pdf-Dateien - Nationales Genomforschungsnetz - NGFN

Forschung 4Abb. 3: Beispiel eines“Gauntlet“ für Arabidopsis-Genotypen.VerzögerteVerlängerung der Primärwurzelim Kurztag dientals Merkmal, um Mutantenund Genotypen mitProblemen in der Verteilungvon Kohlenhydratressourcenzu identifizieren.und Phenylpropanoide bearbeitet viele Probenebenfalls parallel. Wir benutzen gekoppelte zyklischeEnzymreaktionen als hochempfindliches Systemzur Analyse wichtiger Metaboliten aus derZucker-, Stärke- und Lipidbiosynthese aus extremgeringen Probenmengen, wie z.B. Samen von Arabidopsis.Bisher wurden zyklische Reaktionen fürATP, ADP, ADP-Glukose, UDP-Glukose, Pyrophosphat,glykolytische Intermediate, NAD(H),NADP(H) und Acetyl-CoA neu entwickelt. Metabolitanalysensind unabhängig vom genetischenHintergrund und daher als Plattform mit Kulturpflanzenbeliebig kombinierbar. Darüber hinauswird die GC/MS-Technik für die unverzerrte Analyseeines weiten Spektrums an Metabolitengenutzt.Der Antwort einen Sinn geben:MapMan – KontextbezogeneVeranschaulichung großerDatenmengenModerne Messtechnologien generierenUnmengen an Datensätzen mit 1.000en von Messparametern.Deren Aufarbeitung wird durch unsereInterpretationsfähigkeit beschränkt. Oft nutzenWissenschaftler nur die Information über dasVerhalten ausgewählter sog. “Kandidatengene”als Ausgang für detaillierte Funktionsstudien. DieProfiltechniken müssen mit einem Portfolio vonInterpretationswerkzeugen verknüpft werden, umihr Potential für eine umfassende Analyse vonSystemantworten auszunutzen. Den vielen Clustering-Verfahrenund lernenden neuronalenNetzwerken fehlt jedoch die Möglichkeit, genomischeDatensätze zu organisieren und sinnvollim bekannten biologischen Kontext abzubilden.Zusätzlich wurden die meisten Werkzeuge bisherfür mikrobielle Systeme entwickelt. Sie könnennur aufwendig an ein Pflanzensystem angepasstwerden.In Kooperation mit dem RZPD haben wir daherdas Softwaretool MapMan (Abb. 2) entwickelt. Esbildet Datensätze auf einem Diagramm in selbstdefiniertenBereichen ab, die symbolisch einer biologischenFunktion zugeordnet sind. Für jedesindividuelle Gen zeigt MapMan ein diskretes Signalan. Gene sind zunächst in Blöcken und nichtin Stoffwechselwegen gruppiert, wobei Gene eingeordnetwerden können, auch wenn ihre Funktionnur annäherungsweise bekannt ist. DerAbbildungsbereich kann ein Sektor eines Stoffwechselweges,eine bestimmte Funktion in derZelle (z.B. Proteinsynthese) oder eine biologischeAntwort darstellen, z.B. Gene, die im Metabolismusteilnehmen und/oder auf Hormone antworten.Er kann aber auch eine große Enzymfamiliemit vielen unbekannten Mitgliedern darstellen,z.B. die Cytochrom-P450-Familie. Die Veränderungder Auflösung wird, abhängig vom Hintergrundwissenund der Fragestellung, durch denGebrauch hierarchischer Kategorien und Diagrammemit zunehmender Detailtreue ermöglicht.Wirhaben in der MapMan-Software der Flexibilitäteine hohe Priorität gegeben, damit jederBenutzer seine eigenen Datensätze auswählenund funktionelle Kategorien und Diagramme erstellenkann.Enträtselung derpflanzlichen Antwort aufKohlenhydratmangelZucker regulieren viele Prozesse desMetabolismus und der Entwicklung. Die beteiligtenSignaltransduktionswege wurden bisher vorallem durch Applikation hoher externer Zuckerkonzentrationenuntersucht. Unser Ziel war es, zuverstehen wie physiologische Veränderungenagronomisch relevante Eigenschaften der Pflanzeverändern. Daher wurden “Gauntlets” etabliert,um Phänotypen zu generieren, die auf den Wechselder endogenen Zuckerversorgung antworten.Ein Beispiel dafür ist der Transfer von Pflanzen ausLangtagbedingungen in den Kurztag. Die Pflanzehäuft Kohlenhydrate, besonders Stärke, tagsüberan, remobilisiert sie in der Nacht und erhält so denStoffwechsel. Am Ende einer „normalen” Nachtist nahezu der gesamte Anteil der tagsübergespeicherten Stärke verbraucht. Verlängern wirdie Nacht, wird der Stärkepool verbraucht, und dieZuckerpegel fallen innerhalb von 2-4 Stundensehr tief. Ein komplementärer “Gauntlets” setztstärke-defiziente Mutanten ein. Diese Mutantenenthalten sehr hohe Zuckerkonzentrationen amTagesende und sehr niedrige Zuckerkonzentrationenam Ende der Nacht.Keimlinge, die auf vertikalen Platten wuchsen,wurden von Langtag in Kurztagbedingungenüberführt und die Veränderung des Wurzelwachstumsverschiedener Ökotypen auf diesen Stressermittelt (Abb. 3). Wir haben dieses Testsystemauch für Gene genutzt, die als Teil eines SensorundRegelmechanismus für die Begleichung vonZuckerfehlbeträgen zuständig sind. Es gibt einendiagnostischen Abfall glykolytischer Intermediatewährend der ersten 4 Stunden einer verlängertenNacht, der innerhalb von 8 Stunden revertiertwird, da eine Stoffwechselumsteuerung der Pflanzeden Abbau von alternativen Kohlenhydratquellen(z.B. Aminosäuren aus Proteinen) ermöglicht.Innerhalb von nur 2 Tag-Nacht-Zyklen korrigiertdie Pflanze das temporäre Ungleichgewicht zwischenKohlenstoff und Stickstoff, indem sie dieStärkesyntheserate im Kurztag erhöht und einengrößeren Speicher für die Nacht bereitstellt.Transkriptprofile für 5 Zeitpunkte im Bereich desAbfalls und der Erholung glykolytischer Intermediatkonzentrationenzeigen, dass die Expressionvon mind. 800 Genen verändert wird. Eine größereReprogrammierung des Metabolismus dientder Umsteuerung des Energiestoffwechsels. DieTranskriptspiegel für Enzyme der Nitrat- und Sulfat-Assimilationals auch für die Synthese vonAminosäuren, Nukleotiden, Lipiden und der Zellwandfallen (Abb. 4). Gleichzeitig steigt dieExpression vieler Gene, deren Enzyme am Abbauvon Aminosäuren, Nukleotiden, Lipiden und derZellwand beteiligt sind. Diese Expressionsänderungensind von Veränderungen in den beteiligtenEnzymaktivitäten und Metabolitpegeln begleitet.Die Hemmung der Synthese von Aminosäuren, derZellwand und der Lipide wurde von einer globalenRepression der Gene begleitet, die an der Aminosäureaktivierungund der Proteinsynthese beteiligtsind (Abb. 5). Die Repression der Genebetrifft ebenfalls Proteine, die Zellwandeigenschaftenmodifizieren um damit Wachstum zuermöglichen (Abb. 5). Die Transkriptspiegel fürGene aus großen Bereichen des Sekundärstoffwechselsändern sich ebenfalls. Besonders wichtigsind die Veränderungen der Transkriptspiegelfür Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen, Rezeptorkinasenund Komponenten der Signalkaskadenam Anfang der Umschaltung des Zuckerstoffwechsels.Demnach wird das regulierende Netzwerkumfassend neu verdrahtet. Mehrere Gene,die das Enzym Trehalosephosphat-Synthasekodieren, wurden schon zu einem frühen Zeitpunktunter der Niedrigzuckerbedingung starkGenomXPress 3/03