Dissertation Carolin Grundgeiger - TOBIAS-lib - Universität Tübingen
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Material und Methoden 9<br />
Das Gesamtcholesterin wurde nach der CHOD-PAP (Cholesterinoxidase-para-<br />
Aminoantipyrin) Methode (Ecoline ® 25, Boehringer, Mannheim) gemessen,<br />
Triglyceride mit der GPO-PAP (Glycerinphosphatoxidase-para-<br />
Aminophenazon) Methode (Duo-S, Biomed Labordiagnostik GmbH,<br />
Oberschleißheim). Zur Bestimmung der Lipoproteinfaktionen wurde EDTA-<br />
Plasma in einer Ultrazentrifuge (Beckman, Ti 50,3 Rotor) bei 40 000 U/min und<br />
10 °C für 18 h zentrifugiert. Zur Trennung von LDL- und HDL-Cholesterin, die<br />
sich im Unterstand befinden, wurde ein Fällungsreagenz (Nr. 543 004, Roche<br />
Diagnostics, Mannheim) verwendet und erneut bei 12 000 U/min für 2 min<br />
zentrifugiert. Die LDL-Cholesterin-Konzentration ergibt sich aus der Differenz<br />
des Cholesteringehalts des Unterstandes und HDL-Cholesterin-Konzentration.<br />
Durch Subtraktion der Konzentrationen des HDL- und LDL-Cholesterins vom<br />
Gesamtcholesterin wurde die VLDL-Cholesterin-Konzentration berechnet.<br />
2.3 Real-time-RT-PCR<br />
Mittels Real-time-RT (reverse transcription)-PCR (PolymeraseKettenReaktion)<br />
wurde die mRNA-Expression von Kollagen Typ I und VIII, Vascular Cell<br />
Adhesion Molecule (VCAM)-1, Platelet Derived Growth Factor (PDGF)-beta,<br />
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), basic Fibroblast Growth Factor<br />
(bFGF) und Monozyten-chemotaktisches-Protein (MCP)-1 in den rechten und<br />
linken schockgefrorenen Karotiden (Kollagen Typ I nur an der rechten Karotis)<br />
der Versuchstiere untersucht.<br />
2.3.1 Verwendete Chemikalien und Geräte<br />
Chemikalien:<br />
- RNA-Bee TM RNA Isolation Solvent (Tel-Test, Frienswood, USA)<br />
- Applied Biosystems High Capacity cDNA Archive Kit Nr. 4322171<br />
(Applied Biosystems, Foster City, USA) (enthält 10x RT buffer,