pdf-Dateien - Nationales Genomforschungsnetz - NGFN

9 ForschungDas Deutsche cDNA Netzwerk –Functional genomics und ProteomicsStefan Wiemann 1 , Rainer Pepperkok 2 , Wilhelm Ansorge 2 , André Bahr 3 , Helmut Blöcker 4 ,Dagmar Heubner 5 , Karl Köhrer 6 , Hans-Werner Mewes 7 , Brigitte Obermaier 8 , Annemarie Poustka 11DKFZ Heidelberg, 2 EMBL Heidelberg, 3 Qiagen AG Hilden, 4 GBF Braunschweig, 5 AGOWA GmbH,6Heinrich Heine Universität Düsseldorf, 7 GSF MIPS München, 8 Medigenomix GmbHIm DHGP wurde 1996 das Deutsche cDNA Konsortiumgegründet. Dieses Konsortium vereintacht Institutionen, davon drei Firmen (AGOWAGmbH, Medigenomix GmbH, Qiagen AG), dreiZentren der Helmholtz Gemeinschaft (DKFZ,GBF, GSF), eine Universität (Heinrich Heine UniversitätDüsseldorf), sowie das EMBL als internationaleEinrichtung. Die Zielsetzung des Konsortiumsals eines von drei Projekten vergleichbarerGröße weltweit neben der MammalianGene Collection in den USA, und dem NEDOProjekt in Japan, ist die systematische Klonierungund Sequenzierung von humanen Genenauf Basis von cDNA Analyse in einer globalenKooperation (Wiemann et al., 2001, Imanishi etal., eingereicht). Zunächst im DHGP, inzwischenauch innerhalb des NGFN hat das DeutschecDNA Konsortium circa 500.000 cDNA Klonehergestellt, von denen über 200.000 als ESTssequenziert wurden. Kürzlich wurde die Zahlvon 10.000 Klonen überschritten, die in vollerLänge sequenziert worden sind. Diese cDNAsdecken insgesamt 33 Megabasen an Sequenzab, was der sequenzierten Länge etwa deshumanen Chromosoms 21 entspricht (http://mips.gsf.de/projects/cdna). Während die Sequenzendes Konsortiums in die EMBL/Genbank/DDBJDatenbanken eingegeben werden,sind sämtliche Klone über das RZPD verfügbar.Vor vier Jahren wurde das cDNA Konsortium zueinem Netzwerk erweitert, in dem auch diefunktionelle Charakterisierung und Analyse dervon den cDNAs kodierten Proteine in den Fokusaufgenommen wurde (Wiemann et al., 2003).Dieser Prozess erfolgte in mehreren Schritten,die mit der systematischen Analyse der subzellulärenLokalisation dieser Proteine begann(Simpson et al., 2000). Da die Funktion einesProteins zum einen von seiner z.B. katalytischenAktivität abhängt, zum anderen aber insbesondereauch von seiner natürlichen Umgebung,ist die Kenntnis beider Parameter unerlässlichfür die vollständige Charakterisierungeines jeden Proteins. Die Umgebung, das Habitateines Proteins, definiert die möglichen Interaktionen,die ein Protein eingehen kann durchdie Verfügbarkeit der natürlichen Interaktionspartner(z.B. Protein, DNA, Lipid). Unsere Arbeitenstellen also einen ersten Schritt hin zurfunktionellen Charakterisierung von Proteinendar. Bisher wurden über 500 Proteine lokalisiert.Da wir die offenen Leserahmen für dieSubklonierung in Expressionsvektoren in dasGateway Klonierungssystem von Invitrogeneinbringen, eröffnet sich für uns ein weitesSpektrum von Vektoren, mit denen die Proteinein verschiedenen Systemen exprimiert werdenkönnen.Insbesondere im NGFN konnten die Arbeitenzur funktionellen Analyse der Proteine substantiellerweitert werden. Innerhalb des Netzwerkswurde inzwischen eine Pipeline etabliert, in dieProteine aus dem cDNA Konsortium, aber auchProteine von externen Kooperationspartnerneingeschleust und analysiert werden können.Abb. 1: Das Deutsche cDNA NetzwerkDiese funktionelle Pipeline ist um drei wesentlicheKomponenten aufgebaut.1. Am EMBL, in der Abteilung von Rainer Pepperkok,wurde ein high-content screening Mikroskopentwickelt, das für die automatischeAkquirierung von mikroskopischen Images im96well Maßstab eingesetzt wird.2. Eine Reihe von funktionellen, Zell-basiertenAssays wurden am EMBL (Protein Sekretion,Golgi Integrität, Protein Tyrosin-Phosphorylierung)und am DKFZ (Zell-Proliferation, Apoptose,MAPKinase signalling, Calcium Signalling)etabliert, die es erlauben mit automatisiertenMethoden die Einflüsse der zu untersuchendenProteine auf krankheitsrelevante Prozesse inder Zelle zu untersuchen. Dies geschieht durchÜberexpression der Proteine (mithilfe dercDNAs) und durch „Unterexpression“ mittelsRNAi. Neben der Automatisierung dieser Assayswurden auch statistische Methoden entwickelt,mit denen auch relativ geringe Einflüsse derProteine auf die untersuchten Prozesse detek-