Dissertation Carolin Grundgeiger - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

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Material und Methoden
Das im Folgenden beschriebene Verfahren wurde für alle immunhisto-
chemischen Färbungen standardisiert an den Aortenbogensegmenten II und III
angewandt. Die RAM-11-Färbung wurde zusätzlich an den Segmenten II, V und
X der Aorta thoracalis sowie an ausgewählten Segmenten mit einer
Plaquegröße von 1 mm² und 2 mm² durchgeführt.
Zunächst wurden die Präparate schrittweise in Xylol und einer absteigenden
Alkoholreihe (99-70 %) entparaffiniert und mit Aqua bidest. gespült.
Anschließend wurden alle Färbungen außer der α-Aktin-Färbung für 15 min in
Citratpuffer (10 mM, pH 6,0) bei 750 Watt in der Mikrowelle erhitzt und danach
auf Raumtemperatur abgekühlt. Um die endogene Peroxidase zu blockieren,
wurden die Schnitte 30 min in einem mit 30%igem Hydrogenperoxid versetzten
PBS-Puffer belassen (1 l Puffer = 8 g NaCl + 0,2 g KCl + 1,44 g NaH2PO4 +
0,24 g KH2PO4 in 1 l Aqua bidest., pH 7,4). Nach jedem Schritt wurden sie für
10 min mit PBS-Puffer gespült. Vor der Inkubation mit dem jeweils spezifischen
Primärantikörper wurde zur Blockierung von unspezifischen Bindungen im
Gewebe Normalserum aufgetragen, verdünnt in PBS und Rinderserumalbumin
(Albumin Bovine Fraction V, Sigma Aldrich, St. Louis, USA). Die Präparate
wurden dazu 10 min bei 37 °C in die feuchte Kammer gestellt. Als
Sekundärantikörper wurde ein Brückenantikörper zugegeben, der sich an den
Erstantikörper anlagert. In einem weiteren Schritt wurde als Detektionssystem
ein Enzymkomplex aufgetragen, der an den Brückenantikörper bindet. Dieser
wird durch Zugabe eines Färbekomplexes angefärbt. Nach Aufbringen des
Primärantikörpers wurde nach jedem Schritt mit PBS-Puffer gespült und bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Farbintensität wurde regelmäßig unter dem
Mikroskop kontrolliert. Durch zweimaliges Spülen mit PBS-Puffer wurde der
Färbevorgang abgebrochen. Durch kurzes Eintauchen in Hämalaun-Lösung
erfolgte die Gegenfärbung. Eingebettet wurden die Gefäßschnitte in Gelatine
(Aquatex, Merck 8562). (Tab. 3)