pdf-Dateien - Nationales Genomforschungsnetz - NGFN

Forschung 16RZPD entwickelt hoch-spezifischesiRNA ProdukteEffi Rees 1 , Markus Schuster 1 , Frank Buchholz 2 , Bernhard Korn 11RZPD Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung, Im Neuenheimer Feld 580, 69120 Heidelberg2Max-Planck-Institut für Molekulare Zellbiologie und Genetik, Pfotenhauer Str. 108, 01307 DresdenRNA Interferenz (RNAi, Fire et al. 1998) hat sichzu einem wichtigen Werkzeug zum Studium vonGenfunktionen entwickelt („functional genomics“)und ermöglicht den „Knock down“ vonGenen in einer Vielzahl von Organismen (z.B.Drosophila, Caenorhabditis, Mus musculus) sowiein menschlichen Zelllinien. Ein wichtigesCharakteristikum des Mechanismus ist das Prozessierenvon langen dsRNAs in 21-23 Nukleotide,die sogenannten small interfering RNAs(siRNA, Elbashir et al. 2001) durch den Dicer-Enzymkomplex. Die siRNA bildet mit einem Proteinkomplexden sogenannten RNA-inducedSilencing Complex (RISC), dieser bindet an denantisense Strang des 21-mers und schneidet diemRNA in der Mitte des Hybrides (Hammond etal. 2000). Die mRNA Degradation führt zu einem„gene silencing“ auf posttranskriptioneller Ebene.Die neue Technik der RNA Interferenz erlaubtes unter anderem in Säugerzellkulturen im HochdurchsatzGenfunktionen zu analysieren.Ursprünglich wurden 21 bp dsRNAs für den„Knock down“ in menschlichen, murinen undRattenzellen beschrieben (Elbashir et al., 2001).Diese Organismen verfügen über keine inhärenteDicerfunktionalität, d. h. ihnen müssen dieRNAs in ihrer für den „Knock down“ aktivenForm zugeführt werden (im Gegensatz zu Drosophilaund Caenorhabditis).Der Einsatz von 21 bp siRNA Produkten hatjedoch drei wesentliche Nachteile: i.) eine ungewisseErfolgsrate (i. Allg. braucht man 2-3 verschiedenesiRNA Oligos um einen „Knock downzu erreichen), ii.) die Effizienz ist meist gering,d.h. die eingesetzten siRNA Oligos führen lediglichzu einer Reduktion des Proteinlevels vonweniger als 75%), und iii.) die Kosten für siRNAOligonukleotide belaufen sich auf mehrere HundertEURO pro Gen, wodurch ein Genom-weitesScreening behindert wird.Daher arbeitet das RZPD seit einiger Zeit aneinem alternativen Weg des „gene silencing“.Wir beziehen uns dabei auf eine Technologie, dieseit ca. zwei Jahren in der Literatur beschriebenwird: Den Einsatz von in vitro Transkription undrekombinanten, RNA verdauenden Enzymen zurHerstellung von funktionellen siRNAs (Yang etal., 2002; Zhang et al., 2002). Das Prinzip dersiRNAs der RZPD ist in Abb. 1 dargestellt. Wirhaben genspezifische Produkte für 39.161 unigeneCluster hergestellt und verifiziert. Dabeihandelt es sich um PCR Produkte, die mit zweispezifischen Primern pro Gen hergestellt wurdenund keinerlei repetitive bzw. konservierte Sequenzenenthalten. Um diese dsDNA in dsRNAumzuwandeln wurden T7 Promotoren angefügt.Diese Produkte lassen sich sehr leicht über invitro Transkription in dsRNA Moleküle überführen,was am RZPD in automatisierter Form undunter Barcodekontrolle etabliert ist. Diese „langen“dsRNA Moleküle können mittels Dicer oderRNaseIII Reaktion in funktionelle „kleine“siRNAs überführt werden (Abb. 2). Diese Endproduktehaben sich als potente „Tools“ für denspezifischen „Knock down“ erwiesen, die oftden siRNA Oligos überlegen sind (Kawasaki etal., 2003).Das RZPD hat bisher mehr als 2.378 verschiedene,hoch-spezifische, lange dsRNAs hergestellt.Diese werden z. Z. in Kollaboration mit dem MPIfür Zellbiologie (F. Buchholz) und dem DKFZ(S. Wiemann) in Modellversuchen eingesetzt.Entsprechende doppelsträngige PCR Produkte,inkl. T7 Promotoren sollen ab Ende Oktober überdas RZPD zur Verfügung gestellt werden. Parallelwird dieser Satz erweitert und wir gehen davonaus, dass bis Ende des kommenden Jahres 39.000gen-spezifische Produkte für den Menschen zurVerfügung stehen. Darüber hinaus arbeiten wir anentsprechenden Materialien für Maus und Ratte,die zum Frühjahr 2004 bereitstehen sollten.Abb. 1: Von mRNA Sequenz zu siRNA ProduktEine Teilsequenz, die frei von repeats (R) und konserviertenAnteilen ist wird über gen-spezifische PCRamplifiziert. Die Produkte werden verifiziert und mitT7 Promotoren versehen. Über in vitro Transkriptionwerden die PCR Produkte in „lange“ dsRNAs überführt.Diese werden anschließend über spezifischeRNA-abbauende Enzyme (Dicer/RNaseIII) in funktionellesiRNAs umgewandelt.Abb. 2: Dicer/RNaseIII Reaktion in vitro(A) zeigt den Verdau von dsDNA verschiener Längedurch rekombinantes Dicer Enzym. Die Längen derdsRNAs und des Größenmarkers sind in bp angegeben,nach Zhang et al., 2002(B) zeigt dsRNAs nach RNaseIII BehandlungGenomXPress 3/03