Weiterentwicklung und Einsatz der Fluoreszenz-Clamp Methode für ...

Kapitel 1EinleitungDas Grundkonzept der Photosynthese wurde durch die chemiosmotische Hypothese vonMitchell (1961) verstanden. Die beiden Photosysteme II und I nutzen die Lichtenergie, umElektronen vom Wasser zum NADP zu transportieren. Auf dem Weg dorthin bauen sie einenpH-Gradienten über einer Membran auf. Dieser pH-Gradient treibt eine ATPase und erzeugtATP (Witt, 1979). ATP und NADPH/H + treiben zusammen den Calvin-Zyklus, der CO 2 inZucker einbaut.Im Laufe der Jahre wurde dieses Bild jedoch komplexer. Der Elektronenfluß vom Wasser erreichtnicht in jedem Fall das NADP, sondern kann sich hinter PS I auf unterschiedliche Akzeptorenverteilen. Je nach Fragestellung interessieren sich Forschergruppen für verschiedenedieser Zusatzakzeptoren.Gegensätzliche Auffassungen über die Bedeutung der einzelnen Wege können bereits innerhalbeiner Arbeitsgruppe bestehen. In Würzburg halten Heber et al. (1982) den sogenanntenzyklischen Elektronentransport um PS I für den wichtigsten Prozeß, um die ATP-Bilanz imBlatt zu verbessern. Schreiber (Schreiber und Neubauer, 1990) hingegen schreibt diese Rolleder Mehler-Reaktion, d. h. der Übertragung von Elektronen auf molekularen Sauerstoff, zu.In Kiel steht die Bedeutung der Nitratassimilation als PS I-Elektronenakzeptor im Mittelpunkt.Es ist aus der Landwirtschaft bekannt (Magalhaes und Wilcox, 1983 ; Zornoza et al.,1989), daß nitraternährte Pflanzen resistenter gegen Lichtstreß sind als ammoniumernährte.In einem gemeinsamen DFG-Projekt der Kieler Arbeitsgruppe für Biophysik und des Institutsfür Pflanzenernährung soll nachgewiesen werden, daß die Abnahme von Elektronen an PS Ibei nitraternährten Pflanzen eine Entlastung und damit eine Schutzfunktion für die Pflanzebedeutet (Vanselow, 1993; Bendixen et al., 1997). In diesem Zusammenhang spielt auch dieMehler-Reaktion eine große Rolle (Zhu et al., 1997).Eine Schwierigkeit besteht darin, die Verzweigung des Elektronenflusses hinter PS I experimentellzu erfassen. Obwohl es verschiedene meßtechnische Zugänge zum photosynthetischenApparat gibt, wird gerne auf die Chlorophyll-Fluoreszenz von PS II zurückgegriffen. Sieist mit Abstand am leichtesten zu messen und birgt eine Fülle von Information. Allerdingsist die Information so reichhaltig, daß es teilweise schwer ist, sie zu decodieren. Es werdendeshalb Meßverfahren gesucht, die eindeutige Antworten geben.Die Fluoreszenz ist ein Maß für die Konzentration von Exzitonen in den PS II-Antennen. Sieentspricht damit der Messung eines Potentials, vergleichbar mit einer Spannung in einemelektrischen Netzwerk. Die eigentlich interessierenden Exzitonenflüsse aus den Antennen inden photosynthetischen Apparat oder in die Energiedissipationsmechanismen werden indirektaus Veränderungen dieser Potentialgröße geschlossen. Wie in Kapitel 4 gezeigt wird, hates jedoch Vorteile, die Flüsse direkt zu messen.1

EINLEITUNGVor einer ähnlichen Anforderung stand früher die Nervenphysiologie. Es war verhältnismäßigeinfach möglich, Spannungen an den Nervenzellen zu messen, es interessierten aber dieStröme. Dies änderte sich, als Marmont (1949) einen Voltage-Clamp-Kreis aufbaute: ein Regelkreishielt die Spannung konstant und lieferte den dafür erforderlichen Strom nach. DiesesKonzept sollte in einer Vorgängerarbeit (Giannikos, 1995) auf die Chlorophyll-Fluoreszenzübertragen werden. Es entstand die FC-Maschine (Fluoreszenz-Clamp-Maschine), bei derdas Licht so nachgeregelt wird, daß der Exzitonenfluß aus der Antenne kompensiert wird unddie Intensität der Fluoreszenz konstant bleibt.Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es, das Konzept der ersten Version technisch zu vervollkommnen,den Nutzen zu verdeutlichen und damit Messungen zu den oben genanntenProblemkreisen Nitratassimilation und Mehler-Reaktion durchzuführen. Insbesondere warder Nachweis der Mehler-Reaktion eine Motivation zur Entwicklung der FC-Maschine. DieseReaktion ist zwar bei isolierten Chloroplasten nachgewiesen (Mehler, 1951a, 1951b), doch imintakten Blatt ist ihre Rolle nach wie vor unklar.Ein Zugang hierzu wurde von Parallelmessungen des Elektronenflusses mit der FC-Maschineund der Netto-Sauerstoffentwicklung erwartet. Die vorliegende Arbeit wird zeigen, daß diesmit simultanen, photoakustischen Messungen gemeinsam mit Tabrizi (1997) gelingt.2

Kapitel 2Der PhotosyntheseapparatDie folgenden Abschnitte dienen dazu, eine kurze Einführung in die biologischen und physikalischenHintergründe des photosynthetischen Systems zu geben, das hier untersucht wird.Da dieses System bereits in vielen Vorgängerdiplomarbeiten beschrieben wurde, erfolgt nurein kurzer Überblick über die Grundlagen. Eine ausführlichere Beschreibung der Reaktionenan Photosystem I, die die vorliegende Arbeit direkt betreffen, liefern die Kapitel 4 und 8.2.1 Die Licht- und DunkelreaktionDer Gesamtprozeß der Photosynthese läßt sich in zwei Bereiche unterteilen:• die Lichtreaktion, bei der hauptsächlich biophysikalische Vorgänge ablaufen,• die Dunkelreaktion, bei der im wesentlichen biochemische Vorgänge eine Rolle spielen.Die Bezeichnung ”Dunkelreaktion” bringt zum Ausdruck, daß die damit verbundenenProzesse, zumindest für eine gewisse Zeit, ohne direkten Einfluß von Licht ablaufenkönnen.Wie Abbildung 2.1 verdeutlicht, sind Licht- und Dunkelreaktion eng miteinander gekoppelt.Während der Lichtreaktion wird die Energie des absorbierten Lichtes genutzt, um die che-Abbildung 2.1: Zusammenwirken von Licht- und Dunkelreaktion in der Photosynthese (Buschmannund Grumbach, 1985).mischen Substanzen ATP und NADPH/H + herzustellen. Zusätzlich wird durch die Photolyse3

DER PHOTOSYNTHESEAPPARATdes Wassers Sauerstoff freigesetzt. Während der Dunkelreaktion, dem sogenannten Calvin-Zyklus, werden – mit Hilfe des ATP als Energieträger und des NADPH/H + als Reduktionsmittel– durch die Reduktion von CO 2 Kohlenhydrate produziert.Da für diese Arbeit hauptsächlich die Lichtreaktion von Interesse ist, wird sie in den folgendenAbschnitten näher behandelt.2.2 Ort der PhotosyntheseDie Photosynthese der grünen Pflanzen findet in den Chloroplasten der Pflanzenzelle statt.Jede Zelle enthält bis zu 400 Chloroplasten, die von ellipsoider Form sind und ein Volumenvon ca. 40 µm 3 haben (Abb. 2.2).Im Inneren des Chloroplasten befindet sich eine 7 nm dicke Doppellipidschicht, die alsEnvelopeGranastapelStromathylakoid4Abbildung 2.2: Schematische Darstellung eines aufgeschnittenen Chloroplasten (Libbert, 1987).Thylakoidmembran bezeichnet wird. Sie kommt in gestapelter und ungestapelter Form vor.Die ungestapelten Schichten werden Stromathylakoide, die gestapelten Granathylakoidegenannt. Die Thylakoidmembran teilt, da sie in sich geschlossen ist, den Innenraum desChloroplasten in zwei Bereiche auf. Der äußere Bereich wird als Stroma, der innere als Lumenbezeichnet.Die Thylakoide enthalten die Komponenten des Photosyntheseapparates, die für die Energieumwandlungzuständig sind (Junge, 1975; Renger et al., 1987):• die lichtsammelnden Proteine,• die Photosysteme I und II,• die Elektronentransportkette (ETC),• das Elektroenzym ATPase.Das Stroma enthält die Komponenten, die für die Substanzumwandlung verantwortlich sind:• Enzyme des Calvin-Zyklus,• Enzyme weiterer Stoffwechselprozesse, wie Mehler-Reaktion und Stickstoffwechsel.

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE5. (a) Der PQ-Pool diffundiert durch die Thylakoidmembran zum Lumen, wo er die beidenProtonen abgibt. Die Erhöhung der Protonenkonzentration im Lumen – es habensich zusätzlich die vier Protonen aus der Wasserspaltung dort angereichert –führt zum Aufbau eines pH-Gradienten über der Thylakoidmembran. Die darausresultierende freie Reaktionsenthalpie ermöglicht über eine inverse Protonenpumpe(ATPase) die Synthese des ATP aus ADP und Phosphat (Mitchell, 1977; Witt,1979).(b) Die Reoxidation von PQ erfolgt über den Cytochrom b 6 /f-Komplex: das vom Cytochromb 6 aufgenommene Elektron gelangt über das Rieske Fe-S-Zentrum zumCytochrom f und von dort in den Plastocyanin-Pool (PC-Pool).6. Das Reaktionszentrum P700 von PS I übernimmt die Elektronen vom Plastocyanin undführt eine weitere Ladungstrennung durch. Über Zwischenschritte (A x ) wird schließlichFerredoxin (Fd) reduziert.7. Das Fd gibt seine Ladung an das Enzym Ferredoxin-NADP-Reduktase weiter. Es bildetdas Ende der ETC und synthetisiert NADPH/H + aus NADP + .Allerdings gibt es für die Elektronen weitere Möglichkeiten, PS I zu verlassen. Diese Verzweigungenhängen stark mit den Untersuchungen dieser Arbeit zusammen und werden in denKapiteln 4 und 8 näher besprochen. Ist z. B. die ATP-Synthese durch CO 2 -Mangel gehemmt,können die Elektronen vom Fd zurück an den Cytochrom b 6 /f-Komplex gelangen. In diesemFall wird von zyklischem Elektronentransport gesprochen (gestrichelte Linie in Abbildung2.3).7

DER PHOTOSYNTHESEAPPARAT8

DIE FLUORESZENZ ALS MESSGRÖSSE IN DER PHOTOSYNTHESEund Björkmann, 1990; Gruszecki et al., 1994; Goss et al., 1995). Das 515 nm-Signal (A515) hatteeine große Bedeutung bei der Übertragung der chemiosmotischen Hypothese (Mitchell,1961, 1977) auf die Photosynthese (Witt, 1979; Junge, 1977; Gräber, 1987), denn es ermöglichtdie Messung der elektrischen Thylakoidspannung über den Starkeffekt. Im Kieler Biophysik-Praktikum wird es benutzt, um die Rückwirkung der Thylakoidspannung auf die primäre Ladungstrennungin PS II (Abb. 2.3) zu bestimmen (Dau et al., 1991). Die Absorption bei 820 nm(A820) gibt Aufschluß über den Redoxzustand des Reaktionszentrums von PS I (Schreiber etal., 1988; Klughammer und Schreiber, 1994).Für die vorliegende Arbeit ist besonders das Fluoreszenzsignal von Interesse. Aus seinem zeitlichenVerlauf können Rückschlüsse auf Prozesse während der Photosynthese gezogen werden.3.1 FluoreszenzentstehungDie Beleuchtung von photosynthetisch aktivem Material (isolierte Chloroplasten, Algen,grüne Blätter und verschiedene Bakterien) führt zur Emission von Fluoreszenzlicht.Wie in Abschnitt 2.3 erwähnt, bestehen die Antennen der Photosysteme hauptsächlich ausSpektren des Chlorophyll a(Vorwiegend π π∗)Ausschnitt aus dem Termschemanach Jablonski3.0E[eV]400λ[nm]500Anregung(1 fs)S4S3Interne Umwandlung(10 fs)2.5600S2Tn2.0700PhotochemiePhotophysik(6 ps)S1T1Vibration (100 fs)Rotation (1 ps)Elektronisch (1 ns)1.5800AbsorptionFluoreszenzPhosphoreszenzFluoreszenz(1 ns)Phosphoreszenz(1 ms)S0Abbildung 3.2: Darstellung des Absorptions- und Emissionsspektrums von Chl a (links). Auf der rechtenSeite der Abbildung sind im Jablonski-Diagramm die entsprechenden Zustände imTermschema aufgetragen (Haken und Wolf, 1987).den Pigmentmolekülen Chl a und Chl b. Das Absorptionsspektrum von Chl a ist links in Ab-10

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEAn dieser Formel lassen sich die verschiedenen Quenchingmechanismen gut erläutern: eineVerringerung der Fluoreszenz F kann bei konstantem k f und konstanter Lichtintensität Idurch• eine Verminderung des Absorptionsquerschnittes a der Photosysteme II,• ein Anwachsen der thermischen Deaktivierung k t ,• eine Erhöhung der photochemischen Aktivität k pauftreten.Die ersten beiden Punkte werden als nichtphotochemisches Quenching (q N ), die Erhöhungvon k p als photochemisches Quenching (q P ), bezeichnet. Die nichtphotochemischenQuenchingprozesse sollen die Pflanze vor zu hohen Lichtintensitäten schützen. Es werdenverschiedene Arten von nichtphotochemischen Quenchingmechanismen unterschieden:• das Energy-Quenching (q E ) wird auch pH-abhängiges Quenching genannt, weil es zusammenmit dem Aufbau des pH-Gradienten über der Thylakoidmembran auftritt. Esmacht sich in einem Anstieg von k t im Zeitraum von 5 bis 20 Sekunden bemerkbar.Die genauen Prozesse, die zu dieser thermische Deaktivierung führen, sind noch nichtvollständig geklärt (Dau und Hansen, 1990; Schreiber und Neubauer, 1990; Schreiber etal., 1991; Ramm und Hansen, 1993).• beim State-transition-Quenching (k T ) werden die beweglichen LHCs zwischen denPhotosystemen II und I umverteilt, um eine bessere photochemische Ausnutzung derAnregungsenergie zu erreichen. Dies äußert sich in einer Verringerung des Absorptionsquerschnittesa und tritt nach 3 bis 10 Minuten auf (Dau und Hansen, 1988; Dau,1989; Dau und Canaani, 1990).• das Photoinhibitions-Quenching (q I ) wird durch sehr hohe Lichtintensitäten ausgelöst.Dabei werden Einheiten von PS II geschädigt und damit die Fluoreszenzausbeute vermindert.Dieser Prozeß läuft mit einer Zeitkonstanten von 30 Minuten relativ langsamab und macht sich ebenfalls in einer Verringerung des Absorptionsquerschnittes a bemerkbar(Powles und Björkmann, 1982; Krause und Laasch, 1987).3.3 FluoreszenzkinetikWird ein dunkeladaptiertes Blatt mit Licht mittlerer Intensität bestrahlt, zeigt das Fluoreszenzsignaleinen charakteristischen Kurvenverlauf, der in Abbildung 3.4 dargestellt ist. Dieseszum ersten Mal von Kautsky und Hirsch (1931) entdeckte Phänomen wird häufig als“Kautsky-Induktionskurve” bezeichnet. Aus dem Kurvenverlauf kann auf einzelne Prozessewährend der Photosynthese geschlossen werden. Eine ausführliche Erläuterung der Zeitbereiche[1] bis [6] erfolgt in Abschnitt 3.3.2.3.3.1 YieldmessungDie Fluoreszenzmessung ist eine sogenannte Yieldmessung. Hierbei wird zwischen zweiLichtarten unterschieden:13

DIE FLUORESZENZ ALS MESSGRÖSSE IN DER PHOTOSYNTHESEτ 1 < 1 sDas Anwachsen der Fluoreszenzausbeute wird hauptsächlich durch die zunehmendeReduktion des Quenchers Q A verursacht.1 < τ 2 < 10 s Das leichte Absinken der Fluoreszenz spiegelt Redoxzustandsänderungen imPQ-Pool wider. In dieser Phase wird Q A verstärkt von PQ reoxidiert. Die damitverbundene Zunahme des Elektronenflusses äußert sich in einer Verringerungder Fluoreszenzausbeute.2 < τ 3 < 20 s Die zunehmende Reduktion der Akzeptoren von PS I bewirkt eine Abnahmeder Reoxidation von PQ. Die starke Verringerung oxidierter Plastoquinonmoleküleführt zu einem Mangel an Akzeptoren von PS II, was einen erneutenAnstieg der Fluoreszenz auf den Maximalwert P mit sich bringt (Vanselow,1993).3 < τ 4 < 30 s Der steile Abfall der Fluoreszenz ist zum einen auf verstärktes Energy-Quenching durch den Aufbau des pH-Gradienten über der Thylakoidmembranzurückzuführen (Hansen et al., 1987, 1993; Dau und Hansen, 1989, 1990).Zusätzlich tritt durch das Anlaufen des Calvin-Zyklus und der damit verbundenenSogwirkung auf die ETC erhöhtes photochemisches Quenching auf.10 < τ 5a < 100 s Diese Zeitkonstante, die mit einer Zunahme der Fluoreszenz auf das NebenmaximumM einhergeht, beschreibt die lichtinduzierte Ca 2+ -Aufnahme indie Chloroplasten (Plieth und Hansen, 1992; Vanselow und Hansen, 1989).50 < τ 5b < 250 s Der genaue Ursprung dieses Prozesses ist zur Zeit noch nicht bekannt. Es wirdein Zusammenhang mit der verstärkten Umwandlung von ATP zu ADP vermutet(Dau, 1994).200 < τ 6 < 1000 s Diese Phase verschwindet nach Zugabe von NaF , das den Austausch der beweglichenLHC zwischen den Photosystemen hemmt. Aus diesem Grund wirdτ 6 dem Lichtverteilungsregler zugeordnet (Dau und Canaani, 1990, 1992).Die Sekundenangaben der Zeitkonstanten sind Orientierungswerte. Sie hängen stark vonder Art der Pflanze, ihrem jeweiligen physiologischen Zustand sowie der eingestrahltenLichtintensität ab.Die klassische Fluoreszenzmessung ist eine Potentialmessung. Es wird, wie in Abbildung 3.3dargestellt, die Höhe des Exzitonensees gemessen und der Fluß aus der Antenne von PS II inden photochemischen Apparat über eine entsprechende Gleichung aus der Fluoreszenz bzw.der dazu proportionalen Höhe des Exzitonensees gewonnen. Damit ist der Fluß eine indirekterschlossene Größe. Diesem Sachverhalt sollte mit der Entwicklung der Fluoreszenz-Clamp-Maschine abgeholfen werden.16

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEder Lichtreaktion der Photosynthese und tritt in Konkurrenz zur Mehler-Reaktion,bei der hochreaktives und deshalb für die Pflanze schädliches Superoxid gebildetwird.Daß die Lichtatmung keine Auswirkungen auf die photoakustischen Messungenhat, wird in Kapitel 11 diskutiert.– Die Mehler-Reaktion. Die Gesamt-O 2 -Bilanz der Mehler-Reaktion ist Null, da siedas an PS II erzeugte O 2 wieder einfängt. Das würde bedeuten, daß für den zurMehler-Reaktion fließenden Elektronenteilstrom keine O 2 -Entwicklung gemessenwerden könnte.21

Kapitel 5Die Fluoreszenz-Clamp-MaschineMit der Entwicklung der FC-Maschine wurde die Möglichkeit geschaffen, die Exzitonenflüsseaus der PS II-Antenne direkt zu messen. Dieses Verfahren ist komplementär zum klassischenVerfahren mit dem PAM-Gerät der Firma Walz.Messungen der Fluoreszenz, die Aufschluß über den photosynthetischen Apparat gebensollen, werden weitverbreitet mit dem Puls-Amplituden-Modulierten Fluorometer (PAM)durchgeführt. Diese von Schreiber et al. (1986) entwickelte Anlage ist zum internationalenStandard geworden. Hierbei ist die detektierte Fluoreszenz bei konstant gehaltenerLichtstärke die gemessene und mit mathematischen Modellen auszuwertende Größe (Abschnitt6.1). Im Gegensatz dazu wird bei der FC-Maschine mit Hilfe eines Regelkreises dieFluoreszenz konstant gehalten und die nachgeregelte Lichtintensität als neue Meßgröße eingeführt.Das Prinzip ist ähnlich dem in der Elektrophysiologie angewandten Voltage-Clamp (Marmont,1949). Dort werden Ionenflüsse anstatt der Zustandsvariablen, der Membranspannung,gemessen. Wie bereits erwähnt, handelt es sich in der Photosynthese bei der Zustandsvariablenum die Fluoreszenz und bei den Flüssen um die Exzitonenflüsse in die Reaktionszentren,in die thermische Deaktivierung oder Strahlung (Fluoreszenz), wie im Topfmodell inAbbildung 3.3 dargestellt ist.5.1 Der MeßaufbauAbbildung 5.1 zeigt das vereinfachte Meßprinzip, das in einer Vorläuferform bereits imRahmen einer anderen Diplomarbeit (Giannikos, 1995) entwickelt wurde.Der Photodetektor setzt die Intensität der Fluoreszenz in eine dazu proportionale Spannungum. Diese wird mit einer Sollwert-Spannung verglichen und entsprechend angepaßt. Elektronischerfolgt der Vergleich durch Addition der invertierten Sollwert-Spannung mit derAusgangsspannung des Photodetektors an OP 2 (Abb. 5.1). Die Differenz dieser beiden Wertekorrigiert die Intensität der auf die Blattoberfläche strahlenden Leuchtdiode (LED):• ist die Fluoreszenz des Blattes gering, fällt also wenig Licht auf die Photodiode des Detektors,so wird sich der Strom durch die LED vergrößern,• ist die Fluoreszenz des Blattes groß und fällt viel Licht auf die Photodiode, wird derStrom durch die LED sinken.23

DIE FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINE

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE0.5 mVi P = = 500 pA. Dieser Mindeststrom ist also im Vergleich zum maximalen Biasstrom1 MΩdes FET 500 mal größer.Der 5.6 pF-Kondensator parallel zum Rückkopplungswiderstand dient zur Schwingungsunterdrückung.5p600 1100 111 M01013590-0100 1100 11-+OPA60201100OUTAbbildung 5.2: Der im Rahmen dieser Arbeit verwendete Photodetektor. Der Strom durch die Photodiode(Hamamatsu S 3590-01) wird über den Rückkopplungswiderstand (R L = 1 MΩ) desOperationsverstärkers (OPA 602) in eine proportionale Spannung umgewandelt.5.1.3 Der LeuchtdiodenkopfFür die Regelung wurde eine einzige LED (Oshino, OL-SUR 14180-T) mit einer Peakwellenlängevon λ max = 660 nm und einer Lichtstärke von 3000 mcd bei 20 mA verwendet.Wie in den Kapiteln 9 und 10 beschrieben, kamen zusätzlich bei einigen Messungen vier inSerie geschaltete LEDs (Oshino, OL-ESB44510) mit einem Emissionsmaximum im blauen(λ max = 450 nm) bzw. drei, ebenfalls in Serie geschaltete LEDs im fernroten (Walz, KL450-735DDH, λ max = 735 nm) Wellenlängenbereich dazu. Damit die Fläche des Blattes, die überder Photodiode liegt, homogen von den verschiedenen LEDs ausgeleuchtet wird, wurden sieauf einen gemeinsamen Punkt ausgerichtet (Abb. 5.3). Zusätzlich wurde auf das Blatt eineBlende gelegt.5.1.4 Das HintergrundlichtWie in Kapitel 6.2 dargestellt wird, werden zur Bestimmung der thermischen Flüsse aus PS IIzusätzlich zum Licht der roten LED Lichtblitze von sehr hoher Intensität (ca. 1000 W/m 2 )benötigt.Dieses sogenannte sättigende aktinische Licht wurde durch eine Halogenlampe (Osram Xenophot250 W) bereitgestellt, deren Intensität über ein elektronisch regelbares Gleichspannungsnetzteilvariiert werden konnte. Da die Halogenlampe durch einen stark vibrierendenVentilator vor Überhitzung geschützt wurde und sich deshalb außerhalb der Meßkammer befindenmußte, gelangte das Sättigungslicht über einen Lichtleiter in die Meßkammer auf dasBlatt.25

DIE FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINEDiodenkopfFilterRG9000000111111000000111111BlendeBlattFilterRG9 RG9000 111000 111000 111000 111DetektorAbbildung 5.3: Anordnung von Leuchtdiodenkopf, Blatt und Photodetektor. Die verschiedenen LEDswurden auf einen Punkt ausgerichtet, um die Blattfläche über der Photodiode homogenauszuleuchten.5.1.5 Die FilterDas Blatt wurde durch das Licht der roten LED (λ = 660 nm) zur Fluoreszenz angeregt, derenMaximum bei λ = 683 nm liegt. Um nun die Transmissions- und Reflektionsanteile desanregenden Lichtes von der Fluoreszenz des Blattes zu trennen, wurde vor dem Detektor ein2 mm dickes Langpaßfilter (RG9 der Firma Schott) mit λ trans > 700 nm angebracht (Abb. 5.3).Damit der störende Einfluß des Hintergrundlichtes auf den Detektor verringert wurde, befandsich am Kopfende des Lichtleiters ein Hochpaßfilter (BG18 der Firma Schott) mit 300 nm< λ trans

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEDie Pflanzen wurden vom Institut für Pflanzenernährung und Bodenkunde der UniversitätKiel im Gewächshaus angezogen und zur Verfügung gestellt.Drei bis vier Wochen nach dem Keimen des Saatgutes in Vermiculite wurden die Keimlingepikiert, d. h. getrennt und in einzelnen kleinen Gefäßen weiter aufgezogen. Nachdem diePflanzen eine ausreichende Größe erlangt hatten, konnten sie in kleine Filmdosen mit Kiesumgetopft werden, wobei ihre Wurzeln aus einer kleinen Öffnung in der Unterseite der Doseragten. Je zwei der so präparierten Pflanzen wurden am Deckel eines größeren, belüftetenNährlösungsgefäßes (Volumen: 5 Liter) befestigt, so daß ihre Wurzeln in die Flüssigkeit hineinragenkonnten.Um die Auswirkungen der unterschiedlichen Formen der Stickstoffernährung (Nitrat- oderAmmoniumernährung, Abschnitt 8.4) untersuchen zu können, wurden zwei verschiedeneNährlösungen verwendet und alle 8 Tage erneuert. Bei der Pflanzenernährung mit Ammoniumkam, um eine Übersäuerung der Nährlösung zu vermeiden, CaCO 3 hinzu. Tabelle 5.1zeigt die genaue Zusammensetzung der beiden Nährlösungen.Nährstoff Substanz Substanz (Endkonzentration) in mM Molargewicht in g/molK/P KH 2 PO 4 0,300 136,09K/S K 2 SO 4 1,000 174,27Mg/S MgSO 4 0,500 246,48Ca/S CaSO 4 2,500 172,17Mn/S MnSO 4 0,001 169,02B H 3 BO 3 0,010 61,83Cu/S CuSO 4 0,001 249,68Zn/S ZnSO 4 0,001 287,54Mo/N (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 0,0001 1235,86Fe Sequestren 0,045 930,46Zusätzlich für eine überwiegende Nitraternährung:Ca/N Ca(NO 3 ) 2 2,500 236,15Zusätzlich für eine Ernährung mit Ammonium:N/S (NH 4 ) 2 SO 4 2,500 132,14Ca/S CaSO 4 2,500 172,17+ Puffer CaCO 3 gegen VersäuerungTabelle 5.1: Zusammensetzung der Nährlösungen für die Aufzucht der Bohnenpflanzen. Für die jeweiligeStickstoffdüngung wurden die extra aufgeführten Substanzen zusätzlich verwendet.27

DIE FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINE5.2 Technische Verwirklichung der FC-Maschine5.2.1 Grundversion nach GiannikosDie Grundversion der FC-Maschine wurde bereits im Rahmen der Diplomarbeit von Giannikos(1995) entwickelt (Abb. 5.4):das Kernstück der Schaltung ist der Regler-OP (OP2 vom Typ OP 37GP), an dem Soll- undIstwert miteinander verglichen werden. Der Istwert repräsentiert die Fluoreszenz des Blattes.Er gelangt als zum Strom der Photodiode proportionale Spannung über eine Verstärkerstufe(OP4 vom Typ OP 37GP) an den Regler-OP. Der Sollwert wird von außen vorgegeben.OP2 ist als Addierer geschaltet und verstärkt die Differenz der beiden Werte. Die an den VorwiderständenR 1 und R 3 anliegenden Spannungen sind das Sollwert-Signal U S und das Signaldes Istwertes U I . Es gilt mit R 1 = R 3 = R:U a = − R RR (U S + U I ), (5.1)wobei R R der Rückkopplungswiderstand des Regler-OPs ist.Wie an Formel 5.1 zu erkennen ist, müssen Soll- und Istwert für den Vergleich verschiedeneVorzeichen aufweisen. Dazu wird der Sollwert an OP1 (37GP) invertiert. Vor OP1 wird er übereinen Funktionsgenerator (FG) als Rechtecksignal mit 200 Hz eingespeist (rechts oben in Abbildung5.4). Die Punkte deuten zwei Zehnfach-Schalter an, mit denen die Amplitude und dasGleichspannungsniveau des Rechtecksignals für die jeweilige Messung eingestellt wurden.Das Ausgangssignal von OP2 variiert über die Leistungsansteuerung solange die Intensitätder LED, bis der Istwert dem Betrag des Sollwertes entspricht.285.2.1.1 Die Hintergrundlicht-RegelungUm die Exzitonenflüsse in die Einzelkomponenten (photochemischer und nichtphotochemischerAnteil, siehe Topfmodell in Abbildung 3.3 und Abschnitt 6.2) aufzuspalten, ist zusätzlichzum Licht der Regel-LED sättigendes aktinisches Licht notwendig (HL in Abbildung 5.1). DiesesLicht ruft eine sehr starke Fluoreszenz hervor, woraus sich folgende Probleme ergeben:• ohne Zusatzmaßnahmen wird der Regelkreis die Regel-LED ganz ausschalten und kannden Fluoreszenz-Istwert trotzdem nicht bis auf den Sollwert absenken, da die Fluoreszenzdes Hintergrundlichtes alles überstrahlt.• selbst wenn es gelingt, das erste Problem zu lösen, kommt ein weiteres hinzu: bei derFC-Maschine wie beim PAM (Abschnitt 6.1) geht es um eine Yieldmessung, d. h. derRegler soll nur auf die modulierte Fluoreszenz ansprechen und die vom aktinischenLicht erzeugte Fluoreszenz völlig ignorieren. Der Grund für diese Forderung ist in Abschnitt3.3.1 beschrieben: das aktinische Licht bewirkt eine Veränderung der Ratenkonstantender thermischen Deaktivierung und des photochemischen Quenchings undverursacht so eine Modulation der Yieldantwort. Nur diese soll gemessen werden. Deshalbist die Forderung an den Regelkreis sehr stark: er soll den Yield auf einen konstantenWert nachregeln und darf dabei nicht von der durch das aktinische Licht verursachtenFluoreszenz gestört werden.• da das aktinische Licht mit 1000 W/m 2 etwa 100fach stärker als das Licht der Regel-LED(ca. 10 W/m 2 ) ist, könnte es außerdem zu Übersteuerungen der Detektorstufe kommen.

DIE FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINEAus diesen Gründen ist es notwendig, daß der Regelkreis das konstante Hintergrundlichtsignalignoriert und nur auf das modulierte Regellicht (Rechtecksignal von 200 Hz) reagiert.Das Problem wurde von Giannikos (1995) gelöst, indem der Wert der Fluoreszenz durch dasaktinische Licht von der Summe aus den Fluoreszenzen von aktinischem Licht und Meßlichtabgezogen wird. Dies wird möglich, wenn das Meßlicht (mit 200 Hz) rechteckförmig getaktetwird. In der Meßlicht-Dunkelphase liegt nur die aktinische Fluoreszenz an, in der Hellphasedie Summe beider.Technisch realisiert wird diese Subtraktion, indem der Wert der Fluoreszenz während derMeßlicht-Dunkelphase nach der Verstärkerstufe (OP4) abgegriffen und in den Eingangdes Sample&Hold-Bauteils (S&H, NE 5537) eingespeist wird. Dieses speichert ihn bis zurHellphase und gibt ihn in der Hellphase an den nachgeschalteten Invertierer (OP3 vom TypOP 37GP) weiter, so daß er dort dann für die Subtraktion in der Meßlichtphase zu Verfügungsteht.Abbildung 5.5 zeigt links die drei Spannungsniveaus, die an OP2 miteinander verglichen werden:das negative Sollwertsignal, das negative Hintergrundlicht-Niveau und das positive Istwertsignal,das sich aus dem konstanten Hintergrundlicht-Niveau und dem modulierten Anteilzusammensetzt.Hier läßt sich auch der Nachteil dieser Hintergrundlicht-Regelung erkennen: Fehler des S&H-Bausteins und der Subtraktionsstufe wirken sich sich auf das eigentliche Signal sehr stark aus.Hinzu kommt, daß die Verstärkung der Detektorstufe für das Yieldsignal sehr klein sein muß.Sie ist dadurch begrenzt, daß die 100-fach stärkere Hintergrundlicht-Fluoreszenz nicht zuÜbersteuerungen führt.305.2.2 Die neue Version des RegelkreisesBei der in dieser Arbeit entwickelten Hintergrundlicht-Regelung wird das vom konstantenLicht erzeugte Signal durch einen zweiten Regelkreis bereits vor dem Photodetektor auf Nullabgeglichen. Der Detektor verstärkt ausschließlich das Yieldsignal mit der am besten geeignetenVerstärkung. So gelangt neben dem negativen Sollwert nur der modulierte Anteil desIstwertsignals in den Fluoreszenz-Regelkreis. Einen Vergleich der Spannungen an OP2 zeigtAbbildung 5.5. Links sind die Spannungsniveaus der Version von Giannikos abgebildet, rechtsdie Niveaus der in dieser Arbeit entwickelten Version.Abbildung 5.6 zeigt den neuen Regelkreis. Neben der neuen Hintergrundlicht-Regelung gibtes weitere Veränderungen:• ein wesentlicher Nachteil, der die Geschwindigkeit des bisherigen Regelkreises stark begrenzthat, kann aus dem Schaltbild in Abbildung 5.4 nur mir Mühe abgelesen werden.Es hängt mit dem Verhalten der Lichtintensität in der Umgebung von Null zusammen.Wäre die absolute Genauigkeit des Soll-Istwert-Vergleiches unendlich hoch, gäbe es keineProbleme. Es kann aber ein leichter Offset bestehen. Ein Offset könnte bedeuten, daßbeim Sollwert Null der Istwert ungleich Null ist, die LED also noch leicht leuchtet. Umsicher zu gehen, daß die LED wirklich dunkel ist, wird in der in Abbildung 5.4 gezeigtenVersion des Regelkreises die LED statt durch die Spannung 0 V durch einen positivenSollwert abgeschaltet. Dieser Wert ist aus Sicherheitsgründen positiver, als zur Kompensationdes Offsets notwendig. Um diesen Istwert zu erreichen, müßte die LED negativesLicht ausstrahlen. Da dies nicht möglich ist, entsteht eine sehr große Regelabweichung,die den Regler-OP in die Begrenzung fährt. Gesättigte OPs sind nur langsam zu reaktivieren.Beim Wiedereinschalten des negativen Sollwertes behindert die langsame Ant-

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFESOLLWERTSIGNALSOLLWERTSIGNAL10 V 0 V10 V2HINTERGRUND-LICHT -SIGNAL2Das Hintergrundlichtsignalwirdbereits am Eingang desPhotodetektors auf NullgeregeltHalte-Phase des S+HISTWERTSIGNAL3aDETEKTOR-AUSGANGSSIGNAL0 V3HINTERGRUND-LICHT -SIGNAL3bAUSGANGSSIGNAL von S&H 1Halte-Phasevon S+H 10 V02.5 5 7.5 10Zeit in ms0 V0 2.5 5 7.5 10Zeit in msAbbildung 5.5: Gegenüberstellung der an OP2 miteinander verglichenen Spannungsniveaus. Der linkeTeil zeigt die Version von Giannikos (1995), der rechte die in dieser Arbeit entwickelteVersion. Auf der rechten Seite ist in Abbildung (3a) zusätzlich das modulierte Ausgangssignalsdes Photodetektors dargestellt.31

DIE FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINE10 k1SOLLWERTCOMPUTER1M80 k220 p°a/c 90101-OP237GP +01 0110 k3bOUTLOGICINS&H 13aISTWERT330NEUEHINTERGRUND-LICHT-REGELUNG00 1100 11LEISTUNGS-ANSTEUERUNG00 11PHOTODETEKTORAbbildung 5.6: Neuentwickelte Version des Regelkreises. Die größte Veränderung ist die neueHintergrundlicht-Regelung. Hierbei wird das Hintergrundlicht bereits vor dem Photodetektorauf Null geregelt. Im Vergleich zur vorherigen Version wurden dieVerstärkerstufe (OP4) und der Invertierer des Sollwertes (OP1) entfernt, da dieser Wertnun aus dem Computer als negative Gleichspannung vorgegeben wird. Außerdem wurdeein anderer Photodetektor verwendet. S&H 1 wird von der neu entwickelten Takt-Platine über Pin a/c9 angesteuert.wort des gesättigten OPs die schnelle Reaktion und verzögert damit die Regelstrecke.Um diesen Zustand zu vermeiden, wurde das Umschalten zwischen Hell-und Dunkelphasevom Eingang des OP2 zur LED-Endstufe verlagert (Abb. 5.10). Dies bedeutet, daßder Sollwert als Gleichspannung vorgegeben wurde. Da der Istwert in der Dunkelphaseauf Null schalten würde, wurde am Eingang des Regler-OPs ein S&H-Glied (S&H 1) eingefügt,mit dessen Hilfe der Istwert aus der Hellphase in der Dunkelphase gespeichertwird (Punkt (3b) in Abbildung 5.5). Der Takt, der für die Steuerung von S&H 1 notwendigist, wird von der dazu entwickelten Taktplatine über Pin a/c9 eingespeist.• durch die Verwendung eines Detektors mit größerer Verstärkung (Abschnitt 5.2.4) konnteauf die Nachverstärkerstufe OP4 verzichtet werden.• der Sollwert wurde als negativer Gleichspannungswert aus dem Computer eingespeist.Dies ermöglichte eine bessere zeitliche Korrelation von Regelung und Hintergrundlicht,da nun beide vom Computer aus angesteuert wurden. Gute zeitliche Synchronisation32

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEwar bei den Parallelmessungen von PAS- und FC-Maschine (Abschnitt 11.2) ebenso notwendig,wie bei der Bestimmung der thermischen Deaktivierung (Abschnitt 7.3).• der Sollwert lag nun als negativer Spannungswert vor, was den Invertierer (OP1)überflüssig machte.5.2.2.1 Die neue Hintergrundlicht-RegelungBei der neuen Hintergrundlicht-Regelung, die in Abbildung 5.7 dargestellt ist, wird währendder Dunkelphase der durch das Hintergrundlicht verursachte Photodiodenstrom kompensiert.Dazu wurde eine gesteuerte Konstantstromquelle, bestehend aus T1 (BC558B) undR E = 10 kΩ, eingesetzt.Die Arbeitsweise des Hintergrundlicht-Regelkreises erklärt sich wie folgt: das auf die Pho-+ 15V + 15V2n210 kT1BC558B0101R k1 kR a5 kLOGICOUT INS&H 30100 1110 MRR-OP5+CA314000 1100 1100 111 k10 kR40101oa105p601011 M00 1100 110101 01-+OPA60200 1100 11100S&H 2IN OUTLOGICPHOTODETEKTORAbbildung 5.7: Die neue Hintergrundlicht-Regelung. Hier übernimmt OP5 die Funktion des Regler-OPs. Er vergleicht in der Dunkelphase den zum Hintergrundlicht proportionalen Spannungswertmit Null. T1 öffnet soweit, bis der durch das Hintergrundlicht verursachtePhotodiodenstrom kompensiert ist. S&H 3 hält diesen Wert in der Hellphase, S&H 2verhindert, daß OP5 in der Yield-Hellphase in die negative Sättigung gerät. Die beidenS&H-Bausteine werden über Pin a10 von der Takt-Platine aus angesteuert.todiode treffende Hintergrundlicht verursacht einen Strom I P durch die Photodiode. AmAusgang des Photodetektors liegt eine dazu proportionale Spannung an. Da S&H 2 in der33

DIE FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINEDunkelphase auf Durchgang geschaltet ist, vergleicht OP5 diese Spannung mit 0 V und gibtam Ausgang eine entsprechende negative Spannung aus. Da S&H 3 ebenfalls auf Durchganggeschaltet ist, öffnet T1 soweit, bis ein Strom der Stärke I P zum Detektoreingang fließt undeinen Summenstrom von 0 A am Eingang von OPA 602 erzeugt. In der Hellphase wird dieserWert von S&H 3 gehalten.Für das Funktionieren der Hintergrundlicht-Regelung ist nur S&H 3 notwendig. S&H 2verhindert wie S&H 1 im Fluoreszenz-Regelkreis, daß der Regler-OP in die negative Sättigunggerät.Abbildung 5.8 zeigt die genaue zeitliche Ansteuerung für die Regel-LED und die beiden S&H-Bauteile der Hintergrundlicht-Regelung. Durch das An- und Ausschalten der Regel-LEDV00000111115die000000000000000000000000011111Takt für1111111111 die1111111111Regel-LED00000111110HELLPHASEDUNKELPHASEV000000111111Takt für 5000000111111Takt für die000000111111die000000111111Hintergrundlicht-000000111111Hintergrund-000000111111Regelung licht-000000111111Regelung002.55Zeit in msAbbildung 5.8: Zeitlicher Verlauf von Fluoreszenz- und Hintergrundlicht-Regelung.werden die 5 ms in eine Hell- und eine Dunkelphase unterteilt. Die Hintergrundlicht-Regelung beginnt erst, nachdem die Regel-LED ausgeschaltet ist. Dies soll verhindern, daßder Regler-OP in der Übergangsphase von “hell” auf “dunkel” anfangs auf den falschen Wertregelt.Damit beim Einschalten der Regel-LED keine Racing-Effekte entstehen, wird dieHintergrundlicht-Regelung einen Zeittakt vor Beginn der Hellphase beendet.Dieser zeitliche Verlauf der Hintergrundlicht-Regelung während der Dunkelphase mußte beider Messung mit zusätzlichem fernroten Licht allerdings geändert werden (Abschnitt 9.1).5.2.2.2 Die Takt-PlatineDie unterschiedliche Ansteuerung für die Regel-LED und die Hintergrundlicht-Regelungmachte die Entwicklung einer Takt-Platine notwendig (Abb. 5.9):als zentraler Taktgeber dient ein 1 MHz-Quarz. Seine Frequenz wird durch einen Binärzähler(IC1 4020) in verschiedene Frequenzen geteilt. Da die LED im Bereich von 200 Hz angesteuertwerden soll, wird über einen Jumper (JP1) die Frequenz von 1953 Hz ausgewählt und ineinen Dezimalzähler (IC2 4017) eingespeist. Die Einteilung der 200 Hz-Periode in 10 Takteermöglicht die Erstellung des verkürzten Öffnungssignals für die S&H-Bausteine in der Dunkelphase.Dem Dezimalzähler sind zwei Flipflops (IC3 4027) angeschlossen. Das untere Flipflop von34

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE+5 V14Quarz87 11 MhzDGND10IC14020P1 Q1Q4Q5Q6Q7Q8Q9Q10Q11Q12Q1311 3 21RES Q1413 64573121514JP1Clock13572468Jumperblock 1JP 1-2 3906 HzJP 3-4 1953 HzJP 5-6 977 HzJP 7-8 488 HzExt. ClockDGNDSwitchClock OutDGND141315DGNDIC2CLKENARES4017Q0Q1Q2Q3Q4Q5Q6Q7Q8Q9C010 742311 965112IC3 40277S6J3CLK5K4R9S10J13CLK11K12RQ1Q\2Q15Q\14ncncHGLa10Regel-LEDac9DGNDBackplaneAbbildung 5.9: Takt-Platine.IC3 stellt den Takt für die Regel-LED bereit, indem es den Transistor T3 aus Abbildung 5.10ansteuert, der die LED an- und ausschaltet. Das Flipflop wird von Ausgang Q5 des Dezimalzählersgesetzt (set) und von Ausgang Q0 zurückgesetzt (reset), so daß die Regel-LED zwischenden Takten 5 und 0 leuchtet.Das zweite Flipflop von IC3 taktet die S&H-Bauteile (S&H 2, S&H 3 in Abb. 5.7) derHintergrundlicht-Regelung. Es wird von Ausgang Q1 des Dezimalzählers gesetzt undvon Ausgang Q4 nach drei Takten zurückgesetzt. Während dieser drei Takte läuft dieHintergrundlicht-Regelung.5.2.2.3 Die LeistungsansteuerungDer Regelkreis wurde entwickelt, um von der veränderlichen Lichtintensität der LED auf dieExzitonenflüsse aus PS II schließen zu können. Das zur Lichtintensität proportionale Ausgangssignalwird an der Leistungsansteuerung abgegriffen, welche im wesentlichen von Giannikos(1995) übernommen wurde und in Abbildung 5.10 dargestellt ist.Zur Ansteuerung der LED von OP7 aus dient ein Darlington Transistor BC517 (T2). Die Transimpedanz(Spannung von OP7/LED-Strom) bestimmt der umschaltbare Emitterwiderstand.Die Drift der Basis-Emitterspannung von T2 wird durch die Zurückführung des Spannungsabfallsüber dem Emitterwiderstand auf den negativen Eingang von OP7 eliminiert. Außerdemist mit dem Teilverhältnis der Rückführung auch die Transimpedanz (Spannung vonOP2/LED-Strom) einstellbar.Das Ausgangssignal von OP2 steuert über OP7 den Transistor T2 (BC517) an, dieser wiederumüber seinen Kollektorstrom die LED. Kollektor- und Emitterstrom des in Durchlaß betriebenenTransistors können als gleich groß angenommen werden (I B sehr klein). Folglich ist dieüber dem Widerstand R E am Emitter abfallende Spannung U E proportional zur Lichtintensitätder LED.35

DIE FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINEAUSGANGS-SIGNALVON OP2ÜBER PIN a4+ 15V10ZD2V75k0101 012 k+OP7-37GP2 k10 k00 11100 p15T2BC517ZUMCOMPUTER100100010100 1100 1110 k010100 1100 1100 11000 111000 111000 111000 111oooS&H 4IN OUTLOGIC33000 1100 11+OP6-CA314010 k010101015 k100T3FET 9250100 2700 1100 1110000 1100 11oa/c 910 k00 11Abbildung 5.10: Die Leistungsansteuerung. Die Ausgangsspannung von OP2 steuert über den TransistorT2 die Lichtintensität der LED. Das zur Lichtintensität proportionale Ausgangssignalwird über den nichtinvertierenden Verstärker OP6 an den Computer gegeben. OP7dient als weiterer Regler-OP zur Regelung des Diodenstroms. Der Transistor T3 erhältseinen Takt über Pin a/c9 von der Takt-Platine.12 pDiese Spannung wird über einen nichtinvertierenden Verstärker (OP6, CA 3140) als Ausgangssignalauf einen Computer gegeben.Im Vergleich zur Version von Giannikos (1995) wurden folgende Veränderungen vorgenommen:• vor OP6 sitzt ein weiteres S&H (S&H 4, NE 5537). Es dient wie S&H 1 vor OP2 dazu,während der Dunkelphase einen definierten Wert zu halten. Dies war besonders beiden Parallelmessungen von FC- und PAS-Maschine von Bedeutung, da hier die Dunkelphasemit 66 ms 51 mal länger als die Hellphase dauerte.• über den Transistor T3 (FET 9250) wurde die LED mit dem im vorherigen Abschnittbeschriebenen Takt an- und ausgeschaltet. Das war notwendig, weil der Sollwert alsGleichspannung in den Regelkreis eingespeist wurde.36

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE5.2.3 Eigenschaften der neuen Hintergrundlicht-Regelung5.2.3.1 Das ZeitverhaltenWie oben beschrieben, dauert die Phase der Hintergrundlicht-Regelung drei Zeittakte. Dasentspricht einer Zeit von 1.5 ms. Bei den FR-Messungen (Kap. 9) verkürzte sich die Phase aufzwei Zeittakte. Dies bedeutet, daß der Hintergrundlicht-Regelkreis in der Lage sein muß, in1 ms den durch das Hintergrundlicht verursachten Strom zu kompensieren.Um dies zu überprüfen, wurde das Ausgangsignal des Photodetektors auf einem Speicheroszilloskopsichtbar gemacht. Dort war zu erkennen, daß nach 0.4 ms der Strom kompensiertwar, d. h. die Ausgangsspannung des Photodetektors weniger als 1 mV betrug.5.2.3.2 Berechnung der relativen RegelabweichungAbbildung 5.11 zeigt das allgemeine Blockschaltbild eines einfachen Regelkreises mit folgendenGrößen:StörgrößeZ+Y+ZStreckeA SRegelgrößeXYReglerA RStellgrößeW-X-Regelabweichung++ WFührungsgrößeAbbildung 5.11: Schematische Darstellung der Regelgrößen (Tietze und Schenk, 1993).der Regler verstärkt die Differenz des Sollwertes W und des Istwertes X um A R und gibt dieStellgröße Y aus (Tietze und Schenk, 1993):Y = A R (W − X)Die Strecke mit der Streckenverstärkung A S erzeugt aus dem Sollwert Y den Istwert X, wobeiam Eingang noch ein Störsignal Z aufaddiert wird:X = A S (Y + Z)Das Produkt aus Streckenverstärkung A S und Reglerverstärkung A R wird als Ringverstärkungg bezeichnet.Die relative Regelabweichung W − XWim eingeschwungenen Zustand ergibt sich zu:W − XW = 11 + gDie Ringverstärkung der Hintergrundlicht-Regelung setzt sich zusammen aus:• der Verstärkung des Regler-OPs:V OP5 =10 MΩ10 kΩ = 1000, 37

DIE FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINE• dem Spannungsverhältnis, das durch die nachfolgenden Widerstände R k und R a bestimmtwird:V Rk R a= 1 5• und der Verstärkung des Photodetektors V Det . Diese berechnet sich wie folgt:der durch das Hintergrundlicht verursachte Strom istder Kompensationsstrom istGleichsetzen ergibt:I P = U Det1 MΩ ,I K =V Det = U DetU BU B10 kΩ= 1 MΩ10 kΩ = 100.Die Ringverstärkung der Hintergrundlicht-Regelung ist also 20000. Daraus ergibt sich einerelative Regelabweichung von:W − XW= 0.05 · 10−3Wird davon ausgegangen, daß das Yieldsignal mit ca. 10 W/m 2 im Steady-State der Induktionskurve1/100 des Hintergrundlichtsignals beträgt, so ergibt sich für das Yieldsignal einFehler von 0.5 %.Daß dies für die Messungen ausreichend ist, zeigt Abbildung 5.12. Hier wurde die2600 3000000 111000 111in willkürlichen EinheitenΦ2500000 111000 111000 1112400 2000000 111000 111000 111000 1112300 1500000 111000 111000 1110000 11110000 11110000 11110000 11112200 100001010101010101010101HLan0101010101010101010101HLaus2100 500000 111000 1112000000 11100 11 5 0000 111100010 5 111 10 15 15 20000 111000 11100 110000 1111Zeit in s000 11100 1100 11Abbildung 5.12: Test der Hintergrundlicht-Regelung. Die Abbildung zeigt das Ausgangssignal der Leistungsstufe.Nach 5 s wurde Hintergrundlicht (HL) von 1000 W/m 2 zugeschaltet, dasnach weiteren 5 s wieder ausgeschaltet wurde.38

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEHintergrundlicht-Regelung an fluoreszierendem Computerpapier getestet. Dieses stellt einstreng lineares System dar:• die abgestrahlte Fluoreszenz zeigt keine Kinetik,• die Antworten auf das modulierte Licht und das Hintergrundlicht überlagern sich additiv.Es tritt keine Kreuzmodulation auf.Abbildung 5.12 zeigt das Ausgangssignal der Leistungsansteuerung. Nach 5 s wurde Hintergrundlichtvon 1000 W/m 2 zugeschaltet, nach weiteren 5 s wurde es wieder ausgeschaltet. Eszeigte sich keine Störung der Yieldantwort.5.2.4 Untersuchung der Frequenzgänge des Fluoreszenz-RegelkreisesUm die Stabilität des Regelkreises zu untersuchen, wird nun das Verfahren der Frequenzganganalysevon Bode (1964) durchgeführt. Dazu werden die Amplitudengänge im Bode-Diagramm dargestellt. Die einzelnen Übertragungsfunktionen H i , i = 1, 2,..., n, die mit derGesamtverstärkung über die BeziehungV = H 1 · H 2 · . . . · H nzusammenhängen, können in dieser Darstellung additiv betrachtet werden:logV = log |H 1 | + log |H 2 | + . . . + log |H n |Das Stabilitätskriterium besagt, daß die Phasendrehung unter 180 ◦ bleiben muß, solange dieRingverstärkung g = A R A R > 1 ist. Aus Sicherheitsgründen ist es aber wünschenswert, diePhasendrehung auf 90 ◦ zu beschränken, so daß eine Phasenreserve von 90 ◦ erhalten bleibt.Auch die Phasendrehung φ läßt sich, zumindest in Phasenminimalsystemen, im Bodediagrammablesen. Nach dem Satz von Bode (1964) gilt:wenn |H| mit ω −n fällt, folgt: φ = 90 ◦ · n.Abbildung 5.13 zeigt die Übertragungsfunktionen des Regler-OPs (OP2) und der Leistungsansteuerungmit Detektor. Zur Bestimmung der Übertragungsfunktion des Regler-OPs (OP2)wurde hinter S&H 1 (Abb. 5.6) ein Sinus-Signal eingespeist, dessen Ausgangssignal nach dem330 Ω-Widerstand abgegriffen wurde. Zur Messung der Übertragungsfunktion der Leistungsansteuerungund des Detektors wurde an dieser gleichen Stelle das Sinus-Signal eingespeist.Das Ausgangssignal wurde am Detektorausgang abgegriffen.Die Frequenzgänge der Einzelglieder müssen so abgeglichen werden, daß die Ringverstärkungeine 1/f-Flanke erhält. OP2 hat eine Transitfrequenz von 63 MHz. Die Asymptotendes Frequenzganges der Leistungsansteuerung mit Detektor schneiden sich bei 20 kHzbei einer Verstärkung von 10. Da die Verstärkung von OP2 ebenfalls 10 beträgt, ist die Gesamtverstärkungbei 20 kHz 100. Die Transitfrequenz beider muß also bei 2 MHz liegen. Dasbedeutet, daß OP2 bis dort die Verstärkung 10 halten muß. Dies ist bei einer Transitfrequenzvon 63 Mhz erfüllt. Der Faktor 100 als Ringverstärkung bei 20 kHz kann im Niederfrequentennoch vergrößert werden, indem die 1/f-Flanke der LED-Ansteuerung plus Regler zu kleinenFrequenzen hin verlängert wird. Dies wird dadurch erreicht, daß die Gegenkopplung des OPsfür Frequenzen unter 20 kHz abgeschwächt wird. Das Netzwerk aus dem 80 kΩ-Widerstandund dem 220 pF-Kondensator erzeugt eine Nullstelle bei 20 kHz und eine Polstelle bei 300 Hz(mit dem 1 MΩ-Widerstand). Dies ergibt den Frequenzgang von OP2 in Abb. 5.13.Im Unterschied zur Version von Giannikos (1995) ist die Verstärkung des TeilsystemsLeistungsansteuerung–Detektor höher, da ein Detektor mit größerer Verstärkung verwendet39

DIE FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINE100OP210V1Leistungansteuerungund Detektor0.11 10 100 1000 10000 100000 1e+06 1e+07f in HzAbbildung 5.13: Frequenzgänge des Regler-OPs (OP2) und der Leistungsansteuerung mit Detektor.wurde. Die höhere Detektorverstärkung wurde durch die neue Hintergrundlicht-Regelungmöglich, da eine Übersteuerung durch das sättigende Hintergrundlicht nicht mehr zubefürchten war. Dies machte, wie schon in Abschnitt 5.2.2 erwähnt, die Verwendung derNachverstärkerstufe (OP4 in Abbildung 5.4) überflüssig. Hierdurch wurden unnötige Phasendrehungenvermieden. Abbildung 5.14 zeigt den Frequenzgang des gesamten Regelkreises.Es fällt ein leichter “Knick” bei der 1/f-Flanke auf. Dieser kommt dadurch zustande, daß dieNullstelle von OP2 aus Sicherheitsgründen etwas niederfrequenter als die zu kompensierendePolstelle des Systems Leistungsansteuerung-Detektor gelegt wurde.40

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE1000100V1011 10 100 1000 10000 100000 1e+06f in HzAbbildung 5.14: Frequenzgang des gesamten Regelkreises.41

DIE FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINE42

Kapitel 6Vergleich der Standardmeßverfahrenvon PAM und FC-MaschineIn der Fluoreszenzmeßtechnik ist es üblich, zwei ausgezeichnete Zustände des photosynthetischenApparates zu bestimmen: es werden die Werte der Fluoreszenz bei vollständig oxidiertembzw. vollständig reduziertem Quencher Q A ermittelt. Diese Werte werden mit F 0 (minimaleFluoreszenz) bzw. F M (maximale Fluoreszenz) bezeichnet, wenn die Messung nachlängerer Dunkeladaption erfolgt. Die entsprechenden Größen im helladaptierten Zustandwerden F’ 0 bzw. F’ M genannt. Durch die Bestimmung dieser Werte ist es möglich, das photochemischeund nichtphotochemische Quenching zu berechnen. Im folgenden wird nur dasEnergy-Quenching als Ursache für das nichtphotochemische Quenching berücksichtigt.Als standardisierte Meßmethode dieser Größen gilt die sogenannte Sättigungsblitzmethodenach Schreiber et al. (1986), die mit dem von Schreiber entwickelten und durch dieFirma Walz kommerziell vertriebenen Puls-Amplituden-Modulierten Fluorometer (PAM)durchgeführt wird. Da die Messungen der FC-Maschine und die des PAM einander gegenübergestelltwerden, wird nun näher auf das Meßprinzip des PAM eingegangen.6.1 Messungen mit dem PAMBeim PAM wird durch ein festgelegtes Lichtprotokoll (Abb. 6.1) die variable Fluoreszenz bestimmt.Hierbei wird zwischen Meßlicht (ML) und aktinischem Licht (AL) unterschieden: wiein Abschnitt 3.3.1 bereits beschrieben, verändert das aktinische Licht den Zustand des photosynthetischenApparates, während das Meßlicht den vom aktinischen Licht eingestelltenZustand messen soll.1. Zur Messung der Grundfluoreszenz F 0 muß das Blatt vorher dunkeladaptiert wordensein, das Meßlicht (ML) darf keine zu große Intensität besitzen. Eventuell zugeschaltetesfernrotes Licht kann die Reoxidation von Q − Adurch die Saugwirkung von PS I verstärken.In diesem Fall sind dann alle Reaktionszentren von PS II geöffnet , d.h. Q A ist vollständigoxidiert, was Q A = 1 in Gleichung 3.2 entspricht. Aus diesem Grund kann eine maximaleAnzahl an Elektronen in die ETC fließen und die Fluoreszenz ist minimal. Deshalb trittmaximales photochemisches Quenching auf (q P = 1; q N = 0). Hierbei ist q N die thermischeDeaktivierung, die über dem immer vorhandenen minimalen k t liegt.2. Durch einen sättigenden Blitz von 0,5 s – 2 s Dauer und einer Intensität von ca.1000 W/m 2 wird Q A vollständig reduziert. Das entspricht Q A = 0 in Gleichung 3.2 und43

VERGLEICH DER STANDARDMESSVERFAHREN VON PAM UND FC-MASCHINEFM5F ’M4F in willkürlichen Einheiten32F 0SF0 ’1ZeitMLanSPALSP SP ALan ausqqPN==1 q q < q q = 1P= 0 0

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEtochemisches Quenching verringert ist (q P = 0; 0< q N < 1 ).5. Nach Ausschalten des aktinischen Lichtes wird die Grundfluoreszenz F’ 0 im helladaptiertenZustand erreicht. F’ 0 kann wegen des nichtphotochemischen Quenchings tieferals F 0 liegen (q P = 1; 0< q N < 1).Aus den gemessenen Größen F , F 0 , F’ 0 , F M und F’ M lassen sich das photochemische undnichtphotochemische Quenching zubzw.q P = F′ M − FF ′ M − F′ 0q N = 1 − F′ M − F′ 0F M − F 0berechnen (Schreiber et al., 1986; van Kooten und Snel, 1990).Um zu prüfen, in welchem physiologischen Zustand sich das jeweilige Blatt befindet, wirddas F M -F 0 -Verhältnis gebildet. Ein gesundes Blatt erreicht F M /F 0 -Werte von 4 – 5. Ist es ineinem schlechteren physiologischen Zustand, so erhält man niedrigere Werte (2 – 4).6.2 Messungen mit der FC-MaschineMit der FC-Maschine können die zu F M bzw. F 0 äquivalenten Exzitonenflüsse Φ M bzw. Φ 0bestimmt werden. Allerdings ist der Zusammenhang zwischen ihnen invers:• bei maximaler Fluoreszenz F M tritt ein minimaler Exzitonenfluß Φ M auf,• eine minimale Fluoreszenz F 0 hat einen maximalen Exzitonenfluß Φ 0 zur Folge.Für den Exzitonenfluß Φ wurden die gleichen Indices, M und 0, wie für die Fluoreszenz Fgewählt. In beiden Fällen repräsentieren sie den Redoxzustand des Quenchers Q A . So ist Q Abei Φ M maximal, bei Φ 0 minimal reduziert.Bei den Messungen mit der FC-Maschine werden die Änderungen der Ratenkonstanten k pund k t betrachtet. Das nichtphotochemische Quenching q N wirkt über die Ratenkonstantek t , das photochemische Quenching q P über die Ratenkonstante k p .Ähnlich zur Sättigungsblitzmethode mit dem PAM wurde zur Bestimmung des Φ 0 -Φ M -Verhältnisses und der Deaktivierung der Exzitonen durch thermische Effekte die in Abbildung6.2 dargestellte Messung durchgeführt:1. Mit einem sättigenden Lichtpuls (Dauer: 2 s, Intensität: 1000 W/m 2 ) zusätzlich zumLicht der roten LED (LED+SP), das die Fluoreszenz regelt, wird bei einem vorher dunkeladaptiertenBlatt eine vollständige Reduzierung des Akzeptors Q A erreicht. Der damiterhaltene Wert Φ M (1. Puls in Abb. 6.2) ist proportional zum Inversen der maximalenFluoreszenz F M . Der Meßlichtimpuls aus der LED ist klein, da die gesamte zusätzlicheEnergie nur zwischen der Fluoreszenz und der thermischen Deaktivierung aufgeteiltwird (k p = 0, k t = minimal).45

VERGLEICH DER STANDARDMESSVERFAHREN VON PAM UND FC-MASCHINEΦ in willkürlichen Einheiten432100000000000000000000001111111111111111111110000 1111 000000000000000000000111111111111111111111010000 1111 111111111111111110000000000000000001Φ 0000 1111 11111111111111111000000000000000000 60010000 1111010000 1111010000 1111010000 1111010000 1111010000 1111 50010000 1111010000 1111010000 1111010000 1111010000 1111 40010000 1111010000 1111010000 1111010000 1111010000 111130010000 1111010000 1111010000 11110100000000 111101Φ 111101M 1111 20010000 1111010000 1111010000 1111010000 1111010000 1111 10010000 1111010000 1111010000 1111010000 1111 000000000000000000000111111111111111111111011100001111 0000000000000000000000000 1111 00000000000000000000000000 1111 0000000000000000000001111111111111111111111111111111111111111110100 110100 1100 110 20 40 60 80 100 120111111111111111111111000000000000000000000000 111111111111111111111111000000000000000000000000 111 0000000011111111000000001111111110 min 120 sΦ’MZeitLED+SPDALEDanLEDausLED+SPk p = 0k p = maxk p = 0k t = mink t = mink t > minAbbildung 6.2: Schematische Darstellung einer FC-Messung. Bei einem dunkeladaptierten Blatt wirdzuerst durch einen sättigenden Lichtblitz zusätzlich zum Regellicht (LED+SP) der WertΦ M bestimmt. Nach einer Dunkeladaptionszeit (DA) von 10 Minuten löst das Einschaltender Regel-LED (LED an) die Induktionskurve aus. An einer Parallelen zur x-Achsegespiegelt erinnert der Verlauf an die Kautsky-Kurve. Der maximale Fluß Φ 0 wird unmittelbarnach dem Einschalten der LED erreicht. Nach der Aufnahme der Induktionskurvewird noch einmal ein sättigender Lichtblitz auf das Blatt gegeben (LED+SP) unddamit der Wert Φ ′ M bestimmt. Die Differenz der Einzelimpulse Φ M und Φ ′ M während derSättigungsblitze (LED+SP) spiegelt den Fluß in die thermische Deaktivierung wider.2. Nach einer Dunkeladaption (DA) von 10 Minuten, die eine Reoxidation von Q − A bewirkt,wird das LED-Licht eingeschaltet. Dessen aktinische Wirkung erzeugt eine Kurve, derenVerlauf an eine spiegelbildliche Kautsky-Kurve erinnert:am Anfang der Kurve in Abbildung 6.2 ist die Intensität der LED maximal (Φ 0 ). Damitdas vom Regler vorgeschriebene Fluoreszenzniveau erreicht wird, muß genug Licht fürden vollen Fluß in die Reaktionszentren und die thermische Deaktivierung aufgebrachtwerden (k p = maximal, k t = minimal ).Dann sinkt die erforderliche Lichtintensität, da Q A langsam wieder reduziert wird unddadurch der Fluß in die Reaktionszentren abnimmt (k p wird kleiner).Der darauffolgende Lichtintensitätsanstieg hat zwei Ursachen:46

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE• die Reoxidation von Q − A durch die Saugwirkung von PS I (k p wird wieder größer),• das Anwachsen der thermischen Deaktivierung (k t > minimal).3. Die Zunahme von k t wird durch den letzten Impuls in Abbildung 6.2 bei sättigendemHintergrundlicht (LED+SP) sichtbar gemacht. Dieser minimale Exzitonenfluß Φ ′ M imhelladaptierten Zustand ist im Vergleich zu Φ M erheblich größer, weil der Fluß indie thermische Deaktivierung zugenommen hat (k p = 0, k t > minimal). Der ImpulsΦ ′ M setzt sich aus dem ersten Impuls Φ M im dunkeladaptierten Zustand und demzusätzlichen Fluß ∆Φ t in die thermische Deaktivierung zusammen: Φ ′ M = Φ M + ∆Φ t .47

VERGLEICH DER STANDARDMESSVERFAHREN VON PAM UND FC-MASCHINE48

Kapitel 7Vorversuche für den meßtechnischenEinsatzIm vorherigen Kapitel sind mit Φ 0 und Φ M die wichtigsten Meßgrößen der Chlorophyll-Fluoreszenz vorgestellt worden. Um diese Größen exakt messen zu können, sind vorher dieBedingungen für ihre genaue Bestimmung zu ermitteln.7.1 Bestimmung der Hintergrundlicht-Intensität für sättigendeLichtblitzeΦ M spiegelt den Zustand des Blattes wider, in dem alle Reaktionszentren Q A reduziert sind.Um das zu erreichen, wird Hintergrundlicht hoher Intensität benötigt.7060Φ Min relativen Einheiten4000 1100 1100 1130Φ M50201000 500 1000 1500 2000Intensität des Hintergrundlichtes in W/m²Abbildung 7.1: Darstellung des Exzitonenflusses (in willkürlichen Einheiten) in Abhängigkeit von derIntensität des Hintergrundlichtes. Es wurden drei Messungen gemittelt, die an verschiedenenBlättern derselben Pflanze durchgeführt wurden, und die Standardabweichungbestimmt.49

VORVERSUCHE FÜR DEN MESSTECHNISCHEN EINSATZWie stark das Hintergrundlicht sein muß, zeigt Abbildung 7.1.Hier wurde Hintergrundlicht unterschiedlicher Intensität als Lichtpuls von 2 s Dauerzusätzlich zum Regellicht auf das Blatt gegeben. Die Messungen wurden an drei Blätternderselben Pflanze (Bohne) durchgeführt. In Abbildung 7.1 fällt der Φ M -Wert mit steigenderIntensität. Dies bedeutet, daß bei geringen Intensitäten nicht alle Reaktionszentren geschlossensind, so daß noch ein Exzitonenfluß in die ETC stattfinden kann. Ab ca. 700 W/m 2tritt dann Sättigung ein. Es ist also erst bei Intensitäten größer als 700 W/m 2 sicher, daß alleReaktionszentren geschlossen sind.7.2 Bestimmung des Φ 0 /Φ M -WertesΦ 0 spiegelt den Zustand wider, in dem alle Reaktionszentren Q A oxidiert sind. Dies ist nurbei relativ geringen Lichtintensitäten der Fall.Wird nun ein hoher Sollwert vorgegeben, so muß die Regel-LED sehr hell leuchten, damitder Istwert die vorgegebene Sollwert-Spannung erreicht. Der Anfangswert Φ 0 entspricht indiesem Fall nicht seiner ursprünglichen Definition: durch das starke Meßlicht sind bereitseinige Reaktionszentren geschlossen. Dieser Sachverhalt läßt sich an einem kleinen Φ 0 /Φ M -Wert ablesen. Normal ist bei einem Blatt, das sich in einem physiologisch gesunden Zustandbefindet, ein Φ 0 /Φ M -Wert von 4 – 5.Abbildung 7.2 zeigt die Abhängigkeit des Φ 0 /Φ M -Wertes von der vorgegebenen Sollwert-Spannung. Die Messungen wurden an drei Blättern derselben Pflanze (Bohne) durchgeführt.Wie zu erkennen ist, nimmt der Φ 0 /Φ M -Wert mit wachsendem Sollwert ab. Die Bezeichnung“Φ 0 ” ist bei größeren Sollwerten mit Vorbehalt zu verwenden, da hier die eigentliche Definition(“alle Reaktionszentren Q A sind oxidiert”) nicht mehr zutrifft.50

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE108Φ 0 / Φ M00 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 11Φ − Φ − VerhältnisM064200 50 100 150 200 250 300Sollwert in mVAbbildung 7.2: Abhängigkeit des Φ 0 /Φ M -Wertes vom vorgegebenen Sollwert. Es wurden drei Messungengemittelt, die an verschiedenen Blättern derselben Pflanze durchgeführt wurden, unddie Standardabweichung bestimmt.In Tabelle 7.1 sind einige Intensitäten der Regel-LED aufgeführt, die bei der Messung in Abbildung7.2 den jeweiligen Φ 0 -Werten entsprechen. Wie oben beschrieben, nimmt mit wachsendemSollwert die Intensität der Regel-LED zu und deshalb der Φ 0 /Φ M -Wert ab.Sollwert in mV 54.5 102.5 152.0 202.5 252.5Intensität von Φ 0 in W/m 2 6.5 8.9 10.4 11.5 12.7Tabelle 7.1: Auflistung einiger Φ 0 -Werte in W/m 2 , die sich bei den jeweiligen Sollwerten ergaben.In Abbildung 7.2 scheint die Kurve bei kleinen Sollwertspannungen ihr Maximum noch nichterreicht zu haben. Bei Messungen mit kleineren Sollwertspannungen wurde das Rauschenjedoch zu groß. Allerdings ist ein Φ 0 /Φ M -Wert von 6 extrem gut. Normalerweise liegt er bei 5(nächster Abschnitt).7.3 Bestimmung der thermischen DeaktivierungDer mit der FC-Maschine gemessene Fluß enthält nach dem Topfmodell in Abbildung 3.3zwei Hauptkomponenten: den photochemischen Fluß ins Reaktionszentrum Φ p und diethermische Deaktivierung Φ t . Der Anteil der Fluoreszenz ist hierbei vernachlässigt. Währendder Induktionskurve (Abb. 6.2) verändern sich beide. Die folgenden Versuche sollen eineAbschätzung der Aufteilung der Veränderungen auf beide Komponenten erleichtern.51

VORVERSUCHE FÜR DEN MESSTECHNISCHEN EINSATZ7.3.1 Verfahren mit zwei Blitzen pro MessungNach der in Abbildung 6.2 dargestellten Methode mit sättigendem Licht wurde die Änderungder thermischen Deaktivierung im Verlauf der Induktionskurve in mehreren Schritten bestimmt:1. Durch das Einschalten von Sättigungs- und Meßlicht für eine Dauer von 2 s (Intensitätdes Sättigungslichtes: 1000 W/m 2 ) wurde nach zehnminütiger Dunkeladaption dieGröße Φ M gemessen.2. Nach einer weiteren Dunkeladaption von 10 Minuten zur Relaxation des Blattes löstedas Einschalten der Regel-LED die Induktionskinetik aus.3. Um die Änderung der thermischen Deaktivierung mit der Zeit zu bestimmen, wurdein verschiedenen Messungen die Induktionskurve zu unterschiedlichen Zeitpunkten tabgebrochen.4. Ein erneutes Zuschalten von Sättigungslicht zeigte den im Vergleich zu Φ M erhöhtenImpuls Φ ′ M (t).Bei diesem Verfahren mit zwei Lichtblitzen pro Messung hatte der erste Lichtblitz den Zweck,die Reproduzierbarkeit des Anfangswertes Φ M zu überprüfen. Bei einer Dunkeladaptionszeitvon jeweils 10 Minuten zwischen den einzelnen Messungen konnte Φ M reproduziert werden.Die Änderung der thermischen Deaktivierung (normiert auf den Anfangswert k t0 ) wurdedurch den Vergleich von Φ ′ M (t) und Φ M (normiert auf Φ M ) bestimmt:∆k t (t)k t0= Φ′ M (t) − Φ MΦ M(7.1)Daß neben dem Φ 0 /Φ M -Wert auch die thermische Deaktivierung vom vorgegebenen Sollwertund damit von der Intensität des Regellichtes abhängig ist, zeigt Abbildung 7.3. Hier wurde∆k tk t00.40.350.36 LEDs(großer Sollwert)00 11ß00 110.250.26 LEDs(kleiner Sollwert)0.150.11 LED0.0500 20 40 60 80 100 120Zeit in sAbbildung 7.3: Bestimmung der Änderung der thermischen Deaktivierung ∆ktk t0nach dem Verfahren mitzwei Lichtblitzen pro Messung. Der Verlauf wurde bei verschiedenen Intensitäten desRegellichtes bestimmt. Intensitäten siehe Text.52

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEder Verlauf von ∆k tk t0an einem Tabakblatt mit• sechs Regel-LEDs und einem großen Sollwert (U = 500 mV, Intensität der Regel-LEDsim Steady-State: 36.0 W/m 2 ; Φ 0 /Φ M : 2.7),• sechs Regel-LEDs und einem kleineren Sollwert (U = 350 mV, Intensität der Regel-LEDsim Steady-State: 25.0 W/m 2 ; Φ 0 /Φ M : 3.6),• einer Regel-LED und einem Sollwert von 100 mV (Intensität der Regel-LED im Steady-State: 5.1 W/m 2 ; Φ 0 /Φ M : 5.0)gemessen. Es ist eine deutliche Abhängigkeit der Zunahme der thermischen Deaktivierungvon der Intensität des Meßlichtes zu erkennen.Mit dem standardisierten PAM-Fluorometer wurden an derselben Tabakpflanze Messungendurchgeführt, die einen F M /F 0 -Wert von 5.3 ergaben (Bendixen, persönliche Mitteilung). Dazwischen den PAM- und den FC-Größen der inverse ZusammenhangF M ∼ 1Φ Mund F 0 ∼ 1 Φ 0gilt, läßt sich der F M /F 0 -Wert unmittelbar mit dem Φ 0 /Φ M -Wert vergleichen. Es scheint alsonach einer Gegenüberstellung des mit dem PAM gemessenen F M /F 0 -Wertes (5.3) und der beiden unterschiedlichen Meßlichtintensitäten erhaltenen Φ 0 /Φ M -Werte• 2.7 bei 36.0 W/m 2 im Steady-State,• 3.6 bei 25.0 W/m 2 im Steady-State,• 5.0 bei 5.1 W/m 2 im Steady-Statesinnvoll, mit nur einer Regel-LED bei relativ geringen Sollwert-Spannungen zu messen. Wiein Abschnitt 9.4 noch diskutiert wird, hängen der Sollwert und der dazugehörige Steady-State-Wert stark vom physiologischen Zustand der Blätter ab. Daher können die hier erhaltenenWerte nicht automatisch von einer Messung auf die nächste übertragen werden.Der Nachteil des obigen Verfahrens mit zwei Lichtblitzen pro Messung besteht darin, daß derVerlauf der thermischen Deaktivierung nur punktuell erfaßt werden kann und die gesamteKurve aus einer Vielzahl von Messungen zusammengesetzt werden muß. Inwieweit deshalbder mit dieser Methode bestimmte Verlauf dem wahren Verlauf entspricht, muß in Kombinationmit dem im nächsten Abschnitt vorgestellten Verfahren untersucht werden.7.3.2 Verfahren mit mehreren Lichtblitzen pro MessungHier wurden während der Induktionskinetik alle 30 s sättigende Blitze von 2 s Dauer (Intensität:1000 W/m 2 ) zugeschaltet und damit die Werte Φ ′ M(t) bestimmt. Durch einen Vergleichmit dem Wert des minimalen Exzitonenflusses im dunkeladaptierten Zustand Φ M wurde dieÄnderung der thermischen Deaktivierung ∆k tk t0nach Gleichung 7.1 berechnet. Eine dreimaligeWiederholung der Messungen erfolgte nach jeweils 10 Minuten Dunkeladaption (Abb.7.4). Es wurde mit sechs LEDs und einer Sollwertspannung von 350 mV gemessen.Interessant ist folgende Beobachtung: Tabelle 7.2 zeigt, daß sich bei dieser Meßserie sowohlder Φ 0 - als auch der Φ M -Wert nicht verändert. Die thermische Deaktivierung hingegen53

VORVERSUCHE FÜR DEN MESSTECHNISCHEN EINSATZ∆kk t 0t0.60.50.40.30.243210.100 50 100 150 200Zeit in sAbbildung 7.4: Bestimmung der Veränderung der thermischen Deaktivierung ∆ktk t0nach dem Verfahrenmit mehreren Lichtblitzen pro Messung. Es wurden vier Messungen in einem zeitlichenAbstand von 10 Minuten am selben Blatt durchgeführt. Intensität der sechs Regel-LEDsim Steady-State: 25 W/m 2 .1. Messung 2. Messung 3. Messung 4. MessungΦ 0 66.5 67.0 67.0 67.0Φ M 19.0 19.0 19.0 19.0Φ 0 /Φ M 3.5 3.5 3.5 3.5Tabelle 7.2: Die Φ 0 - bzw. Φ M -Werte (in willkürlichen Einheiten) und die Φ 0 /Φ M -Werte , die sich bei denvier Messungen ergaben.wächst bei jeder neuen Messung an. Es tritt ein Erinnerungseffekt auf, der den photosynthetischenApparat verändert. Der pH-Gradient kann allerdings nicht die Ursache dafür sein, dadie Φ M -Werte bei jeder Messung gleich sind (Tabelle 7.2). Es ist ohnehin bekannt, daß sich derpH-Gradient mit einer Zeitkonstanten von 20 - 40 s abbaut (Hansen et al., 1993) und deshalbnach einer Dunkeladaptionszeit von 10 Minuten verschwunden sein muß. Photoinhibitionscheidet als Ursache ebenfalls aus, denn auch sie würde sich in einer Veränderung der Φ 0 -und Φ M -Werte in Tabelle 7.2 zeigen. Prozesse, die eine Langzeitwirkung haben, sind:• die Zeaxanthin-Bildung (Goss et al., 1995),• die Stimulierung von PS I-Elektronenakzeptoren, wie das Malat-Ventil (Krömer, 1995),die zyklische Phosphorylierung (Heber et al., 1982; Katona et al., 1992) oder die Nitratassimilation(Turpin und Bruce, 1990; Bendixen, 1995).Zeaxanthin ist ein Carotenoid in den PS II-Antennen, das als Verstärker für die pH-induzierte54

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEthermische Deaktivierung wirkt. Es wird bei starker Beleuchtung aus dem wirkungslosen Violaxanthindurch Deepoxidation gebildet. Dies kann durch Zugabe von Dithiothreitol (DTT)unterbunden werden (Bilger et al., 1989).Die Langzeitwirkung des Zeaxanthins wird in der Dissertation von Bendixen (1997) untersucht.Das genaue Zusammenwirken der oben genannten PS I-Elektronenakzeptoren ist noch weitgehendunbekannt. Mit den Fernrot-Messungen im nächsten Kapitel sollen diese Mechanismennäher untersucht werden.7.3.3 Gegenüberstellung der beiden MeßverfahrenBei einem Vergleich der Messungen in den Abbildungen 7.3 und 7.4 fällt das leichte Absinkender thermischen Deaktivierung nach ca. 50 s in Abbildung 7.4 auf. Diese Abnahme wurdeauch bei den Messungen mit dem PAM beobachtet (Abb. 6.1) und der Stimulierung derCalvin-Zyklus-Enzyme zugeschrieben (Schreiber et al., 1986).In Abbildung 7.3 fehlt diese Komponente allerdings. Hier wird bei ca. 40 s ein Sättigungswerterreicht. Da sich diese Kurve aber aus nacheinander ablaufenden Messungen zusammensetzt,ist es wahrscheinlich, daß auch hier ein Erinnerungseffekt auftritt. Dieser Erinnerungseffektbewirkt, wie Abbildung 7.4 zeigt, daß die Werte von k t nach einigen Messungen anwachsen.Daher ist anzunehmen, daß die in Abbildung 7.3 gezeigten Kurven nicht alleinedie Entwicklung des Flusses Φ t während der Induktionskurve widerspiegeln, sondern eineÜberlagerung des Induktionskurvenverlaufs von k t und des Erinnerungeffektes darstellen.Würde also, wie in Abbildung 7.5 gezeigt, zur Bestimmung von Φ p die Differenz aus der Induktionskurveund Φ t gebildet, würde sich fälschlicherweise ein zu kleiner Wert für Φ p ergeben.Zum Vergleich sind in Abbildung 7.6 die Induktionskurve und Φ t , das durch die Methodemit mehreren Blitzen pro Messung erhalten wurde, dargestellt. In diesem Fall läßt sichaus der Differenz der beiden Kurven der tatsächliche photochemische Fluß Φ p bestimmen.Daher ist trotz der Gefahr, das Experiment durch die häufigen Blitze zu stören, das Verfahrenmit mehreren Blitzen pro Messung zu bevorzugen.55

VORVERSUCHE FÜR DEN MESSTECHNISCHEN EINSATZ60000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111in relativen EinheitenΦΦ in willkürlichen Einheiten5040302010ΦΦpt00 20 40 60 80 100 120Zeit in sAbbildung 7.5: Gegenüberstellung der Induktionskurve und der durch das Verfahren mit zwei Blitzenbestimmten Kurve der thermischen Deaktivierung (sechs LEDs, Sollwertspannung:350 mV). Der Fluß in die thermische Deaktivierung ist in dieser Darstellung nichtauf den Anfangswert normiert, sondern in willkürlichen Einheiten (Einheiten des x-t-Schreibers) aufgetragen, um die Induktionskurve und Φ t direkt miteinander vergleichenzu können.56

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE60010101010101010101010101010101010101010101in relativen EinheitenΦΦ in willkürlichen Einheiten50403020Φ p10Φ t00 20 40 60 80 100 120Zeit in sAbbildung 7.6: Gegenüberstellung der Induktionskurve und der durch das Verfahren mit mehreren Blitzenbestimmten Kurve der thermischen Deaktivierung. Der Fluß in die thermische Deaktivierungist in dieser Darstellung nicht auf den Anfangswert normiert, sondern inwillkürlichen Einheiten (Einheiten des x-t-Schreibers) aufgetragen, um die Induktionskurveund Φ t direkt miteinander vergleichen zu können.57

VORVERSUCHE FÜR DEN MESSTECHNISCHEN EINSATZ58

Kapitel 8Flußverzweigungen an PS I –Motivation für FC-Messungen beiPflanzen mit verschiedenenPS I-AkzeptorenDie neuen meßtechnischen Möglichkeiten der FC-Maschine sollen bei Untersuchungen eingesetztwerden, die für das gemeinsame DFG-Projekt der Kieler Arbeitsgruppe für Biophysikmit dem Institut für Pflanzenernährung (Sattelmacher) von Interesse sind. Bei diesem Projektgeht es um die Resistenz gegenüber Lichtstreß. Es ist bekannt, daß nitraternährte Pflanzenresistenter als ammoniumernährte Pflanzen sind (Magalhaes, 1983). Im DFG-Projekt wirddie Hypothese vertreten, daß die günstigere Flußverteilung der Nitratpflanzen an PS I einenSchutzeffekt darstellt.Um dies und die Rolle der FC-Messungen bei den Untersuchungen zu erklären, werden imfolgenden die PS I-Akzeptoren genauer beschrieben. Abbildung 8.1 gibt ein detailliertes Bilddes bereits in Abbildung 4.1 gezeigten Schemas. Es sind fünf verschiedene Elektronenakzeptorendargestellt.8.1 Der lineare bzw. nichtzyklische ElektronentransportDer lineare bzw. nichtzyklische Elektronentransport ist der im Rahmen der ETC beschriebeneElektronentransport. Der Donor ist das Wasser, der Akzeptor NADP (NADPH/H + in Abbildung8.1).Mit dem Ausdruck nichtzyklische Phosphorylierung ist die Bildung von ATP gemeint, diedurch den linearen Elektronentransport angetrieben wird. Er heißt nichtzyklisch, weil derElektronenfluß vom Wasser bis zum NADPH/H + direkt, ohne Rückführungen verläuft. DerName Phosphorylierung ist geschichtlich bedingt und deshalb irreführend. Er stammt ausder Zeit vor Mitchell (1961), als noch nicht bekannt war, daß der Elektronentransport ersteinen pH-Gradienten über der Thylakoidmembran aufbauen muß, um dann über eine ATPasedas ADP zu ATP zu phosphorylieren. Die damalige Meinung war, daß die Phosphorylierungdirekt chemisch an den Elektronenfluß gekoppelt sei.Es wird angenommen, daß das meiste ATP, das für die CO 2 -Assimilation notwendig ist, diesemWeg entstammt.59

FLUSSVERZWEIGUNGEN AN PS I – MOTIVATION FÜR FC-MESSUNGEN BEI PFLANZEN MITVERSCHIEDENEN PS I-AKZEPTORENCYTOSOLNO - 3NADH NAD +Envelope1 ATPNR2 e -OAAMalatMalat-OAA-TranslocatorFihaNiRSTROMANO - 2NH 37 H +2 H+2 e-6 e -4HH10 e-e4H4eOAA Malat2 NADPH/H3ADP2O22eGlutamat-ZyklusCalvin-Zyklus3ATPCO2FifExzitonenseeFitFipPS IIP6804ePQZ4ePS IP7002eM2O2m2HO2ATPase2HOO24H4H2H3*(3...4H)LUMENAbbildung 8.1: Elektronentransportkette mit einer detaillierteren Darstellung der verschiedenen PS I-Akzeptoren. Weitere Erläuterungen im Text.Für die späteren Messungen ist wichtig, daß die CO 2 -Aufnahme und damit der lineare Elektronenflußmit Glyceraldehyd unterbunden werden kann (Stokes und Walker, 1972).8.2 Der zyklische ElektronentransportBeim zyklischen Elektronentransport (Z in Abbildung 8.1) werden Elektronen vom Ferredoxinentweder direkt oder über ein Cytochrom, das Bestandteil des Cytochrom b 6 /f-Komplexesist, auf den Plastoquinonpool übertragen (Buschmann und Grumbach, 1985). Vom Plastoquinonpoolist der Verlauf des zyklischen Elektronentransportes mit dem linearen identisch(Heber et al., 1982).Beim zyklischen Elektronentransport wird weder Sauerstoff freigesetzt noch NADPH/H + gebildet.Es werden jedoch Protonen für die ATP-Synthese ins Lumen transportiert. Ist diesem60

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEFall wird von zyklischer Phosphorylierung gesprochen (Arnon, 1959). Die Kopplung mit derATP-Synthese ist mit der Protonenübertragung vom Plastoquinon in das Lumen verbunden.Die physiologische Bedeutung des zyklischen Elektronentransportes ist noch nichtvollständig geklärt. Es wird durch ihn auf jeden Fall zusätzliches ATP zur Verfügung gestellt.Der zyklische Elektronentransport wird in den folgenden Messungen durch Antimycin A unterbunden.8.3 Der pseudozyklische Elektronentransport (Mehler-Reaktion)Eine weitere Alternative zum “normalen” Elektronenakzeptor NADP ist molekularer Sauerstoff(M in Abbildung 8.1):aus der Wasserspaltung stammende Elektronen werden, unter Bildung von Radikalen, auf O 2übertragen (Hormann et al., 1993). Nach Detoxifikation des Superoxids entsteht letztendlichwieder Wasser. Tatsächlich setzt sich dieser Prozeß aus einer Reihe von Einzelreaktionenzusammen (Asada und Takahashi, 1987; Schreiber und Neubauer, 1990):2 H 2 OPS−−→II4 e − + 4 H + + O 2 ↑ (1)4 O 2 ↓ + 4 e − PS−−→I4 O − 2 ·(2)4 O − 2 · + 4 H + −−→ 4 HO 2 (3)4 HOSOD 2 −−→ 2 H 2 O 2 +2 O 2 ↑ (4)2 H 2 O 2 + 4 AsAAPO−−→ 4 MDA + 4 H 2 O (5)4MDA + 4 e − + 4 H + MDR−−→ 4 AsA (6)2 H 2 OPS−−→II4 e − + 4 H + + O 2 ↑ (7)Gleichung (1) beschreibt noch einmal die Wasserspaltung an PS II. Diese stellt die Elektronenfür die an PS I stattfindende Reaktion (2) zur Verfügung. Hier wird pro Elektron ein Sauerstoffmolekülzum Superoxidradikal reduziert. Aufgrund seiner negativen Oberflächenladungkann das Superoxidradikal nicht in das Stroma gelangen. Daher wird es zunächst im Lumenprotoniert (Gleichung (3)). Als HO 2 -Molekül gelangt es ins Stroma, wo unter Beteiligung derSuperoxiddismutase (SOD) eine Dismutationsreaktion stattfindet (Gleichung (4)). Hierbeientsteht Wasserstoffsuperoxid (H 2 O 2 ) und molekularer Sauerstoff. H 2 O 2 ist ein Zellgift undwird in Reaktion (5) unter Beteiligung des Enzyms Ascorbatperoxidase (APO) durch dasAscorbat AsA reduziert. Dabei wird gleichzeitig Monodehydroascorbat (MDA) gebildet. Fürdie Regeneration von Ascorbat aus MDA (Gleichung (6)) sind vier Elektronen notwendig.Diese stammen wiederum aus der Wasserspaltung (Gleichung (7)).Vereinfacht kann gesagt werden, daß die Mehler-Reaktion Elektronen aus der Wasserspaltungbenötigt, damit zum Aufbau des pH-Gradienten beiträgt, aber selbst kein ATPverbraucht. Für die geplanten Messungen ist wichtig, daß stöchiometrisch gesehen beidieser Reaktion die Freisetzung von O 2 -Molekülen nicht sichtbar wird, da das bei derWasserspaltung an PS II erzeugte O 2 von der Mehler-Reaktion wieder verbraucht wird.8.4 Die StickstoffassimilationDie Zufuhr von Stickstoff ist zur Synthese von Aminosäuren und Proteinen in der Pflanze notwendig.Er wird von höheren Pflanzen in Form von Nitrationen (NO − 3 ) oder Ammoniumionen 61

FLUSSVERZWEIGUNGEN AN PS I – MOTIVATION FÜR FC-MESSUNGEN BEI PFLANZEN MITVERSCHIEDENEN PS I-AKZEPTOREN(NH + 4 ) über die Wurzel aufgenommen. Die Proteinsyntheseprozesse verarbeiten ausschließlichNH 3 , was bei Nitratdüngung eine Reduktion des Nitrats notwendig macht. Diese erfolgtin zwei Schritten:NO − 3 + 2 e− + 2 H + −−→NR NO − 2 + H 2ONO − 2 + 6 e− + 7 H +−−→NiRNH 3 + 2 H 2 OFür die Reduktionsprozesse verbrauchen die beiden Enzyme Nitrat (NR)- und Nitritreduktase(NiR) Elektronen und Energie aus der ETC (links oben in Abbildung 8.1). So entsteht also beiNitratdüngung ein zusätzlicher Elektronenakzeptor hinter PS I (Vanselow, 1993; Turpin undBruce, 1990; Manzano et al., 1976).Ammoniumgedüngte Pflanzen assimilieren den Stickstoff bereits in der Wurzel (Givan, 1979).Sie besitzen deshalb diesen zusätzlichen Elektronenakzeptor im Chloroplasten nicht. Daherwird angenommen, daß sie verstärkt die Mehler-Reaktion als PS I-Akzeptor benutzen (Zhu etal., 1997) .Um zu untersuchen, wie sich eine unterschiedliche Stickstoffdüngung auf die Prozesse inder ETC auswirkt, wurde ein Teil der Bohnenpflanzen nur mit Nitrat, der andere Teil nur mitAmmonium gedüngt.8.5 Das Malat-VentilRedoxäquivalente von PS I können in Form von NADPH/H + nicht nur an den Calvin-Zyklusgegeben, sondern auch über die Envelope ins Cytosol exportiert werden (rechts oben in Abbildung8.1).NADP + und NADPH in den Chloroplasten, sowie NAD + und NADH im Cytoplasma könnenallerdings die intakte Hülle nicht passieren. Stattdessen muß ein besonderes Transportsystem,das Malat-Oxalacetat-Shuttle (Dry et al., 1987; Krömer et al., 1992; Hanning und Heldt,1993) benutzt werden. Ein Shuttle ist ein Antiporter, der einen Stoff (Malat) gegen einen anderen(Oxalacetat, OAA) über eine Membran austauscht. Auf diese Weise kann das ReduktionsäquivalentMalat ins Cytosol transportiert werden und zur Bildung von ATP in den Mitochondrienführen (Krömer et al., 1988).Malat als reduzierte Form wird aus der oxidierten Form OAA gebildet. Die Reduktion von OAAinnerhalb des Chloroplasten katalysiert die lichtmodulierte NADP-Malat-Dehydrogenase(NADP-MDH). Diese hängt einerseits vom Elektronenfluß ab, der über das reduzierte Thioredoxindie Enzyme aktiviert, andererseits vom Verhältnis NADPH/NADP (Scheibe, 1987). Deshalbwird der Malatexport verhindert, wenn das durch Licht gebildete NADPH für andereStroma-Reaktionen gebraucht wird.Der Aktivierungszustand der NADP-MDH reflektiert den Redoxzustand der reduzierten Seitevon PS I; die Umwandlung von OAA zu Malat bestimmt die Rate des Elektronenflusses durchdas Malat-Ventil.8.6 Die Protonen-ElektronenbilanzEin zentrales Problem der Photosynthese, die Protonen-Elektronenbilanz, ergibt sich ausdem folgenden, in den Abbildungen 4.1 und 8.1 dargestellten Sachverhalt:das WSE an PS II spaltet nach Absorption von 4 Photonen zwei Wassermoleküle zu vierProtonen, einem O 2 -Molekül und vier Elektronen:62

FLUSSVERZWEIGUNGEN AN PS I – MOTIVATION FÜR FC-MESSUNGEN BEI PFLANZEN MITVERSCHIEDENEN PS I-AKZEPTOREN64

Kapitel 9Messungen mit zusätzlichem fernrotenLichtDurch fernrotes Licht (FR-Licht, λ > 700 nm) wird hauptsächlich PS I angeregt. Dies bewirkteine Saugwirkung von PS I auf die ETC, die zu einer verstärkten Reoxidation von Q − A führt.Demnach sollte sich der Elektronenfluß aus PS II nach Zuschalten von FR-Licht erhöhen.Bevor diese These jedoch experimentell überprüft werden konnte, mußten an der FC-Maschine einige Veränderungen vorgenommen werden.9.1 Veränderungen an der FC-Maschine für das Zuschalten von FR-LichtZuerst wurde der Leuchtdiodenkopf um drei FR-LEDs (Walz, KL 450-735DDH, λ max = 735nm) erweitert. Für die Ansteuerung der LEDs wurde die in Abbildung A4 gezeigte Schaltungbenutzt.Da durch die FR-Licht-Messungen der Einfluß der verschiedenen Prozesse an PS I abgeschätztwerden soll, muß vermieden werden, daß auch PS II durch das FR-Licht angeregtwird. In Abbildung 9.1 sind die Absorptionsspektren der beiden Photosysteme dargestellt. Dadas Absorptionsspektrum von PS II bei 707 nm endet, das Intensitätsspektrum der FR-LEDssich allerdings ohne Filter über den Wellenlängenbereich von 670 nm bis 780 nm erstreckt(Abb. 9.2), wurde ein 2 mm dickes RG9-Filter (λ trans > 700 nm) vor die FR-LEDs gesetzt.Wie Abbildung 9.2 zeigt, kann mit dieser Kombination ein Einfluß auf PS II ausgeschlossenwerden.65

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHTAbsorption in willkürlichen Einheiten Absorption in willkürlichen Einheiten50403020100540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 7405040302010PS IIPS I0540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740λ in nmAbbildung 9.1: Absorptionspektren der beiden Photosysteme im Bereich von 540 nm –740 nm (Witt,1979).30000Intensität in Transmissionwillkürlichen Einheiten00 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 11250002000015000100005000ohneFilter1 mm-RG92 mm-RG93 mm-RG90660 680 700 720 740 760 780λ in nmAbbildung 9.2: Intensitätsspektren der FR-LEDs (Walz, KL 450-735DDH) ohne Filter und mit RG9-Filtern unterschiedlicher Dicke (1 mm, 2 mm und 3 mm). Die Spektren wurden miteinem Photometer (Boehme, 1996) gemessen (Tabrizi, 1997).Weiterhin stellte sich die Frage, wie die FR-LEDs getaktet werden sollten. Eine Möglichkeitwar, sie als konstantes Hintergrundlicht leuchten zu lassen. Im Gegensatz zum hellroten Licht66

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHTFür die Ansteuerung der FR-LEDs wurde das andere Flipflop von Zähler-Ausgang Q0 gesetztund von Zähler-Ausgang Q2 zurückgesetzt.Als zusätzliche Maßnahme gegen eine Übersteuerung des Photodetektors wurde währendder FR-Phase durch eine Verkleinerung des Rückkopplungswiderstandes die Verstärkung desDetektors vermindert (Abb. 9.4):Hintergrundicht-Regelung0101010101010101010101T40100 11 0101 0 0 1 1-+5p61 MOPA6025 k00 11 015 k1000101oIstwerta7PHOTODETEKTORAbbildung 9.4: Während der FR-Phase wurde durch die Verkleinerung des Rückkopplungswiderstandesdie Empfindlichkeit des Photodetektors vermindert. Der Transistor wird über Pin a7 vonder Takt-Platine aus angesteuert.sobald am Gate von T4 (FET 9250) 5 V anliegen, was während der FR-Phase der Fall ist, wirdder FET leitend, und der 5 kΩ-Widerstand liegt zum Rückkopplungswiderstand (1 MΩ) parallel.Dies verringert die Verstärkung des Detektors um den Faktor 200.68

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHT9.2.1 Untersuchung der thermischen DeaktivierungIn der Messung in Abbildung 9.5 war gezeigt worden, daß FR-Licht eine Erhöhung des Flussesaus PS II bewirkt. Nach Gleichung 4.1 kann dies durch eine Erhöhung des photochemischenFlusses Φ p oder der thermischen Deaktivierung Φ t entstehen.Um sicher zu gehen, daß die Erhöhung des Flusses wirklich auf eine Vergrößerung des Elektronenflussesaus PS II und nicht auf eine erhöhte thermische Deaktivierung zurückzuführenist, wurde die in Kapitel 6.2 beschriebene Methode mit sättigendem Licht durchgeführt (Abb.9.6 ): nach einer Dunkeladaption von 20 Minuten erfolgte zuerst die Bestimmung des Φ M -7060Φ in willkürlichen Einheiten00 1100 1100 1100 1100 1100 1100 11Fluss50403020Φ Φ MF’ Φ’MMRFRanFRaus100-12001010101010101010100 11 01 00 11 01 010101000 111000 111000 1110 500011 50 100 11 100 150000 111 150 200 20000 11 00 11 111 00000 11 Zeit in s 00 11 111 000Abbildung 9.6: Untersuchung der thermischen Deaktivierung. Zu den Zeitpunkten t 1 = 150 s undt 2 = 180 s wurde sättigendes Licht auf das Blatt gegeben. Dies ergab die beiden Werte Φ ′ MF(nach 30 s FR-Beleuchtung) und Φ ′ MR (naRch 30 s ohne FR-Beleuchtung) des minimalenExzitonenflusses im helladaptierten Zustand. Würde das FR-Licht eine Erhöhung derthermischen Deaktivierung verursachen, müßte der erste Impuls höher als der zweitesein. Zwei Minuten vor Beginn der Kinetik wurde zum Vergleich der Wert Φ M bestimmt.Intensität des sättigenden Lichtes: 1000 W/m 2 , Dauer: 2 s; Intensität der Regel-LED imSteady-State: ca. 10 W/m 2 , Intensität der FR-LEDs: 15 W/m 2 .Wertes. Nach einer weiteren Dunkeladaption von 2 Minuten wurde durch das Einschaltender Regel-LED die Induktionskinetik ausgelöst, in deren Verlauf alle 30 s das FR-Licht einbzw.ausgeschaltet wurde. Zu den Zeitpunkten t 1 = 150 s und t 2 = 180 s wurde für eine Dauervon 2 s sättigendes Licht von 1000 W/m 2 auf das Blatt gegeben. Wäre thermische Deaktivierungfür die Erhöhung des Flusses verantwortlich, müßte der erste Wert (Φ ′ MF) nach 30 sFR-Beleuchtung höher als der zweite (Φ ′ MR) nach 30 s ohne FR-Beleuchtung liegen.Diese Messung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten t 1 (60, 90, 120, 150 und 180 s) und t 2(90, 120, 150, 180 und 210 s) jeweils zweimal durchgeführt. In Tabelle 9.1 sind die Mittelwerteder insgesamt 10 Messungen aufgeführt. Wie zu erkennen ist, gilt: Φ ′ MR ≃ Φ′ MF. Deshalb kannthermische Deaktivierung als Grund für den zusätzlichen Fluß ausgeschlossen werden.Weiterhin wird durch den Vergleich des Wertes Φ M im dunkeladaptierten Zustand mit denWerten Φ ′ MF und Φ′ MRim helladaptierten Zustand deutlich, daß die thermische Deaktivierungim Verlauf der Induktionskurve sehr gering ist. Da mit nur einer Regel-LED gemessen wurde,70

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEΦ M Φ ′ MFΦ ′ MRMittelwert über zehn Messungen 19.6 ± 0.5 22.8 ± 0.9 22.3 ± 0.6Tabelle 9.1: Die Mittelwerte und Standardabweichungen von Φ M , Φ ′ MF und Φ′ MR in willkürlichen Einheiten.entspricht dies der unteren Kurve in Abbildung 7.3.9.3 Messungen im SommerBiologische Objekte sind sehr variabel, da ihre Antworten stark vom physiologischen Zustandabhängen. Es zeigte sich, daß deshalb Ergebnisse von im Sommer angezogenen Pflanzen getrenntvon Ergebnissen der “Winterpflanzen” behandelt werden müssen.9.3.1 Die KontrollmessungenEs wurde der zusätzliche Elektronenfluß in Abhängigkeit von der Intensität der FR-LEDs mitfolgender Methode bestimmt: nach einer Dunkeladaption von 20 Minuten löste das Einschaltender Regel-LED die Kautsky-Kurve aus. In ihrem Verlauf wurde alle 30 s das FR-Licht einbzw.ausgeschaltet. Im Abstand von jeweils 20 Minuten, die zur Relaxation des Blattes notwendigwaren, wurden die Messungen mit verschiedenen Intensitäten (0.7 – 16.0 W/m 2 ) derFR-LEDs wiederholt. Diese Messungen wurden an fünf nitraternährten (NO − 3 – ernährten)Bohnenblättern und fünf ammoniumernährten (NH + 4 – ernährten) Bohnenblättern derselbenPflanzenaufzucht (“1. Aufzucht”) im August 1996 durchgeführt. Die Mittelwerte der aufden Steady-State-Wert normierten, FR-induzierten Elektronenflüsse werden in Abbildung 9.7miteinander verglichen. Das wichtigste Ergebnis ist, daß keine signifikante Abhängigkeit vonder Stickstofform zu erkennen ist.Unter Normalbedingungen scheint also kein Unterschied in der FR-Antwort zu bestehen, dader Stoffwechsel bei stationären Verhältnissen in beiden Fällen auf gleiche Effektivität eingestelltist. Unterschiede können jedoch auftreten, wenn die Pflanzen eine plötzlichen Störungerfahren. Dann werden die begrenzten Kapazitäten in den einzelnen Stoffwechselzweigensichtbar. Die plötzlichen Störungen können durch Inhibitoren verursacht werden.9.3.2 Messungen mit InhibitorenUnter Inhibitoren versteht man Substanzen, die von der Pflanze aufgenommen werden undeinzelne Teilprozesse der Photosynthese stark beeinflussen bzw. ganz unterbinden. Durchden Vergleich von Messungen mit und ohne Inhibitor kann auf die Bedeutung des jeweiligenTeilprozesses geschlossen werden.Ein Problem besteht allerdings darin, den Wirkstoff homogen im Blatt zu verteilen. Die entsprechendeSubstanz kann über den Transpirationsstrom in das Blatt ziehen, indem derBlattstengel für einige Stunden in die jeweilige Wirkstofflösung gestellt wird. Eine andere Methodebesteht darin, das Blatt mit der Substanz zu infiltrieren (Vakuum-Infiltration). Hierbeibefindet sich das Blatt mit der jeweiligen Lösung in einer vorne verschlossenen Arztspritze(50 ml). Das Herausziehen des Stempels erzeugt einen Unterdruck. Durch den Wechsel von71

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHT0.30.25NO 3NH 4Φ FRΦ SS/000 111000 1110.2000 111000 111000 111000 111000 1110.15000 111000 111000 111000 111000 1110.1000 111zusätzlicher Elektronenfluß0.0500 5 10 15 20Intensität der FR-LEDs in W/m²Abbildung 9.7: 1. Aufzucht, Kontrollmessung ohne Verwendung von Inhibitoren. Vergleich derEmpfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- und ammoniumernährtenBohnen. Es wurde jeweils über fünf Messungen an verschiedenen Blätterngemittelt und die Standardabweichung aufgetragen.72

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEUnterdruck und Relaxation gelangt die Inhibitorlösung in das Blatt. Da sich unmittelbar danachkeine Luft mehr im Blatt befindet und sich dadurch u.a. seine optischen Eigenschaftenverändern, muß es für etliche Stunden in die betreffende Nährlösung gestellt werden. Danachist die Flüssigkeit aus den Interzellularen verdunstet, der Wirkstoff verbleibt aber in denBlattzellen.9.3.2.1 Messungen mit Antimycin AAntimycin A ist ein Fe-S-Inhibitor und unterbindet den zyklischen Elektronentransport umPS I (Lawlor, 1990; Backhausen et al., 1994; Mano et al., 1995; Heber et al., 1995), aber auchin Mitochondrien (Furbank und Horton, 1987). Es lag in kristalliner Form als Mischung ausAntimycin A 1 und Antimycin A 3 vor (Molekulargewicht: 534 g/Mol). Da es nicht wasserlöslichist, wurde zum Lösen Ethanol verwendet und eine 20 mMol-Stammlösung hergestellt. Diesewurde mit destilliertem Wasser auf die jeweilige Antimycin A-Konzentration (5, 25, 50 und100 µMol) verdünnt. Hierbei lag die Ethanolkonzentration zwischen 0.025 % und 0.5 % unddamit unterhalb der Grenze von 1 %. Diese ist einzuhalten, um Effekte des Alkohols auf denphotosynthetischen Apparat auszuschließen (Dau, persönliche Mitteilung). In die so erhaltenenLösungen wurden die Blätter sieben Stunden lang gestellt.9.3.2.2 Darstellung des zusätzlichen Elektronenflusses in Abhängigkeit von der Intensitätder FR-LEDsVor Beginn der eigentlichen Messungen wurde zur Klärung der zugrundeliegenden Mechanismennach der Methode aus Abbildung 9.6 untersucht, ob thermische Deaktivierung alsUrsache für den durch das FR-Licht hervorgerufenen, zusätzlichen Fluß in Frage kommt.Ein Vergleich der Werte Φ ′ MF und Φ′ MRaus Tabelle 9.2 zeigt, daß auch bei Antimycin A-vergifteten Bohnen der zusätzliche Fluß nicht auf thermische Deaktivierung, sondern aufeinen zusätzlichen Elektronenfluß zurückzuführen ist.Φ M Φ ′ MFΦ ′ MRMittelwert über zehn Messungen 16.5 ± 0.7 18.5 ± 0.5 18.9 ± 0.7Tabelle 9.2: Mittelwerte und Standardabweichungen von Φ M , Φ ′ MF und Φ′ MRVergiftung in willkürlichen Einheiten.bei Antimycin A-Dann wurde nach derselben Methode wie bei den Kontrollmessungen der zusätzliche Elektronenfluß(normiert auf den Steady-State-Wert) in Abhängigkeit von der Intensität der FR-LEDs bestimmt: nach 20 Minuten Dunkeladaption löste das Einschalten des Meßlichtes(Steady-State-Wert: ca. 10 W/m 2 ) die Induktionskurve aus. Zusätzlich wurde das FR-Licht mitIntensitäten zwischen 0.7 und 16.0 W/m 2 alle 30 s ein- bzw. ausgeschaltet. Die Anphase desFR-Lichtes fiel mit dem Beginn der Induktionskurve zusammen.Bei den Konzentrationen (5, 25, 50 und 100 µMol Antimycin A) wurde jeweils eine Messungan einem nitrat- und einem ammoniumernährten Bohnenblatt durchgeführt (1. Aufzucht).Die Abbildungen 9.8 bis 9.11 zeigen die FR-Amplitude, die im Steady-State der Induktionskurvegemessen wurde, in Abhängigkeit von der Intensität des FR-Lichtes für verschiedeneAntimycin A-Konzentrationen.73

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHTDie wichtigste Messung ist die bei 5 µMol, da dies der Bereich ist, in dem das Gift meistenseingesetzt wird. Deshalb ist bei diesen Messungen auch eine Kontrollmessung an mehrerennichtvergifteten Blättern der gleichen Pflanze durchgeführt worden. Die in Abbildung 9.8 dargestellteKontrolle ist der Mittelwert der beiden Kontrollmessungen aus Abbildung 9.7. DieMessungen bei höheren Konzentrationen zeigen eine eigenartige Abnahme des Effektes beihöheren Lichtintensitäten, die wahrscheinlich Effekte 2. Ordnung andeutet. Die Interpretationwird sich deshalb hauptsächlich auf die Messungen bei 5 µMol stützen. Allerdings zeigendie Messungen bei höheren Antimycin A-Konzentrationen den gleichen Nitrat–Ammonium–Unterschied wie die bei 5 µMol.Dieser Unterschied wird noch einmal an Pflanzen einer zweiten Aufzucht im September beidenselben Konzentrationen von Antimycin A gezeigt (Abbildungen 9.12 bis 9.15).0.30.251. Aufzucht5 µMol Antimycin ANH 4Φ FR/ Φ SS00 1100 1100 110.200 1100 1100 1100 1100 110.1500 1100 1100 1100 1100 110.100 1100 11zusätzlicher ElektronenflußKontr.NO 30.0500 5 10 15 20Intensität der FR-LEDs in W/m²Abbildung 9.8: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- undammoniumernährten Bohnen bei 5 µMol Antimycin A (1. Aufzucht). Zur besseren Deutungder Ergebnisse ist hier zusätzlich der Mittelwert der beiden Kontrollmessungen ausAbbildung 9.7 dargestellt.9.3.2.3 Darstellung des zusätzlichen Elektronenflusses in Abhängigkeit von der AntimycinA-KonzentrationDie Abbildungen 9.16, 9.17 und 9.18 zeigen die Abhängigkeit des zusätzlichen Elektronenflussesvon der Antimycin A-Konzentration. Dazu wurde über die Messungen der beidenAufzuchten gemittelt und bei drei verschiedenen Intensitäten der FR-LEDs (6.1, 10.0 und14.0 W/m 2 ) der zusätzliche Elektronenfluß (normiert auf den Steady-State-Wert) über derKonzentration aufgetragen.74

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE0.30.251. Aufzucht25 µMol Antimycin AΦ FR/ Φ SS0.2000 111000 111000 111000 111Φ FR000 1110.15000 111000 111Φ SS000 1110.1NH 4NO 30.0500 5 10 15 20Intensität der FR-LEDs in W/m²Abbildung 9.9: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- undammoniumernährten Bohnen bei 25 µMol Antimycin A (1. Aufzucht).0.30.251. Aufzucht50 µMol Antimycin AΦ FRΦ SS/0.2000 111000 111000 111000 111Φ FR000 1110.15000 111 Φ000 111 SS000 111NH 4NO 30.10.0500 5 10 15 20Intensität der FR-LEDs in W/m²Abbildung 9.10: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- undammoniumernährten Bohnen bei 50 µMol Antimycin A (1. Aufzucht).75

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHT0.30.251. Aufzucht100 µMol Antimycin AΦ FRΦ SS/0.2000 111000 111000 111000 111 Φ FR000 111 0.15000 111000 111 Φ SS000 111NH 40.1NO 30.0500 5 10 15 20Intensität der FR-LEDs in W/m²Abbildung 9.11: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- undammoniumernährten Bohnen bei 100 µMol Antimycin A (1. Aufzucht).0.30.252. Aufzucht5 µMol Antimycin AΦ FRΦ SS/00 1100 1100 110.200 1100 1100 1100 1100 110.1500 1100 1100 1100 1100 110.100 11zusätzlicher ElektronenflußNH 4NO 3200.0500 5 10 15 20Intensität der FR-LEDs in W/m²Abbildung 9.12: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- undammoniumernährten Bohnen bei 5 µMol Antimycin A (2. Aufzucht).76

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEΦ FRΦ SS/0.30.25000 111000 111000 111000 1110.2000 111000 111000 111000 111000 1110.15000 111000 111000 111000 111000 1110.1000 111zusätzlicher Elektronenfluß2. Aufzucht25 µMol Antimycin ANH 4NO 30.0500 5 10 15 20Intensität der FR-LEDs in W/m²Abbildung 9.13: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- undammoniumernährten Bohnen bei 25 µMol Antimycin A (2. Aufzucht).0.30.252. Aufzucht50 µMol Antimycin ANH 4Φ FR/ Φ SS00 1100 1100 1100 110.200 1100 1100 1100 1100 110.1500 1100 1100 1100 1100 110.100 11zusätzlicher ElektronenflußNO 30.0500 5 10 15 20Intensität der FR-LEDs in W/m²Abbildung 9.14: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- undammoniumernährten Bohnen bei 50 µMol Antimycin A (2. Aufzucht).77

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHT0.30.252. Aufzucht100 µMol Antimycin AΦ FR/ Φ SS00 1100 1100 110.200 1100 1100 1100 1100 110.1500 1100 1100 1100 1100 110.100 1100 11zusätzlicher ElektronenflußNH 4NO 30.0500 5 10 15 20Intensität der FR-LEDs in W/m²Abbildung 9.15: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- undammoniumernährten Bohnen bei 100 µMol Antimycin A (2. Aufzucht).0.30.25Intensität der FR-LEDs6.1 W/m²Φ FR / Φ SS0.2000 11101 000 111000 111000 111 Φ FR000 1110.15000 111000 111 Φ SS000 111000 1110.1NH 4NO 30.0500 20 40 60 80 100Konzentration von Antimycin A in µMolAbbildung 9.16: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- undammoniumernährten Bohnen in Abhängigkeit von der Antimycin A-Konzentration.Es wurde über die Messungen der beiden Aufzuchten gemittelt und die Standardabweichungaufgetragen. Intensität der FR-LEDs: 6.1 W/m 2 .78

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE0.30.25Intensität der FR-LEDs10 W/m²0.2000 111000 111000 111000 111 Φ000 111 FR0.15000 111000 111 Φ SS000 11101 000 111Φ FR / Φ SS0.1NH 4NO 30.0500 20 40 60 80 100Konzentration von Antimycin A in µMolAbbildung 9.17: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- undammoniumernährten Bohnen in Abhängigkeit von der Antimycin A-Konzentration.Es wurde über die Messungen der beiden Aufzuchten gemittelt und die Standardabweichungaufgetragen. Intensität der FR-LEDs: 10.0 W/m 2 .0.30.25Intensität der FR-LEDs14 W/m²01 Φ FR / Φ SS0.2000 111000 111000 111000 111 Φ000 111 FR000 1110.15000 111 Φ SS000 111000 1110.1NH 4NO 30.0500 20 40 60 80 100Konzentration von Antimycin A in µMolAbbildung 9.18: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen nitrat- undammoniumernährten Bohnen in Abhängigkeit von der Antimycin A-Konzentration.Es wurde über die Messungen der beiden Aufzuchten gemittelt und die Standardabweichungaufgetragen. Intensität der FR-LEDs: 14.0 W/m 2 .79

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHT9.3.2.4 Vorläufige Schlüsse aus den Messungen mit Antimycin ADie Phänomenologie der in den Abbildungen 9.8 bis 9.18 gezeigten Effekte ist vielfältig undhängt von den zwei Parametern Lichtintensität und Antimycin A-Konzentration ab, so daßes schwerfällt, generelle Schlüsse zur Deutung der Messungen zu ziehen. Folgendes läßt sichdennoch feststellen:• Abbildung 9.7 zeigt, daß unter Normalbedingungen kein signifikanter Unterschied inder FR-Antwort von nitrat- und ammoniumernährten Pflanzen besteht. Dies ist nichtweiter erstaunlich, da beide Ernährungsarten zu gesunden Pflanzen führen, so daß derStoffwechsel unter Normalbedingungen auf gleiche Effektivität eingestellt ist.• unter Streßbedingungen kommen die Unterschiede jedoch zum Tragen. Die Abbildungen9.8 bis 9.18 zeigen, daß bei den nitraternährten Pflanzen durchgehend eine höhereEmpfindlichkeit gegenüber Antimycin A besteht als bei den ammoniumernährten.• bei 5 µMol zeigen ammoniumernährte Pflanzen im Vergleich zur Kontrolle keinen AntimycinA-Effekt und nitraternährte Pflanzen eine Erniedrigung. Inwieweit diese Aussagesignifikant ist, ergibt die Betrachtung der Kontrollmessung. Sie ist der Mittelwertaus den beiden Kontrollmessungen in Abbildung 9.7. Diese mußten herangezogen werden,da es nicht möglich ist, unter den gleichen Bedingungen am selben Blatt mit undohne Inhibitor zu messen. Durch die Einführung der Normierung sollte allerdings dieAuswirkung eventueller Unterschiede zwischen den Blättern weitgehend ausgeschaltetwerden. Dennoch zeigen die Kontrollmessungen in Abbildung 9.7 eine starke Streuung.809.3.2.5 Messungen mit GlyceraldehydGlyceraldehyd (Molekulargewicht: 90,08 g/Mol) inhibiert die Phosphoribulokinase und damitnicht nur die CO 2 -Aufnahme im Calvin-Zyklus, sondern auch die Photorespiration (Stokesund Walker, 1972; Wu et al., 1991).Es lag ebenfalls in kristalliner Form vor. Da es wasserlöslich ist, wurden 90 mg in 100 ml destilliertemWasser gelöst, um eine Konzentration von 10 mMol zu erhalten.Abends wurden die Blätter damit vakuuminfiltriert und über Nacht in ihre jeweiligenNährlösungen gestellt.Die Messung des durch FR-Licht-induzierten zusätzlichen Elektronenflusses (normiert aufden Steady-State-Wert) in Abhängigkeit von der Intensität der FR-LEDs geschah, wie bereitsfür die Antimycin A-Messungen beschrieben, indem nach jeweils 20 minütiger Dunkeladaptiondes Blattes das Einschalten der Regel-LED die Kinetik auslöste. Im Verlauf der Induktionskurvewurde alle 30 s FR-Licht unterschiedlicher Intensitäten (0.7 – 16.0 W/m 2 ) ein- bzw.ausgeschaltet, wobei die Anphase mit dem Beginn der Induktionskurve zusammenfiel. DieMittelwerte dieser Messungen werden in Abbildung 9.19 mit den Mittelwerten der Kontrollmessungverglichen.Auch hier wurde mit der Blitzmethode, die in Abbildung 9.6 dargestellt ist, untersucht, obthermische Deaktivierung beim Zustandekommen des zusätzlichen Flusses eine Rolle spielt.Wie ein Vergleich der beiden Werte Φ ′ MF und Φ′ MRin Tabelle 9.3 zeigt, ist dies auch fürGlyceraldehyd-vergiftete Bohnen auszuschließen. Hier ist, wie bei den Kontrollmessungenund den Messungen an Antimycin A-vergifteten Bohnen, der zusätzliche Elektronenfluß indie ETC der einzige Grund für die beobachtete Zunahme des Flusses nach Einschalten von

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEFR-Licht.Φ M Φ ′ MFΦ ′ MRMittelwert über zehn Messungen 19.0± 0.5 22.5 ± 0.6 22.9 ± 0.6Tabelle 9.3: Mittelwerte und Standardabweichungen von Φ M , Φ ′ MF und Φ′ MRVergiftung in willkürlichen Einheiten.bei Glyceraldehyd-Abbildung 9.19 zeigt, daß die Wirkung von Glyceraldehyd auf die Pflanzen bezüglich derStickstoffernährung genau entgegengesetzt zu Antimycin A ist: die nitraternährten Pflanzen0.40.35NO 3- MessungΦ FR/ Φ SSΦ FR/ Φ SS0.300 1100 1100 1100 110.2500 1100 1100 110.200 1100 1100 1100 110.1500 1100 1100 110.1zusätzlicher Elektronenfluß0.40.3500 110.300 1100 1100 1100 110.2500 1100 1100 110.200 1100 1100 1100 110.1500 1100 1100 110.1zusätzlicher Elektronenfluß0.050.05Kontrollmessung00 5 10 15 20Intensität der FR-LEDs in W/m²mit Glyceraldehydmit GlyceraldehydNH 4KontrollmessungA- MessungB00 5 10 15 20Intensität der FR-LEDs in W/m²Abbildung 9.19: Vergleich der Empfindlichkeit des Elektronenflusses auf FR-Licht zwischen der Kontrollmessungohne Inhibitoren (siehe auch Abbildung 9.7) und der Messung mit Glyceraldehyd(1. Aufzucht). A zeigt die Ergebnisse bei nitraternährten Bohnen, B die Ergebnissebei ammoniumernährten Bohnen. Es wurde jeweils über fünf Messungen anverschiedenen Blättern gemittelt und die Standardabweichung aufgetragen.81

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHTsind fast unempfindlich gegenüber Glyceraldehyd, bei den ammoniumernährten kommt eszu einer Erhöhung der FR-Empfindlichkeit.9.3.3 Einfluß des Steady-State-WertesDurch einen Vergleich der Steady-State-Werte wird nun untersucht, ob sich die Unterschiedezwischen Nitrat- und Ammoniumernährung in ihrer Reaktion auf die Inhibitoren ausschließlichin der Empfindlichkeit auf FR-Licht äußern. Da der zusätzliche Elektronenfluß jeweils aufden Steady-State-Wert ohne FR-Beleuchtung normiert wurde, könnten die Effekte auch in einerVeränderung des Nenners begründet sein.In Tabelle 9.4 werden die Steady-State-Werte der Messungen mit Glyceraldehyd mit denNO − 3 NH + 4Kontrollmessungen 9.42 ± 1.13 11.06 ± 0.70Messungen mit Glyceraldehyd 9.30 ± 0.82 9.71 ± 0.80Tabelle 9.4: Steady-State-Werte (in W/m 2 ) der Kontrollmessungen und der Messungen mit Glyceraldehyd.Es wurde jeweils über die fünf Messungen gemittelt und die Standardabweichung bestimmt.Steady-State-Werten der Kontrollmessungen verglichen. Wie zu erkennen ist, liegen die Unterschiedeim Streubereich. In den beiden Abbildungen 9.20 und 9.21 sind die Steady-State-Werte in Abhängigkeit von der Antimycin A-Konzentration einander gegenübergestellt: essind ebenfalls keine nennenswerten Differenzen zu erkennen. Dies bedeutet, daß allein dasFR-Licht Unterschiede bei nitrat- und ammoniumernährten Bohnen sichtbar macht.20Intensität in W/m²181614121086421. Aufzucht-NO3+NH400 20 40 60 80 100 120Konzentration von Antimycin A in µMolAbbildung 9.20: Vergleich der Steady-State-Werte (in W/m 2 ) in Abhängigkeit von der Antimycin A-Konzentration zwischen nitrat- und ammoniumernährten Bohnen (1. Aufzucht). Eswurde über die neun Steady-State-Werte der betreffenden Messung gemittelt und dieStandardabweichung aufgetragen.82

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE2018162. Aufzucht-NO3Intensität in W/m²1412108642NH4 +00 20 40 60 80 100 120Konzentration von Antimycin A in µMolAbbildung 9.21: Vergleich der Steady-State-Werte (in W/m 2 ) in Abhängigkeit von der Antimycin A-Konzentration zwischen nitrat- und ammoniumernährten Bohnen (2. Aufzucht). Eswurde über die neun Steady-State-Werte der betreffenden Messung gemittelt und dieStandardabweichung aufgetragen.83

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHT9.3.4 Einfluß auf den Φ 0 /Φ M -WertIn Tabelle 9.5 sind die Mittelwerte von Φ 0 und Φ M dargestellt, die sich bei den Kontrollmessungenund den Messungen mit den Inhibitoren (1. Aufzucht) ergaben.Φ M Φ 0 Φ 0 /Φ MKontroll- NO − 3 15.6 ± 1.2 62.4 ± 2.3 4.0 ± 0.3messung NH + 4 19.1 ± 1.5 76.4 ± 2.2 4.0 ± 0.1Messung mit NO − 3 16.3 ± 1.1 75.0 ± 2.9 4.6 ± 0.1Antimycin A NH + 4 17.0 ± 1.7 66.3 ± 3.1 3.9 ± 0.4Messung mit NO − 3 17.6 ± 1.7 68.6 ± 3.3 3.9 ± 0.4Glyceraldehyd NH + 4 20.1 ± 2.3 68.3 ± 2.8 3.4 ± 0.4Tabelle 9.5: Gegenüberstellung von Φ 0 und Φ M (in willkürlichen Einheiten) bei nitrat- und ammoniumernährtenBohnen (1. Aufzucht). Daraus ergab sich der Φ 0 /Φ M -Wert. Es wurde bei denWerten der Kontrollmessung und der Messung mit Glyceraldehyd über die fünf Messungengemittelt und die Standardabweichung bestimmt. Da bei den Werten der Messung mit AntimycinA keine Abhängigkeit von der Konzentration zu erkennen war, wurde ebenfalls überdie vier Messungen gemittelt und die Standardabweichung bestimmt.Interessant ist die Betrachtung des Quotienten Φ 0 /Φ M : bei den Kontrollmessungen tritt keinUnterschied zwischen nitrat- und ammoniumernährten Bohnen auf. Bei den Messungen mitAntimycin A hingegen fällt auf, daß der Φ 0 /Φ M -Wert bei den Nitratpflanzen im Vergleich zurKontrolle größer ist, während er bei den Ammoniumpflanzen im Rahmen der Standardabweichungunverändert bleibt. Glyceraldehyd hat eine entgegengesetzte Wirkung. Hier vermindertsich der Φ 0 /Φ M -Wert bei Ammoniumpflanzen, bei Nitratpflanzen zeigt sich kein Effektdes Giftes auf das Φ 0 /Φ M -Verhältnis. Inwieweit dieses Verhalten mit der FR-Antwort zusammenhängt,wird in Kapitel 12 diskutiert.84

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE9.4 Messungen im Herbst und WinterBei der Betrachtung der oben beschriebenen Effekte von Glyceraldehyd und Antimycin Astellte sich die Frage, wie beide Gifte gemeinsam wirken. Unter der Annahme, daß glyceraldehydvergifteteNH + 4 -Pflanzen verstärkt auf den zyklischen Transport zurückgreifen, wäre dieAuswirkung einer zusätzlichen Antimycin A-Vergiftung hilfreich für die weitere Interpretationder Ergebnisse.Leider konnten die Messungen nicht mehr an den gleichen Pflanzen durchgeführt werden,da zum einen zu diesem Zeitpunkt eine starke Nachfrage sowohl in unserer Arbeitsgruppeherrschte als auch im Institut für Pflanzenernährung und Bodenkunde, das die Pflanzen bereitstellte.Zum anderen können die Pflanzen aufgrund ihres Alterungsprozesses nur eine gewisseZeit für Messungen herangezogen werden. Aus diesem Grund mußten neue Aufzuchtenverwendet werden, was, wie unten gezeigt wird, die Vergleichbarkeit sehr erschwert hat.Die dritte Pflanzenaufzucht im Treibhaus stand im November zur Verfügung. Doch dieseBohnen zeigten sowohl bei Nitrat- als auch bei Ammoniumernährung kaum ein Ansprechenauf FR-Licht. Es war deshalb nicht möglich, sie zu den geplanten Untersuchungen heranzuziehen.Im Januar stand die vierte Pflanzenaufzucht bereit. Die Blätter wurden nach den oben beschriebenenMethoden mit• Antimycin A in einer Konzentration von 10 µMol,• Glyceraldehyd in einer Konzentration von 10 mMol und• beiden Inhibitoren gleichzeitigvorbehandelt.Aufgrund der Zeitbegrenzung der Diplomarbeit wurde bei Antimycin A nur eine Konzentrationeingesetzt, deren Wert nach den Erfahrungen der Sommermessungen gewählt wurde.Die Durchführung der Messungen und die Untersuchung der FR-Antwort und der Steady-State-Werte erfolgte nach dem gleichen Protokoll, wie im Zusammenhang mit den Kontrollmessungenim Sommer beschrieben ist. Es wurde allerdings nur mit einer Intensität derFR-LEDs (15.0 W/m 2 ) gemessen.In den Abbildungen 9.22 und 9.23 sind die Steady-State-Werte dargestellt. Diese zeigen, wieschon bei den Sommerpflanzen, weder aufgrund der Stickstoffernährung noch nach Zugabeder Inhibitoren signifikante Unterschiede.85

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHT1412Intensität in W/m 2108642NO 3-0KontrollmessungMessungmitAntimycin AMessungmitGlyceraldehydMessungmitAntimycin AundGlyceraldehydAbbildung 9.22: Vergleich der Steady-State-Werte der unterschiedlich vorbehandelten Bohnen (Nitraternährung).Es wurde jeweils über vier Messungen an verschiedenen Blättern gemitteltund die Standardabweichung aufgetragen.1412Intensität in W/m 2108642NH 4+0KontrollmessungMessungmitAntimycin AMessungmitGlyceraldehydMessungmitAntimycin AundGlyceraldehydAbbildung 9.23: Vergleich der Steady-State-Werte der unterschiedlich vorbehandelten Bohnen(Ammoniumernährung). Es wurde jeweils über vier Messungen an verschiedenenBlättern gemittelt und die Standardabweichung aufgetragen.86

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEDer im Vergleich zu den Sommerpflanzen andere physiologischen Zustand ist u. a. am vorgegebenenSollwert für das Meßlicht zu erkennen. Um bei den Sommerpflanzen einen Steady-State-Wert von ca. 10 W/m 2 zu erhalten, wurde ein Sollwert von 200 mV eingestellt. Bei denWinterpflanzen konnte für den gleichen Steady-State-Wert nur ein Sollwert von 55 mV vorgegebenwerden. Das bedeutet für diese Winterpflanzen, daß die abgestrahlte Fluoreszenzpro Blattfläche nur 25 % der Fluoreszenz im Sommer betrug.Die unterschiedlichen Φ 0 /Φ M -Werte sind in Tabelle 9.6 dargestellt. Sie scheinen sich wiedie Steady-State-Werte zu verhalten: bei gleichen Steady-State-Werten (im Sommer bei einerSollwertspannung von 200 mV, im Winter bei U= 55 mV) sind auch die Φ 0 /Φ M -Werte imRahmen der Meßgenauigkeit identisch. Bei höheren Sollwertspannungen wird bei den Winterpflanzender Φ 0 /Φ M -Wert deutlich kleiner.Messungen im Sommer Messungen im Winter Messungen im WinterU = 200 mV U = 200 mV U = 55 mVΦ 0 /Φ M 4.0 ± 0.2 2.6 ± 0.4 3.8 ± 0.4Tabelle 9.6: Φ 0 /Φ M -Wert in Abhängigkeit von der Jahreszeit und der vorgegebenen Sollwertspannung.Es wurde über jeweils fünf Messungen an verschiedenen nitraternährten Bohnen gemitteltund die Standardabweichung bestimmt.In den Abbildungen 9.24 und 9.25 ist die FR-Antwort Φ FR , normiert auf den Steady-State-Wert Φ SS , dargestellt, die sich nach unterschiedlicher Vorbehandlung der Bohnen ergab.Im Vergleich zu den Sommerpflanzen zeigen die Winterpflanzen folgendes Verhalten:• die Empfindlichkeit gegenüber FR-Licht unter Kontrollbedingungen beträgt bei denNH + 4 -Pflanzen nur 25 % (normiert auf den Steady-State-Wert) der Empfindlichkeit derNO − 3 -Pflanzen,• gemeinsam ist wieder die weitgehende Unempfindlichkeit der Steady-State-Werte,• NO − 3 -Pflanzen sind nun empfindlicher gegenüber Glyceraldehyd als gegenüber AntimycinA,• NH + 4 -Pflanzen sind gleich empfindlich gegenüber Antimycin A und Glyceraldehyd. 87

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHTΦ FR/ Φ SS0.250.200 1100 1100 1100 1100 110.1500 1100 1100 1100 1100 11 0.100 1100 1100 1100 110.05zusätzlicher ElektronenflußNO 3-0KontrollmessungMessungmitAntimycin AMessungmitGlyceraldehydMessungmitAntimycin AundGlyceraldehydAbbildung 9.24: Darstellung des zusätzlichen Elektronenflusses (normiert auf den Steady-State-Wert)bei nitraternährten Bohnen, die mit Antimycin A, Glyceraldehyd und mit beiden Inhibitorengleichzeitig behandelt wurden. Zum Vergleich ist die Kontrollmessung dargestellt.Es wurde jeweils über vier Messungen an verschiedenen Blättern gemittelt unddie Standardabweichung aufgetragen.Φ FRΦ SSzusätzlicher Elektronenfluß/0.250.200 1100 1100 1100 1100 1100 11 0.1500 1100 1100 1100 1100 11 0.100 1100 1100 1100 1100 110.05NH 4+0KontrollmessungMessung mitAntimycin AMessung mitGlyceraldehydMessung mitAntimycin AundGlyceraldehydAbbildung 9.25: Darstellung des zusätzlichen Elektronenflusses (normiert auf den Steady-State-Wert)bei ammoniumernährten Bohnen, die mit Antimycin A, Glyceraldehyd und mit beidenInhibitoren gleichzeitig behandelt wurden. Zum Vergleich ist die Kontrollmessungdargestellt. Es wurde jeweils über vier Messungen an verschiedenen Blättern gemitteltund die Standardabweichung aufgetragen.88

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE5000 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 11Φ in relativen EinheitenΦ in relativen Einheitenin willkürlichen EinheitenΦ00 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 11Φ in willkürlichen Einheiten40302010A00 5 10 15 20 25 305040302010B00 5 10 15 20 25 30Zeit in sAbbildung 9.26: Typische Induktionskurve einer nitraternährten (A) bzw. ammoniumernährten (B)Sommerpflanze. Die vorgegebene Sollwertspannung betrug 200 mV.Um obige Ergebnisse besser einschätzen zu können, werden die Induktionskurven derSommer- und Wintermessungen näher untersucht (Abbildungen 9.26 und 9.27).Auch hieran ist zu erkennen, daß der physiologische Zustand der Winterpflanzen andersist. Bei den Nitratpflanzen kommt dies nicht ganz so drastisch zum Vorschein. Es verlangsamtsich hauptsächlich die Zeitskala, während die Dynamik des zweiten Maximums ähnlichausgeprägt ist wie im Sommer. Die Ammoniumpflanzen zeigen hingegen eine völlig andereKautsky-Kurve. Das zweite Maximum fehlt, und die Flußerhöhung nach dem Minimum istsehr schleichend.Bei diesem Ausgangsmaterial ist eine Fortführung der Fragestellung der Sommermessungnicht möglich. Dennoch lassen diese Messungen einige Schlüsse zu. Was zuerst auffällt, istdie sehr viel geringere FR-Antwort bei Ammoniumpflanzen und der gleichzeitige Wegfall deszweiten Maximums in der Induktionskurve. Die Ursachen dieses zweiten Maximums sindnoch weitgehend unbekannt. Daß bei den Ammoniumpflanzen der Fortfall des zweiten Maximumsmit der geringen FR-Empfindlichkeit zusammenfällt, ist ein Hinweis auf die Rolle89

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM FERNROTEN LICHT38003600Φ in relativen Einheiten Φ in relativen EinheitenΦ in willkürlichen EinheitenΦ in willkürlichen Einheiten00 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 113400320030002800260024002200A20000 5 10 15 20 25 3038003600340032003000280026002400220020000 5 10 15 20 25 30BZeit in sAbbildung 9.27: Typische Induktionskurve einer nitraternährten (A) bzw. ammoniumernährten (B)Winterpflanze. Die vorgegebene Sollwertspannung betrug 55 mV.der PS I-Aktivität bei seinem Zustandekommen.Eine Diskussion der Inhibitorwirkung ist bei den Ammoniumpflanzen in Anbetracht der unklarenphysiologischen Situation nicht sinnvoll.Bei den Nitratpflanzen hingegen sind die Prozesse, die die Ursache für das zweite Maximumsind, noch aktiv, wenn auch langsamer. Was auffällt, ist die geringe Antimycin A-Empfindlichkeit in Abbildung 9.24. Möglicherweise spielt bei diesen Pflanzen der zyklischeElektronentransport keine große Rolle, eher scheint bei ihnen die Wirkung von Glyceraldehydauf den Calvin-Zyklus von größerer Bedeutung zu sein. Dennoch ist der Zustand derNitrat-Winter-Pflanzen nicht mit dem Zustand der Ammonium-Sommer-Pflanzen zu vergleichen,da die Wirkung von Glyceraldehyd eine Schwächung anstelle einer Stimulierungdes FR-Effektes mit sich bringt.Obige Ergebnisse zeigen, daß die Winter- und Sommerpflanzen sehr verschiedene Stoffwechselwegegehen. In gewisser Weise zeichnete sich dieser Trend schon beim Übergang von der1. Aufzucht (August) zur 2. (September) ab.Eine umfassende Diskussion der Ergebnisse erfolgt in Kapitel 12.90

Kapitel 10Messungen mit zusätzlichem blauenLichtDas Absorptionspektrum von Chlorophyll a besitzt zwei ausgeprägte Maxima im blauen(450 nm) und roten (680 nm) Spektralbereich (Abschnitt 3.1). Blaues Licht hat die gleicheWirkung wie rotes, da der vom blauen Licht angeregte S 2 -Zustand nach 10 −15 s in den S 1 -Zustand zurückspringt. Da hier ein Licht benutzt werden soll, das durch optische Filter gutvom FR-Licht zu trennen ist, wird blaues für das langsam geschaltete Zusatzlicht benutzt.Weil blaues Licht wie normales rotes Licht beide Photosysteme anregt, bietet es dieMöglichkeit zu untersuchen, wie die Wirkung der beiden Photosysteme auf den Redoxzustandvon Q A ausbalanciert ist. Theoretisch könnte blaues Licht sowohl eine Verringerungdes Flusses (Reduktion durch PS II) als auch eine Stimulierung (Oxidation durch PS I) erzeugen.Ein solches Umklappen der Wirkung haben Hansen et al. (1991) beschrieben. Die Entwicklungdieser Balance während der Induktionskurve und ihre Störung durch FR-Licht, dasnur auf PS I wirkt, soll im folgenden zeigen, ob das FR-Licht über die Redoxzustände zwischenden Systemen oder auf den LHC-Regler wirkt. Mit Hilfe dieser Messungen sollte Einblick indie Rolle des FR-Lichtes bei den Messungen des vorherigen Kapitels gewonnen werden.Wenn Blaulicht eine Schwächung des FC-Flusses bewirkt, hätte es eine genau entgegengesetzteWirkung zum FR-Licht, das den Exzitonenfluß erhöht.Zur experimentellen Überprüfung obiger Überlegungen wurde der Leuchtdiodenkopf umvier LEDs (Oshino, OL-ESB44510, λ max = 450 nm) erweitert. Die Ansteuerung ist analog zurFR-Ansteuerung (Abschnitt 9.1).Zuerst wurde die Wirkung des blauen Lichtes auf die FC-Messungen untersucht. Dazu löstenach 20 minütiger Dunkeladaption des Bohnenblattes das Einschalten der Regel-LED die Induktionskinetikaus, in deren Verlauf alle 20 s die vier blauen LEDs ein- bzw. ausgeschaltetwurden, wobei die Anphase mit dem Beginn der Induktionskurve zusammenfiel. Abbildung10.1 zeigt das Ergebnis dieser Messung: der Exzitonenfluß wird geringer, sobald blaues Lichtzugeschaltet ist. Bemerkenswert ist, daß sich die Antwort auf dieses Licht während der Induktionskurveverändert. Erstens wird der Unterschied zwischen der Aus- und der Anphasekleiner, zweitens ändert sich die Form: sie geht von einem einphasigen in einen zweiphasigenVerlauf über.Als eine Erklärungsmöglichkeit für das im Verlauf der Induktionskurve immer geringere Ansprechendes Blattes auf das zusätzliche Lichtangebot käme die Wirkung des Lichtverteilungsreglersin Frage.91

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM BLAUEN LICHT42004000Φ in willkürlichen Einheiten38003600340032003000000 111001101000 111 2800 00 110101010101blauanblauaus0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240Zeit in sAbbildung 10.1: Induktionskurve mit zusätzlichem blauen Licht, das alle 20 s ein- bzw. ausgeschaltetwurde. Das Zuschalten des blauen Lichtes ist am geringeren Exzitonenfluß Φ ausPS II zu erkennen. Die Form und Höhe der Antwort auf das blaue Licht verändert sichim Laufe der Induktionskurve. Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die Ordinate gespreiztdargestellt. Intensität der Regel-LED: ca. 10 W/m 2 im Steady-State. Intensitätder vier blauen LEDs: 6,4 W/m 2 .10.1 Überprüfung der LichtverteilungstheorieDie LHCs, bewegliche Antennenkomplexe, können zwischen den Photosystemen PS II undPS I wandern, um die Anregung von PS II und PS I aufeinander abzustimmen. Dieser Ausgleichfindet nach ca. drei Minuten (Dau und Canaani, 1990) statt, was mit den hier durchgeführtenMessungen übereinstimmt. FR-Licht ist in der Lage, die LHC-Komplexe wieder“zurückzuschieben”, d. h. den Ausgangszustand vor der Messung wiederherzustellen. Wirddeshalb nach Aufnahme einer Induktionskurve mit der oben beschriebenen Methode dasBlatt ca. vier Minuten lang mit FR-Licht bestrahlt und erneut eine Messung durchgeführt,so müßte sich das anfängliche Verhalten der Induktionskurve wieder einstellen lassen (Abb.10.2 B). Um die Wirkung des FR-Lichtes abschätzen zu können, wurde in einer anderen Meßreihedas Blatt zwischen zwei Messungen nicht mit FR-Licht bestrahlt, sondern vier Minutenlang dunkeladaptiert (Abb. 10.2 A).Die Abbildungen 10.2 A und B zeigen, daß eine teilweise Rückkehr zum Anfangszustand eintritt,die aber nicht vollständig ist, so daß die Frage nach der Beteiligung des LHC nicht eindeutigbeantwortet werden kann.Unter der Annahme, daß der LHC-Regler bei den beobachteten Effekten eine Rolle spielt,wäre die Zeit von vier Minuten für einen vollständigen Rückgang nicht ausreichend. Die Tatsache,daß das Minimum der Induktionskurve in den Abbildungen 10.2 A und B nicht so tiefwie bei der ersten Messung in Abbildung 10.1 liegt, müßte auch mit der Wirkung des LHC-Reglers erklärt werden. Das ist möglich, weil die Saugwirkung des LHC-unterstützten PS Ieine zu starke Reduktion von Q A verhindert.Gegen die LHC-Hypothese spricht, daß es keinen Unterschied macht, ob das Blatt zwischenzwei Messungen dunkeladaptiert (Abb. 10.2 A) oder mit FR-Licht bestrahlt wird (Abb. 10.2 B).92

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE42004000Φ in willkürlichen Einheiten38003600340032003000blauanblauaus000 111000 1112800000 111 000 111 A0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 24042004000Φ in willkürlichen Einheiten38003600340032003000000 111000 1112800000 111 000 111blauanblauausB0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240Zeit in sAbbildung 10.2: Zwei Induktionskurven mit zusätzlichem blauen Licht, das alle 20 s ein- bzw. ausgeschaltetwurde. Die beiden Messungen fanden jeweils vier Minuten nach einer erstenMessung (Abb. 10.1) statt. Während dieser vier Minuten wurde das Blatt dunkeladaptiert(A) oder mit FR-Licht bestrahlt (B). Die Antworten auf das blaue Licht erholen sichnicht, unabhängig davon, ob das Blatt vorher dunkeladaptiert (A) oder mit FR-Licht(B) bestrahlt wurde. Auch hier wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit die Ordinategespreizt dargestellt. Intensität der Regel-LED: ca. 10 W/m 2 im Steady-State. Intensitätder vier blauen LEDs: 6,4 W/m 2 . Intensität der beiden FR-LEDs: 10 W/m 2 .Abbildung 10.2 B zeigt sogar eine geringere Rückstellung. Die FR-Bestrahlung hätte die LHC-Rückführung zu PS II beschleunigen sollen, gerade wenn argumentiert wird, daß vier Minutenzu kurz für die Rückstellung des LHC waren.Es ist also anzunehmen, daß andere Gedächtniseffekte vorliegen. Bei den Abbildungen 7.3und 7.4 war schon einmal von einem solchen Erinnerungseffekt gesprochen worden. Effektedieser Art oder eine nachbleibende Stimulierung der Enzyme des Calvin-Zyklus können auchhier in Frage kommen. Ehe diese Diskussion weiter verfolgt wird, soll eine neue Meßreihe be-93

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM BLAUEN LICHTtrachtet werden.10.2 FR-Wirkung auf die BlaulichtmodulationIn der Messung in Abbildung 10.3 wurde 16 Minuten lang eine Induktionskurve aufgenommen,in deren Verlauf wieder alle 20 s blaues Licht ein- bzw. ausgeschaltet, das FR-Licht jedochwährend der Messung zweimal für drei bzw. vier Minuten zugeschaltet wurde.42004000blauausblauanΦ in willkürlichen Einheiten380036003400FR FR FRan ausan3200000 11100 11000 11100 111 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16Zeit in minAbbildung 10.3: Eine Induktionskurve, in deren Verlauf alle 20 s blaues Licht ein- bzw. ausgeschaltetwurde. Zusätzlich wurde das Blatt zweimal 3 bzw. 4 Minuten lang mit FR-Lichtbestrahlt. Auch hier wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit die Ordinate gespreiztdargestellt. Intensität der Regel-LED: ca. 10 W/m 2 im Steady-State. Intensität der vierblauen LEDs: 6,4 W/m 2 . Intensität der beiden FR-LEDs: 10 W/m 2 .Die Ergebnisse der Messung lassen folgende Schlüsse zu:1. Das FR-Licht wirkt auf die blau-induzierte Yieldflußmodulation in weniger als 30 s, alsoviel schneller, als sich der LHC-Regler einstellen könnte. Damit dürften andere Effekteeine größere Rolle spielen.2. Das FR-Licht erhöht den Fluß aus PS II, wie aus den Untersuchungen in Kapitel9 bekannt ist. Neu ist die Erkenntnis, daß damit die Empfindlichkeit des Q A -Redoxzustandes gegenüber blauem Licht – zu erkennen an der Rechteckmodulation,die während der FR-Beleuchtung auftritt – wieder steigt.Die Ergebnisse können wie folgt gedeutet werden: im stationären Fall, ohne zusätzliches FR-Licht, sind die Transportraten in PS I und PS II (fast) aufeinander abgeglichen. Eine Erhöhung94

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEder Intensität des blauen Lichtes gibt in beiden Systemen die gleiche Transporterhöhung, daPS I von Q A soviel absaugt wie PS II nachliefert. Es kommt deshalb nur zu einer geringenÄnderung des PS II-Redoxzustandes. Ein Hinweis hierauf ist der kleine Overshoot bei denAntworten auf Blaulicht ohne zusätzliche FR-Beleuchtung. Die Saugwirkung von PS I wirdüber den Plastoquinon-Pool (Abb. 2.3) kurz verzögert, so daß Q A im ersten Moment etwasstärker reduziert wird. Der leichte Anstieg danach ist wahrscheinlich auf die zunehmendeReduktion der PS I-Akzeptoren zurückzuführen.Dieses Gleichgewicht kann aus verschiedenen Gründen gestört sein:1. Am Beginn der Induktionskurve: die Enzyme des Calvin-Zyklus sind noch nicht aktiviertund der pH-Gradient ist noch nicht groß genug für eine ausreichende ATP-Versorgung.PS I hat keine genügende Anzahl an Akzeptoren und kann die Kompensation eineserhöhten PS II-Flusses nicht leisten. Es kommt zu den großen Blau-Antworten am Beginnder Induktionskurve, die jedoch mit dem Anfahren des Calvin-Zyklus kleiner werden,wenn FR-Licht eingestrahlt wird.2. Im stationären Bereich: die Stimulation des Gesamtflusses durch FR-Licht (Anhebungder gesamten Mittellinie) zeigt, das die PS I-Akzeptoren zahlreich genug sind, um einehöhere PS I-Aktivität durch zusätzliches PS I-Licht zuzulassen. Es fällt allerdings auf,daß die Antworten im FR-Bereich gegen eine unsichtbare obere Linie zu stoßen scheinen.Diese ist wahrscheinlich durch die maximale Kapazität der PS I-Akzeptoren gegeben.Ist dies richtig, kann PS I in Anwesenheit des FR-Lichtes durch Blau-Licht nicht weiter stimuliertwerden. Deshalb ist die Balance zwischen PS II und PS I gestört. Es kommt wiederzu größeren Redoxänderungen an Q A , so daß die Blaulichtmodulation erneut großeÄnderungen im Flußyield bewirkt.Wichtig für die FR-Untersuchungen ist, daß Blaulicht in der Tat den entgegengesetzten Effektvon FR-Licht auf die Yieldflüsse aus der PS II-Antenne hat. Die Störung der PS II/PS I-Balancedurch FR-Licht hängt mit intersystemalen Redoxzuständen und nicht mit der Wirkung derLHCs zusammen.95

MESSUNGEN MIT ZUSÄTZLICHEM BLAUEN LICHT96

Kapitel 11Parallelmessungen von PAS- undFC-MaschineWie in Kapitel 4 beschrieben, war ein Ziel der Entwicklung der FC-Maschine, parallele Messungenvon Elektronenfluß und Sauerstoffentwicklung zu ermöglichen und dadurch dieMehler-Reaktion nachzuweisen.11.1 Die PhotoakustikNeben der Fluoreszenzmeßtechnik ist die Photoakustik eine wichtige Methode, um Aufschlußüber den photosynthetischen Apparat zu bekommen.Hierbei wird ein dunkeladaptiertes Blatt durch einen Lichtpuls von 70 W/m 2 angeregt. MitHilfe eines Mikrophons wird der zeitliche Verlauf der Druckamplitude als Antwort auf diesenLichtpuls gemessen (Abb. 11.1).Das Signal setzt sich aus verschiedenen Komponenten zusammen:• thermisch (th) verursachte Druckänderungen (photothermischer Anteil).Diese werden hauptsächlich durch die Menge der spontan freigesetzten Wärme bestimmt.Sie ist maximal, wenn die moduliert zugeführte Energie nicht photochemischgenutzt werden kann (Kolbowski et al., 1990).• durch Gaswechselvorgänge verursachte Druckänderungen (photobarischer Anteil).Diese Komponente läßt sich noch einmal unterteilen in– eine Gasaufnahmekomponente up (= uptake), die auf die CO 2 -Aufnahmezurückzuführen ist. Dies ist allerdings nicht die CO 2 -Aufnahme durch den Calvin-Zyklus, sondern die Lösung von CO 2 im Stroma bei licht-induzierter Alkalinisierung(Reising, 1994; Reising und Schreiber, 1994).– einen Anteil ev (= evolution), der den bei der Wasserspaltung entwickelten Sauerstoffrepräsentiert (Kolbowski et al., 1990).Die photoakustische Antwort auf einen Lichtblitz war von Kolbowski et al. (1990) mit folgendemAnsatz in die drei Anteile aufgespalten worden:f(t) = k 1 th(t) + k 2 ev(t) + k 3 up(t) (11.1)97

PARALLELMESSUNGEN VON PAS- UND FC-MASCHINEI(t)0P(t)thev0 up35Zeit in msAbbildung 11.1: Schematische Darstellung der Druckantwort P(t) auf einen Lichtimpuls I(t) von 1 msDauer. Hierbei überlagern sich die drei Komponenten th (photothermischer Anteil), ev(Komponente der Sauerstoffentwicklung) und up(Gasaufnahmekomponente).Hierbei ist th der thermische Anteil, ev die Sauerstoffentwicklung und up ein Aufnahmeterm,den Kolbowski et al. (1990) fälschlicherweise für die O 2 -Aufnahme durch die Mehler-Reaktionhielten. Reising (1994, Reising und Schreiber, 1994) fanden die wahre Zuordnung zur CO 2 -Aufnahme.Die gemessenen Druckverläufe nach einem Lichtblitz konnten mit obiger Gleichung gefittetwerden. Um die Koeffizienten k 1 , k 2 , und k 3 zu erhalten, mußten allerdings die Normkurventh, ev und up bekannt sein. Kolbowski et al. (1990) bestimmten diese Kurven mit folgendenMethoden:th wurde bei sättigendem Hintergrundlicht gemessen, wenn der Blitz keine zusätzliche photochemischeAktivität mehr auslösen kann. ev ergab sich nach Vorbeleuchtung und up nachlanger Dunkeladaption.Leider zeigte sich, daß die up-Normkurve nicht formstabil war. Sie veränderte sich mit demCO 2 -Gehalt (Reising, 1994). Aus diesem Grunde wurden Fits dieser Art in der Arbeitsgruppevon Schreiber nicht mehr durchgeführt.Tabrizi (1997) führte einen Spreizungsfaktor a für die up-Normkurve ein, der im Fit mitbestimmtwurde:f(t) = k 1 th(t) + k 2 ev(t) + k 3 up(at) (11.2)Dadurch war es wieder möglich, gemessene photoakustische Blitzantworten quantitativ auszuwertenund in die drei Komponenten th, ev und up aufzuspalten.Weiterhin wurde die Normkurvengewinnung modifiziert: die ev-Kurve ergibt sich in CO 2 -freier Luft, die up-Kurve unter sättigenden (6%) CO 2 -Konzentrationen (Tabrizi, 1997).Um die zeitliche Entwicklung dieser drei Größen während der gesamten Induktionskurve zuerhalten, werden die Lichtpulse (Dauer: 1 ms) alle 35 ms wiederholt. Es werden 200 Antwortenüber 6.6 ms gemittelt, um die statistische Sicherheit zu erhöhen. Dann erfolgt aus der98

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEgemittelten Kurve mit Hilfe vorher aufgenommener Normkurven die Bestimmung der Koeffizientenk 1 , k 2 und k 3 als Maß für die jeweiligen Anteile durch einen Fit. k 2 ist die Größe, diein den folgenden Abbildungen als Sauerstofffluß aufgetragen ist.Inwieweit der Verlauf der Sauerstoffentwicklung (k 2 ) mit dem des Elektronenflusses korrelliert,soll durch eine Parallelmessung mit der FC-Maschine untersucht werden.11.2 Änderungen an der FC-MaschineBei den bisherigen Messungen wurde auf ein symmetrisches Rechteck-Signal von 200 Hz geregelt.Für die Parallelmessungen mit der PAS-Maschine mußte die Hellphase ca. 1 ms, dieDunkelphase ca. 34 ms dauern. Da die PAS-Maschine zur Messung einen 1 ms-Lichtpuls konstanterIntensität benötigt, konnten nicht beide Maschinen zusammen in einer Phase messen.Folglich wurden PAS- und FC-Maschine alternierend geschaltet (Abb. 11.2). Die langeDunkelphase nach der Regelphase der FC-Maschine ist nötig, damit sich das Blatt für diedarauffolgende Photoakustikmessung regeneriert.Für die Simultanmessung mit der PAS-Maschine sollte das Originalkonzept der FC-MaschineI(t)RegelphasederFC-MaschineZeit/msI(t)MeßphasederPAS-Maschine0 32.8 65.6Zeit/msAbbildung 11.2: Die PAS- und die FC-Maschine messen alternierend in Zeitintervallen von 32.8 ms. DieLichtpulse haben eine Dauer von 1.3 ms.möglichst wenig geändert werden. Bei der bestehenden Takt-Platine (Abb. 5.9) wurden dieFlipflops des Rechtecksignals mit 200 Hz angesteuert, indem aus dem Dezimalzähler IC2 der5. und der 0. Takt zum Setzen und Rücksetzen diente. Dazu mußte dieser Zähler mit 1953 Hzgesteuert werden. Um den Takt 5 und 0 weiterhin zum Setzen und Rücksetzen zu benutzen,wählt der Jumper JP1 eine doppelt so hohe Frequenz (3906 Hz) aus. Damit verkürzt sich die“An”-Zeit des unteren Flipflops in IC3 auf 1.3 ms.Die “Aus”-Phase muß wesentlich länger sein. Sie besteht aus 30.5 ms für die Nachphase derFC-Maschine und aus 32.8 ms für die PAS-Messung. Dazu wird der Dezimalzähler nach demersten Durchlauf für 30.5 ms + 32.8 ms über den Enable-Eingang gesperrt (Abb. 11.4). DieLänge der Sperrzeit bestimmt der zusätzliche Binärzähler IC6 (Abb. 11.3). Er erhält sein Signal99

PARALLELMESSUNGEN VON PAS- UND FC-MASCHINE+5 V14Quarz87 11 MhzDGNDIC1402010P1 Q1Q4Q5Q6Q713 64573Q8Q912Q101514Q11Q12Q1311 3 21RES Q14JP1Clock13572468Jumperblock 1JP 1-2 3906 HzJP 3-4 1953 HzJP 5-6 977 HzJP 7-8 488 HzExt. ClockDGNDSwitchClock OutDGND141315DGNDIC2CLKENARES4017Q0Q1Q2Q3Q4Q5Q6Q7Q8Q9C010 742311 965112IC3 40277S6J3CLK5K4R9S10J13CLK11K12RQ1Q\2Q15Q\14alte HGLncncRegel-LEDac9JP31324DGND76354SJCLKKRQQ\12JP2Verst. Det.a7FR-LEDc7910131112SJCLKKRQ15Q\14neue HGLnc1324a10DGNDIC5 4027PAS OutDGND10P1 Q1Q4Q5Q6Q713 64573Q8Q912Q101514Q11Q12Q1311 3 21RES Q14IC6402012103984563/4 IC7 4011BackplaneAbbildung 11.3: Geänderte Takt-Platine. Mit ihr wird ermöglicht, auf Pulse von 1.3 ms Dauer zu regelnund eine Synchronisation mit der PAS-Maschine herzustellen.ebenfalls aus dem Taktgeber (IC1 und JP1). Der 16-Bitzähler benötigt bei der Clock-Frequenzvon 3906 Hz 32.8 ms, um Ausgang Q8 auf 1 zu setzen, und weitere 32.8 ms, um ihn wieder aufNull zu schalten. Er wird beim Einschalten von Q9 zurückgesetzt.Im Detail ist der Impulsablauf wie folgt: Q9 wird invertiert und über die beiden oberen NAND-Gatter in IC7 mit Ausgang Q0 des Dezimalzählers mit einem logischen AND verknüpft. DerImpuls geht also durch und gibt den Dezimalzähler frei. Ausgang Q1 des Dezimalzählers100

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEIC2DezimalzählerFR-PhaseHGL-RegelungAnphasederRegel-LEDAusgang Q9von IC6QEnablefürIC201 2 3 4 5 6 7ResetfürIC68 9 0Q0 von IC2undQ9 von IC6sperrenIC2Ausgang Q8von IC6Meßphase derPAS-Maschine32.8 ms1.3 ms 1.3 ms32.8 msAbbildung 11.4: Schematische Darstellung der Steuerungssignale auf der Takt-Platine. WeitereErläuterungen im Text.löscht dann den Binärzähler IC6. Das Rücksetzen von Q9 wird noch nicht wirksam, da an Q0inzwischen Null anliegt. Der Dezimalzähler zählt einmal durch und läßt, wie oben beschrieben,über das Flipflop in IC3 zwischen Q5 und Q0 die LED leuchten. Wenn IC2 wieder Q0erreicht, bleibt er stehen, weil jetzt am zweiten NAND-Eingang 5 V anliegen und der Disable-Impuls an IC2 freigegeben wird. Das Erreichen des Q1 von IC2 hat jedoch inzwischen denReset-Eingang von IC6 freigegeben.11.3 Messungen der O 2 - und FC-FlüsseDie folgenden Parallelmessungen von O 2 - und FC-Flüssen wurden in Kooperation mit H. Tabrizidurchgeführt.11.3.1 Nachweis der Mehler-ReaktionDie parallelen Photoakustikmessungen wurden durchgeführt, um die Rolle der Mehler-Reaktion meßtechnisch zu erfassen. Hierbei liegt folgender Ansatz zugrunde: jedes vonPS II abgegebene Elektron erzeugt 1/4 O 2 . Deshalb ist normalerweise zu erwarten, daß O 2 -Entwicklung und Elektronenfluß durch einen konstanten Proportionalitätsfaktor verbundensind. Dies gilt bei zwei PS I-Akzeptoren nicht:• Photorespiration• Mehler-ReaktionBeide Reaktionen fangen einen Teil des an PS II entwickelten Sauerstoffs wieder ein, so daßdie photoakustisch gemessene Druckwelle durch die Sauerstoffentwicklung vermindert wird.101

PARALLELMESSUNGEN VON PAS- UND FC-MASCHINEPhotorespiration tritt erst nach ca. 100 ms auf. Im Gegensatz zur Mehler-Reaktion, bei der dasElektron direkt an den molekularen Sauerstoff abgegeben wird (Hormann et al., 1993), sindauf dem Weg zum Calvin-Zyklus noch Fd und NADPH/H + zwischengeschaltet (Abb. 2.3). Ausdiesem Grund kann die Photorespiration im Zeitraum des Meßintervalls von 32.8 ms nicht erfaßtund deshalb als Ursache der beobachteten Effekte ausgeschlossen werden. Eine ähnlicheArgumentation gilt für das CO 2 , das vom Calvin-Zyklus assimiliert wird. Dieses CO 2 erzeugtebenfalls eine Unterdruckwelle, die aber im Meßintervall von 32.8 ms nicht registriert wird.Die Versuchsdurchführung für die in Abbildung 11.5 gezeigte Kurve war wie folgt: nach einer0.006 0.008000000 1111110.005 0.00600 1100 11elΦ00 1100 110.00400 11Φ /O 200 1100 110011 00110.003 0.002000000000 1111111110.002 0.0001 00 1111100000 11 00 1110 00 11000 11150 100 150 11200 111 000250 3000100 1111100011 00000 111000 111111 000 000 111Zeit in sAbbildung 11.5: Das Verhältnis von Sauerstoffentwicklung Φ O2Messung mit Tabrizi (1997).zu Elektronenfluß Φ el . GemeinsameDunkeladaption von 90 Minuten erzeugte das Einschalten der Regel-LED die Induktionskurve.Vor Beginn der Messung wurde, um einen Einfluß des CO 2 -Gehaltes zu vermeiden (siehenächster Abschnitt), die Kammer mit Luft gespült. Nach Durchführung der Messungenerfolgte nach der in Abschnitt 7.3 beschriebenen Methode mit mehreren Blitzen pro Messungdie Bestimmung der thermischen Deaktivierung. Da die Meßlichtintensität im Steady-State wiederum ca. 10 W/m 2 betrug, kann nach den Erfahrungen aus den Kapiteln 7 (untereKurve in Abbildung 7.3) und 9 (Tabelle 9.1) davon ausgegangen werden, daß der Anteilder thermischen Deaktivierung sehr gering war und sich während der Induktionskurve kaumveränderte.Der so bestimmte Fluß in die thermische Deaktivierung wurde dann von der Induktionskurveabgezogen, so daß für die Berechnung der Kurve in Abbildung 11.5 nur der ElektronenflußΦ el herangezogen wurde. Simultan erfolgte die Messung der Sauerstoffentwicklung. Abbildung11.5 stellt den Quotienten aus Sauerstoffentwicklung und Elektronenfluß dar.In Abbildung 11.5 ist zu sehen, daß der Quotient Φ O2 /Φ el nach Einschalten des Lichtes raschfällt: Φ O2 /Φ el sinkt auf 33 %. Die Netto–Sauerstoffentwicklung nimmt also relativ zum Elektronenflußab. Dies ist der in Abbildung 4.2 vorhergesagte Effekt. Die rasche Abnahme desQuotienten Φ O2 /Φ el entspricht der von Schreiber und Neubauer (1990) vertretenen Auffas-102

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEsung, daß die Mehler-Reaktion nach dem Einschalten von Licht als Starter für einen schnellenAufbau des pH-Gradienten sorgt.11.3.2 Auswirkungen des CO 2 -GehaltesDa die photoakustischen Signale häufig in einer geschlossenen Meßkammer gemessenwurden, in der sich bei Dunkeladaption CO 2 aus der Atmung anreichert, soll hier untersuchtwerden, wie sich die CO 2 -Anreicherung nach Dunkeladaption auf die FC-Messungen auswirkt.Abbildung 11.6 zeigt zwei FC-Messungen an Nitratpflanzen der Septemberaufzucht. DieKurven wurden unter verschiedenen Rahmenbedingungen aufgenommen. Bei Messung Aherrschten Normalbedingungen (Luft). Diese stellten sich ein, nachdem die Meßkammer vorder Messung mit Luft gespült wurde. Bei Messung B befand sich das dunkeladaptierte Blattfür 90 Minuten in der geschlossenen Kammer.Aus den Messungen von Tabrizi (1997) ist bekannt, daß die CO 2 -Konzentration ohne300000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111000 111Φ in relativen EinheitenelΦ in willkürlichen Einheitenel25020015010050Messung unter LuftMessung unter CO 2AB00 50 100 150 200 250 300Zeit in sAbbildung 11.6: FC-Messung des Elektronenflusses Φ el an nitraternährten Bohnenpflanzen der Septemberaufzucht.Messung A fand unter Normalbedingungen, Messung B untererhöhtem CO 2 -Gehalt statt. Es wurde die mit mehreren Blitzen pro Messung bestimmte,thermische Komponente Φ t abgezogen.Luftspülung auf 6% ansteigt. Ähnliche Beobachtungen wurden von Reising und Schreiber(1992) gemacht.Die Versuchsdurchführung war wie bereits oben beschrieben: nach einer Dunkeladaptionvon 90 Minuten erzeugte das Einschalten der Regel-LED (ca. 10 W/m 2 im Steady-State) dieInduktionskurve. Nach Durchführung der Messungen wurde wieder nach der in Abschnitt7.3 beschriebenen Methode mit mehreren Blitzen pro Messung die thermische Deaktivie-103

PARALLELMESSUNGEN VON PAS- UND FC-MASCHINErung bestimmt. Auch hier wurde der so bestimmte Fluß in die thermische Deaktivierungdann von der Induktionskurve abgezogen, so daß die Kurven in Abbildung 11.6 nur denElektronenfluß Φ el darstellen.In Abbildung 11.6 B fällt ein im Vergleich zu Messung A langsamerer Anstieg des Elektronenflussesbei erhöhtem CO 2 -Gehalt auf. Das Phänomen wurde in der Literatur noch nichtbeschrieben. Als Erklärungsmöglichkeit bietet sich an, daß die hohe CO 2 -Konzentration zueiner Ansäuerung des Stromas führt. Dies vermindert die Aktivität der Calvin-Zyklus-Enzymeund verlangsamt dadurch den Elektronenfluß.Im weiteren Verlauf dieses Anstieges verbraucht die verbleibende Aktivität des Calvin-Zyklusdas CO 2 in der Kammer, und die Normalbedingungen stellen sich wieder ein. Deshalberreicht die “CO 2 -Kurve” die “Luft-Kurve” nach ca. 100 s.10411.3.3 Messungen mit zusätzlichem FR-LichtDie Giftmessungen in den vorangegangenen Kapiteln waren im Hinblick auf das Verhaltender Elektronenakzeptoren von PS I bei zusätzlichem FR-Licht durchgeführt worden. Um dieRolle der Mehler-Reaktion bei diesen Vorgängen zu untersuchen, wurden wiederum Messungenmit FR-Licht und den Inhibitoren Antimycin A und Glyceraldehyd durchgeführt.Diese Messungen fanden an nitraternährten Bohnenpflanzen der Januaraufzucht untererhöhtem CO 2 -Gehalt statt, da das Blatt 90 Minuten dunkeladaptiert und die Kammer nichtmit Luft gespült wurde. Das Einschalten der Regel-LED erzeugte dann die Induktionskurve,das FR-Licht (15 W/m 2 ) wurde nach 150 s zugeschaltet. Nach Durchführung der Messungenerfolgte wieder nach der in Kapitel 7.3 beschriebenen Methode mit mehreren Blitzen proMessung die Bestimmung der thermischen Deaktivierung. Diese wurde von der Induktionskurveabgezogen, so daß Abbildung 11.7 nur den Elektronenfluß zeigt.Die Blätter wurden vor den Messungen nach den in Kapitel 9 beschriebenen Methoden mit• Antimycin A in einer Konzentration von 10 µMol,• Glyceraldehyd in einer Konzentration von 10 mMol,• und beiden Inhibitoren gleichzeitigvorbehandelt.Abbildung 11.7 zeigt den Effekt von Antimycin A und Glyceraldehyd auf den Elektronenfluß.Wie bei den Winter-Nitratpflanzen in Abbildung 9.24 führen alle Gifte auf eine Verminderungdes Elektronenflusses.Interessanter ist die Wirkung auf die Sauerstoffentwicklung. In Abbildung 11.8 ist die Giftwirkungviel ausgeprägter als beim Elektronenfluß in Abbildung 11.7. Es ist allerdings zu bedenken,daß die Vorbehandlung mit den Giftstoffen die akustischen Eigenschaften des Blattesgeändert haben kann.Deshalb sollte das Schwergewicht der Auswertung auf der Kurvenform und nicht so sehr aufden Absolutbeträgen liegen. Auch mit dieser Beschränkung fallen einige Erscheinungen auf,besonders bei Betrachtung des Quotienten Φ O2 /Φ el (Abb. 11.9).Für die Untersuchungen dieser Arbeit ist die FR-Antwort wichtig. Hier fällt auf, daß bei Glyceraldehydim Gegensatz zu den Kontrollmessungen und den Messungen mit Antimycin Anach dem Zuschalten von FR-Licht keine Absenkung des Quotienten Φ O2 /Φ el auftritt. In Kapitel12 wird besprochen, daß dies mit der Inhibition des Calvin-Mehler-Komplexes durch

PARALLELMESSUNGEN VON PAS- UND FC-MASCHINE1.61.4Kontrolle00 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 1100 11Φ Ο 2in relativen EinheitenΦ O2in willkürlichen Einheiten1.210.80.60.40.2Antimycin AGlyceraldehydGlyc. +Antimycin A00 50 100 150 200 250 300 350 400Zeit in sAbbildung 11.8: Sauerstoffentwicklung Φ O2 (bestimmt als Koeffizient k 2 in Gleichung 11.2) von nitraternährtenBohnenblätter, die mit unterschiedlichen Inhibitoren (Antimycin A, Glyceraldehydund beiden Inhibitoren gleichzeitig) vorbehandelt wurden. Nach 150 s wurdeFR-Licht von 15.0 W/m 2 zugeschaltet. Die Blätter wurden 90 Minuten in einer geschlossenenKammer dunkeladaptiert, so daß der CO 2 -Gehalt am Anfang der Messungenerhöht war. Es wurde jeweils über acht Messungen gemittelt und die Standardabweichungbestimmt. Gemeinsame Messung mit Tabrizi (1997).106

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE0.00350.003KontrolleΦ O2/ Φ el0.00250.0020.0015Glyceraldehyd0.0010.00050.003500 50 100 150 200 250 300 350 4000.0030.0025Antimycin AΦ O2/ Φ el0.0020.0015Glyc. +Antimycin A0.0010.000500 50 100 150 200 250 300 350 400Zeit in sAbbildung 11.9: Das Verhältnis von Sauerstoffentwicklung Φ O2Messung mit Tabrizi (1997).zu Elektronenfluß Φ el . Gemeinsame107

PARALLELMESSUNGEN VON PAS- UND FC-MASCHINE108

Kapitel 12Diskussion der ErgebnisseDie Diskussion muß davon ausgehen, daß alle Steady-State-Messungen die gleichen Flüsseergeben haben (Abbildungen 9.20, 9.21, 9.22, 9.23 und Tabelle 9.4). Das bedeutet, daß sichdie Pflanzen in der Einwirkungszeit von ca. sieben Stunden (Antimycin A) bzw. 16 Stunden(Glyceraldehyd) mit ihrem Stoffwechsel auf das Gift eingestellt haben. Die Antwort auf FR-Licht zeigt aber, daß diese Einstellung zu verschiedenen Lösungen bei den nitrat- und ammoniumernährtenPflanzen geführt hat. Infolgedessen können die Ergebnisse aus der Literaturüber die Kurzzeitgiftwirkungen an isolierten Chloroplasten (Backhausen et al., 1994)nicht unbedingt übernommen werden. Im Gegensatz zu den Kurzzeitmessungen muß beiden Messungen dieser Arbeit mit umfangreichen Stoffwechselumstellungen gerechnet werden,um eine ungestörte Funktion des Elektronenflusses wiederherzustellen. Denn die mitdem Regellicht induzierten Kurven zeigen, daß die Pflanzen unter Antimycin A- und Glyceraldehydeinwirkungwieder normal arbeiten. Aussagen wie die von Backhausen (1994), daßAntimycin A den zyklischen Elektronentransport unterbindet, aber gleichzeitig den Malatexportstimuliert, sind daher auf die Langzeitmessungen nicht unbedingt übertragbar.12.1 Diskussion der SommermessungenBei den FR-Untersuchungen werden zuerst die Sommermessungen diskutiert, da dort dieEffekte am deutlichsten zu Tage treten. Wichtig ist folgender Befund:• an den Steady-State-Werten sind keine Unterschiede zu erkennen,• Antimycin A senkt die FR-Antwort bei nitraternährten, aber nicht bei ammoniumernährtenPflanzen,• Glyceraldehyd erhöht die FR-Antwort bei ammoniumernährten Pflanzen und läßt sieunverändert bei nitraternährten.Um diese Effekte zu erklären, muß angenommen werden, daß es Akzeptorgruppen an PS Igibt, die freie Aufnahmekapazitäten haben, um den durch FR stimulierten Fluß aufzunehmen,und solche, deren Fluß nur wenig stimulierbar ist.Abbildung 12.1 verdeutlicht die hypothetischen Flußverteilungen unter Normalbedingungen,Antimycin A- oder Glyceraldehydvergiftung für NO − 3 - und NH+ 4 -Pflanzen.Folgende Hypothese soll als Erklärungsvorschlag für die Befunde in dieser Arbeit benutztwerden:109

DISKUSSION DER ERGEBNISSENORMALBEDINGUNG ANTIMYCIN A GLYCERALDEHYDNO 3-AZNECBNECCZNEMMMNH +4DZECEECFZEMMMAbbildung 12.1: Hypothese der Stoffwechselumstellung bei ammonium- bzw. nitraternährten Sommerpflanzennach Zugabe der Inhibitoren Antimycin A und Glyceraldehyd. DieAbkürzungen bedeuten: Z: zyklischer Elektronentransport, C: Calvin-Zyklus, N: Nitratreduktase,E: Export=Malatventil, M: Mehler-Reaktion. Die Dicke der Striche deutet dieAusprägung des jeweiligen Prozesses an.• zyklischer Elektronentransport, Stickstoffassimilation und Malatexport (Z, N und E inAbbildung 12.1) bilden eine durch FR-stimulierbare Gruppe (Gruppe 1),• Calvin-Zyklus und Mehler-Reaktion (C und M in Abbildung 12.1) bilden eine schwachstimulierbare Gruppe (Gruppe 2).Eine weiter Annahme für die Sommerpflanzen ist:• unter Normalbedingungen dominiert bei Nitratpflanzen Gruppe 1 (Abbildung 12.1 A),bei Ammoniumpflanzen Gruppe 2 (Abbildung 12.1 D).Die Giftwirkungen lassen sich mit diesen drei Annahmen wie folgt erklären:• Antimycin A blockiert bei Nitratpflanzen den zyklischen Elektronentransport. Das senktdie Aktivität der ersten Gruppe und verlagert sie auf die zweite. Diese ist weniger durchFR-Licht stimulierbar (Abbildung 12.1 B). Dadurch wird die FR-Antwort, wie in den Abbildungen9.8 bis 9.18 gezeigt, vermindert. Bei den Ammoniumpflanzen tritt dieser Effektnicht auf, da hier Gruppe 2 sowieso dominiert (Abbildung 12.1 E) .• Glyceraldehyd verändert wenig bei den NO − 3 –Pflanzen (Abbildung 12.1 C). Es wird zwardie Aktivität des Calvin-Zyklus vermindert, das kann aber durch Z, N und E aufgefangenwerden. Bei NH + 4 -Pflanzen hingegen verschiebt Glyceraldehyd den Stoffwechselvon Gruppe 2 zu Gruppe 1 (Abbildung 12.1 F) . Gruppe 1 besteht allerdings bei NH + 4 -Pflanzen nur aus zyklischem Elektronentransport und Malatexport, da die Stickstoffassimilationhier eine geringe Rolle spielt. Die FR-Empfindlichkeit steigt, wie in Abbildung9.19 gezeigt wurde.110

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEUnsicher an obiger Hypothese ist die Gruppeneinteilung. Sie steht aber in Übereinstimmungmit den Erwartungen: die Nitratassimilation benötigt ATP wie der Calvin-Zyklus, wenn auchin etwas geringerem Maße (Miflin und Lea, 1977; Turpin und Bruce, 1990). Dieser Bedarf kanndurch den zyklischen Weg gedeckt werden. Der Malatexport ist notwendig, weil die StickstoffassimilationKohlenstoffskelette benötigt (Champigny, 1995). Diese werden im Cytosolals Citrat bereitgestellt (Champigny, 1995; Krömer, 1995). Als Triebkraft dienen die über denMalatexport aus den Chloroplasten für die Mitochondrien hergestellen Redoxäquivalente(Krömer, 1995).Damit hängen die drei Stoffwechselwege tatsächlich zusammen. Außerdem kann AntimycinA möglicherweise in dieser Gruppe auch an einer zweiten Stelle, an den Mitochondrien,angreifen. Es ist zwar nicht die externe Bindungstelle für Malat, durch die die mitochondrialeElektronentransportkette blockiert wird, aber im Langzeitversuch ist damit zu rechnen, daßdie Antimycin A-vergifteten Mitochondrien alle noch funktionierenden Mitochondrien fürdie ATP-Bildung von anderen Aufgaben freihalten und damit auch die Citrat-Produktion fürdie Nitratassimilation einstellen.Die Kombination von Calvin-Zyklus und Mehler-Reaktion wird von vielen Autoren angenommen(Schreiber und Neubauer, 1990). Auch die photoakustischen Messungen sprechen dafür,wie weiter unten noch ausgeführt wird. Nun ist zu diskutieren, wie die anderen Befunde dieserArbeit in obiges Schema passen:die Φ 0 - und Φ M -Messungen zeigten einen Anstieg des Φ 0 /Φ M -Wertes bei Antimycin A-vergifteten, nitraternährten Pflanzen (Tabelle 9.5). Nach obiger Hypothese machen die AntimycinA-vergifteten, nitraternährten Pflanzen weniger zyklischen (Gruppe 1) als linearenElektronentransport (Gruppe 2). Im Dunkeln würde der lineare Elektronentransport die Akzeptorenzwischen PS II und PS I aber stärker oxidieren als der zyklische, so daß ein höhererΦ 0 -Wert auftritt.Dementsprechend würde Glyceraldehydvergiftung bei den ammoniumernährten Pflanzeneine Senkung des Φ 0 /Φ M -Wertes verursachen, da hier eine Umstellung vom linearen auf denzyklischen Elektronentransport stattfand. Dies zeigt Tabelle 9.5.Beide Ergebnisse passen also zu obiger Hypothese.12.2 Diskussion der WintermessungenDie Wintermessungen zeigen wesentlich andere Ergebnisse als die Sommermessungen.Wenn jedoch angenommen wird, daß der jahreszeitliche Unterschied darin liegt, daß Gruppe1 auch bei den Winter-Nitratpflanzen schwach ausgeprägt ist, dann läßt sich der geringeAntimycin A-Effekt in Abbildung 9.24 erklären. Glyceraldehyd kann nicht zu einer Stimulationder FR-Antwort wie bei den Ammonium-Sommerpflanzen führen, weil Gruppe 1 fehlt.Stattdessen führt die Blockierung des Calvin-Zyklus zu einer generellen Abnahme an Akzeptorenund damit zu einer Reduktion der FR-Antwort.Bei den Ammoniumpflanzen ist die FR-Stimulierbarkeit sehr gering und der Einfluß der Gifteim Streubereich nicht signifikant. Sie sind deshalb zum Test obiger Hypothese nicht geeignet.Trotzdem könnten die Ergebnisse wie bei den Nitrat-Winterpflanzen erklärt werden.111

DISKUSSION DER ERGEBNISSE12.3 Diskussion der Parallelmessungen von Sauerstoffentwicklungund ElektronenflußNach der oben aufgestellten Hypothese müßte die in Abbildung 11.9 gezeigte Darstellung desΦ O2 /Φ el -Wertes an Nitrat-Winterpflanzen folgende Effekte zeigen:1. Die Stimulierung der Mehler-Reaktion durch FR-Licht bei den Kontrollmessungen paßtweniger ins Bild der Sommerpflanzen. Bei den hier benutzten Winterpflanzen muß miteiner solchen Antwort allerdings gerechnet werden, da , wie bereits diskutiert, bei ihnenGruppe 2 eine größere Rolle spielt.2. Unter Glyceraldehyd ist keine Stimulation der Mehler-Reaktion bei FR-Licht zu beobachten.Dies entspricht der Erwartung, da Gruppe 2 durch Glyceraldehyd blockiertwird.3. Antimycin A hingegen führt zu einer Verlagerung der Restaktivität nach Gruppe 2. Dieerwartete Stimulierung der Mehler-Reaktion ist in Abbildung 11.9 tatsächlich zu sehen.4. Die Wirkung der Kombination von Antimycin A und Glyceraldehyd ist schwer vorherzusagen,da beide Inhibitoren eine entgegengesetzte Wirkung bei der Verlagerung von einerGruppe zur anderen haben. Die Pflanze muß also beide Wirkungen irgendwie kompensieren.Offenbar überwiegt die Wirkung von Antimycin A.Obige Befunde lassen sich also alle mit den eingangs genannten Hypothesen erklären.112

Kapitel 13FazitDie Motivation zur Entwicklung der FC-Maschine ergab sich aus der Rechnung in Kapitel 4:im Gegensatz zu den klassischen Fluoreszenzmessungen hat die FC-Maschine besonders beiFlußvergleichen den Vorteil, daß der Skalierungsfaktor unabhängig von den Parametern k tund k p und damit unabhängig vom Arbeitspunkt ist.Diese Arbeitspunktunabhängigkeit zahlte sich bei den Untersuchungen von FernrotlichtinduziertenFlüssen bei nitrat- und ammoniumernährten Pflanzen aus. Insbesondere abererfüllte sich die Hoffnung, daß der direkte Vergleich von Elektronenfluß und Sauerstoffentwicklungzum Nachweis der Mehler-Reaktion führt.In Abbildung 11.5 ist eine Einkerbung im Verhältnis Φ O2 /Φ el deutlich zu sehen. Dies bedeutetim Rahmen der in Abschnitt 11.3.1 geführten Diskussion, daß die Mehler-Reaktionam Anfang der Induktionskurve tatsächlich eingeschaltet wird, um den pH-Gradienten überder Thylakoidmembran aufzubauen. Auch bei Antimycin A- und Glyceraldehyd-vergiftetenPflanzen entspricht das Verhalten des Quotienten Φ O2 /Φ el dem erwarteten, aber bisher nichtdirekt nachgewiesenen Verhalten der Mehler-Reaktion.Während also bei der Mehler-Reaktion das Ziel der Arbeit erreicht werden konnte, warf dieneue Methode der direkten Flußmessung bei den Untersuchungen zur Flußverteilung an PS Iviele neue Fragen auf. Im wesentlichen entsprach die Wirkung von Antimycin A und Glyceraldehydden Erwartungen. Doch die Tatsache, daß die Messungen unter Normallichtbedingungenkeine ernährungsspezifischen Unterschiede bei den Steady-State-Werten zeigten,wies darauf hin, daß sich während der langen Vergiftungsphase der Stoffwechsel neu eingestellthatte. Ernährungsspezifische Unterschiede traten insbesondere bei den Sommerpflanzennur unter Giftwirkung auf. Es mußte also ein neues Modell gefunden werden.Eine Erklärung der Ergebnisse war nur mit Hilfe einer ad hoc Hypothese möglich. Diese Hypothesebesagte, daß bestimmte Stoffwechselwege im Block umgeschaltet werden. Die Annahme,daß Calvin-Zyklus und Mehler-Reaktion den einen Block und zyklischer Elektronentransport,Malatexport und Nitratassimilation den anderen Block bilden, ist zwar in vielerHinsicht plausibel, aber keineswegs bewiesen.Dieser Problemkreis fordert viele neue Untersuchungen. Die naheliegende Kombination vonAntimycin A- und Glyceraldehydwirkung sollte nachgeholt werden, wenn wieder Sommerpflanzenzur Verfügung stehen. Notwendig erscheint jedoch der simultane Einsatz der Flußmessungenmit der Untersuchung anderer Signale. Ein Anfang wurde in Kapitel 11 mit denphotoakustischen Messungen gemacht. Dies ist weiter zu vertiefen.In dieser Arbeit wurden nur die dynamischen Prozesse betrachtet. Eine intensivereBeschäftigung mit dem Eichungsproblem könnte zur Deutung der Absolutwerte des Φ O2 /Φ el -Verhältnisses beitragen. Auch sollten die photoakustischen Gasflußmessungen noch durch113

FAZITdirekte Bestimmung der Gase mit Hilfe von Clark-Elektroden für O 2 oder mit einem BINOSfür CO 2 überprüft werden. Die Absorption bei 820 nm ist ein Maß des Redoxzustandes vonPS I. Ihn zu untersuchen scheint notwendig, da er möglicherweise den zyklischen Transportmitsteuert.Einige der Wege, wie Nitratassimilation und Malatexport, sind nur auf biochemischem Wegezu erfassen. In dieser Richtung sind Gespräche mit der Arbeitsgruppe Heldt in Göttingengeführt worden.Insgesamt haben die Messungen dieser Arbeit die Komplexität der Flußverteilung an PS I verdeutlichtund gezeigt, daß hier ein Gebiet vorliegt, das zu vielen neuen Forschungsansätzenanregt.114

Kapitel 14ZusammenfassungAufgabe der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung einer verbesserten Version derFluoreszenz-Clamp-Maschine und der Nachweis ihrer Vorteile beim Studium der Photosynthese.Die Grundversion der FC-Maschine war bereits in einer Vorgängerform von Giannikos (1995)entwickelt worden. Hier wurden folgende Verbesserungen eingeführt:• eine neue Art der Hintergrundlicht-Regelung, die das Hintergrundlicht bereits amEingang des Detektors kompensierte und dadurch eine optimale Anpassung derVerstärkung des Regelkreises an den Fluoreszenzyield ermöglichte.• Minimierung der Elemente des Regelkreises zur Verminderung von Phasenverschiebungenund zur Verkürzung der Einstellzeit, so daß Messungen zusammen mit der photoakustischenApparatur möglich wurden.• Einbau eines S&H-Bauteils, um zu verhindern, daß der Regler-OP während der Yielddunkelphasein die negative Sättigung gerät. Dieses Problem hatte die vorherige Versionstark verlangsamt.• Einspeisung des Sollwertes aus dem Computer, was eine bessere zeitliche Synchronisationfür die Messung der thermischen Deaktivierung und die Simultanmessung mit derPAS-Maschine ermöglichte.• Entwicklung einer Taktplatine zur Erzeugung des Meßlichttaktes und der Steuersignalefür verschiedene S&H-Stufen in der FC-Maschine. Die Ableitung der Signale aus einemhochfrequenten Muttergenerator erlaubte die Anpassung des Lichtprogramms anverschiedene Meßprotokolle für die Vorversuche, die FR-Versuche und die photoakustischenMessungen.Weiterhin konnte gezeigt werden, daß neben der Möglichkeit des direkten Flußvergleichesvon Elektronenstrom und Sauerstoffentwicklung ein weiterer Vorteil der FC-Maschine derarbeitspunktunabhängige Skalierungsfaktor ist.Der mit der FC-Maschine erhaltene Exzitonenfluß setzt sich aus dem Fluß in die thermischeDeaktivierung Φ t , dem Elektronenfluß Φ el und dem Fluß in die Fluoreszenz Φ f zusammen.Aufgrund der Wichtigkeit des Abzugs der thermischen Komponente bei den physiologischenMessungen wurden im Rahmen der Vorversuche zwei Verfahren zur Bestimmung der thermischenDeaktivierung einander gegenübergestellt. Bei dem einen der beiden Verfahren wurdenmehrere Blitze während einer Induktionskurve auf das Blatt gegeben, um den Verlauf115

ZUSAMMENFASSUNG116von Φ t (t) zu erhalten. Beim anderen Verfahren erfolgte das Zuschalten von sättigendem Lichtnur zweimal pro Induktionskurve. Da der zweite Blitz bei verschiedenen Messungen zu unterschiedlichenZeitpunkten gesetzt wurde, konnte auch hier der Verlauf von Φ t (t) bestimmtwerden. Es zeigte sich jedoch, daß bei beiden Verfahren langfristige Erinnerungseffekte auftraten,die bewirken, daß der Verlauf von Φ t beim zweiten Verfahren verfälscht wird. Daherist trotz der Gefahr, den photosynthetischen Apparat durch die häufigen Blitze zu stören, dasVerfahren mit mehreren Blitzen zu bevorzugen.Durch die Trennung der beiden Komponenten Φ t und Φ el gelang in Kooperation mit H. Tabrizider lang erwartete, aber bisher noch nicht erfolgte Direkt-Nachweis der Mehler-Reaktion.Diese Reaktion, bei der PS I-Elektronen unmittelbar auf molekularen Sauerstoff gegeben werden,hilft der Pflanze am Anfang der Beleuchtung, schnell einen pH-Gradienten über der Thylakoidmemebranaufzubauen. Die Existenz der Mehler-Reaktion wurde in Parallelmessungender Netto–Sauerstoffentwicklung und des Elektronenflusses sichtbar.Ein weiterer Schwerpunkt für den Einsatz der FC-Maschine war das Studium des Zusammenwirkensder Prozesse an PS I. FR-Licht, das nur PS I anregt, wurde im Verlauf der Induktionskurveperiodisch zugeschaltet und erzeugte im Steady-State einen zusätzlichen Exzitonenflußaus der Antenne von PS II. Mit Hilfe der Sättigungsblitzmethode konnte nachgewiesenwerden, daß dies ein photochemischer Fluß und nicht eine thermische Deaktivierung war.Der zusätzliche Fluß durch FR-Licht erwies sich als ein neuer meßtechnischer Zugang zurVerzweigung der Elektronenflüsse hinter PS I und stand im Zentrum der Messungen.Vergleiche mit Blaulichtmessungen zeigten die Besonderheit der Wirkung des FR-Lichtes aufdie Exzitonenflüsse. Es ergab sich, daß das FR-Licht auf die intersystemalen Redoxzuständewirkt und nicht mit dem LHC-Regler zusammenhängt. Aufgrund dieses Ergebnisses konntedavon ausgegangen werden, daß die FR-Antwort tatsächlich Aufschluß über die Flußverteilungenan PSI gibt.Mit den Inhibitoren Antimycin A und Glyceraldehyd war es möglich, einzelne PS I-Akzeptoren auszuschalten. Die Hauptaufgabe im Rahmen dieser Messungen lag darin zu untersuchen,ob die Stickstoffernährung eine unterschiedliche Wirkung auf die Flußverteilungin die PS I-Akzeptoren hat. Der Nutzen des neuen Meßverfahrens wurde deutlich, als alleMessungen ergaben, daß die Steady-State-Werte der Induktionskurven unter Normallichtbedingungenkeine Unterschiede in Abhängigkeit von Ernährung oder Vergiftung zeigten. Effektetraten erst bei den FR-Antworten auf.Im Sommer reagierten nitraternährte Bohnen mit einer Verringerung der FR-Flüsse auf AntimycinA, das den zyklischen Elektronentransport um PS I schwächt, während die ammoniumernährtenBohnen kaum eine Wirkung zeigten. Glyceraldehyd, das den Calvin-Zyklusinhibiert, erhöhte die Antwort bei ammoniumernährten Pflanzen, hatte aber kaum einenEffekt auf nitraternährte. Dies erfordert eine Hypothese, die die folgenden experimentellenErgebnisse dieser Arbeit erklären muß:• keine Stickstoff-Unterschiede der Steady-State-Werte unter Normallichtbedingungen,• keine Stickstoff-Unterschiede in der FR-Antwort der Sommerpflanzen,• kleinere FR-Antwort bei ammoniumernährten Winterpflanzen,• Antimycin A-Empfindlichkeit der FR-Antwort bei nitraternährten Sommerpflanzen,• Glyceraldehyd-Empfindlichkeit der FR-Antwort bei ammoniumernährten Sommerpflanzen,• Glyceraldehyd-Empfindlichkeit der FR-Antwort bei nitraternährten Winterpflanzen,

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE• FR-Stimulation der Mehler-Reaktion bei Kontrollpflanzen und Antimycin A-vergiftetenNitrat-Winterpflanzen,• keine FR-Stimulation der Mehler-Reaktion bei Glyceraldehyd-vergifteten Nitrat-Winterpflanzen,• größeres Φ 0 /Φ M -Verhältnis bei Antimycin A vergifteten Nitrat-Pflanzen,• kleineres Φ 0 /Φ M -Verhältnis bei Glyceraldehyd vergifteten Ammonium-Pflanzen.Die hier entwickelte Hypothese beeinhaltet, daß es zwei Gruppen von PS I-Akzeptorengibt, die als Gruppe auf die jeweiligen Giftstoffe reagieren. Die eine Gruppe (Gruppe 1) bestehtaus dem zyklischen Elektronentransport, dem Malat-Export und der Nitratassimilation,die andere Gruppe (Gruppe 2) aus der Mehler-Reaktion und dem Calvin-Zyklus. Bei denNitrat-Sommerpflanzen wurde eine stärkere Aktivität der Gruppe 1 angenommen, währenddie Ammonium-Sommerpflanzen die Akzeptoren der Gruppe 2 bevorzugten. Hiermit kanndie bekannte Schutzwirkung der Nitraternährung zusammenhängen, da die stärkere Rolleder Mehler-Reaktion bei ammoniumernährten Pflanzen zur Bildung von aggressiven O −·2 -Radikalen führt.Unter Giftwirkung kam es zu einer Verschiebung der Gruppen, um die jeweiligen Ausfälleder PS I-Akzeptoren zu kompensieren. Leider traten starke jahreszeitliche Schwankungen desphysiologischen Zustandes und damit der PS I-Akzeptoren auf, die die Vergleichbarkeit vonMessungen über lange Zeiträume erschwerten.117

ZUSAMMENFASSUNG118

AnhangSchaltpläne654Φ / Φ0 M32100 50 100 150 200 250set-point voltage/mV119

ANHANG+15 VGND−15 VR135 kΩ23T 4VN0106N51Verst. Det.a7+15 V287S&H 33IN OUT5ADJLOGREFNE5537CH6C 131 µFR 105 kΩR 111 kΩR 1210 kΩ213T 1BC 558BGNDGNDHGLa10C 10220 pFEINGANGIstwertGNDGND3IN OUT5287S&H 2ADJLOGREFNE5537CH6GNDR 910 kΩC 121 µFR 81 kΩGNDGNDR 610 MΩ23*6OP 5CA 3140R 7330 ΩREGEL-LEDac9EINGANGSollwertGND3IN OUT5287S&H 1ADJLOGREFNE5537CH6GNDC 111 µFR 310 kΩR 410 kΩR 2 C 980 kΩ 220 pFR 1*1 MΩ263GNDOP 2OP 37GPR 5330 ΩAusganga4GNDOP 2 S&H 1 OP 57 8 7S&H 2 S&H 38 8+15 VDGNDac1,ac16,ac32C 14100 nFC 16100 nFC 18100 nFC 20100 nFC 22100 nF+5 Vac3,ac18C 15100 nFC 17100 nFC 19100 nFC 21100 nF4 4 4 4 4C 23100 nFGND−15 V+15 V−15 Vac2,ac17ac15,ac31A2: Die Regel-PlatineBackplane120

VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFEAUSGANGIntensitätGNDC 2612 pFGND3IN OUT5287S&H 4ADJLOGREFNE5537CH6GNDC 251 µFR 28330 ΩR 2910 kΩGND32R 3010 kΩ6OP 6CA 3140R 31100 Ω+15 VR 26330 ΩR 27100 kΩR 2510 ΩAnschluß LED-KopfSwitchExt. LevelGNDD 1ZD 2V7GNDR 145 kΩR 152 kΩGND32OP 7OP 37GP6C 24100 pFR 1810 kΩR 192 kΩR 2010 kΩ2GND31T 2BC 517R 2115 ΩSwitchR 16100 ΩR 175 kΩR 22100 ΩR 2327 ΩR 24100 ΩGNDT 3VN0106N5231R 25100 ΩREGEL-LEDac9GNDAusg. REGa4+15 VOP 6 OP 77 7S&H 48+15 VGND−15 VC 27100 nFC 28100 nFC 29100 nFC 30100 nF4 4 4C 31100 nFC 32100 nFGND−15 VGNDac1,ac16,ac32A3: Die LeistungsansteuerungBackplane121

ANHANGAnschluß LED-KopfR 38100 ΩGND+15 VC 330.33 µF35 VD 2ZD 5.6 VR 3550 kΩR 37100 ΩR 324.7 kΩ236OP 8TL 081PR 3682 Ω231T 5BC 557SwitchTestOn/OffR 3422 kΩ231T 6BC 548 BR 334.7 kΩGNDGNDFR-ELD on/offc7+15 VOP 87+15 VGND−15 VC 34100 nFC 35100 nF4GND−15 VGNDac1,ac16,ac32BackplaneA4: Die Ansteuerung der FR-LEDs122

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DanksagungAn erster Stelle möchte ich mich bei Prof. Dr. Hansen für die interessante Aufgabenstellungund die außerordentlich gute Betreuung dieser Arbeit, besonders in der Endphase, bedanken.Mein Dank geht auch an Herrn Schlüter für die technische Unterstützung.Der gesamten Arbeitsgruppe danke ich für das nette, lustige und stets hilfsbereite Arbeitsklima.Ein besonderes Dankeschön geht an Ilka Giannikos für die Einführung in das Thema,Christoph Plieth für seine Hilfe beim Umgang mit den Giftstoffen und Hamed Tabrizi für diegute Zusammenarbeit und die zur Verfügung gestellten Meßergebnisse.Mein ganz besonderer Dank gilt Volker Prüß, dessen Hilfe wesentlich zum technischenGelingen dieser Arbeit beigetragen hat.Ganz herzlich bedanken möchte ich mich bei Astrid Erdmann und dem ”Dr. Chip-Team”Oliver Karschnick und Jörg Lippmann nicht nur für ihre prompte Beratung bei sämtlichenComputerproblemen und das überaus sorgfältige Korrekturlesen, sondern auch für die seelischeAufmunterung in der Endphase.Meinen Eltern danke ich für ihre Unterstützung, die sie mir immer, in jeder Hinsicht gegebenhaben.129

DANKSAGUNG130

Die eidesstattliche Erklärung:Hiermit erkläre ich an Eides Statt, daß ich die vorliegende Diplomarbeit selbständig unterAnleitung meiner akademischen Lehrer angefertigt und dabei nur die genannten Quellen alsHilfsmittel verwendet habe.Kiel,den ................................................................................................................131