Dissertation Carolin Grundgeiger - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

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10 Material und Methoden 25x dNTPs, 10x Random Hexamers und Multiscribe Reverse Transkriptase (50/µl)) - Applied Biosystems RNase Inhibitor Nr. N8080119 (Applied Biosystems, Foster City, USA) - SYBR ® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, USA) (enthält SYBR ® Green I dye, Ampli Taq Gold ® DNA Polymerase, dNTP Mix mit dUTP, Passive Reference I und optimierte Pufferkomponenten) - Primer Express ® Primer Design Software v2.0 - Primer (Invitrogen, Karlsruhe) (Tab. 2) Tab. 2: für die RT-PCR verwendete Primer Gen Primer Sequenz Housekeeping- Gen rabbit 18S rRNA forward TTCGTATTGCGCCGCTAGA rabbit 18S rRNA reverse TTGGCA AATGCTTTCGCTC Kollagen Typ I rabbit Typ I Collagen forward GGAGAGTACTGGATTGACCCCA rabbit Typ I Collagen reverse CATGTCGCAGAAGACCTTGATG Kollagen Typ VIII rabbit Typ VIII Collagen forward ACATGAAGGAAGTTCAACCGGT rabbit Typ VIII Collagen reverse CCCTCGTAAACTGGCTAATGGT VCAM-1 rabbit VCAM-1 forward ATATGGCTCATCATTCCGCAAG rabbit VCAM-1 reverse CATAGGCAGCCATTTCTTTCCA PDGF-β rabbit PDGF-β forward GCCCATCTACATCATCACCGA rabbit PDGF-β reverse CTGCAGGAAGGTGTGCTTGTT VEGF rabbit VEGF forward CTGCTGCAATGATGAAAGCCT rabbit VEGF reverse AGGTTTGATCCGCATGATCTG bFGF rabbit bFGF forward AGAAGAGCGACCCACACATCA rabbit bFGF reverse AACGGTTTGCACACACACCTT MCP-1 rabbit MCP-1 forward TGATCTTCATGACCAAACTGGC rabbit MCP-1 reverse ATCCTGGACCCACTTCTGCTT
Geräte: - Autoklav: Varioklav Dampfsterilisator (H+P Labortechnik, Oberschleißheim) Material und Methoden 11 - Homogenisiergerät: Polytron ® PT-MR 3000 (Kinematica, Littau, Schweiz) - Küvette: Micro Cell 4 Position (Beckman, Fullerton, USA) - Real-time-PCR-Gerät: ABI PRISM ® 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, USA) - Spectrophotometer: DU ® 460 (Beckman, Fullerton, USA) - Thermal Cycler: Peltier Thermal Cycler DNA Engine PTC-200 (MJ RESEARCH, Watertown, USA) - PCR-Platten: 96-well-PCR-Platten (Greiner, Frickenhausen) - Zentrifugen: Megafuge 1,0 R (Heraeus, Hanau) 2.3.2 RNA-Isolierung Eppendorf Centrifuge 5417 R (Eppendorf, Hamburg) Zur RNA-Isolierung wurden schockgefrorene Karotiden verwendet. Diese wurden in 1,5 ml RNA-Bee TM RNA Isolation Solvent im Homogenisator zerkleinert. Nach Zugabe von 300 µl Chloroform und 30 sec Vortexen wurden die Proben 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Daran schloss sich ein 15-minütiger Zentrifugationsschritt (Eppendorf Centrifuge) bei 12 000 rpm und 4 °C an. Hierbei konzentriert sich die RNA in der w ässrigen Oberphase, die abpipettiert, in ein neues Probengefäß überführt und nach Zugabe von 700 µl Isopropanol für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die dabei ausgefällte RNA war nach der folgenden Zentrifugation (15 min, 12 000 rpm, 4 °C) als Pellet zu sehen. Es folgten das Dekantier en des Überstandes, die Zugabe von 1 ml 75%igem Ethanol und ein abschließender Zentrifugations- schritt (8 min, 8 000 rpm, 4 °C). Danach wurde der Überstand abpipettiert, das Pellet luftgetrocknet und in 30 µl autoklaviertem Aqua dest. gelöst.
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62 Ergebnisse Tab. 8: Plaquefläche
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78 Ergebnisse 3.9 Zusammenfassung d
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80 Ergebnisse (p=0,0499). In der AU
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82 Ergebnisse gegenüber der Kontro
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88 Diskussion gefäßerweiternde Su
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92 Diskussion Herzfrequenz, des Blu
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138 Anhang Tab. 14: Fortsetzung MCV
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Danksagung An dieser Stelle möchte
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