pdf-Dateien - Nationales Genomforschungsnetz - NGFN

3 ForschungAbb. 1: Roboter-basierte EnzymtestsAbb. 2: Modularer Aufbau von MapMangigkeit von der Verfügbarkeit von Kohlenstoff andNährstoffen regulieren. Als Modell-Untersuchungsobjektdient die Kruzifere Arabidopsis thaliana,die„Ackerschmalwand“. Die generelle Strategieist es, eine Serie von definierten Wachstumsbedingungen,sogenannten “Gauntlets“(deutsch: Spießrutenlauf), zu erstellen. “Gauntlets”werden als Screening-Verfahren für genetischeDiversität und für die Entdeckung von Genendurch sog. “forward genetics“-Methoden eingesetzt.Sie bieten sich auch als experimentelleSysteme an, mit denen mehrschichtige Analysenzur Charakterisierung von Systemantwortendurchgeführt werden. Mehrschichtige analytischePlattformen generieren zugleich Unmengen anDaten. Um ein umfassendes Verständnis überkomplexe Systeme erlangen zu können, wurdenneuartige Visualisierungs-Softwaretools entwickelt,die solche Daten sinnvoll in den biologischenKontext einbetten.Bringen wir die Pflanzenzum Sprechen: Wachstumin “Gauntlets”“Gauntlets“ sind standardisierte Wachstumsbedingungenim Hochdurchsatzverfahren,die eine klare phänotypische Veränderung erzwingen.Der Phänotyp sollte idealerweise quantifizierbarsein und sich möglicherweise visuell oderauch als Veränderung von Metabolitspiegelnbemerkbar machen, die über eine Hochdurchsatz-Plattform gemessen werden.“Gauntlets” könneneinerseits in Mutanten-Screeningverfahren, fürdie Identifizierung natürlicher Variation in Ökotypenund für die Charakterisierung von mutantenArabidopsis-Linien aus dem GABI-Verbund eingesetztwerden. Ferner definieren sie geeigneteBedingungen für die detaillierte Analyse der Antwort,zum Beispiel durch die Erstellung von Metabolit-,Transkript- und Enzymprofilen.Typischerweise wird für jeden “Challenge” einSatz komplementärer “Gauntlets” entwickelt.Einige stellen einfache aber künstliche Situationendar. Ein Beispiel für eine einfache Behandlungist die abrupte Veränderung der Wachstumsbedingungendurch Einführen von Nährstoffen indas Medium von Keimlingen in Flüssigkultur.Andere “Gauntlets” bilden kompliziertere Situationenab, zum Beispiel vertikale Platten mit Nährmedium,das beliebig zusammengesetzt seinkann, um zum Beispiel die Auswirkung des Nährstoffangebotsauf die Wachstumsraten von Wurzelnund deren Architektur zu untersuchen.Andere“Gauntlets” gehen die Einflüsse auf das reproduktiveWachstum der Pflanze an.Wenn möglich,werden komplementäre “Gauntlets” entwickelt,die komplexe Antworten, z.B. auf Stickstoffmangel,in einfache Bestandteile zerlegen.Der Weg zur Antwort:vielschichtige Analyse vonTranskript-, Enzym- und MetabolitprofilenTranskriptprofile werden mit kommerziellenArray-Chips erstellt (Fa. Affymetrix: > 22.000Transkripte parallel), was Informationen über dieExpression für ca. drei Viertel der Gene aus demArabidopsis-Genom liefert. Für einige Gene ist dieSensitivität der Array-Methode zu gering, z.B. fürdie Transkripte vieler Transkriptionsfaktoren, welcheselbst die Expression anderer Proteine regulieren.Daher werden Transkriptanalysen durch dieMethode der Realtime-PCR ergänzt. Eine institutseigeneRT-PCR-Plattform wurde von MichaelUdvardi, Wolf-Rüdiger Scheible und Mitarbeiternentwickelt, die 1.400 der ca. 1.600 annotiertenTranskriptionsfaktoren aus Arabidopsis quantitativdetektiert.Veränderungen von Transkriptspiegeln könnenschnell und umfassend gemessen werden, liefernallerdings nur indirekte Hinweise, ob die Spiegelder abgeleiteten Proteine sich ändern und, wennja, ab wann und wie groß die Veränderungen sind.Zur Zeit liefert die Proteomik noch eher qualitativedenn quantitative Informationen. Enzymaktivitätenkönnen mit hoher Präzision gemessenwerden und stellen momentan eine Alternativezur quantitativen Proteomik dar. Mehr als 40 Aktivitätstestsfür Enzyme wurden an das ELISA-Formatangepasst und werden routinemäßig imHochdurchsatz mit einem Pipettierroboter bearbeitet.Diese Tests umfassen Enzyme aus der Photosynthese,der Zucker- und Stärkesynthese, demprimären Stickstoffmetabolismus, aus dem AufundAbbau von Aminosäuren, der Nukleotidsyntheseund dem Lipidstoffwechsel. Enzymaktivitätsprofilewerden zusätzlich als Strategie genutzt,um genetische Diversität in Ökotypen, F1-Hybriden,RILs und NILs (Arabidopsis Verbund I) festzustellen.Sie werden mit Transkriptprofilen zurMehrschichtanalyse kombiniert. Enzymaktivitätsprofileunterstützen auch die Analytik für Kulturpflanzenohne die Proteomik unterstützendeSequenzinformation.Innerhalb der Zelle haben Proteine vielfältigeFunktionen. Im Kontext unseres Projekts spielenEnzyme eine wichtige Rolle.Veränderungen in derEnzymexpression führen zu Veränderungen derSpiegel und Flüsse von Metaboliten. Die Erstellungvon Metabolitprofilen stellt daher die drittezentrale Komponente unserer Phänotypisierungsplattformdar (Abb. 1). Sie ist ein wichtiges Elementunserer Strategie für das experimentelleDesign (siehe unten). Die Komponenten der Plattformfür Metabolitprofile besteht aus Testreaktionenfür verschiedene Zucker, Stärke, Protein, Chlorophyll,Nitrat, wichtige phosphorylierte Intermediateund Aminosäuren. Die Tests im ELISA-Plattenformatwerden von einem Pipettierroboterbedient, der im Hochdurchsatz auch die Entwicklungneuer Gauntlets ermöglicht. Die automatisierteHPLC-Analytik für Nukleotide,Aminosäuren