Ionenchromatographische Bestimmung von Laktose in Lebensmitteln
Ionenchromatographische Bestimmung von Laktose in Lebensmitteln
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NEUES AUS UNTERNEHMEN<strong>Ionenchromatographische</strong> <strong>Bestimmung</strong><strong>von</strong> <strong>Laktose</strong> <strong>in</strong> <strong>Lebensmitteln</strong>Klaus Huege, Thomas Kolb, IC Applikationslabor, Metrohm Deutschland<strong>Laktose</strong>, auch als Milchzucker bezeichnet,ist e<strong>in</strong> bedeutsamer Bestandteil derMuttermilch <strong>von</strong> Säugetieren. Der Anteilbeträgt zwischen 2% und 7%. <strong>Laktose</strong> istvor allem für Säugl<strong>in</strong>ge e<strong>in</strong> wichtiger Energielieferant,unterstützt die Calcium-Resorptionund hemmt Fäulnisbakterien. Beider Verdauung sorgt das körpereigene EnzymLaktase für die Aufspaltung <strong>von</strong> <strong>Laktose</strong><strong>in</strong> D-Galaktose und D-Glucose. DieProduktion <strong>von</strong> Laktase lässt bei Erwachsenenstark nach. Kann <strong>Laktose</strong>, aufgrunde<strong>in</strong>es Mangels an Laktase, nicht mehr abgebautwerden spricht man <strong>von</strong> e<strong>in</strong>er <strong>Laktose</strong>unverträglichkeit.Diese kann u.a. Blähungenund Durchfall hervorrufen. DieLebensmittel<strong>in</strong>dustrie hat darauf reagiertund br<strong>in</strong>gt vermehrt »laktosefreie« Lebensmittelauf den Markt. Dies bedeutet,dass der Gehalt <strong>von</strong> <strong>Laktose</strong> <strong>in</strong> Milchproduktenunter 100 mg/100 g Probe liegt.Zur Zeit ist im Gespräch diesen Wert auf10 mg/100 g Probe zu senken. Um diesesKriterium für die Angabe »laktosefrei« sichernachweisen zu können, wird e<strong>in</strong> entsprechendesAnalyseverfahren benötigt.Die Ionenchromatographie ist aufgrundder e<strong>in</strong>fachen Bedienung, der sehr weitgehendenAutomation, der <strong>in</strong>tegrierten Probenvorbereitungund der notwendigen<strong>Bestimmung</strong>sgrenze prädest<strong>in</strong>iert dieseAufgabenstellung umfassend zu lösen.Gerätekonfiguration• IC-System und Detektor:850 Professional IC850 IC Amperometric Detector• Automation:858 Professional Sample Processor800 Dos<strong>in</strong>oIC-Ausrüstung für Inl<strong>in</strong>e-Dialyse• Software:MagIC Net 2.4 Professional• Vor- und Trennsäule:Metrosep Carb 1 Guard/4.0Metrosep Carb 1 – 150/4.0Probenvorbereitung[1]Die notwendige Probenvorbereitung iststark <strong>von</strong> der zu untersuchenden Lebensmittelmatrixabhängig. Zunächst muss dafürgesorgt werden, dass die zu bestimmende<strong>Laktose</strong> quantitativ <strong>in</strong> e<strong>in</strong>e wässrigeLösung überführt wird. Feste Proben,wie z.B. Hartkäse, werden nach dem Zerkle<strong>in</strong>ernim Ultraschallbad wässrig extrahiertund das Extrakt über 0,45 µm filtriert.Dieses Extrakt kann dann direkt auf demAutosampler bereitgestellt werden. Fürflüssige Proben (z.B. Milch) ist zunächstnur e<strong>in</strong> Verdünnungsschritt (z.B. 1:500 <strong>in</strong>Re<strong>in</strong>stwasser) nötig, der manuell oder automatischdurchgeführt werden kann. Dieverdünnte oder unverdünnte flüssige Probekann dann direkt auf dem Autosamplerplatziert werden. Die hochmolekularen,unpolaren Matrixbestandteile (Prote<strong>in</strong>e,Fettsäuren etc.) der Lebensmittelextraktewürden sich auf die Trennleistung und Lebensdauerder Trennsäule stark negativauswirken oder diese <strong>in</strong> kurzer Zeit unbrauchbarmachen. Mit Hilfe der Inl<strong>in</strong>e-Dialyse-Technik werden diese Matrixbestandteileautomatisch durch e<strong>in</strong>e semipermeableMembran abgetrennt. Die treibendeKraft bei dieser Technik ist der Konzentrationsgradientzwischen der Probelösungund e<strong>in</strong>er Akzeptorlösung (Re<strong>in</strong>stwasser).Über e<strong>in</strong> spezielles Liquid-Handl<strong>in</strong>gmit der bewährten Dos<strong>in</strong>o-Technologieund e<strong>in</strong>em 6-Port-Ventil wird der Ablaufso gesteuert, dass sich e<strong>in</strong> nahezu100%iges Dialysegleichgewicht e<strong>in</strong>stellt.Dadurch erübrigt sich e<strong>in</strong>e langwierige <strong>Bestimmung</strong>und Kalibrierung der Dialyserate.Durch e<strong>in</strong>e <strong>in</strong>telligente Steuerung derDie Detektion erfolgtmit dem 850 ICAmperometricDetector.Module über die Software MagIC Netkann die Dialyse so betrieben werden, dasswährend der Chromatogrammaufnahmebereits die folgende Probe vorbereitetwird. Die Dialysedauer <strong>von</strong> 10 M<strong>in</strong>utenwirkt sich somit nicht negativ auf denmöglichen Probendurchsatz aus.Nach der Matrixabtrennung mittelsDialyse werden 20 µl der aufgearbeitetenProbe automatisch <strong>in</strong>s Chromatographiesystem<strong>in</strong>jiziert. Im Anschluss wird die Dialysezellezunächst mit e<strong>in</strong>er Ethanol/Wasser-Mischungund anschließend mitRe<strong>in</strong>stwasser <strong>von</strong> der Probenmatrix freigespültund für die nächste <strong>Bestimmung</strong> vorbereitet.So werden Verschleppungenauch bei deutlichen Konzentrationsunterschiedenverh<strong>in</strong>dert und e<strong>in</strong>e möglichstlange Standzeit der Dialysemembran gewährleistet.Chromatographie undDetektion[2]Die chromatographische Trennung derKohlenhydrate erfolgt auf e<strong>in</strong>er hochka-24 | dmz 7/2013[1] G. Bogenschütz, T. Kolb, A. Walter: Matrixentfernung mittels Inl<strong>in</strong>e-Verfahren <strong>in</strong> der Ionenchromatographie, GIT Labor-Fachzeitschrift 01/2003, S. 25-28[2] Application Work AW IC CH6-1105-082012, Metrohm AG, Herisau
NEUES AUS UNTERNEHMENProbenvorbereitung[3]pazitiven Anionenaustauscher-Säule (MetrosepCarb 1 150/4.0) im stark alkalischenNaOH-Eluenten (10 mMol/L Na-OH, 4 mMol/L Natriumacetat) bei 30°C.Unter diesen Bed<strong>in</strong>gungen liegen die Kohlenhydrateunterschiedlich deprotoniertals Anionen vor und können auf der Ionenaustauschersäulegetrennt werden.Die chromatographischen Arbeitsbed<strong>in</strong>gungenwurden so optimiert, dass <strong>Laktose</strong>möglichst gut <strong>von</strong> anderen Kohlenhydratenwie Saccharose, Galaktose, Glucose,Lactulose etc. getrennt wird.Im PAD-Modus (gepulste amperometrischeDetektion) werden an e<strong>in</strong>er Gold-Arbeitselektrode pro Sekunde drei verschiedeneSpannungen angelegt. Bei e<strong>in</strong>erArbeitsspannung <strong>von</strong> 50 mV (gegenüberder Palladium-Referenzelektrode) werdendie zu bestimmenden Kohlenhydrate ander Goldoberfläche oxidiert. Der dabeifließende Strom dient als Messsignal undTests mit verschiedenenLebensmittelprobenUm die Eignung der beschriebenenMethode für unterschiedliche Lebensmittelmatriceszu untersuchen, wurden verschiedenelaktosefreie Produkte (Schokowaffeln,Schokomilch, Hartkäse) orig<strong>in</strong>alsowie mit <strong>Laktose</strong> dotiert vermessen. Inder folgenden Tabelle s<strong>in</strong>d die Ergebnissedargestellt:Tests mit verschiedenen LebensmittelprobenBewertungund AusblickDie beschriebeneMethode ermöglicht die<strong>Bestimmung</strong> <strong>von</strong> <strong>Laktose</strong><strong>in</strong> unterschiedlichen<strong>Lebensmitteln</strong>. Zur Untersuchungfester Probenist e<strong>in</strong>e wässrige Extraktionnotwendig.Flüssige Proben oder diewässrigen Extrakte werdendirekt auf dem Autosamplerbereitgestelltund alle weiteren Probenvorbereitungsschrittesowie die anschließende Analyse laufenautomatisch ab. Nach den bisherigen Untersuchungenkönnen Gehalte ab 10mg/100 g <strong>Laktose</strong> <strong>in</strong> unterschiedlichen <strong>Lebensmitteln</strong>mit der Ionenchromatographieerfasst werden. Zusätzlich bietet dieseMethode die Möglichkeit, weitere Kohlenhydratewie Saccharose, Galaktose, Glukose,Fruktose oder Maltose mitzubestimmen.Im Vergleich mit den für diese Analytikhäufig e<strong>in</strong>gesetzten enzymatischenProben <strong>Laktose</strong>gehalt Dotierte Wiederf<strong>in</strong>dung<strong>in</strong> Orig<strong>in</strong>alprobe <strong>Laktose</strong>menge [%][mg / 100 g] [mg / 100 g]Schokomilch < 5 10 98Schokowaffeln < 10 25 109Hartkäse < 1 2,5 97[4]Aufgrund der unterschiedlichen Störsignaleund der teilweise sehr großen Konzentrationsunterschiededer e<strong>in</strong>zelnenKohlenhydrate <strong>in</strong> den verschiedenen <strong>Lebensmitteln</strong>ergeben sich für die untersuchtenMatrices unterschiedliche <strong>Bestimmung</strong>sgrenzenfür <strong>Laktose</strong>. E<strong>in</strong> Gehalt <strong>von</strong>10 mg/100 g ist aber <strong>in</strong> allen drei Probenmessbar.Tests ergeben sich bei der Ionenchromatographiedeutlich niedrigere Kosten für Verbrauchsmaterialsowie teilweise niedrigere<strong>Bestimmung</strong>sgrenzen. Durch Optimierungder Probenvorbereitung (Extraktion,Verdünnung) für die e<strong>in</strong>zelnen Lebensmittelkönnen die erreichbaren Nachweisund<strong>Bestimmung</strong>sgrenzen noch weiter gesenktwerden.ist direkt proportional zur Konzentration.E<strong>in</strong>e positive und e<strong>in</strong>e negative Re<strong>in</strong>igungsspannungdienen dazu, die Elektrodenoberflächewieder <strong>von</strong> Oxidationsproduktenzu befreien. So steht stets e<strong>in</strong>e frischeArbeitselektrodenoberfläche zur Verfügungund e<strong>in</strong>e robuste und zuverlässigeDetektion ist garantiert.[3] A. Ste<strong>in</strong>bach: Amperometrische Detektion, GIT Labor-Fachzeitschrift 05/2012, S. 334-335[4] Application Work AW IC DE8-0816-122012, Metrohm Deutschland, Filderstadtdmz 7/2013 | 25