dem NO-Donor DETA-NO von der
Anwesenheit des Transkriptionsfaktors
NRF2 abhängt [13].
Neben diesen transkriptionellen Wirkungen
von NO auf die HO-1-Expression, sind
auch posttranskriptionelle Prozesse
(mRNA-Stabilität und -Translatierbarkeit)
an der NO-abhängigen Regulation der HO-
1-Expression beteiligt. Die posttranskriptionale
Regulation der Genexpression ist häufig
von DNA- bzw. RNA-Sequenzen abhängig,
die sich in der 3’-untranslatierten Region
(3’-UTR) der mRNAs befinden [14,
15]. Vergleicht man nun die 3’-UTR-Sequenzen
der HO-1-mRNA verschiedener
Spezies (Abb. 5a), so findet man auch hier
Sequenzbereiche mit hoher Homologie. Bildet
man nun aus diesen Sequenzen eine
Konsensus-Sequenz, so erkennt man die
hohe Konservierung von AU-reichen Elementen
(ARE) in der 3’-UTR-Sequenz der
HO-1-mRNA (Abb. 5b). An solche ARE
können verschiedene RNA-BP (dann ARE-
BP genannt) wie HuR binden, die die Stabilität
und Translatierbarkeit von mRNAs
regulieren. So fanden Kuwano et al. eine
58 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
HO-1
*

A
B NRF2
HuR-abhängige Stabilisierung der HO-1
mRNA in humanen und murinen Fibroblasten
nach Inkubation der Zellen mit dem
NO-Donor SperNO. [8].
In Transfektionsexperimenten mit humanen
Endothelzellen konnten die Autoren
zeigen (Abb. 6), dass die 3’-UTR der
humanen HO-1-mRNA einen destabilisierenden
Effekt auf ein Reportergen ausübt.
Somit scheint die HO-1-mRNA-Stabilität
in humanen Zellen von der 3’-UTR-Sequenz
negativ reguliert zu werden. Wurden
die Endothelzellen nach der Transfektion
mit PETN behandelt, ergab sich eine Stabilisierung
der Reporter-mRNA. Diesen
Effekt zeigte die Behandlung mit NTG
nicht. Somit scheint die PETN-induzierte
Erhöhung der HO-1-Expression in Endothelzellen
mindestens zum Teil durch post
transkriptionelle Erhöhung der mRNA-
Stabilität bedingt zu sein.
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
DNA-Microarray-Analysen zur Analyse
der Wirkungen von NTG bzw. PETN
auf die Genexpression in Rattenherzen
Um die expressionellen Wirkungen von
NTG und PETN näher zu analysieren, wurden
DNA-Microarray-Analysen durchgeführt
[16]. Mithilfe dieser Technik kann die
Expression aller mRNAs, die von einer
Zelle bzw. einem Gewebe/Organ gebildet
werden können (Expressionsprofile), analysiert
werden (Abb. 7).
Zur Bestimmung der Effekte von NTG
bzw. PETN auf das Expressionsprofil in
Rattenherzen wurden Ratten für vier Tage
mit NTG oder PETN behandelt, die Herzen
entnommen, die RNA präpariert und
diese RNA für die Experimente eingesetzt.
Wie diese DNA-Microarray-Analysen zeigen,
führte die NTG-Behandlung zur
Veränderung der Expression von mehr als
530 Genen. Bei der PETN-Behandlung
Organische Nitrate
Abb. 4: Vergleich der Promotorsequenzen des HO-1-Gens in verschiedenen Spezies. A: Mit Hilfe des Programms ECR-Browser (http://
ecrbrowser.dcode.org/) wurde die 5’-flankierenden Sequenzen (10 kb) des HO-1-Gens des Menschen mit denen der Maus, der Ratte,
des Rhesus-Affen und des Schimpansen (Schimp) verglichen. Als Spannbreite des Suchrasters wurden 10 bp vorgegeben und als minimale
Homologie 90%. Die Höhe der Kurven (50% < x < 100%) zeigt die Homologie an. Die Farbmarkierung ist folgende: rot = intergenische
Bereiche; grün = einfache Sequenzwiederholungen („repeats“); gelb = UTR (untranslatierte Bereiche der mRNA); blau = kodierende
Exons; lachsfarben = Intronsequenzen; rosa = evolutionär konservierte Regionen (ECR; jeweils oberhalb der Sequenzen). Es sind
deutlich Sequenzbereiche mit hohen Homologien zu erkennen. B: Darstellung der Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren im
humanen HO-1-Promotor (10 kb). Die rot markierten Namen stehen für Transkriptionsfaktoren, deren Bedeutung für die HO-1-Expression
schon experimentell bestätigt wurde.
Ratte
Maus
Rhesus
Schimp
59

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
wurde die Modulation der Expression von
über 1200 Genen beobachtet. Interessanterweise
wurden nur etwa 70 Gene in
ihre Expression sowohl von NTG als auch
von PETN moduliert [16]. Diese geringe
Zahl der von beiden organischen Nitraten
regulierten Gene zeigt schon an, dass
PETN und NTG sehr unterschiedliche Effekte
auf die Genexpression vermitteln.
Effekte von NTG bzw. PETN
auf die Expression von Markergenen
für kardiotoxische Prozesse
Eine genauere Auswertung der erhaltenen
Genexpressionsprofile zeigt (Abb. 8), dass
die NTG- (aber nicht die PETN-)Behandlung
die Expression von (Marker-)Genen
verstärkt, deren Expression bei kardiovaskulären
Erkrankungen erhöht ist (z.B.
HuR
Abb. 5: Vergleich der Sequenzen des 3’-UTR der HO-1 mRNA in verschiedenen Spezies. A: Mithilfe des Programms ECR-Browser wurde
die 3’-untranslatierte Region (3’-UTR) der humanen HO-1-mRNA mit der der Maus, der Ratte, des Rhesus-Affen und des Schimpansen
(Schimp) verglichen. Als Spannbreite des Suchrasters wurden 10 bp vorgegeben und als minimale Homologie 90%. Die Höhe der Kurven
(50% < X < 100%) zeigt die Homologie an. B: Mithilfe des Programms RNAlogo (http://rnalogo.mbc.nctu.edu.tw/createlogo.html)
wurde eine Konsensus-Sequenz für die 3’-UTR der HO-1-mRNA des Menschen, der Maus, der Ratte, des Rhesus-Affen und des Schimpansen
erstellt. Dabei gibt die Größe der Buchstaben die Häufigkeit des Auftretens der spezifischen Base an. AU-reiche Bereiche sind
rot umrandet. Eine putative Bindungsstelle für das RNA-BP HuR ist markiert.
ANP; Literatur siehe [16]). Ebenso reduziert
die NTG-, aber nicht die PETN-Behandlung
die Expression von Genen, die als
kardioprotektive Gene publiziert wurden.
PETN induziert dagegen die Erhöhung der
Expression von Genen, die als Schutzfaktoren
gegen pathologische Veränderungen
im Herzen beschrieben wurden, und senkt
die Expression von Genen, die als negative
Faktoren der Pathogenese verschiedener
Herzerkrankungen beschrieben wurden.
Analysiert man nun z. B. die Promotorsequenz
des ANP-Gens in verschiedenen
Spezies (Abb. 9), so finden sich wieder Sequenzbereiche,
die zwischen den Spezies
hoch konserviert sind und so wahrscheinlich
an der Regulation der Aktivität des ANP-
Promotors beteiligt sind. In diesen Sequenzbereichen
finden sich so auch die Konsen-
60 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Ratte
Maus
Rhesus
Schimp
A
B

a
Relative Luciferaseaktivität
[% von Kontrolle]
150
100
50
0
Kontrolle/EtOH
Kontrolle/DMSO
* **
3UTR/EtOH
3UTR/DMSO
Oligonukleotide (ODN),
die zu allen möglichen
Transkripten homolog sind
Annotation
der Gene
(Panther)
SAM-Analyse
(Tiger-MEV)
Aufbringen der
ODN auf
Glasträger
„Heat-Map“
Behandelt
Intensitätsverteilung
Unbehandelt
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
b
Relative Luciferaseaktivität
[% von EtOH bzw. DMSO]
1200
800
100
0
EtOH
RNA von
unbehandelten
Kontrollen
Alexa
546
ns
0 300 600 800 1200 1600 1800 2400 2600 2800 3000
3200 3600 3800 4000 4200 4800 5000 5400
SV40 late poly(A) signal
NTG
Alexa 546 Alexa 647
Normalisierung
(TIGR-MIDAS)
RNA von
behandelten
Proben
Fuoreszenz-
Markierung in der
RT-Reaktion
Pseudocoloured
Alexa
647
DMSO
Mischen und
Hybridisierung
*
PETN
Auslesen der
Fluoreszenz-Signale
(Scanarray-Express)
Organische Nitrate
Abb. 6: Posttranskriptionelle
Regulation der humanen HO-
1-Expression. A: Humane EA.
hy926-Endothel-Zellen wurden
mit einem Konstrukt
transfiziert, das den 3’-UTR
der humanen HO-1-mRNA
kloniert hinter ein Luciferase-
Reportergen enthält (3’-UTR;
siehe Darstellung des Konstruktes
in B). Als Kontrolle
erfolgte die Transfektion der
Zellen mit einem Reportergen-Konstrukt
ohne HO-1-3’-
UTR (Control). Die Zellen
wurden dann 24 h nach der
Transfektion mit den Lösungsmitteln
der organischen
Nitrate (EtOH bzw.
DMSO; wieder 24 h) behandelt
(** = p < 0,01; * = p < 0,05
vs. mit Control transfizierten
Zellen). Wie die Analyse der
durch die Konstrukte in den
Zellen induzierte Luciferase-
Aktivität zeigt, hat der 3’-UTR
der humanen HO-1-mRNA
einen negativen Einfluss auf
die Luciferase-Expression
(wahrscheinlich durch Destabilisierung
der mRNA).
B: EA.hy926-Zellen wurden
mit dem 3’-UTR-Konstrukt
transfiziert und nach 24 h
mit EtOH, DMSO, NTG oder
PETN (wieder 24 h) behandelt.
Wie die Analyse der
Luciferase-Aktivität der
Zellen zeigt, ändert NTG die
Expression des Reportergens
nicht. PETN erhöht dagegen
die Luciferase-Expression um
etwa das Zehnfache. Somit
scheint PETN abhängig von
der 3’-UTR der humanen
HO-1-mRNA die Stabilisierung
der Reporter-mRNA zu
induzieren.
Abb. 7: DNA-Microarray-Technik zur Analyse von Expressionsprofilen. Zur Bestimmung der Expression aller in einer Zelle (oder Organ/
Gewebe) exprimierten mRNAs wird die DNA-Microarray-Technik eingesetzt [17]. Bei dieser Methodik werden aus Zellen (bzw. Organen
oder Geweben) Total-RNA-Proben gewonnen. Diese RNAs werden dann unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase (RT-
Reaktion) in sogenannte komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Dabei werden für die RT-Reaktion mit den RNA-Proben unterschiedliche
Fluoreszenz-markierte Desoxyribonukleotide (dNTPs) eingesetzt. Somit erhält man zwei unterschiedlich markierte cDNAs,
die zu allen in den Zellen (Organen/Geweben) vorhandenen mRNAs komplementär sind. Diese markierten cDNAs werden dann mit
einem Glasträger (der Chip) inkubiert (Hybridisierung), auf den DNA-Oligonukleotide (etwa 30 000) aufgebracht wurden, die jeweils
zu einem Protein-kodierenden Gen des Organismus homolog sind. Somit erfasst dieser DNA-Chip die Expression aller Protein-kodierenden
mRNAs eines Organismus. Nach der Hybridisierung werden überflüssige cDNAs abgewaschen und dann der Glasträger
mithilfe eines „Microarray-Readers“ ausgelesen. Dieser „Microarray-Reader“ ist in der Lage, die Fluoreszenz der beiden eingesetzten
Farbstoffe anzuregen und die Intensität der Signale für jedes aufgebrachte Oligonukleotid (der „Spot“) zu bestimmen. Da die Intensität
der Fluoreszenz der eingebrachten cDNA-Menge und mithin der in der Zelle (Organ/Gewebe) exprimierten mRNA direkt proportional
ist, kann somit auf einem „Chip“ das Transkriptom der unbehandelten Zellen (Organ/Gewebe) mit dem der behandelten Zellen
(Organ/Gewebe) direkt verglichen werden. Durch statistische und bioinformatische Methoden können die Signale verschiedener
Experimente normiert und verglichen werden. Schlussendlich erhält man Listen von Genen, deren mRNA-Expression sich durch die
Behandlung ändert. Diese Listen können dann durch weitere Bioinformatik-Softwarepakete analysiert werden (Annotation der Gene,
Bezug der Daten zur vorhandenen Literatur).
61

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Abb. 8: Effekte der organischen
Nitrate auf die Expression
von Markergenen
für kardioprotektive bzw.
kardiotoxische Prozesse.
Gezeigt sind die Wirkungen
von NTG bzw. PETN auf die
Expression von Genen, die
als Markergene für die kardiovaskulärenPathogeneseprozesse
beschrieben wurden
( = kardioprotektiv, =
kardiotoxisch, = erhöhte
Expression, = erniedrigte
Expression, = keine Änderung).
Abb. 9: Vergleich der Promotorsequenzen
des ANP-Gens
in verschiedenen Spezies.
Mithilfe des im Internet frei
zugänglichen Programms
ECR-Browser (http://ecrbrowser.dcode.org/)
wurden
die 5’-flankierenden Sequenzen
(10 kb) des ANP-Gens des
Menschen mit denen der
Maus, der Ratte, des Rhesus-
Affen und des Schimpansen
(Schimp) verglichen. Als
Spannbreite des Suchrasters
wurden 10 bp vorgegeben
und als minimale Homologie
90%. Die Höhe der Kurven
(50% < x < 100%) zeigt die
Homologie an. Es sind deutlich
Sequenzbereiche mit
hohen Homologien zu erkennen.
sussequenzen für die Bindungsstellen der
TF CREB, NF-κB, Evi-1, Nkx2-5, NRF-2,
RORα1 und STAT. Insbesondere CREB,
NF-κB und STAT sind an inflammatorischen
Prozessen beteiligte Transkriptionsfaktoren
und NF-πB und STAT scheinen
die ANP-Expression zu beeinflussen [18,
19]. Inwieweit diese Faktoren an der NTGinduzierten
Erhöhung der ANP-Expression
beteiligt sind muss noch erforscht werden.
Analysiert man nun die 3`-UTR-Sequenzen
der ANP-mRNA in verschiedenen
Spezies (Abb. 10), so fallen auch ihre Bereiche
hoher Homologie auf. Hier finden
sich AREs, die als putative Bindungsstel-
len für RNA-BP dienen könnten, die die
Stabilität bzw. Translatierbarkeit der ANPmRNA
steuern. Inwieweit die NTG-induzierte
Erhöhung der ANP-Expression auf
posttranskriptionellen Prozessen beruht,
bei denen diese RNA-BP eine Rolle spielen,
muss noch untersucht werden.
Effekte von NTG bzw. PETN
auf die Expression von
Transkriptionsfaktoren im Rattenherz
Auch die Analyse der Expression von TF
(Abb. 11) zeigt, dass die Behandlung mit
NTG, nicht aber die Therapie mit PETN zu
der Induktion der Expression von TF führt,
Kardioprotektiv Kardiotoxisch
62 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Ratte
Maus
Rhesus
Schimp

die nach Literaturangaben (siehe [16]) in
kardiotoxische Prozesse beim Herzversagen
involviert sind. Zusätzlich vermindert
NTG, aber nicht PETN, die Expression von
„kardioprotektiven“ TF. Im Gegensatz dazu
führte die PETN-Behandlung zu der Erhöhung
der Expression verschiedener TF,
die in kardioprotektiven Expressionsnetzwerken
eine wichtige Rolle spielen.
Bioinformatische Analyse der Promotoren
der in ihrer Expression durch NTG oder
PETN regulierten Gene
Ein Ansatz, die unterschiedlichen Effekte
von NTG und PETN auf die Genexpression
zu erklären, liegt in der Vermutung, dass diese
organischen Nitrate die Aktivität von
Transkriptionsfaktoren unterschiedlich beeinflussen
könnten. Daher wurde eine bioinformatische
Analyse der Promotoren der
Gene, die durch NTG- bzw. PETN in ihrer
Expression im Rattenherz verändert wurden,
durchgeführt. Dabei wurden die Gene
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
HuR, KSRP ?
analysiert, die laut Literatur eine kardioprotektive
oder kardiotoxische Funktion bei der
Pathogenese von kardiovaskulären Erkrankungen
zeigen (21 Gene bei PETN und 18
Gene bei NTG). Wie Abbildung 12 darstellt,
führt diese bioinformatische Analyse zur
Identifizierung von 26 TF, die putative Bindungsstellen
in den Promotoren aller entweder
durch NTG oder PETN regulierten
Gene zeigen. Zusätzlich finden sich vier TF
(Elk-1, IRF-2, MEF-2A und XFD-3), die
putative Bindungsstellen in den Promotoren
von allen Genen zeigen, die von NTG reguliert
wurden. Die Faktoren zeigen dagegen
keine Bindungsstellen in den Promotoren
der durch PETN regulierten Gene. In der
Literatur gibt es Hinweise, dass diese
Transkriptionsfaktoren an pathologischen
Prozessen bei Erkrankungen des Herzens
beteiligt sind [20, 21]. Ob dieser Unterschied
die deutlichen Diskrepanzen zwischen den
Expressionseffekten von NTG bzw. PETN
erklärt, müssen weitere Analysen zeigen.
Organische Nitrate
Abb. 10: Vergleich der 3’-UTR-Sequenzen der ANP-mRNA in verschiedenen Spezies. A: ECR-Browser-Analyse der 3’-untranslatierten Region
(3’-UTR) der ANP-mRNA des Menschen, der Maus, der Ratte, des Rhesus-Affen und des Schimpansen (Schimp). Als Spannbreite des Suchrasters
wurden 10 bp vorgegeben und als minimale Homologie 90%. Die Höhe der Kurven (50% < x < 100%) zeigt die Homolgie an. B: Erstellung
einer Konsensussequenz 3’-UTR der ANP-mRNA des Menschen, der Maus, der Ratte, des Rhesus-Affen und des Chimpansen mithilfe des
Programms RNAlogo. AU-reiche Bereiche sind rot umrandet. Die putative Bindungsstelle für die RNA-BP HuR und KSRP ist markiert.
Ratte
Maus
Rhesus
Schimp
A
B
63

Herz Supplement
Cardiovascular Diseases
Abb. 11: Effekte der organischen
Nitrate auf die Expression
von Transkriptionsfaktoren.
Gezeigt sind die
Wirkungen von NTG bzw.
PETN auf die Expression von
für kardiovaskuläre Pathogeneseprozesse
relevanten
Transkriptionsfaktoren ( =
kardioprotektiv, = kardiotoxisch,
= erhöhte Expression,
= erniedrigte Expression,
= keine Änderung
der Expression; Erläuterungen
der Abkürzungen und
relevante Literatur in [16]).
Kardioprotektiv Kardiotoxisch
Abb. 12: Bioinformatische Analyse der Promotoren der durch NTG bzw. PETN regulierten „kardioprotektiven“ bzw. „kardiotoxischen“ Gene.
Aus der ENSEMBL-Datenbank (http://www.ensembl.org/index.html) wurden mithilfe der Toucan-Software (http://homes.esat.kuleuven.
be/~saerts/software/toucan.php; [22]) die 5’-flankierenden genomischen Sequenzen der Gene (Promotoren, jeweils etwa 10 000 Basenpaare
Sequenz; jeweils Mensch, Ratte, Maus, Rhesus-Affe und Schimpanse) extrahiert, die durch NTG bzw. PETN reguliert wurden und für die eine
Relevanz bei pathologischen Prozessen des Herzens publiziert war. Dann wurde das Vorhandensein von TF-Bindungsstellen in diesen Promotoren
mithilfe der P-Match-Software (http://www.gene-regulation.com; core similarity 0,9; matrix similarity 0,9; [23]) analysiert. Nur Bindungsstellen,
die in den Promotorsequenzen eines spezifischen Gens bei allen untersuchten Spezies zu finden waren, wurden herausgefiltert.
Gezeigt sind die TF, für die in den Promotoren der durch NTG regulierten Gene putative Bindungsstellen zu finden sind.
64 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel

Unterschiede in den freigesetzten NO-
Spezies erklären vielleicht die unterschiedlichen
expressionellen Wirkungen
von NTG und PETN
Eine mögliche Erklärung für die starken
Unterschiede der Effekte von NTG und
PETN auf die Genexpression könnte sein,
dass aus beiden Nitraten unterschiedliche
Vasodilatatoren freigesetzt werden. Es gibt
Publikationen, die zeigen, dass NTG in klinisch
relevanten Dosen (< 1 µM) gar kein
authentisches NO freisetzt. Weiterhin zeigen
diese Daten, dass die bei hohen suprapharmakologischen
Dosen von NTG messbare
NO-Freisetzung nicht mit der Relaxation
von Gefäßen korreliert [24, 25]. In allen
Publikationen, die eine NTG-abhängige
NO-Freisetzung beschreiben, werden hohe,
suprapharmakologische NTG-Konzentrationen
(>10 µM) verwendet (siehe [26]).
Dagegen ist aber klar gezeigt worden, dass
die NTG-vermittelte Vasodilatation von
der sGC abhängt [27]. Es gibt gute Belege,
dass NTG eine S-Nitros(yl)ierung von Proteinen
im Blut und Geweben induziert [28].
Somit könnte NTG entweder eine direkte
Bildung von S-Nitrothiolen oder die Entstehung
von einer bis jetzt nicht genauer
definierten Häm-NO-Spezies induzieren.
PETN scheint dagegen direkt authentische
NO freizusetzen [29]. Da NO (wie oben
dargestellt) die Aktivität/Expression verschiedener
TF und RNA-BP modifiziert,
könnte dies die Unterschiede in den gefundenen
Expressionsprofilen erklären.
Schlussfolgerungen
Die Daten der Expressionsstudie mithilfe der
DNA-Microarray-Technik legen den Schluss
nahe, dass eine NTG-Behandlung im Herzen
ein Netzwerk von TF aktiviert/induziert, das
kardiotoxische Prozesse begünstigt. Diese
Daten erklären vielleicht teilweise den Befund,
dass Langzeit-Behandlung mit NTG
mit einem erhöhten kardiovaskulären Todesfallrisiko
verbunden ist [30].
Eine PETN-Behandlung scheint dagegen
kein kardiotoxisches, sondern eher ein
kardioprotektives TF-Netzwerk zu aktivieren/induzieren.
Somit müsste die Prognose
von Patienten, die für längere Zeit mit
PETN behandelt werden, besser als im Fall
einer NTG-Behandlung sein. n
Summary
Nitric oxide (NO) has been described to
have multiple effects on gene expression.
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
NO regulates gene expression by modulating
the activity of transcription factors and
thereby the activity of the promoters of
NO-regulated genes. In addition, also posttranscriptional
effects of NO (mRNA-stability,
-translatability, -localization) and
also post-translational effects (Protein-stability,
-localization) have been described.
Organic nitrates like nitroglycerin (NTG)
and pentaerithrityl tetranitrate (PETN) are
used in the treatment of angina pectoris,
myocardial infarction, and congestive heart
failure. Organic nitrates are believed to be
donors for nitric oxide (NO) and their cardiovascular
effects are attributed to this
NO.
There are also reports showing effects of
organic nitrates (mostly NTG) on gene expression.
However, recent data show
marked differences in the effects of NTG
and PETN on expression of genes. For example,
in endothelial cells PETN but not
NTG enhances the expression of the antioxidative
protein heme oxygenase-I (HO-
1) or the heavy chain of ferritin (FeHc).
Analyses of the effects of NTG or PETN
on the total genomic expression profiles in
rat hearts indicate marked differences in
the expressional effects of these organic
nitrates. A close analysis of the expression
profiles induced by NTG or PETN indicate
that NTG-treatment results in the induction
of cardiotoxic gene expression networks
leading to an activation of mechanisms,
which result in pathologic changes in
cardiomyocytes. In contrast, PETN-treatment
seems to activate gene expression
networks, which result in cardioprotective
effects. These data may explain the described
adverse cardiovascular effect associated
with long-term NTG-treatment.
Keywords: Nitroglycerin (NTG) – pentaerithrityl
tetranitrate (PETN) – gene expression
– genomic expression profiles –
DNA microarrays – cardiotoxicity
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Für die Verfasser:
Prof. Dr. Hartmut Kleinert
Institut für Pharmakologie, Universitätsmedizin
der Johannes Gutenberg-
Universität, Obere Zahlbacher Str. 63
55101 Mainz, Germany
Tel.: +49 (0) 6131 17 9276
Fax: +49 (0) 6131 17 9042
66 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel