Entwicklung einer GC/MS-Methode zur Bestimmung von ...

Jira, W. (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 160, 151-158Entwicklung einer GC/MS-Methode zur Bestimmung von kanzerogenen PAKin geräucherten Fleischerzeugnissen und RauchkondensatenDevelopment of a GC/MS-method for the determination of carcinogenic PAHin smoked meat products and liquid smokesW. JIRAZusammenfassungPolycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) sind eine Gruppe von organischenVerbindungen, die 2 oder mehr kondensierte aromatische Kohlenstoffringe enthalten. Siewerden hauptsächlich bei pyrolytischen Prozessen, insbesondere bei der unvollständigenVerbrennung organischen Materials und daher auch beim Räuchern gebildet. Die Gruppeder PAK umfasst bis zu 250 verschiedene Substanzen, von denen 16 Verbindungen von deramerikanischen Umweltbehörde (US-EPA) als besonders gesundheits- und umweltgefährdendangesehen werden. Von einer niederländischen Arbeitsgruppe wurde neuerdings vorgeschlagen,für PAK sogenannte Toxizitätsequivalent-Faktoren (TEF) zu verwenden, umden Gehalt der toxikologisch relevanten PAK in einer Bezugssubstanz wie z. B.Benzo[a]pyren zusammenzufassen. Um den Gehalt dieser kanzerogenen PAK in geräuchertenFleischerzeugnissen und Rauchkondensaten bestimmen zu können wurde eineGC/MS-Methode entwickelt.SummaryPolycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are a group of organic compounds, which contain 2or more condensed aromatic carbon rings. They are produced mainly during pyrolytic processes,especially by the incomplete combustion of organic material and consequently alsoby smoking. The class of PAH includes about 250 different compounds. The US EnvironmentalProtection Ageny (US-EPA) considered 16 of these compounds as especiallyhazardous to health and environment. Researchers of the Netherlands proposed to use socalled toxic equivalent factors (TEF), to bring the content of toxicological relevant PAHs togetherin one substance, i. e. benzo[a]pyrene. In order to determine the contents of thesecarcinogenic PAH in smoked meat products and liquid smokes a GC/MS-method wasdeveloped.SchlüsselwörterKey WordsPolycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe – PAK – GC/MS – Kanzerogenität– Toxizitätsequivalentfaktoren – geräucherte Fleischerzeugnisse –Rauchkondensatepolycyclic aromatic hydrocarbons – PAH – GC/MS – carcinogenity – toxicequivalent factors – smoked meat products – liquid smokesEinleitungPolycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe(PAK) stellen eine Reihe von organischenVerbindungen dar, die 2 odermehr kondensierte aromatische Kohlenstoffringeenthalten. Sie werden hauptsächlichbei pyrolytischen Prozessen, insbesonderebei der unvollständigenVerbrennung organischen Materials gebildetund sind ubiquitär verbreitet. DieGruppe der PAK umfasst bis zu 250 verschiedeneSubstanzen, von denen 16Verbindungen von der amerikanischenUmweltbehörde (US-EPA) als besondersgesundheits- und umweltgefährdend angesehenwerden (US-EPA, 1984; sieheTab. 1).151

Jira, W. (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 160Tab. 1: Liste der 16 PAK, die von der amerikanischen Umweltbehörde als besonders gesundheitsundumweltgefährdend angesehen werden152

Jira, W. (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 160Von diesen 16 EPA-PAK werden 6 Verbindungenvon der International Agencyfor Research on Cancer (IARC) als Stoffemit ausreichendem Beweis für die kanzerogeneWirkung im Tierversuch klassifiziert(siehe Tab. 2).Tab. 2: Klassifizierung der International Agency for Research on Cancer (IARC) nach den kanzerogenenEigenschaften der von der US-EPA vorgeschlagenen 16 PAK aus dem Jahr 19871. Einen ausreichenden Beweis für die kanzerogene Wirkung im Tierversuch gibt es für:Benzo[a]anthracenBenzo(b)fluoranthenBenzo(k)fluoranthenBenzo[a]pyrenIndeno(1,2,3-cd)pyrenDibenzo(a,h)anthracen2. Von den zuvor genannten Stoffen werden folgende als wahrscheinlich auch für denMenschen kanzerogen eingestuft:Benzo[a]anthracenBenzo[a]pyrenDibenzo(a,h)anthracen3. Als möglicherweise für den Menschen kanzerogen werden eingestuft:Benzo(b)fluoranthenBenzo(k)fluoranthenIndeno(1,2,3-cd)pyrenIm Jahr 2002 hatte die EU-Kommissiondas Scientific Commitee on Food (SCF)beauftragt, die Belastung der Lebensmittelmit PAK in der EU zu ermitteln (SCF,2002). Dabei sollte das SCF auf der Basisdes gegenwärtigen Kenntnisstandes herausfinden,welche PAK als gesundheitlichesRisiko für den Verbraucher besondersrelevant sein könnten und in welchenBereichen ein dringender Bedarf für künftigeUntersuchungen bestehen könnte.Hintergrund für diese Risikoabschätzungist eine Überlegung der EU-Kommission,Höchstgehalte für PAK in Lebensmittelnauf EU-Ebene einzuführen. Die Stellungnahmebeschränkt sich dabei im Wesentlichenauf die 16 EPA-PAK.Für Nichtraucher erfolgt die PAK-Aufnahme zu mehr als 95 % über dieNahrung (DE VOS et al., 1990). Untersuchungenüber den Beitrag der verschiedenenLebensmittelgruppen zur PAK-Aufnahme aus dem Jahr 1983 habenergeben, dass britische Bürger 50 % derPAK über Öle und Fette, 30 % überCerealien und 8-10 % über Gemüse aufnehmen(DENNIS et al., 1983). GeräuchertesFleisch und geräucherter Fischliefern demnach nur einen sehr kleinenBeitrag für die Aufnahme von PAK. DieErgebnisse dieser Untersuchungen wurdenim Jahr 1990 durch eine in den Niederlandendurchgeführte Studie bestätigt(DE VOS et al., 1990). Das SCF weist inseiner Stellungnahme jedoch darauf hin,dass geräuchertes und gegrilltes Fleischund Fleischerzeugnisse einen deutlichenBeitrag zur PAK-Aufnahme durch Lebensmittelleisten können, falls sie überdurchschnittlichkonsumiert werden. Dasin dem Bericht des Komitees angeführteDatenmaterial hinsichtlich des PAK-Gehaltes in Fleisch und Fleischerzeugnissenist jedoch kaum belastbar, ja sehrdürftig. Daten über PAK-Gehalte in geräuchertenFleischerzeugnissen fandenkeinen Eingang in dem Bericht. Geräu-153

Jira, W. (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 160chertes Fleisch und Fleischerzeugnissestellen mit einem durchschnittlichen Verzehrdes Bundesbürgers von ca. 24 kgden größten Anteil der geräucherten Lebensmitteldar und demzufolge ist für eineAbschätzung der Belastungssituation mitPAK eine ausreichende Kenntnis der PAK-Gehalte in diesen Lebensmitteln vonbesonderer Wichtigkeit.Bislang wird die PAK-VerbindungBenzo[a]pyren als Leitsubstanz für dieBelastung mit PAK bei geräuchertenFleischerzeugnissen verwendet. Dabei giltlaut Aromenverordnung (BGBl., 2001) eintolerierbarer Höchstgehalt von 1 µg/kg(ppb), bezogen auf Frischmasse. FürFleischerzeugnisse, die mit Rauchkondensaten(Flüssigrauch) behandelt wurden,gilt die Regelung, dass Lebensmittel,denen durch Aromen mehr als 0,03 µg/kg(ppb) an Benzo[a]pyren zugeführt wurden,gewerbsmäßig nicht in den Verkehrgebracht werden dürfen. Da für PAK nurder Gehalt an Benzo[a]pyren gesetzlichgeregelt ist, exisierte an der BAFFbis dato nur eine entsprechendeHPLC/Fluoreszenz-Bestimmungmethode,die jedoch nicht geeignet ist, gleichzeitigden Gehalt aller kanzerogenen PAK zubestimmen. Aus diesem Grund wurde imJahr 2002 an der BAFF eine Methode zurBestimmung der kanzerogenen PAK mitHilfe der GC/HRMS erarbeitet.Analysenmethode zur Bestimmung derkanzerogenen PAKDie an der BAFF entwickelte Analysenmethodezur Bestimmung der kanzerogenenPAK beruht auf dem Prinzip der Isotopenverdünnungsanalyse,d. h. die zuanalysierenden PAK-Verbindungen (Fluoranthen,Pyren, Benzo[a]anthracen, Chrysen,Benzo[b]fluoranthen, Benzo[k]-fluoranthen, Benzo[a]pyren, Indeno(1,2,3-c,d)pyren, Dibenzo(a,h)anthracen undBenzo(g,h,i)perylen) werden alle als isotopenmarkierteStandardverbindungen vorder Aufarbeitung zugesetzt und zurQuantifizierung herangezogen. Das Aufarbeitungsschemaist in Abbildung 1 zusehen.Zunächst werden die PAK mit Hilfe derbeschleunigten Lösemittelextraktion (ASE200, Fa. Dionex) extrahiert. Hierzu wirddas zu untersuchende Probenmaterial zunächstsorgfältig homogenisiert und ca. 6bis 8 Gramm mit der gleichen Menge anTrockenmittel (Poly-(acrylsäure)-Natriumsalz-pfropf-poly-(ethylenoxid))in einemBecherglas verrieben und in eine 33 mlExtraktionszelle gefüllt. Auf eine Zugabevon Seesand sollte unbedingt verzichtetwerden, da sich in Vorversuchen gezeigthat, dass von den oben genannten PAK-Verbindungen nur Fluoranthen, Chrysen,Benzo[b]fluoranthen und Benzo[k]fluoranthennicht an Seesand absorbiert werden.Alle anderen PAK werden nahezuvollständig an Seesand gebunden. Anschließenderfolgt die Zugabe der 13 C-markierten PAK als interne Standardverbindungen.Die Abtrennung von Fett undanderen höhermolekularen Verunreinigungenerfolgt mit Hilfe einer Gelpermeationschromatographiesäulemit einemPolystyrolgel (Bio-Beads SX-3, 200-400mesh) als Füllmaterial. Anschließend erfolgtdie Abtrennung von polaren Verunreinigungenund eventuell verbliebenenFettspuren mit Hilfe einer kleinen Kieselgelsäule(2,5 g Kieselgel, mit 15 % Wasserdeaktiviert). In der Regel ist diese Aufreinigungüber GPC- und Kieselgel-Säulevöllig ausreichend. Bei besonders schwierigenMatrices wie beispielsweise manchenRauchkondensaten ist jedoch nochein weiterer Aufreinigungsschritt über eineCN/SiOH-Kombinationsphase erforderlich.Vor der GC/MS-Messung erfolgt die Zugabeeiner Standardlösung (D12-Benzo[a]anthracen, D12-Benzo[a]pyrenund D12-Benzo(g,h,i)perylen) zur Bestimmungder Wiederfindungsraten. DieWiederfindungsraten liegen für Benzo[a]-anthracen und Benzo(g,h,i)perylen bei ca.90-110 %, für Benzo[a]pyren bei etwa 75-85 %.154

Jira, W. (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 160Probenhomogenisierung undZugabe der13C-markiertenStandardverbindungenProbenextraktionmit ASE(n-Hexan)ASE-Parameter:Lösungsmittel:n-HexanExtraktionstemperatur: 100°CExtraktionsdruck: 100 bar (10 MPa)Statische Extraktion: 10 minSpülung mit Lösungsmittel: 80% des ZellvolumensSpülung mit Stickstoff: 120 s (Druck 1MPa)Zahl der Extraktionszyklen: 2Gelpermeationschromatographieüber Bio Beads S-X3Chromatographie über Kieselgel(deaktiviert mit 15% H 2O)optionalGPC-Parameter:Säulenmaterial: Bio-Beads S-X3, 200-400 meshInnendurchmesser: 25 mmFüllhöhe:42 cmFlußgeschwindigkeit: 5 ml/minElutionsmittel: Cyclohexan/Ethylacetat = 1:1Verwerfen:0 - 36 minSammeln:36 - 65 minchromatographische-Bedingungen:Glassäule (ID): 7 mmSäulenmaterial: 2,5 g Kieselgel (mit 15% H 2O deaktiviert)Elutionsmittel: 30 ml n-Hexan/Dichlormethan = 4:1Chromatographieüber CN/SiOH-Kombinationsphasechromatographische Bedingungen:Säulenmaterial: Chromabond CN/SiOH (500/1000 mg)Elutionsmittel: 5 ml Acetonitril/Toluol = 3:1Zugabe der 2 H-markiertenStandardverbindungenMessung der PAK mit GC/HRMSGC-Bedingungen:Trennsäule: DB5-ms, 60m x 0,25 mm x 0,25µmTrägergas: HeliumInjektionsmodus: splitlos (1 min)Injektortemperatur: 300°CTemperaturprogramm: 80°C : 2 min100°C→130°C80°C→100°C : 20°C/min: 8°C/min130°C→320°C : 5°C/min320°C : 10 minGesamtzeit : 54 minMS-Bedingungen:Ionenquellentemperatur: 250°CIonisierungsmodus: Electron Impact (EI)Elektronenenergie: 35 eVAuflösung: 8000 - 10000Modus: SIRAbb. 1: Schema der GC/HRMS-Analytik der kanzerogenen PAK155

Jira, W. (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 160Die Qualität des Analysenverfahrenswurde durch Untersuchung eines Standard-Referenzmaterials(Mussel TissueSRM 2977) des National Institute of Standardsand Technology überprüft. EineGegenüberstellung der mit Hilfe des obenbeschriebenen Analysenverfahrens gemessenenund den zertifizierten Konzentrationenergab sehr gute Übereinstimmungenfür die untersuchten PAK-Verbindungen (siehe Abb. 2).PAK-Gehalte in Mussel Tissue [µg/kg]80706050403020100FluoranthenePyreneBenzo[a]anthraceneChryseneBenzo[b]fluorantheneBenzo[k]fluoranthenezertifizierte Konzentrationgemessene KonzentrationBenzo[a]pyreneIndeno(1,2,3-cd)pyreneDibenzo(a,h)anthraceneBenzo(g,h,i)peryleneAbb. 2: Gegenüberstellung der gemessenen und zertifizierten PAK-Konzentrationen in Mussel Tissue(SRM 2977)Das Toxizität-Equivalent-KonzeptDie 16 von der US-EPA vorgeschlagenenPAK unterscheiden sich hinsichtlich ihrerGehalte und ihrer Kanzerogenität. Daherwurde, um das kanzerogene Potential derPAK vergleichbar zu machen, vorgeschlagen,den Gehalt an toxikologischrelevanten PAK in einer Leitsubstanz wiez. B. Benzo[a]pyren zusammenzuführen.Von einer niederländischen Arbeitsgruppe(TRAAG et al., 2001) wurde neuerdingsempfohlen, für PAK sogenannte Toxizitätsequivalent-Faktoren(TEF) zu verwenden,wie dies bereits bei der DioxinundPCB-Analytik angewandt wird: Bei derAnalytik der Dioxine und PCB fasst mandie (im Tierversuch ermittelten) Toxizitätenaus den 17 Dioxin-, Furan- und den 12dioxinähnlichen PCB-Verbindungenzusammen. Diese Größe drückt summarischdie relative Toxizität von 17 unterschiedlichenPCDD/F und 12-PCB-Kongeneren im Vergleich zum 2,3,7,8-TCDD („Seveso-Dioxin“) aus und wird alsToxizitäts-Equivalent (TEQ) bezeichnet.Dieser errechnet sich aus der jeweiligenKonzentration eines Kongeners, multipliziertmit einem Toxizitätsequivalent-Faktor(TEF), der die relative Toxizität diesesKongeners im Vergleich zum 2,3,7,8-TCDD angibt, dem ein TEF von 1 zugewiesenwird.In Analogie dazu wurde ein TEQ-Konzeptfür PAK entwickelt, das sich auf die PAK-Verbindung mit der höchsten Toxizität,Benzo[a]pyren, als Bezugsgröße bezieht.Diesem wird ebenso wie Dibenzo(a,h)-anthracen ein TEF von 1 zugeordnet.Diese beiden PAK sind in der Klassi-156

Jira, W. (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 160fizierung der IARC als „wahrscheinlichauch für den Menschen krebserregend“eingestuft. Dies gilt auch für Benzo[a]-anthracen, dem wie den als „möglicherweisefür den Menschen krebserregend“eingestuften PAK Benzo(b)fluoranthen,Benzo(k)fluoranthen, und Indeno(1,2,3-cd)pyren jeweils ein TEF von 0,1 zugewiesenwird. Die anderen in Tabelle 3 aufgeführtenVerbindungen, für die keineHinweise auf Kanzerogenität vorliegen,haben nur geringe TEF-Werte (0,01 bzw.0,001).Tab. 3: Vorgeschlagene TEF-Werte für PAK(TRAAG et al., 2001)SubstanzTEFBenzo[a]pyren 1Dibenzo(a,h)anthracen 1Benzo[a]anthracen 0,1Benzo[b]fluoranthen 0,1Benzo[k]fluoranthen 0,1Indeno(1,2,3-cd)pyren 0,1Chrysen 0,01Acenaphthylen 0,01Fluoranthen 0,01Acenaphthen 0,001Phenanthren 0,001Pyren 0,001Es muss allerdings erwähnt werden, dassdie Anwendung eines TEF-Modells fürPAK sehr kritisch betrachtet werden sollte,da ein solches Modell eigentlich nur unterder Voraussetzung angewendet werdenkann, falls die einzelnen PAK-Verbindungenihre toxikologischen Effekte auf demgleichen Wirkmechanismus ausüben. Diesist zwar bei Dioxinen und dioxinähnlichenPCB der Fall, trifft jedoch bei den PAKnicht zu. Obwohl einige PAK wie auch dieDioxine und dioxinähnlichen PCB an denAh-Rezeptor binden, ist dies nicht dereinzige Effekt, der das kanzerogenePotential der PAK bestimmt. Danebenspielen Effekte wie DNA-Bindung und dieInduzierung von Mutationen eine Rolle.Ferner existieren keinerlei Hinweise, dassdie verschiedenen PAK auf dem gleichenmetabolischen Weg aktiviert werden, andie DNA in den gleichen Positionen bindenund die gleichen Arten von Mutationen inden gleichen Organen und Gewebeninduzieren.Trotz dieser Einwände von toxikologischerSeite gegen ein TEF-Modell kann ein solchesModell dennoch dazu dienen abzuschätzen,ob tatsächlich alle kanzerogenenPAK erfasst werden müssen oder obdie Messung einiger weniger PAK odergar die Bestimmung von Benzo[a]pyrenallein als Leitsubstanz ausreichend ist.DiskussionFür geräucherte Fleischerzeugnisse ist bisdato Benzo[a]pyren die Leitsubstanz, dieanderen 5 PAK-Verbindungen mit nachgewiesenerkanzerogener Wirkung imTierversuch werden nicht berücksichtigt.Um den Gehalt dieser kanzerogenen PAKin geräucherten Fleischerzeugnissen undRauchkondensaten untersuchen zu könnenwurde eine GC/MS-Analytik entwickelt.Dies war erforderlich, da die fürBenzo[a]pyren an der BAFF etablierteHPLC/Fluoreszenz-Methode nicht geeignetist, gleichzeitig den Gehalt aller 16umweltrelevanten PAK zu bestimmen(TRAAG et al., 2001).Zudem bietet die entwickelte GC/MS-Methodeauch weitere Vorteile gegenüber derMethode nach § 35 LMBG L 07.00-40: Auf eine aufwändige Verseifung derFette kann verzichtet werden. Diesführt zu einer deutlichen Ersparnis anLösemitteln und Zeit. Der Einsatz der beschleunigtenLösemittelextraktion (AcceleratedSolvent Extraction, ASE) benötigt nurgeringe Mengen an Lösmitteln undgewährleistet eine sehr effiziente Extraktionmit einem hohen Automatisierungsgrad. Die Detektion mit Hilfe der hoch auflösendenMassenspektrometrie steigertaufgrund der hohen Selektivität dieNachweissicherheit. Zudem erlaubt157

Jira, W. (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 160sie den Einsatz von isotopenmarkiertenStandardverbindungen.Anhand dieser Methode sollen nun dieGehalte der kanzerogenen PAK in geräuchertenFleischerzeugnissen und Rauchkondensatenbestimmt werden. Dabei sindfolgende Fragestellungen von besondererBedeutung:• Wie sieht die aktuelle Belastungssituationvon geräucherten Fleischerzeugnissenmit kanzerogenen PAKin der Bundesrepublik Deutschlandaus?• Haben die verschiedenen Räuchertechnologienund Räucherbedingungenbei Fleisch und Fleischerzeugnisseneinen signifikanten Einfluss aufdas PAK-Muster bzw. den PAK-TEQ?• Gibt es bei den modernen Räucherverfahrenein festes Verhältnis zwischendem Benzo[a]pyren-Gehalt unddem PAK-TEQ, d. h. könnte mandurch alleinige Bestimmung vonBenzo[a]pyren zuverlässige Abschätzungendes PAK-TEQ vornehmen?• Welchen Beitrag zum PAK-TEQ inFleisch und Fleischerzeugnissenliefern Gewürze?In dem eingangs erwähnten Positionspapierdes SCF-Komitee werden Untersuchungenzur Bestimmung von PAK-Musternin verschiedenen Lebensmitteln alsdringend erforderlich angesehen, dadiesbezüglich bislang nur sehr wenigeDaten (insbesondere für geräucherteFleischerzeugnisse) existieren. Wendetman das TEQ-Modell auf die im Berichtaufgeführten Literaturdaten an, bei denendie Gehalte der EPA-PAK (oder zumindestdie meisten davon) in verschiedenen Lebensmittelnuntersucht wurden, so zeigtsich, dass Benzo[a]pyren bei allenuntersuchten Lebensmitteln den größtenBeitrag zum PAK-TEQ liefert. Der Beitragvon Benzo[a]pyren zum PAK-TEQ liegtsowohl bei Ölen und Fetten (z. B. Sonnenblumenöl,Olivenöl, Margarine, Butter),als auch bei Cerealien (z. B. Kleie,Frühstückscerealien, Brot) und Gemüse(z. B. Salat) bei etwa 50 %, wobei dieSchwankungsbreite relativ gering ist.Bereits im Jahr 1979 wurden an der BAFFmit Hilfe eines allerdings sehr aufwändigenAnalysenverfahrens 7 verschiedenegeräucherte Fleischerzeugnisse hinsichtlichihres Gehaltes an zahlreichen PAKuntersucht (POTTHAST, 1979). Ähnlich wiebei den oben durchgeführten Untersuchungenergab sich hier im Median einAnteil des Benzo[a]pyren am PAK-TEQvon 46 %. Der Anteil von Dibenzo[a,h]-anthracen lag hier im Median bei 31 %.Die beiden PAK mit dem höchsten TEF-Wert scheinen hier also den PAK-TEQ zudominieren.Die bereits 1979 an der BAFF durchgeführtenUntersuchungen sind jedoch nichtohne weiteres auf die Gegenwart übertragbar,da sich zum einen die Räuchertechnologiein den letzten 20 Jahrendeutlich weiterentwickelt hat, zum anderenheute auch vermehrt Rauchkondensatezur Anwendung kommen.DanksagungFür die sorgfältige und zuverlässige technischeMitarbeit sei Frau Elisabeth Klötzerherzlich gedankt.LiteraturDie Literatur kann beim Verfasser angefordertwerden.158