Nachweis von Listeria spp. mittels fluoreszenzmarkierter Gensonden

Krumbholz, Lydia et al. (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 161,191-195Nachweis von Listeria spp. mittels fluoreszenzmarkierter GensondenDetection of Listeria spp. by means of fluorescently labelled gene probesLydia KRUMBHOLZ, Rohtraud PICHNER, T. ALBERT, H. WEBER und M. GAREISZusammenfassungListeria monocytogenes gehört zu den wichtigsten Lebensmittelinfektionserregern, für dessenNachweis verschiedene Methoden zur Verfügung stehen. Ziel der vorliegenden Studiewar es, die VIT (vermicon identification technology)-Methode als ein neues, schnelles Verfahrenfür den Nachweis von Listerien in Fleisch und Fleischerzeugnissen zu testen und diebisher für dieses System empfohlene Anreicherungszeit von 48 auf 24 Stunden zu reduzieren.Sowohl mit dem VIT-Verfahren als auch mit der parallel eingesetzten Referenzmethodenach § 35 LMBG wurden in 33 von 50 untersuchten Tupferproben aus einemFleisch verarbeitenden Betrieb Listerien nachgewiesen. Mit der VIT-Methode konnten zudemzwei weitere Proben als L. monocytogenes positiv bestätigt werden. Bei einer hohen Begleitflorawar die mikroskopische Auswertung nach 24-stündiger Anreicherung zum Teilproblematisch, führte aber dennoch zu einem eindeutigen Ergebnis. Nach den bisherigenUntersuchungen steht mit der VIT-Methode ein schnelles und sensitives Nachweisverfahrenfür Listeria spp. und Listeria monocytogenes zur Verfügung.SummaryThere are various detection methods available for Listeria monocytogenes, one of the mostimportant food borne pathogens. The aim of this study was to test VIT (vermiconidentification-technology)as a new rapid method for the detection of Listeria in meat andmeat products and to reduce the required enrichment time for VIT from 48 hours to24 hours. With both, the VIT and the reference method, Listeria positive results were obtainedin 33 out of 50 swab samples from a meat processing company. By use of the VIT itwas possible to detect L. monocytogenes in two further samples. However, the microscopicevaluation after a 24 hours enrichment period is aggravated when high levels of accompanyingflora occur in the swab samples. Nevertheless, the use of VIT as a fast and sensitivedetection method for Listeria spp. and Listeria monocytogenes could be demonstrated in thisstudy.SchlüsselwörterL. monocytogenes – Listeria spp. – VIT – Fluoreszenz – GensondeKey WordsL. monocytogenes – Listeria spp. – VIT – fluorescence – gene probeEinleitungListeria monocytogenes ist ein wichtigerLebensmittelinfektionserreger. Durch dasubiquitäre Vorkommen dieses Keimeskönnen Lebensmittel in allen Bereichender Produktions- und Kühlkette kontaminiertwerden. Listeriose-Erkrankungen desMenschen werden häufig durch den Verzehrkontaminierter Lebensmittel wieRohmilch, aus Rohmilch erzeugte Produkte,Räucherlachs und rohe Fleischerzeugnissehervorgerufen (ANONYM,2000). Zu den typischen Eigenschaftenvon L. monocytogenes zählt ihre Fähigkeit,sich auch bei niedrigen Temperaturen(< 2 °C) und pH-Werten (< 5) zu vermehren,sowie in NaCl-Lösungen bis 16 % einJahr überleben zu können (BAUMGART,2002; WILSON und MILES, 1974).191

Krumbholz, Lydia et al. (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 161Damit kontaminierte Lebensmittel nicht inden Handel gelangen sind schnelle undsichere Nachweismethoden für L. monocytogenesnotwendig. Eine dieser Schnellmethodenist das VIT (vermicon identificationtechnology) System. Es basiert aufder Grundlage der FISH (fluorescence-insitu-hybridisation)Gensondentechnologie(BEIMFOHR, 1993). Bei dieser Methodewerden gezielt spezifische rRNA-Abschnitte einer Bakterienart oder einerganzen Bakteriengruppe mit fluoreszenzmarkiertenGensonden detektiert.(SNAIDR, 2002).STEPHAN (2003) untersuchte mit der VIT-Methode Hackfleisch- und Tupferprobenauf das Vorkommen von Listeria spp. undL. monocytogenes. Er stellte nach 48-stündiger Anreicherung mit diesem Nachweisverfahrenkeine falsch positiven oderfalsch negativen Ergebnisse fest. Alsproblematisch erwies sich jedoch die mikroskopischeDetektion von Listeria spp.bei Vorliegen einer hohen Begleitflorabzw. bei Matrixeffekten der Probe, die eineEigenfluoreszenz besaßen. ÄhnlicheErgebnisse wurden bei einer Studie übervakuumverpackten Räucherlachs erzielt(BECKER, 2002).Ziel dieser Arbeit war es, das VIT-Systemauf die Einsatzmöglichkeit für den Nachweisvon Listerien in Fleisch und Fleischerzeugnissenzu überprüfen und mit dieserMethode Tupferproben und streichfähigeRohwürste aus Fleisch verarbeitendenBetrieben zu untersuchen.Weiterhin sollte die vom Hersteller empfohlene48-stündige zweistufige Anreicherung(Halb-FRASER-Bouillon / FRASER-Boullion) auf eine einstufige 24-stündigeAnreicherung verringert werden.abcMaterial und MethodikBisher wurden Tupferproben aus einemFleisch verarbeitenden Betrieb qualitativauf Listeria spp. und Listeria monocytogenesgetestet. Die Proben wurden sowohlvor als auch nach der Reinigung im Produktionsbereichgezogen. Weiterhin wurdender Sanitärbereich und Handabklatschprobendes Personals überprüft.Abb. 1: Listeria-Nachweis in einer Lebensmittelprobe(Quelle: vermicon AG, München)(a) Bildausschnitt bei Bandbreite 450-490 nm: alleListeria spp. leuchten grün unter dem Epifluoreszenzmikroskop;(b) Ausschnitt wie in a: Listeriamonocytogenes leuchtet bei Bandbreite 546/12nm rot, Listeria spp. nicht; (c) Ausschnitt wie in aund b unter Durchlicht192

Krumbholz, Lydia et al. (2003) Mitteilungsblatt BAFF 42, Nr. 161n = 50§35 VIT33 35 12301447 1PositivegesamtL.monocyt.+ L. spp. positivL.monocyt.gesamtL.spp.gesamtAbb. 3: Vorkommen von Listeria spp. und Listeria monocytogenes in TupferprobenNeben Listerien wurde eine Begleitflora (KbE). In einem Bereich ≤ 10 3 KbE Listerien/mlwar ein schnelles Auffinden (< 1mit variierenden Keimdichten zwischen10 4 und 10 8 KbE/ml nachgewiesen. Die min) der Keime unter dem Mikroskop nichtKeimzahl an Listerien lag bei den positiven möglich (Abb. 4).Proben zwischen 4,0 × 10 2 und 7,0 × 10 8abAbb. 4: L. monocytogenes-Nachweis in einer Tupferprobe aus dem Produktionsbereich vor derReinigung. (a) Bildausschnitt bei Bandbreite 450-490 nm, in der Mitte des Bildes ist eine Listeria spp.erkennbar; (b) identischer Ausschnitt: leuchtet derselbe Keim bei Bandbreite 546/12 nm auch rot,handelt es sich um Listeria monocytogenes.DiskussionDie bisherigen Ergebnisse zeigen, dassmit dem VIT-System Listerien sicher undschnell nachgewiesen werden konnten.Bis zum Vorliegen eines Ergebnisses wurdennach der Anreicherung maximal vierStunden benötigt, wie auch schon beiSTEPHAN (2003) und BECKER (2002) beschrieben.194

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