Dissertation Carolin Grundgeiger - TOBIAS-lib - Universität Tübingen
Dissertation Carolin Grundgeiger - TOBIAS-lib - Universität Tübingen
Dissertation Carolin Grundgeiger - TOBIAS-lib - Universität Tübingen
Erfolgreiche ePaper selbst erstellen
Machen Sie aus Ihren PDF Publikationen ein blätterbares Flipbook mit unserer einzigartigen Google optimierten e-Paper Software.
Material und Methoden 13<br />
Die Reaktionen wurden in 96-well-PCR-Platten in Ansätzen von 10 μl in<br />
Doppelbestimmungen durchgeführt. 3 μl cDNA wurden mit 1x SYBR ® Green<br />
Mastermix, sowie forward- und reverse-Primern (Endkonzentration 300 nmol/l)<br />
mit folgendem Thermoprofil inkubiert: 50 °C für 2 m in, 95 °C für 10 min,<br />
40 Zyklen mit 95 °C für 15 sec, gefolgt von 1 min b ei 60 °C.<br />
Zur relativen Quantifizierung wurde die 2 -∆∆C T -Methode angewandt. 22<br />
2.4 Quantitative Bestimmung von MCP-1 mittels ELISA<br />
Die Bestimmung des Monocyten-chemotaktisches-Protein-1 (MCP-1) erfolgte<br />
mit Hilfe des humanen ELISA (enzyme-linked immuno-sorbent assay) Kit<br />
Quantikine® (R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA) in (gekühlten)<br />
Serumproben vom Versuchende. Nach Angaben des Herstellers eignet sich<br />
dieser primär für humane Proben konzipierte Assay auch zur Messung des<br />
Kaninchen-MCP-1-Antigens. Das Prinzip dieses kolorimetrischen Verfahrens ist<br />
folgendes: Die Serumproben werden in eine 96-well-Mikrotiterplatte pipettiert,<br />
die mit einem Anti-MCP-1-Antikörper beschichtet ist. In den Proben<br />
vorhandenes MCP-1 bindet während einer ca. 2-stündigen Inkubationzeit an<br />
die Antikörper. Anschließend werden mit Meerrettich-Peroxidase konjugierte<br />
Anti-MCP-1-Antikörper auf die Platte gegeben und für weitere 2 h inkubiert.<br />
Danach werden die an der Platte gebundenen Immunkomplexe mit dem<br />
Färbesubstrat 3,3’5,5’-Tetramethylbenzidin (TMB) detektiert. Hierbei einsteht<br />
ein blauer Farbstoff. Durch Zugabe von 0,3 M Schwefelsäure als Stopplösung<br />
nach ca. 30 min wird die Reaktion abgebrochen und es erfolgt ein<br />
Farbumschlag zu gelb. Dieses Reaktionsprodukt kann nun durch<br />
Absorptionsmessung bei 450 nm in einem ELISA-Reader (DYNATECH<br />
MR 7000, Guernsey, Großbritannien) quantifiziert werden. Die Absorption<br />
korreliert mit der Menge an MCP-1, welches in der Probe enthalten war.<br />
Anhand einer Standardkurve aus mitgelieferten Standards werden die<br />
Messergebnisse ausgewertet. Alle Arbeitschritte wurden gemäß den Angaben<br />
des Herstellers durchgeführt.