Forschung 8Abb. 3: Clusteranalyse erlaubt die Trennungverschiedener Hydronephrose-Nieren.Nierengewebe von Patienten mit chronischemHarnstau (Hydronephrose) und gesundes Kontrollgewebewurden mit einem Makroarray analysiert.Die Clusteranalyse trennte die Proben passend zuihrer histologischen Veränderung (Fibrose, Inflammation,Kontrolle). Diese Pilotstudie zeigt, dassmRNA-Analysen von Nierengeweben die Unterscheidungtubulo-interstitieller Veränderungenerlaubt.Zur Testung wurde eine Pilotstudie durchgeführt: Nierengewebe wurdeuntersucht, welches von explantierten Nieren stammte und daher mehrGewebe lieferte als einzelne Biopsien. Das Gewebe kam zum einen von Nierendie entfernt werden mussten, da die Niere durch einen chronischen Harnstaugeschädigt wurde; zum anderen wurde der gesunde Nierenanteil vonPatienten untersucht, die an einem Nierentumor litten (Kontrollgruppe).Obgleich die Schädigung der Nieren durch Harnstau (Hydronephrose) einediffuse und chronische Veränderung der Nieren bewirkt, gelang eine zuverlässigeUnterscheidung der beiden Gruppen nach Analyse mit einem inflammationsspezifischenMakro-Array. Als zweiter Schritt wurde untersucht,ob auch die Schwere und die Art der Nierenschädigung bei Hydronephrosedurch Expressionsanalyse unterschieden werden kann. Hierfür wurde dasGewebe zunächst histologisch wie folgt klassifiziert: überwiegend Inflammation(entzündet), vorwiegend Fibrose (vernarbt) oder unauffällig (Kontrollgewebe).Die Expressionsmuster der Gruppen unterschieden sich sodeutlich, dass auch hier eine Zuteilung zu allen drei Gruppen gelang(Abb. 3). Aus den regulierten Genen wurden einzelne mit besonders ausgeprägterVeränderung ausgewählt und es wurde ihre Expression an Biopsienaus der ERCB untersucht.Abermals gelang es, die Art der Schädigung zuverlässiganhand des RNA-Expressionsmusters zu bestimmen. Über die konventionellehistologische Diagnostik hinausgehend erlauben diese Marker,die Patientengruppe mit hohem Progressionsrisiko zu identifizieren. Siekönnten damit in allen Nierenbiopsien zur Prognoseabschätzung eingesetztwerden (Henger et al., submitted; und Kretzler et al., 2002).Umfassende Expressionsanalysenzur Identifizierungder molekularen Mechanismendes NierenversagensNachdem anhand dieses Pilotexperiments gezeigt werden konnte,dass auch zum Teil diskrete Veränderungen des Nierengewebes durch Genexpressionsanalyseerkannt und differenziert werden, galt es, diese Technikauf die geringen Gewebemengen aus Biopsien zu übertragen.Hierbei wurde die mRNA aus Routine-Biopsien nach linearer Amplifikationauf kommerziellen Oligonucleotid-Microarrays analysiert. Erste Daten vonüber dreißig Patienten zeigen eine gute Trennschärfe zwischen den Erkrankungskollektiven.Neben einigen Molekülen, die bekanntermaßen an derProgression von Nierenerkrankungen beteiligt sind, finden sich zahlreichecDNAs mit potentiell wichtiger Funktion bei renaler Schädigung. NachBestätigung der Ergebnisse können diese Gene genauer auf ihre Rolle beiNierenerkrankungen untersucht werden. Sollten die identifizierten Schädigungsmechanismenpharmakologisch beeinflussbar sein, so können sich ausdieser Studie neue, pathophysiologisch definierte Therapiemöglichkeiteneröffnen.Rückblick und AusblickDie ERCB hat sich innerhalb von 3 Jahren mit Hilfe der Unterstützungführender nephrologischer Zentren zu einer bislang einzigartigen Ressourcezur Genexpressionsanalyse bei Nierenerkrankungen entwickelt. Mitihrer Hilfe gelang es, mehrere diagnostisch wertvolle Ansätze zu etablieren.Es ist daher zu hoffen, dass in nicht zu ferner Zukunft die Genexpressionanalyseeine wichtige Ergänzung in der nephrologischen Diagnostik darstellenwird.Aktuelle, genomweite Expressionsanalysen renaler Erkrankungen werdenhelfen, die Entwicklung und das Fortschreiten von Nierenerkrankungen besserzu verstehen, und somit neue therapeutische Ansätze zu identifizierenund umzusetzen.Beteiligte Zentren derEuropäischen RenalencDNA Bank (ERCB):P. Mertens, J. Floege, Aachen; A. McKinnon, P. A. J. Brown, A. Rees,Aberdeen; L. Gesualdo, F. P. Schena, Bari; H. Peters, H. H. Neumayer, Berlin;M. Saleem, Bristol; P. Gross, Dresden, P. Doran, D. Lappin, H. R. Brady,Dublin; K. Ivens, B. Grabensee, Düsseldorf; F. Strutz, G. Müller, Göttingen;H.-J. Gröne, Heidelberg; J. K. Gerth, R. Fünfstück, G. Stein, Jena;P. Mampaso, Madrid, M. P. Rastaldi, G. D´Amico, Milano; C. D. Cohen,H. Schmid, M. Kretzler, D. Schlöndorff, München; N. Mistri, W. Samtleben,W. Land, M-Grosshadern; F. Delarue, J. D. Sraer, Paris; M. Tesar, Prag; B.Banas, B. Krämer, Regensburg; N. Braun, T. Risler, Tübingen; R. Oberbauer,D. Kerjaschki, Wien; D. Mönks, C. Wanner, Würzburg.Wir danken allen Patienten für Ihre Mitarbeit und Ihre Einwilligungin die Studie.Literatur• Cohen, C. D. et al., Kidney Int. (2002 );61:125-32• Cohen, C. D. et al., Kidney Int. (2002 a); 61: 133-40• Kretzler, M. et al., J Am Soc Nephrol. (2002);13:1961-72• Schmid, H., J Am Soc Nephrol (2003), in press• Schmid, H. et al., Nephrol Dial Transplant. (2003 ); 18 (S4): 240 (abstract)• Schmid, H. et al., Nephrol Dial Transplant. (2003 a); 18 (S4): 807 (abstract)Ansprechpartner:PD Dr. Matthias Kretzler,Medizinische Poliklinik derLudwig-Maximilians-Universität(Direktor Prof. Dr. D. Schlöndorff)Pettenkoferstr. 8a · 80336 MünchenTel.: 089-5996-845 · Fax: 089-5996-860e-mail: kretzler@medpoli.med.uni-muenchen.deGenomXPress 3/03
9 ForschungDas Deutsche cDNA Netzwerk –Functional genomics und ProteomicsStefan Wiemann 1 , Rainer Pepperkok 2 , Wilhelm Ansorge 2 , André Bahr 3 , Helmut Blöcker 4 ,Dagmar Heubner 5 , Karl Köhrer 6 , Hans-Werner Mewes 7 , Brigitte Obermaier 8 , Annemarie Poustka 11DKFZ Heidelberg, 2 EMBL Heidelberg, 3 Qiagen AG Hilden, 4 GBF Braunschweig, 5 AGOWA GmbH,6Heinrich Heine Universität Düsseldorf, 7 GSF MIPS München, 8 Medigenomix GmbHIm DHGP wurde 1996 das Deutsche cDNA Konsortiumgegründet. Dieses Konsortium vereintacht Institutionen, davon drei Firmen (AGOWAGmbH, Medigenomix GmbH, Qiagen AG), dreiZentren der Helmholtz Gemeinschaft (DKFZ,GBF, GSF), eine Universität (Heinrich Heine UniversitätDüsseldorf), sowie das EMBL als internationaleEinrichtung. Die Zielsetzung des Konsortiumsals eines von drei Projekten vergleichbarerGröße weltweit neben der MammalianGene Collection in den USA, und dem NEDOProjekt in Japan, ist die systematische Klonierungund Sequenzierung von humanen Genenauf Basis von cDNA Analyse in einer globalenKooperation (Wiemann et al., 2001, Imanishi etal., eingereicht). Zunächst im DHGP, inzwischenauch innerhalb des <strong>NGFN</strong> hat das DeutschecDNA Konsortium circa 500.000 cDNA Klonehergestellt, von denen über 200.000 als ESTssequenziert wurden. Kürzlich wurde die Zahlvon 10.000 Klonen überschritten, die in vollerLänge sequenziert worden sind. Diese cDNAsdecken insgesamt 33 Megabasen an Sequenzab, was der sequenzierten Länge etwa deshumanen Chromosoms 21 entspricht (http://mips.gsf.de/projects/cdna). Während die Sequenzendes Konsortiums in die EMBL/Genbank/DDBJDatenbanken eingegeben werden,sind sämtliche Klone über das RZPD verfügbar.Vor vier Jahren wurde das cDNA Konsortium zueinem Netzwerk erweitert, in dem auch diefunktionelle Charakterisierung und Analyse dervon den cDNAs kodierten Proteine in den Fokusaufgenommen wurde (Wiemann et al., 2003).Dieser Prozess erfolgte in mehreren Schritten,die mit der systematischen Analyse der subzellulärenLokalisation dieser Proteine begann(Simpson et al., 2000). Da die Funktion einesProteins zum einen von seiner z.B. katalytischenAktivität abhängt, zum anderen aber insbesondereauch von seiner natürlichen Umgebung,ist die Kenntnis beider Parameter unerlässlichfür die vollständige Charakterisierungeines jeden Proteins. Die Umgebung, das Habitateines Proteins, definiert die möglichen Interaktionen,die ein Protein eingehen kann durchdie Verfügbarkeit der natürlichen Interaktionspartner(z.B. Protein, DNA, Lipid). Unsere Arbeitenstellen also einen ersten Schritt hin zurfunktionellen Charakterisierung von Proteinendar. Bisher wurden über 500 Proteine lokalisiert.Da wir die offenen Leserahmen für dieSubklonierung in Expressionsvektoren in dasGateway Klonierungssystem von Invitrogeneinbringen, eröffnet sich für uns ein weitesSpektrum von Vektoren, mit denen die Proteinein verschiedenen Systemen exprimiert werdenkönnen.Insbesondere im <strong>NGFN</strong> konnten die Arbeitenzur funktionellen Analyse der Proteine substantiellerweitert werden. Innerhalb des Netzwerkswurde inzwischen eine Pipeline etabliert, in dieProteine aus dem cDNA Konsortium, aber auchProteine von externen Kooperationspartnerneingeschleust und analysiert werden können.Abb. 1: Das Deutsche cDNA NetzwerkDiese funktionelle Pipeline ist um drei wesentlicheKomponenten aufgebaut.1. Am EMBL, in der Abteilung von Rainer Pepperkok,wurde ein high-content screening Mikroskopentwickelt, das für die automatischeAkquirierung von mikroskopischen Images im96well Maßstab eingesetzt wird.2. Eine Reihe von funktionellen, Zell-basiertenAssays wurden am EMBL (Protein Sekretion,Golgi Integrität, Protein Tyrosin-Phosphorylierung)und am DKFZ (Zell-Proliferation, Apoptose,MAPKinase signalling, Calcium Signalling)etabliert, die es erlauben mit automatisiertenMethoden die Einflüsse der zu untersuchendenProteine auf krankheitsrelevante Prozesse inder Zelle zu untersuchen. Dies geschieht durchÜberexpression der Proteine (mithilfe dercDNAs) und durch „Unterexpression“ mittelsRNAi. Neben der Automatisierung dieser Assayswurden auch statistische Methoden entwickelt,mit denen auch relativ geringe Einflüsse derProteine auf die untersuchten Prozesse detek-