FastTri DNA, RNA Protein Aufreinigung: Datenblatt - GeneON

DatasheetTriFaster MaximoAufreinigung von DNA, RNA und Protein aus einer ProbeFeatures:- Extraktion von RNA, DNA und Proteinen aus der gleichen Probe- Für kleine und große Mengen von Probe- Gleichzeitiges Vorbereiten mehrerer Proben- Für frische, lyophilisierte und gefrorener Proben- Höchster Ertrag von nicht-degradierter totaler RNA- Kurze AusfällungszeitErtrag:1 – 15 µg RNA pro mg Gewebe2 – 7 µg DNA pro mg Gewebe0,2 – 13 µg pro mg ProteinBeschreibung:Gebrauchsfertiges Reagenz für die sukzessive Extraktion von RNA, DNA und Proteinen aus einund derselben Probe. Enthält Phenol und Guanidinisothiocyanat.TriFaster-Maxima ist ein gebrauchsfertiges Reagenz für die gleichzeitige Extraktion von RNA, DNAund Proteinen ausMaterialien humanen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen und viralen Ursprungs.Die Methode basiert auf einer Einschritt-Flüssigphasen-Separation. Mit ihrer Hilfe erhält man nichtdegradierte RNAssowohl aus kleinen als auch aus großen Probenmengen. TriFaster ermöglicht auch die gleichzeitige Bearbeitunggroßer Probenzahlen.TriFaster-Maxima enthält Phenol und Guanidinisothiocyanat in einphasiger Lösung. Nach der Zugabevon Chloroformund anschließender Zentrifugation trennt sich das Homogenat in drei Phasen auf. Die RNA ist in der wässrigen Phaseenthalten, die DNA in der organischen und der Interphase. Die Proteine befinden sich in der organischen Phase. DieExtraktion mit TriFaster-Maxima ergibt qualitativ und quantitativ sehr gute Ausbeuten.Extrakte zahlreicher Zell- und Gewebearten enthalten in der endgültigen RNA-Fraktion noch Material unbekannterZusammensetzung mit einem hohen Anteil an Proteoglycanen und Polysacchariden. Dieses Material ist in wässrigenGuanidinisothiocyanatlösungen und Wasser löslich sowie in Alkohol unlöslich.Es bildet DNA-ähnliche Fäden und hat eine den Nukleinsäuren vergleichbare UV-Absorption. Dadurch führt es zufalschen Berechnungen des RNA-Gehaltes, was bei Hybridisierungen und Enzymreaktionen zu Problemen führenkann. Darüber hinaus verschlechtert es die RNA-Qualität und hat inhibitorische Effekte auf RT-PCRs. Zellenverschiedener Entwicklungsstadien enthalten unterschiedliche Mengen dieses kontaminierenden Materials.Warnung:TriFaster-Maxima enthält die gesundheitsschädlichen Stoffe Phenol und Guanidinisothiocyanat. DasArbeitenmit TriFaster-Maxima darf nur mit Handschuhen und Schutzbrille unter einem Abzugerfolgen. Sollte esdennoch zu einem Kontakt von TriFaster-Maxima mit der Haut oder den Augen kommen, sind die betroffenenStellen für mindestens 15 Minuten unter fließendem Wasser zu waschen. Begeben Sie sich danach umgehendin ärztliche Behandlung. Dieses Produkt ist ausschließlich für Forschungszwecke geeignet. Eine Verwendungfür diagnostische Zwecke oder als Arzneimittel sowie eine Verabreichung an Menschen oder Tiere ist nichterlaubt.Lagerung: bei + 4°CTransport: bei RaumtemperaturGeneON .. a good decision ..Contact Phone +49-(0)-621- 5720 864 Fax: +49-(0)-621-5724 462E-Mail: mailto:info@geneon.net WEB: http://www.GeneOn.net Version: 10.2009 UKUnless specified otherwise, all products of GeneON are sold for research use only.

DatasheetBestell-Information:Kat.-Nr Beschreibung Menge302010 TriFaster Maximo-Isolation 100 ml302015 TriFaster Maximo-Isolation 5x100 mlAnleitung für die RNA-ExtraktionRNA-Extraktionen können mit TriFaster-Maxima in 1 Stunde ausgeführt werden. RNA, die dabeiextrahiert wird, ist nicht-degradiert und frei von DNA und Proteinen. Sie kann für folgende Verfahren weiterverwendetwerden: Northern-Analysen, cDNA-Synthesen, RT-PCR-Reaktionen, Dot-Blot- Hybridisierungen, Poly(A)+Selektionen, in vitro-Translationen, Klonierungen und RNase-Assays.Benötigte Reagenzien, die nicht mitgeliefert werden:- Chloroform- Isopropanol- Ethanol- Hochwertige Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (Zentrifugation mit Phenol bei 12.000 x g !!!)Das Verfahren besteht aus folgenden Schritten:1. Homogenisierung 1.0 ml TriFaster-Maxima + 50-100 mg Probe2. Phasentrennung Homogenat + 0.2 ml Chloroform3. RNA-Präzipitation wäßrige Phase + 0.5 ml Isopropanol4. Waschen der RNA 1 ml 75 %iges Ethanol5. Lösen der RNA Formamid, 0.5 % SDS oder WasserWenn nicht anders angegeben, wird die Extraktion bei Raumtemperatur durchgeführt.1. Homogenisierunga. Gewebe50-100 mg Gewebe werden mit je 1 ml TriFaster-Maxima homogenisiert. Um eine gute Lyse zuerreichen, sollte ein Glas-, ein Teflon- oder ein elektrischer Homogenisator verwendet werden. DasProbenvolumen sollte nicht mehr als 10 % des verwendeten TriFaster-Maxima -Volumens betragen.b. Monolayer-ZellenDie Zellen werden direkt in der Zellkulturschale durch die Zugabe von 1 ml TriFaster-Maxima je 3.5-cm-Schale und durch mehrmaliges Aufziehen mit der Pipette lysiert. Die Menge an benötigtemTriFaster-Maxima ist nicht von der Zellzahl, sondern von der Größe der Zellkulturschale (in der Regel1 ml pro 10 cm2) abhängig. Eine unzureichende Menge an TriFaster-Maxima kann zur Kontaminationder extrahierten RNA mit DNA führen.c. ZellsuspensionenZellsuspension zentrifugieren und mit 1 ml TriFaster-Maxima je 5-10 x 106 Zellen (Tier-, Pflanzen,Hefe- oder Bakterienzellen) resuspendieren. Waschen der Zellen vor der Lyse fördert den Abbau derRNA und sollte vermieden werden. Bei der Extraktion von RNA aus Hefen und Bakterien ist in einigenFällen eine zusätzliche Homogenisierung notwendig.2. PhasentrennungDie Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, um die Dissoziation derNukleotidkomplexe zu gewährleisten. Je eingesetztem Milliliter TriFaster-Maxima 0.2 ml Chloroformzugeben und die Proben für 15 Sekunden kräftig schütteln. Danach 3-10 Minuten bei Raumtemperaturstehen lassen. Anschließend die Probe für 5 Minuten bei 12.000 x g zentrifugieren um einePhasenauftrennung zu bekommen. Es bilden sich drei Phasen: eine untere rote Phenol-Chloroform-Phase, eine obere farblose wäßrige Phase und eine dazwischenliegende Interphase. Die RNA istausschließlich in der wäßrigen Phase angereichert, während sich die DNA und die ProteinederinGeneON .. a good decision ..Contact Phone +49-(0)-621- 5720 864 Fax: +49-(0)-621-5724 462E-Mail: mailto:info@geneon.net WEB: http://www.GeneOn.net Version: 10.2009 UKUnless specified otherwise, all products of GeneON are sold for research use only.

DatasheetInterphase und der Phenolphase befinden. Die wäßrige Phase nimmt dabei ca. 60 % desProbenvolumens ein.Das verwendete Chloroform sollte von Zusätzen wie z.b. Isoamylalkohol frei sein.3. RNA-PräzipitationDie wäßrige Phase in ein frisches Röhrchen überführen und die Inter- und Phenolphase für einemögliche Extraktion von DNA und Proteinen bei 4 °C lagern. Die Präzipitation der RNA erfolgt mit0.5 ml Isopropanol pro eingesetzten Milliliter TriFaster-Maxima . Die Probe mischen und für5-15 Minuten auf Eis bzw. 4 °C inkubieren. Im Anschluss für 10 Minuten bei 12.000 x g und 4 °Czentrifugieren. Das RNA-Präzipitat sollte von gelartiger Konsistenz sein und an der unteren Seite desRöhrchens liegen.4. Waschen der RNADen Isopropanolüberstand vorsichtig abnehmen und das Pellet zweimal mit 1 ml 75 % Ethanol durchVortexen und anschließende Zentrifugation (10 Minuten, 12.000 x g, 4 °C) waschen.5. Lösen der RNADas RNA-Pellet kurz an der Luft oder durch Anlegen eines leichten Vakuums trocknen lassen. Einvollständiges Trocknen des Pellets verschlechtert die Löslichkeit der RNA und sollte deshalb vermiedenwerden. Die RNA nicht durch Vakuumzentrifugation trocknen lassen!!!Die RNA durch mehrmaliges Auf- und Abziehen mit der Pipette in deionisiertem Formamid, RNasefreiemWasser oder in 0.5 %igem SDS lösen. Ein Erhitzen der RNA-Lösung auf 55-60 °C verbessert dieLösbarkeit.Um eine Kontamination mit RNasen zu verhindern sollten Wasser und SDS-Lösungen, die zum Lösender RNA eingesetzt werden, vorher mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt werden.TriFaster-Maxima extrahiert Gesamt-RNA einschließlich mRNA und rRNA. Die erhaltene Lösung istfrei von DNA und Proteinen und hat einen A260/280-Quotienten von 1.6-2.0.Anmerkungen1. Um RNase-Kontaminationen zu vermeiden, sollten während der gesamten Extraktion Handschuhegetragen und ausschließlich RNase-freie Lösungen und Geräte verwendet werden.2. Erwartet man nur geringe Mengen von RNA (< 10 µg) sollten 70 µg Glykogen pro 1 mlTriFaster als Carrier für die Präzipitation zugesetzt werden.3. Nach der Homogenisierung und vor der Zugabe von Chloroform können die Proben für einigeMonate bei –70 °C gelagert werden. Das RNA-Präzipitat kann nach dem Waschen für 1-3 Wochenbei 4 °C in 75 %igem Ethanol oder für ca. 1 Jahr bei –20 °C gelagert werden.4. Für die RNA-Extraktion mit TriFaster-Maxima können auch Table-Top-Zentrifugen verwendetwerden, wenn sie ein Maximum von 2.600 x g erreichen. In diesem Fall müssen lediglich dieZentrifugationszeiten in den Schritten 2 und 3 auf 30-60 Minuten verlängert werden.5. Bei Verwendung von Proben mit hohem Gehalt an Proteinen, Polysacchariden, Fetten oder anderenBestandteilen ist ein Extra-Reinigungsschritt ratsam. Vor der Phasentrennung mit Chloroform könnenunlösliche Bestandteile durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 12.000 x g und 4 °C entferntwerden. Der Überstand enthält die RNA, während im Pellet die Polysaccharide, extrazellulärenMembranbestandteile und hochmolekularen DNAs lokalisiert sind. Bei Proben aus fettreichemGewebe kommt es zur Bildung einer schaumartigen Fettschicht, die entfernt werden sollte. Der klare,RNA-haltige Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und die Chloroform-Extraktiondurchgeführt wie beschrieben.GeneON .. a good decision ..Contact Phone +49-(0)-621- 5720 864 Fax: +49-(0)-621-5724 462E-Mail: mailto:info@geneon.net WEB: http://www.GeneOn.net Version: 10.2009 UKUnless specified otherwise, all products of GeneON are sold for research use only.

DatasheetTroubleshooting Guide – RNA IsolationErwartete RNA-Mengen pro mg Gewebe oder 10 6 Zellen:- Leber und Milz 6-10 µg- Niere 3-4 µg- Skelettmuskulatur und Gehirn 1-1.5 µg- Plazenta 1-4 µg- Epithelzellen 8-15 µg- Fibroblasten 5-7 µgRNA Menge zu gering:¨ Ausgangsmaterial mit geringem RNA-Gehalt¨ Unvollständige Homogenisierung oder unvollständige Lyse¨ RNA-Pellet nicht vollständig gelöstA260/280-Quotient < 1.65:¨ Probe wurde in zu geringem Volumen homogenisiert¨ Probe wurde nach der Homogenisierung nicht bei Raumtemperatur inkubiert¨ Die wäßrige Phase war mit der Phenolphase kontaminiert¨ RNA-Pellet nicht vollständig gelöstRNA-Abbau:¨ Gewebe wurde nicht direkt zur Extraktion verwendet oder nicht direkt eingefroren¨ Zellen wurden durch Trypsinieren zerstört¨ Kontamination mit RNase während der Präparation¨ Die verwendeten Proben wurden nicht bei –70 °C gelagert¨ Bei der Elektrophorese lag der pH-Wert der Formaldehydlösung unter 3.5DNA-Kontamination:¨ Probe wurde in zu geringem Volumen homogenisiert¨ Die zur Extraktion verwendeten Proben enthielten organische Lösungen z.B. Ethanol, DMSO,konzentrierte Puffer oder hatten einen alkalischen pH-WertB. Anleitung für die DNA-ExtraktionWährend der obenbeschriebenen Phasentrennung wird die DNA aus der wäßrigen Phase entfernt.Nach ihrer Präzipitation aus der organischen Phase und einigen Waschschritten wird sie in 8 mMNaOH gelöst und anschließend neutralisiert. Die mit TriFaster-Maxima gereinigte DNA ist für die PCR,Southern Blotting, Restriktionsverdaus und Klonierungen geeignet.Benötigte Reagenzien, die nicht mitgeliefert werden:- Ethanol- Natriumcitrat- NatriumhydroxidDas Verfahren besteht aus folgenden Schritten und wird, wenn nicht anders angegeben, beiRaumtemperatur durchgeführt.1. DNA-Präzipitation Phenolphase und Interphase + 0.3 ml Ethanol pro 1 ml TriFaster-Maxima2. Waschen der DNA 1 ml 0.1 M Natriumcitrat in 10 % Ethanol3. Lösen der DNA 8 mM NaOH1. DNA-PräzipitationNach dem vollständigen Entfernen der wäßrigen Phase wird die DNA durch die Zugabe von 0.3 ml100 % Ethanol pro eingesetzten ml TrifastTM präzipitiert. Durch mehrmaliges Invertieren des Tubesden Ansatz gut mischen und für 2 bis 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließenddie DNAGeneON .. a good decision ..Contact Phone +49-(0)-621- 5720 864 Fax: +49-(0)-621-5724 462E-Mail: mailto:info@geneon.net WEB: http://www.GeneOn.net Version: 10.2009 UKUnless specified otherwise, all products of GeneON are sold for research use only.

Datasheet1. Protein-PräzipitationDie Proteine durch Zugabe von 1.5 ml Isopropanol zum Phenol/Ethanol-Überstand präzipitieren. DieProben 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend für 10 Minuten bei 12.000 x gund 4 °C zentrifugieren.2. Waschen der ProteineÜberstand entfernen und das Proteinpellet dreimal mit 2 ml 0.3 M Guanidinhydrochlorid in 95 %Ethanol waschen. Hierfür die Proben jeweils für 20 Minuten in 0.3 M Guanidinhydrochlorid / 95 %Ethanol bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend für 5 Minuten bei 7.500 x g und 4 °Czentrifugieren.Danach Protein-Pellet in 2 ml 100 % Ethanol vortexen, 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren underneut zentrifugieren (5 Minuten, 7.500 x g, 4 °C).3. Lösen der ProteineDer kritische Schritt bei der Isolierung von Proteinen mit TriFaster-Maxima ist die Resolubilisierung ausdem Pellet. Hierfür stehen drei alternative Methoden zur Verfügung, die, abhängig vomAusgangsmaterial, ein effizientes Lösen der Proteine ermöglichen:Option 1:Ethanol vollständig entfernen und Protein-Pellet durch Anlegen eines leichten Vakuums für 5-10 Minutentrocknen. 1 % SDS zugeben und durch Auf- und Abziehen mit der Pipette lösen. Um das Pelletvollständig zu lösen, kann eine Inkubation bei 50-100 °C notwendig sein. Das Pellet besteht auslöslichen Proteinen und unlöslichen Bestandteilen, wie Membranresten und extrazellulärem Material, diedurch eine Zentrifugation für 10 Minuten bei 10.000 x g und 4 °C entfernt werden können. DenProteinüberstand in ein neues Röhrchen überführen. Die Proteinlösung kann sofort verwendet oder bei–20 °C gelagert werden.Option 2:Schwer zu lösende Pellets können alternativ auch durch Beschallen in 10 M Harnstoff/50 mM DTTgelöst werden. Dazu Ethanol vollständig entfernen und Protein-Pellet durch Anlegen eines leichtenVakuums für 5-10 Minuten trocknen. Zunächst 50 µl frisch angesetzten 10 M Harnstoff/50 mM DTTzugeben und Pellet mit einer Nadel aufbrechen. Das Gesamtvolumen der zugegebenen Lösung solltevariiert werden, um die gewünschte Konzentration an gelösten Proteinen bestimmen zu können. Probefür eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend für 3 Minuten auf 100 °C erhitzen.Danach mit 10 Impulsen auf Eis beschallen. Falls bis zu diesem Zeitpunkt noch nicht alle Proteine inLösung sind, sollte der Koch/Beschall-Schritt noch ein- bis zweimal wiederholt werden. DieProteinlösung kann sofort verwendet oder bei –20 °C gelagert werden.Option 3:Den Phenol/Ethanol-Überstand aus Schritt B.2. bei 4 °C über Nacht gegen dreifach gewechseltes 0.1 %SDS dialysieren. Das Dialysat für 10 Minuten bei 10.000 x g und 4 °C zentrifugieren und den klarenÜberstand für Western weiterverwenden oder bei –20 °C einfrieren.Anmerkungen1. In einigen Fällen werden bei Fällungen mit Aceton bessere Proteinerträge erzielt als bei derVerwendung von Isopropanol. Optimale Ergebnisse sind dabei mit Aceton:Phenol/Ethanol-Verhältnissen von 3:1 bis 6:1 zu erzielen. Generell liegt die Protein-Ausbeute nachTriFaster-Extraktion bei rund 40 bis 60 % einer Extraktion mit der SDS-Methode.2. Die Proteine sind in 0.3 M Guanidinhydrochlorid/95 % Ethanol oder in absolutem Ethanol bei 4 °Cfür einen Monat und bei –20 °C für mindestens ein Jahr stabil.3. Proteine können in Anlehnung an die Bradfort-Methode quantifiziert werden, wenn der SDS-Gehaltunter 0.1 % liegt.GeneON .. a good decision ..Contact Phone +49-(0)-621- 5720 864 Fax: +49-(0)-621-5724 462E-Mail: mailto:info@geneon.net WEB: http://www.GeneOn.net Version: 10.2009 UKUnless specified otherwise, all products of GeneON are sold for research use only.

DatasheetTroubleshooting Guide - Protein-ExtraktionProtein-Menge zu gering:¨ Unvollständige Homogenisierung oder unvollständige Lyse¨ Protein-Pellet nicht vollständig gelöst¨ Protein-AbbauProtein-Degradation:¨ Gewebe wurde nicht direkt verarbeitet oder eingefrorenBanden-Deformation bei der PAGE:¨ Protein-Pellet nicht sorgfältig genug gewaschenErwartete Protein-Mengen pro mg Gewebe oder 106 Zellen:- Leber und Milz 9-11 µg- Niere 10-12 µg- Lunge 10-13 µg- Skelettmuskulatur ca. 5 µg- Gehirn 8-10 µg- Thymus 9-11 µg- Epithelzellen 0.2-0.3 µg- Fibroblasten 0.2-0.3 µgGeneON .. a good decision ..Contact Phone +49-(0)-621- 5720 864 Fax: +49-(0)-621-5724 462E-Mail: mailto:info@geneon.net WEB: http://www.GeneOn.net Version: 10.2009 UKUnless specified otherwise, all products of GeneON are sold for research use only.