Dissertation Carolin Grundgeiger - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

Material und Methoden 13
Die Reaktionen wurden in 96-well-PCR-Platten in Ansätzen von 10 μl in
Doppelbestimmungen durchgeführt. 3 μl cDNA wurden mit 1x SYBR ® Green
Mastermix, sowie forward- und reverse-Primern (Endkonzentration 300 nmol/l)
mit folgendem Thermoprofil inkubiert: 50 °C für 2 m in, 95 °C für 10 min,
40 Zyklen mit 95 °C für 15 sec, gefolgt von 1 min b ei 60 °C.
Zur relativen Quantifizierung wurde die 2 -∆∆C T -Methode angewandt. 22
2.4 Quantitative Bestimmung von MCP-1 mittels ELISA
Die Bestimmung des Monocyten-chemotaktisches-Protein-1 (MCP-1) erfolgte
mit Hilfe des humanen ELISA (enzyme-linked immuno-sorbent assay) Kit
Quantikine® (R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA) in (gekühlten)
Serumproben vom Versuchende. Nach Angaben des Herstellers eignet sich
dieser primär für humane Proben konzipierte Assay auch zur Messung des
Kaninchen-MCP-1-Antigens. Das Prinzip dieses kolorimetrischen Verfahrens ist
folgendes: Die Serumproben werden in eine 96-well-Mikrotiterplatte pipettiert,
die mit einem Anti-MCP-1-Antikörper beschichtet ist. In den Proben
vorhandenes MCP-1 bindet während einer ca. 2-stündigen Inkubationzeit an
die Antikörper. Anschließend werden mit Meerrettich-Peroxidase konjugierte
Anti-MCP-1-Antikörper auf die Platte gegeben und für weitere 2 h inkubiert.
Danach werden die an der Platte gebundenen Immunkomplexe mit dem
Färbesubstrat 3,3’5,5’-Tetramethylbenzidin (TMB) detektiert. Hierbei einsteht
ein blauer Farbstoff. Durch Zugabe von 0,3 M Schwefelsäure als Stopplösung
nach ca. 30 min wird die Reaktion abgebrochen und es erfolgt ein
Farbumschlag zu gelb. Dieses Reaktionsprodukt kann nun durch
Absorptionsmessung bei 450 nm in einem ELISA-Reader (DYNATECH
MR 7000, Guernsey, Großbritannien) quantifiziert werden. Die Absorption
korreliert mit der Menge an MCP-1, welches in der Probe enthalten war.
Anhand einer Standardkurve aus mitgelieferten Standards werden die
Messergebnisse ausgewertet. Alle Arbeitschritte wurden gemäß den Angaben
des Herstellers durchgeführt.