Dissertation Carolin Grundgeiger - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

Geräte:
- Autoklav: Varioklav Dampfsterilisator (H+P Labortechnik,
Oberschleißheim)
Material und Methoden 11
- Homogenisiergerät: Polytron ® PT-MR 3000 (Kinematica, Littau, Schweiz)
- Küvette: Micro Cell 4 Position (Beckman, Fullerton, USA)
- Real-time-PCR-Gerät: ABI PRISM ® 7000 Sequence Detection System
(Applied Biosystems, Foster City, USA)
- Spectrophotometer: DU ® 460 (Beckman, Fullerton, USA)
- Thermal Cycler: Peltier Thermal Cycler DNA Engine PTC-200
(MJ RESEARCH, Watertown, USA)
- PCR-Platten: 96-well-PCR-Platten (Greiner, Frickenhausen)
- Zentrifugen: Megafuge 1,0 R (Heraeus, Hanau)
2.3.2 RNA-Isolierung
Eppendorf Centrifuge 5417 R (Eppendorf, Hamburg)
Zur RNA-Isolierung wurden schockgefrorene Karotiden verwendet. Diese
wurden in 1,5 ml RNA-Bee TM RNA Isolation Solvent im Homogenisator
zerkleinert. Nach Zugabe von 300 µl Chloroform und 30 sec Vortexen wurden
die Proben 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Daran schloss sich ein
15-minütiger Zentrifugationsschritt (Eppendorf Centrifuge) bei 12 000 rpm und
4 °C an. Hierbei konzentriert sich die RNA in der w ässrigen Oberphase, die
abpipettiert, in ein neues Probengefäß überführt und nach Zugabe von 700 µl
Isopropanol für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die dabei
ausgefällte RNA war nach der folgenden Zentrifugation (15 min, 12 000 rpm,
4 °C) als Pellet zu sehen. Es folgten das Dekantier en des Überstandes, die
Zugabe von 1 ml 75%igem Ethanol und ein abschließender Zentrifugations-
schritt (8 min, 8 000 rpm, 4 °C). Danach wurde der Überstand abpipettiert, das
Pellet luftgetrocknet und in 30 µl autoklaviertem Aqua dest. gelöst.