Dissertation Carolin Grundgeiger - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

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18 Material und Methoden Das im Folgenden beschriebene Verfahren wurde für alle immunhisto- chemischen Färbungen standardisiert an den Aortenbogensegmenten II und III angewandt. Die RAM-11-Färbung wurde zusätzlich an den Segmenten II, V und X der Aorta thoracalis sowie an ausgewählten Segmenten mit einer Plaquegröße von 1 mm² und 2 mm² durchgeführt. Zunächst wurden die Präparate schrittweise in Xylol und einer absteigenden Alkoholreihe (99-70 %) entparaffiniert und mit Aqua bidest. gespült. Anschließend wurden alle Färbungen außer der α-Aktin-Färbung für 15 min in Citratpuffer (10 mM, pH 6,0) bei 750 Watt in der Mikrowelle erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Um die endogene Peroxidase zu blockieren, wurden die Schnitte 30 min in einem mit 30%igem Hydrogenperoxid versetzten PBS-Puffer belassen (1 l Puffer = 8 g NaCl + 0,2 g KCl + 1,44 g NaH2PO4 + 0,24 g KH2PO4 in 1 l Aqua bidest., pH 7,4). Nach jedem Schritt wurden sie für 10 min mit PBS-Puffer gespült. Vor der Inkubation mit dem jeweils spezifischen Primärantikörper wurde zur Blockierung von unspezifischen Bindungen im Gewebe Normalserum aufgetragen, verdünnt in PBS und Rinderserumalbumin (Albumin Bovine Fraction V, Sigma Aldrich, St. Louis, USA). Die Präparate wurden dazu 10 min bei 37 °C in die feuchte Kammer gestellt. Als Sekundärantikörper wurde ein Brückenantikörper zugegeben, der sich an den Erstantikörper anlagert. In einem weiteren Schritt wurde als Detektionssystem ein Enzymkomplex aufgetragen, der an den Brückenantikörper bindet. Dieser wird durch Zugabe eines Färbekomplexes angefärbt. Nach Aufbringen des Primärantikörpers wurde nach jedem Schritt mit PBS-Puffer gespült und bei Raumtemperatur inkubiert. Die Farbintensität wurde regelmäßig unter dem Mikroskop kontrolliert. Durch zweimaliges Spülen mit PBS-Puffer wurde der Färbevorgang abgebrochen. Durch kurzes Eintauchen in Hämalaun-Lösung erfolgte die Gegenfärbung. Eingebettet wurden die Gefäßschnitte in Gelatine (Aquatex, Merck 8562). (Tab. 3)
Färbung Normalserum Primärantikörper Sekundärantikörper Detektionssystem Färbung Ram -11 α-Aktin Endothelin Kollagen Typ I/III PCNA Anti-NFκB Normal Horse Serum; Jackson Immuno Research Lab. Inc., West Grove, USA Normal Horse Serum; Jackson Immuno Research Lab. Inc., West Grove, USA Normal Horse Serum; Jackson Immuno Research Lab. Inc., West Grove, USA Nomal Rabbit Serum, Vectastain ABC Kit PK- 4500; Vector Laboratories, Burlingame, USA Normal Horse Serum; Jackson Immuno Research Lab. Inc., West Grove, USA Swine Serum; DAKO, Glostrup, Denmark Monoclonal Mouse Anti- Rabbit Macophage; Dako Corp., Carpinteria, USA Monoclonal Anti-Smooth Muscle Actin; Sigma Immuno Chemicals, St. Louis, USA Endothelin-1, Mouse monoclonal IgG; Oncogene Research Products, San Diego, USA Goat Anti-Type I/III Collagen IgG; Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, USA Monoclonal Antibody PCNA IgG; Immunotech, Marseille, France Mouse Anti-NFκB IgG p65 subunit monoclonal antibody; Chemicon International, Temecula, USA Biotinylated Mouse Antibody, Mouse UniTect ABC Kit; Calbiochem, San Diego, USA Biotinylated Anti-Mouse IgG, Vectastain ABC Kit PK-4002; Vector Laboratories, Burlingame, USA Biotinylated Anti-Mouse IgG, BA-2000; Vector Laboratories, Burlingame, USA Biotinylated Anti-Goat IgG, Vectastain ABC Kit PK-4500; Vector Laboratories, Burlingame, USA Biotinylated Mouse Antibody, Mouse UniTect ABC Kit; Calbiochem, San Diego, USA Rabbit Anti-Mouse IgG,Z0259; DAKO, Glostrup, Denmark Tab 3: Immunhistochemische Färbungen und verwendete Antikörper Avidin DH, Mouse UniTect ABC Kit; Calbiochem, San Diego, USA Avidin DH, Vectastain ABC Kit PK-4002; Vector Laboratories, Burlingame, USA Streptavidin Peroxidase conjugated; Jackson Immuno Research Lab. Inc., West Grove, USA Avidin DH, Vectastain ABC Kit PK-4005; Vector Laboratories, Burlingame, USA Avidin DH, Mouse UniTect ABC Kit; Calbiochem, San Diego, USA APAAP Mouse Monoclonal, D 651; DAKO Glostrup, Denmark Biotinylated horseradish peroxidase H, Mouse UniTect ABC Kit; Calbiochem, San Diego, USA Biotinylated horseradish peroxidase H, Vectastain ABC Kit PK-4002; Vector Laboratories, Burlingame, USA AEC Peroxidase Substrate Kit SK-4200; Vector Laboratories, Burlingame, USA Biotinylated horseradish peroxidase H, Vectastain ABC Kit PK-4005; Vector Laboratories, Burlingame, USA Biotinylated horseradish peroxidase H, Mouse UniTect ABC Kit; Calbiochem, San Diego, USA Fast Red Tablets; Roche Mannheim, Deutschland Material und Methoden 19
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