Kapillarelektrophorese - TCI @ Uni-Hannover.de

Instrumentelle MethodenTeil 2: KapillarelektrophoreseTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Gliederung• Prinzip• GerätetechnikKapillarenInjektionsmethodenDetektionsmethoden• Kapillarelektrophoretische Modi• BeispielgerätTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Prinzip der Kapillarelektrophorese• Kapillarelektrophorese:Trägerfrei in einemoffenen Rohr(Kapillare)• CE (capillary(electrophoresis)• Kapillarlängen:5-100 cm• Innendurchmesser derKapillare:20-200 200 µm+ -5-100 cm20-200 200 µmTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Prinzip der Kapillarelektrophorese• Trennmedien: Wäßrige Puffersysteme Stromtransport,konstanter pH-Wert• Beispiele:‣ Phosphat- und Citratpuffer bei saurem pH‣ Borat- und TRIS-Pufferbei basichen pH‣ Auch zwitterionische Puffer• Trennung bei elektrischer Feldstärke von mehrerenhundert V/cm• Resultierender Strom ist gering (im Bereich von 100 µA)• Detektion: on-Column UV-Absorption direkt durch dietransparente KapillareTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

• fused-SilicaSilica-Kapillare• Hochspannungs-versorgung• 2 Elektroden• Pufferreservoirs• On-ColumnColumn-Detektor• Moderne Geräte:‣ Probengeber‣ Fraktionssammler‣ HydrodynamischenInjektionssystem‣ Kapillarthermo-statisierungseinheitGerätetechnikTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Kapillaren• UV transparente Materialien:‣ fused-Silica amorpher Quarz‣ Borsilikatglas‣ Teflon• Geringer Durchmesser: Effiziente WärmeableitungW• Mechanische Stabilität: t: Außenoberflenoberfläche der Kapillaremit Polyimidschicht geschützt Entfernen für f Detektionnötig (Skalpell oder Flamme)TCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

• HydrodynamischeInjektion‣ Vakuum auf derDetektionsseite‣ Druck auf derEinlassseite‣ Gravitationskraftdurch Anhebender Einlassseite• ElektrokinetischeInjektionInjektionsmethodenTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Injektionsmethoden• Trenneffizienz der Kapillarelektrophorese‣ Geringes Injektionsvolumen keine Bandenverbreiterung• Gesamtvolumen der Kapillare wenige µl‣ Probenvolumen einige nl• Reproduzierbare Injektionsvolumina wichtig Routineanalytik• Probenvolumen V i bei der hydrodynamischen InjektionVi=4∆p⋅ Π ⋅r8 ⋅ η⋅L⋅ t‣ Abhängig von: Druckdifferenz ∆p, Injektionszeit t, Kapillarlänge L,Viskosität η, , Kapillarradius rTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Injektionsmethoden• ElektrokinetischeInjektion‣ AufgebrachtesProbenmenge nimmtmit der Mobilität derProben-Ionen zu‣ Injizierte Probenmengehängt von derProbenmatrix ab• HydrodynamischeInjektion‣ Unhabhängig ngig von derMobilität t derProbenmatrixElectrodeElectrodeTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Detektionsmethoden• Absorptions-Detektor⎛I⎞‣ Lambert-BeerscheBeersche-Gesetz= log⎜⎟ = ε ⋅c⎝ I ⎠‣ UV-Detektor‣ Diodenarray-Detektor Detektor (DAD)‣ Photodiodenarray-Detektor (PDA)‣ Empfindlichkeit: 10 -15- 10 -13mol‣ Anwendungen: Proteine, aromatischeVerbindungen0A ⋅ d• Indirekte UV-Detektion(Probenohne Absorption im UV-Bereich)‣ Puffer + Elektrolyt mit UV-Absorption Negatives Signal‣ Empfindlichkeit: 10 -16- 10 -13mol‣ Anwendungen: Organische undanorganische Ionen, ZuckerUV-DetektionDetektorzelleKapillareNegatives SignalTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Fluoreszenz-DetektorDetektionsmethoden‣ Molekülanregunglanregung Abgabe derAnregungsenergie durch spontane Emission(Fluoreszenz)‣ Signalintensität ist direkt proportional derIntensität der eingestrahlten Anregungsenergie‣ Lampenanregung:‣ Empfindlichkeit: 10 -18- 10 -13mol‣ Anwendungen: derivatisierte Aminosäuren,DNA, Peptide, Protein‣ Laserinduzierte Fluoreszenz:‣ Hohe Empfindlichkeit:10 -21- 10 -17mol‣ Anwendungen: DNA-Fragmente,derivatisierteAminosäurenTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007KapillareFluoreszenzInstitut fürTechnische Chemie

Detektionsmethoden• Massenspektrometrie-Detektor‣ Empfindlichkeit: 10 -17- 10 - 8 mol‣ Anwendungen: Proteine, Peptide, drug-monitoring‣ z.B. ESI-MS (Electrospray(Ionization)TCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

DetektionsmethodenEingesetzt werden auch:• Leitfähigkeitsdetektor• Elektrochemischer Detektor• Brechungsindexdetektor• Detektor für RadioisotopeTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Elektrophoretische Wanderung• Zunehmende Spannung und damit wachsende Feld-stärke E führt zu Erhöhung der elektrophoretischenWanderungsgeschwindigkeit v EPH der IonenLEFFvEPH= µEPH⋅E=t‣ Elektrophoretische Mobilität µ EPH , effektive Kapillarlänge L EFFMigrationszeit t M• Wanderndes Ion im elektrischen Feld unterliegtKräftegleichgewicht+K RE+zMK B-EFF ,K R = ReibungskraftK B = Beschleunigungskraftv EPHTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Elektrophoretische WanderungBeschleunigungskraft KBKB=z ⋅F⋅ENAReibungskraft KR (Stokesches(GesetzK R=6 ⋅ π ⋅ η⋅r⋅ vWanderungsgeschwindigkeit:vEPH=z ⋅F⋅E6 ⋅ π ⋅ η⋅r⋅NTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Az = effektive Ladung des IonsF = Faraday-KonstanteN A = Avogadrozahlη = dynamische Viskositätr = Stokescher Radius desIonsFür die elektrophoretische Mobilität µEPH ergibt sich damit:µEPH=6 ⋅z ⋅Fπ ⋅ η⋅r⋅NAInstitut fürTechnische Chemie

Elektrophoretische Wanderung• Anlegen von Spannung (10 bis 30 kV) Trennung aufgrundverschiedener Wanderungsgeschwindigkeiten der Probe imTrennpuffer• Berechnung der Mobilität µ EPH im elektrischen Feld EµEPH=LtMEFF⋅E⋅L⋅U‣ Elektrisches Feld fällt füber gesamte Länge Lder Kapillare ab (L GES‣ Moleküle durchwandern aber nur effektive Länge L(L EFF ) (bis zumDetektor) in der Migrationszeit (t M )=LEFFtMGESGES )Elektrophoretische Trennungen nur möglich mbei unterschiedlicherMobilität t der IonenTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Negativ geladeneKapillarwand (fused(silica)• Hydratisierte Kationenakkumulieren nahe derKapillarwand• Elektroosmotischen Fluß(EOF) in Richtung derKathode bei Anlegen eineselektrischen FeldesTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Trennungsprinzip‣ Interaktionen der Analyten mit dem EOF• Kationen wandern zur Kathode (negativer Pol)• Anionen wandern zu Anode (positiver Pol)TCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Unbehandelte Kapillaren (uncoated(uncoated)‣ Elektrophoretische Geschwindigkeit‣ Zusätzlich: Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Gesamtgeschwindigkeit:‣ Vektorielle Summe aus elektrophoretischer (v EPH ) undelektroosmotischer (v(EOF )GeschwindigkeitDiffuse Doppelschicht Zeta-PotenitalTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Ladungsunterschiede an derInnenseite der Kapillare (diffuseDoppelschicht) resultieren in Zeta-Potential (ζ)• Zeta-Potentialund damit der EOF istabhängig von der Dissoziation derSilanolgruppen und dadurch vom pH-Wert der Elektrolytlösung• Basischer pH EOF höher h her alsWanderungsgeschwindigkeit derIonen‣ Auch Anionen werden durch denEOF zur Kathode transportiert• Saurer pH EOF geringer alsWanderungsgeschwindigkeit derIonenTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Elektroosmotischer Fluss (EOF)• Flussprofil des EOF ist stempelförmigen‣ Bei konstantem Fluss trägt der EOF nicht zu Peakverbreiterungbei• Wanderungsgeschwindigkeit (v(EOF ) des EOF:ε ⋅E⋅ ζv EOF= 4 ⋅ π ⋅ η‣ Dielektrizitätskonstantetskonstante ε, Zeta-Potentialζ, , Viskosität ηTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Elektrischer StromflußElektrischer Stromfluss führt fzu JoulescherWärmeentwicklung‣ Wärmeabfuhr nur über Kapillarwand resultierenderTemperaturgradient‣ Maximale Trenneffizienz kleiner TemperaturgradientVerringerung KapillarinnendurchmesserFlüssigkssigkühlung der Kapillare‣ Temperaturgradient verursacht Viskositätsgradiententsgradienten Auswirkung aufs Flussprofil‣ Langsamere Wanderung im Bereich hoher Viskosität(Kapillarwand)‣ Schnellere Wanderung im Bereich geringer Viskosität(Kapillarmitte)TCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Kapillarzonenelektrophorese (CZE)• Trennung nach Unterschied inGröße und Ladung• Zunächst wird die Probe (AB) indie Kapillare injiziert• Unter Einfluss des elektrischenFeldes wird die Probe indiskrete Zonen (A und B)unterteilt, die ihrerseitsAnalyten mit der gleichenelektrophoretische Mobilitätenthalten• Puffer, pH-Wert, elektrischeFeldstärke bleiben konstantTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Kapillarzonenelektrophorese (CZE)TCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Peakverbreiterung• Peakverbreiterung Verursachung durch longitudinale Diffusion• Eingangsprofil sei unendlich schmal örtliche Varianzder Konzentrationsverteilung durch die Einstein-Gleichung bestimmt2σ = 2 ⋅D⋅ tz2σ zDiffusionskoeffizient D; Zeit t‣ Varianz und damit mit Peakverbreiterung nimmt mit der Zeit t zuTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

PeakshapeElektrodispersion zusätzlicherPeakverbreiterung‣ Elektrische Feldstärke nicht in gesamter Trennkapillare konstant gestört durch lokale Leitfähigkeitsunterschiede Mobilität t von Analyt-Ionund Puffer-Ion nicht ähnlich Konzentration Puffer-Ion ist nicht sehr viel größößer als Analyt-Ion (> Faktor 100)Mobilität t des Proben-IonuA < Puffer-IonuCE Peak-TailinguA > uCE Peak-Leading(Fronting)TCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

• Auflösung R zweier PeaksAuflösung‣ Migrationszeiten t 1 und t 2 zweier aufeinanderfolgender Peaks;gemittelte Standardabweichungσ tRt• Einsetzen der entsprechenden Beziehungen liefert:==N4‣ Theoretische Trennstufen N, Mobilität u2−t4 ⋅ σt1⎛ u⋅⎜⎝− u2 1Ru⎞⎟⎠TCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Puffersystem• Anforderungen an den Puffer‣ Selektivität t für f r die zu trennenden Ionen‣ pH-WertstabilitWertstabilität, , Pufferkapazität t (Reproduzierbarkeit)‣ Geringe UV-Absorption bei der Detektionswellenlängenge‣ Anpassung der Mobilität t zwischen Probe- und Pufferion‣ Das Gegenion sollte eine geringe Mobilität t besitzen (kleineStröme)‣ Reproduzierbare Herstellung des Puffers‣ Stabilität t des PuffersTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Optimierung• Trennungsoptimierung Variation folgender Parameter:‣ pH-Wert‣ Ionenstärke‣ Temperatur‣ Kapillarbelegung‣ PufferzusätzeTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

ElektropherogrammTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Kapillaraffinitätselektrophorese (CAE)• Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen einemRezeptor und Liganden• Bestimmung von Bindungskonstanten und -stöchiometrie• Unterschied in der Mobilität t zwischen Protein und demgebildeten Komplex‣ Ligand trägt eine Ladung‣ Molekulargewicht des Komplexes unterscheidet sich wesentlichvon der des ProteinsTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Micellarelektrokinetische ChromatographieMEKC• Hybridtechnik aus Elektrophorese und Chromatographie• Zusatz von Micellenbildnern (Detergenzien)) zumPuffersystem pseudostationäre Phase aus geladenenMicellen• Trennung basierend auf Verteilung der Analyte zwischenLösung und MicelleninnerenTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Elektropherogramm• Neutralmoleküle le erhalten elektrophoretische Mobilität t u iui'⎛ ki⎜⎝1+k= uMC'i⎞⎟⎠‣ Abhängig von Mobilität t der Micelle u MC und dem Kapazitätsfaktortsfaktork‘ i• Kapazitätsfaktortsfaktor k‘ i ist Verhältnis der Analytaufenthalts-zeit in der mobilen zur pseudostationären Phasek'i=toti−⎛ ⋅⎜1−⎝t0ttiMC⎞⎟⎠TCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Elektropherogramm• Auflösung R zweier KomponentenR =N{ 4Effizienz⋅α −1213 αSelektivitätt01−'k2tMC⋅ ⋅'1+k t2 0 '1+⋅k1tMC14 44 24443Re tention• Verbesserung der Auflösung durch:‣ Steigende Micellbildnerkonzentration‣ Vergrößößerung des Zeitfensters des Migrationsbereichs‣ Wahl unterschiedlicher Micellbildner‣ Änderung in der Zusammensetzung der wässrigen wPhaseTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Kapillargelelektrophorese (CGE)• Trennung nach unterschiedlichen Masse/Ladungsverhältnissen• DNA-Moleküe und SDS-denaturierte Proteine besitzenbei unterschiedlichen Massen sehr ähnliche Masse/Ladungsverhältnissen• Gelmedium bewirkt einen Siebeffekt und behindert dieelektrophoretische Wanderung der größeren Molekülestärker als die der kleineren• Vergleich mit klassischen GelelektrophoreseVorteileSchnellere TrennzeitenOnline-DetektionGeringer Arbeits- und GeräteaufwandNachteileKeine präparative ProbensammlungKeine parallele Trennung mehrerer ProbenNicht zweidimensional durchführbarTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Isoelektrische Fokussierung (CIEF)• Trennung der Analyten nach ihrem isoelektrischen Punkt• Injektion der Probe in einem Ampholytgemisch in dieKapillare• Eine starke Säure wird an der Anode platziert (Anolyt(Anolyt),eine starke Base dient als Kathodenpuffer (Katholyt(Katholyt).• Anlegen der Spannung pH-Gradient Ampholyt-Ionen wandern entsprechend ihrem pI.• Bei pI = pH endet die elektrophoretische Wanderung.Anode+DiffusionE-FeldKathode+ Ladung des--Verd.H 3 PO 4AnalytmolekülspH = pIpH-GradientVerd.NaOHTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Isotachophorese (ITP)• Trennung nach Größe und Ladung• Zwei Elektrolyte: Leitelektrolyt (LE) und Endelektrolyt(TE)‣ Mobilität t Leitelektrolyt > Mobilität t aller Analyt-Ionen‣ Mobilität t Endelektrolyt < Mobilität t aller Analyt-Ionen‣ Anlegen konstanten Stroms Bildung eines Feldstärkenrken-gradients‣ Probenaufgabe der Proben-Ionen (A, B)an der Grenzfläche der beiden Elektrolyte‣ Feldstärkengradient verhindert Diffusionscharfer ZonengrenzenTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Gerät schematischTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Beckmann PACETCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

Quellen• F. Lottspeich/H.Zorbas, , Bioanalytik• H.Engelhardt, W.Beck, , T. Schmitt, Kapillarelektrophorese• Altria, , Kevin; http://www.ceandcec.com• Oliver J. Schmitz; www.kapillarelektrophorese.de• P.W. Atkins, Physikalische ChemieTCI PD Dr. C. Kasper SoSe 2007Institut fürTechnische Chemie

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