Dissertation Carolin Grundgeiger - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

Material und Methoden 9
Das Gesamtcholesterin wurde nach der CHOD-PAP (Cholesterinoxidase-para-
Aminoantipyrin) Methode (Ecoline ® 25, Boehringer, Mannheim) gemessen,
Triglyceride mit der GPO-PAP (Glycerinphosphatoxidase-para-
Aminophenazon) Methode (Duo-S, Biomed Labordiagnostik GmbH,
Oberschleißheim). Zur Bestimmung der Lipoproteinfaktionen wurde EDTA-
Plasma in einer Ultrazentrifuge (Beckman, Ti 50,3 Rotor) bei 40 000 U/min und
10 °C für 18 h zentrifugiert. Zur Trennung von LDL- und HDL-Cholesterin, die
sich im Unterstand befinden, wurde ein Fällungsreagenz (Nr. 543 004, Roche
Diagnostics, Mannheim) verwendet und erneut bei 12 000 U/min für 2 min
zentrifugiert. Die LDL-Cholesterin-Konzentration ergibt sich aus der Differenz
des Cholesteringehalts des Unterstandes und HDL-Cholesterin-Konzentration.
Durch Subtraktion der Konzentrationen des HDL- und LDL-Cholesterins vom
Gesamtcholesterin wurde die VLDL-Cholesterin-Konzentration berechnet.
2.3 Real-time-RT-PCR
Mittels Real-time-RT (reverse transcription)-PCR (PolymeraseKettenReaktion)
wurde die mRNA-Expression von Kollagen Typ I und VIII, Vascular Cell
Adhesion Molecule (VCAM)-1, Platelet Derived Growth Factor (PDGF)-beta,
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), basic Fibroblast Growth Factor
(bFGF) und Monozyten-chemotaktisches-Protein (MCP)-1 in den rechten und
linken schockgefrorenen Karotiden (Kollagen Typ I nur an der rechten Karotis)
der Versuchstiere untersucht.
2.3.1 Verwendete Chemikalien und Geräte
Chemikalien:
- RNA-Bee TM RNA Isolation Solvent (Tel-Test, Frienswood, USA)
- Applied Biosystems High Capacity cDNA Archive Kit Nr. 4322171
(Applied Biosystems, Foster City, USA) (enthält 10x RT buffer,