Dissertation Carolin Grundgeiger - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

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Material und Methoden
2.3.3 Reverse Transkription
Im Anschluss an die spektrophotometrische Messung der isolierten
Gesamt-RNA erfolgte die Reverse Transkription mit Hilfe des Applied
Biosystems High Capacity cDNA Archive Kit. Dabei wurde jeweils 1 μg RNA in
einem Reaktionsansatz von 30 µl (1x RT Puffer, 1x dNTPs, 1x Random
Hexamers, 0,4 U/µl RNase Inhibitor, 2,5 U/µl MultiScribe TM Reverse
Transkriptase) im Peltier Thermal Cycler DNA Engine PTC-200 (MJ
RESEARCH, Watertown, USA) zunächst 10 min bei 25 °C und dann 120 min
bei 37 °C inkubiert. Nach der RT-Reaktion wurden je weils 45 µl H2O
zugegeben.
Alle cDNA-Proben wurden bis zur Verwendung in der PCR bei -20 °C gelagert.
2.3.4 Polymerasekettenreaktion
Die PCR wurde für diese Arbeit als Real-time-PCR in einem ABI PRISM ® 7000
Sequence Detection mit SYBR ® Green als Detektionsfarbstoff durchgeführt.
Das Prinzip der quantitativen Real-time-PCR beruht auf der enzymatischen
Vermehrung eines spezifischen DNA-Abschnittes durch Wiederholung der
Schritte Denaturierung, Annealing und Elongation. Dem Reaktionsansatz wird
hierbei der Fluoreszenzfarbstoff SYBR ® Green zugefügt, der unspezifisch in die
entstehende Doppelstrang-DNA interkaliert. Dadurch kommt es mit steigender
Zyklenzahl zu einem der Produktmenge proportionalen Anstieg der
Fluoreszenz. Die Quantifizierung basiert auf der Berechnung des Fluoreszenz-
Schwellenwertes, dem so genannten Threshold-Cycle oder CT-Wert. Dabei
handelt es sich um jenen PCR-Zyklus, in dem erstmals ein statistisch
signifikanter Anstieg der Reporterfluoreszenz über die Hintergrundfluoreszenz
hinaus zu verzeichnen ist. Zur Berücksichtigung der Variabilität in der initial
eingesetzten Gesamt-RNA erfolgte eine Normalisierung auf das Housekeeping-
Gen 18S rRNA, von dem angenommen wird, dass es in konstanter Menge im
Karotisgewebe exprimiert wird.