¨Uberprüfung von Vorhersagen und Ergänzungen zum Markov ...

Überprüfung von Vorhersagen undErgänzungen zum Markov-Modell desAnomalen Molfraktionseffektes in CharaDiplomarbeit derMathematisch-NaturwissenschaftlichenFakultätder Christian-Albrechts-Universitätzu KielIndra Schröder09.09.2003

Inhaltsverzeichnis1 Einleitung 12 Biologische Grundlagen 32.1 Aufbau der Pflanzenzelle und Zellmembranen . . . . . . . . . . . . . . . . 32.2 Stofftransport . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.3 Kanäle und Carrier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.3.1 Kaliumkanäle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.4 Chara Corallina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103 Material und Messmethode 133.1 Die Patch-Clamp-Technik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133.1.1 Meßaufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153.1.2 Differenzverstärker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173.1.3 Maßnahmen zur Rauschreduktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193.1.4 Pipettenziehen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.1.5 Elektroden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.1.6 Vorzeichenkonvention . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213.2 Das Meßobjekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213.2.1 Anzucht der Algen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213.2.2 Der Kaliumkanal in Chara corallina . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223.2.3 Präparation der Vesikel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223.3 Durchführung der Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233.3.1 Testmessung und Stromeichung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233.3.2 Offset-Korrektur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233.3.3 Herstellung des Giga-Seals und Datenaufnahme . . . . . . . . . . . 244 Mathematische Methoden 254.1 Markov-Modelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254.2 Simulation von Zeitreihen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 264.3 Ablauf der Analyse einer Einzelkanalaufzeichnung . . . . . . . . . . . . . . 274.4 Bestimmung von Einzelkanalstrom und Rauschen . . . . . . . . . . . . . . 284.5 Hinkley-Detektor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284.5.1 Sublevel-Hinkley-Detektor (Draber und Schultze, 1994) . . . . . . . 29i

4.5.2 Die Übergangsmatrix als Modellunterscheidungskriterium . . . . . . 304.6 Bestimmung der Ratenkonstanten mit dem direkten Zeitreihenfit . . . . . . 304.6.1 Der HMM-Fit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304.6.2 Zerschneiden der Zeitreihen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 314.6.3 Korrektur der Ratenkonstanten und Bestimmung derStromreduktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324.7 andere Verfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364.7.1 Leveldetektor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364.7.2 Betafit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 364.7.3 Dwell-time/Target-Fit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 375 Effekte durch die schlechte Löslichkeit von TlNO 3 395.1 Meßlösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 395.2 Lösungswechsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405.3 Ionenaktivität und Osmolarität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415.4 Einfluß der Ionenaktivität auf den Einzelkanalstrom . . . . . . . . . . . . . 445.5 Liquid-Junction-Potentiale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455.6 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 486 Der anomale Molfraktionseffekt 496.1 Bisherige Meßergebnisse zum K + /Tl + -AMFE . . . . . . . . . . . . . . . . 506.1.1 Ergebnisse von Hagiwara . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506.1.2 Ergebnisse von Tester . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 516.1.3 Ergebnisse von Keunecke . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 516.1.4 Ergebnisse von Farokhi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 537 Kanalmodelle zum AMFE 557.1 Permeationsmodelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 567.1.1 Das Modell von Hille und Schwarz . . . . . . . . . . . . . . . . . . 567.1.2 Das Wu-Modell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 567.2 Die fünf Gating-Modelle aus Hansen et al. (2003) . . . . . . . . . . . . . . 577.2.1 Modell 1: Direkter Einfluss der Ionenbindung auf das Gating . . . . 587.2.2 Modell 2: Nichtlinearer Effekt der Ionenbindung auf das Gating . . 607.2.3 Modell 3: Modulation des Gatings durch Ionenbindung . . . . . . . 617.2.4 Modell 4: Direkte Wirkung des Foot-in-the-door-Effekts auf die Besetzung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 637.2.5 Modell 5: Modulationseffekt des Foot-in-the-door-Effekts auf die Besetzung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 647.2.6 Zusammenfassung der Modellvorhersagen und Ziel der Diplomarbeit 648 Selektivitätswechsel 678.1 Die Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 678.2 Meßstrategie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67ii

8.3 Meßmethode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 708.4 Scheinbare Selektivitätsänderungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 708.5 Analyse der Stromspannungskurven . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 748.6 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 759 Cytosolische Thalliumeffekte 799.1 Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 799.2 Messungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 809.3 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 839.3.1 Lokalisation der Bindungsstellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 839.3.2 Ein zweiter Tl + -Effekt: Hohe cytosolische Thalliumkonzentration erhöhtdie Leitfähigkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8410 Luminale Thallium-Effekte 8710.1 Motivation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8710.2 Meßergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8710.3 Ratenkonstanten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9010.4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9211 Amplitudenverteilung pro Level 9511.1 Amplitudenhistogramme pro Level als Kontrolle für Leveldetektoren . . . . 9711.2 Unterscheidung verschiedener Markov-Modelle . . . . . . . . . . . . . . . . 10011.2.1 Vergleich verschiedener linearer Modelle . . . . . . . . . . . . . . . 10011.2.2 Vergleich zyklischer und linearer Modelle . . . . . . . . . . . . . . . 10111.3 Sublevel durch schnelles Schalten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10912 Fazit und Ausblick 11113 Zusammenfassung 113Literaturverzeichnis 115iii

Kapitel 1EinleitungDer Ionentransport durch biologische Membranen ist einer der ältesten und zugleich aktuellstenForschungsschwerpunkte der Biophysik. Diese Bedeutung ergibt sich aus der zentralenRolle des Transportes in lebenden Systemen (der Organismus verwendet ∼25% seinerGesamtenergie allein dafür). Der Transport wird durch spezielle Protein-Moleküle, sogenannteKanäle, Pumpen oder Carrier geleistet.Ionenkanäle schalten spontan oder gesteuert durch Liganden (andere Substanzen, die andas Protein binden) oder Potentialänderungen zwischen verschiedenen Aktivitätszuständenhin und her (Gating). Die Kenntnis dieser Schaltprozesse hat Bedeutung auf verschiedenenEbenen: 1. Klassifizierung verschiedener Kanal-Typen. 2. Verständnis der Transportvorgängeund ihrer Steuerung. 3. Gewinnung von Kenndaten zum Test der Vorhersagenaus Molecular-Dynamics-Rechnungen.Punkt 3 gewinnt jetzt besonders an Bedeutung, nachdem es Durell et al. (1998) gelungenist, die von Doyle et al. (1998) aus Röntgenbeugung ermittelte räumliche Struktur einesKaliumkanals aus der Aminosäuresequenz vorherzusagen. Auch die Berechnung der Potentialeim Selektivitätsfilter nur aus der Anordnung der Aminosäurereste durch Bernècheund Roux (2001) haben gezeigt, wie weit die Molecular-Dynamics-Rechnungen inzwischengereift sind. Damit wird es vermutlich bald möglich sein, die Schwingungen des Protein-Komplexes, die zum Gating führen, aus der Kanal-Struktur zu berechnen.Doch Theorien hängen in der Luft, wenn sie nicht experimentell überprüft werdenkönnen. Zum Test der theoretischen Vorhersagen benötigt man eine gute Beschreibung desSchaltverhaltens, und die kann im schnellen Zeitbereich besonders die Kieler Arbeitsgruppeliefern. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich in diesem Sinne mit dem AMFE. DerAMFE (anomaler Molfraktionseffekt: in einer Mischlösung von zwei Ionen ist die scheinbareLeitfähigkeit geringer als in den reinen Lösungen gleicher Gesamtkonzentration) hateine lange Tradition als Prüfstein für Theorien über die Mechanismen, die den Leitungsmechanismuseines biologischen Ionenkanals bestimmen.In Vorgängerarbeiten (Farokhi et al., 2000; Hansen et al., 2003) konnte durch neueeffektive Verfahren mit hoher Zeitauflösung gezeigt werden, dass der AMFE in der GrünalgeChara ein Gating-Effekt ist. Schnelles Schalten zwischen leitenden und nicht-leitendenZuständen täuscht eine Reduzierung des Einzelkanalstroms vor. Der Nachweis des Gatings1

(Unterbrechung eines Stromes von Ionen durch Zeiten der Inaktivität) als Ursache desAMFE enthob die teilweise sehr alten Permeationstheorien (Veränderung der Durchtrittsratedes einzelnen Ions, z.B. Hille und Schwarz, 1978) ihrer bis dahin fast unangefochtenenVormachtstellung. In Hansen et al. (2003) wurde ein neues Gating-Modell für denAMFE vorgeschlagen, das insgesamt 5 Varianten hatte. Diese Varianten bezogen sich aufverschiedene aus der Literatur bereits bekannte Mechanismen oder Modelle der Ion-Kanal-Wechselwirkung.Es ging jetzt also darum, experimentelle Zugänge zu suchen, um die Vorhersagen dereinzelnen Varianten zu überprüfen. Am Anfang der vorliegenden Arbeit ging es um einenEffekt, der aus Untersuchungen von Kiss und Korn (1998) und Kiss et al. (1999) bekanntwar: Während der Inaktivierung nach einer Depolarisation ändert sich der Porenradiusdes Selektivitätsfilters und die Selektivität wechselt derart, dass ein K + -Kanal plötzlichNa + besser durchlässt. Diese Beobachtung, unterstützt durch andere Befunde, dass zumBeispiel in einer K + /Na + -Lösung ein K + -Kanal bei Na + -Überschuss Na + -selektiv und mitwachsendem K + -Anteil wieder K + -selektiv wird, führte zu der Frage, ob beim AMFE inK + /Tl + -Lösung auch ein Selektivitätswechsel vorliegt.Diese Frage war der Ausgangspunkt für Untersuchungen in antisymmetrischen K + /Tl + -Lösungen mit entgegengesetzten Nernstpotentialen für K + und Tl + (Kapitel 8). Im Rahmender jetzigen Analysemöglichkeiten konnte ein Selektivitätswechsel verneint werden. Dafürenthüllten die Messungen aber unerwartete Effekte, nämlich zusätzlich zum bereits genanntenGating-Effekt auch noch zwei Permeationsffekte der Tl + -Wirkung auf den K + -Kanal,die cytosolischen und luminalen Bindungsstellen zugeordnet werden könnten (Kapitel 9und 10). Das Bild des AMFE ist nach dieser Arbeit also komplizierter geworden, klärtaber auch bisher unbeantwortete Fragen aus den früheren Untersuchungen (Farokhi et al.,2000; Keunecke, 1995).2

Kapitel 2Biologische GrundlagenDies ist eine Diplomarbeit in Angewandter Physik und zwar in dem Sinne, daß physikalischeMess- und Analysemethoden auf eine Nachbardisziplin angewandt werden. In der Biophysikdes Membrantransportes ist diese Nachbardisziplin die Biologie. Zum besseren Verständniswerden daher zunächst einige biologische Grundlagen kurz dargestellt.2.1 Aufbau der Pflanzenzelle und ZellmembranenDie Zelle ist die kleinste noch eigenständige Einheit des Lebens. Die einfachsten Zellensind die Prokaryoten, zu denen die Bakterien und die Blaualgen gehören, sie haben wederZellkern noch Organellen. Pflanzen (und auch höhere Algen wie Chara) und Tiere gehörenzu den Eukaryoten, die über einen Zellkern und Organellen als abgetrennte Kompartimentebesonderer Funktion verfügen. Abbildung 2.1 zeigt die schematische Darstellung einerPflanzenzelle. Im Gegensatz zu tierischen Zellen befindet sich außerhalb der Zellmembran(Plasmalemma) eine zellulosehaltige Zellwand, die der Zelle Stabilität verleiht. Der Zellkernenthält die Hauptmenge der DNA; die Chloroplasten (Photosynthese) und die Mitochondrien(Zellatmung) sind für den Energiehaushalt der Zelle zuständig. Proteine, so auchIonenkanäle werden an den Ribosomen gebildet. Die größte Organelle ist die Vakuole, dieetwa 80% des gesamten Zellvolumens einnimmt und als Speicher dient. Die für die vorliegendeArbeit wichtigsten ,,Organe” der Zelle sind die Membranen (Abb. 2.2). Sie dienen derAbgrenzung der einzelnen Kompartimente und der Zelle selbst. Ihre strukturbildenden Bestandteilesind Lipide mit einem hydrophilen Kopf und einem hydrophoben Schwanzteil auszwei Kohlenwasserstoffketten. In wässeriger Lösung bilden sie aufgrund der sogenanntenhydrophoben Wechselwirkung Doppelschichten von 6-10 nm Dicke, so daß die hydrophobenEnden sich in der Mitte in wasserfreier Umgebung befinden. Das Plasmalemma und derTonoplast (die Vakuolenmembran) sind einfache Membranen, Zellkern, Chloroplasten undMitochondrien sind vom Cytosol jeweils durch eine Doppelmembran abgegrenzt, die auszwei Elementarmembranen besteht. Dadurch wird das Prinzip aufrecht erhalten, dass eineeinzelne Membran immer ein cytosolisches (Medium im Zellinneren oder den Organellen)von einem luminalen (Außenmedium oder Vakuolenflüssigkeit) Kompartiment trennt.3

ChloroplastPlasmodesmosCytosolERKernNucleolusZellwandPlasmalemmaVakuoleTonoplastfreieRibosomenMitichondriumGolgi-ApparatAbbildung 2.1: Schematischer Aufbau einer PflanzenzelleAbbildung 2.2: Schematische Darstellung einer Zellmembran mit Zytoskelett und eingelagertenProteinen4

Membranen dienen nicht nur der Abgrenzung, sondern übernehmen vielfältige Aufgaben,z.B. in der Photosynthese und anderen Stoffwechselprozessen und der Signalübermittlung.Hier soll nur ihre Bedeutung für den Ionentransport betrachtet werden: JedeZelle muß für ihr Überleben einen Ionengradienten über der Membran als ,,Arbeitspotential”aufrechterhalten. Dazu ist es notwendig, verschiedene Ionen gezielt und selektiv durchdie Barriere zu schleusen. Reine Lipidmembranen sind extrem gute elektrische Isolatoren,die für Ionen eine nahezu undurchdringliche Diffusionsbarriere darstellen. Der Transportwird daher durch in die Doppelschicht eingelagerte Proteine (Abb 2.2) bewerkstelligt. EineKlassifizierung der verschiedenen Möglichkeiten des Ionentransports findet sich im nachfolgendenAbschnitt.2.2 StofftransportEin Nettofluß von Ionen durch die Membran findet nicht von allein statt. Er benötigt eineantreibende Kraft, beispielweise einen Potentialgradienten oder eine äußere Kraft. EineMöglichkeit, die verschiedenen Transportprozesse zu klassifizieren ist daher die jeweils verwendeteEnergiequelle (Maathuis und Sanders, 1992) oder Triebkraft: a) Passiver Transporter:Er ermöglicht den Transport von Ionen ,,bergab” entlang eines Gradienten. DieEnergiequelle ist die elektrochemische Potentialdifferenz des Ions. b) Pumpen: Sie könnenIonen ,,bergauf” gegen Konzentrations- oder Potentialgradienten transportieren. Die notwendigeEnergie wird aus der Hydrolyse von ATP in ADP gewonnen (ca. 450 meV proMolekül, Heldt, 1999). c) Cotransporter: Sie transportieren eine Ionenart passiv durch dieMembran. Die dabei freiwerdende Energie wird für den Bergauftransport einer anderenIonenart entgegen ihrem Potentialgradienten verwendet. Der Transport beider Ionenartenin die gleiche Richtung wird als Symport bezeichnet, in entgegengesetzter Richtung alsAntiport. Der Gradient für das antreibende Ion wird meist durch Pumpen erzeugt.Als elektrogene Transporter werden solche bezeichnet, die einen Nettofluß von Ladungdurch die Membran erzeugen. Der dabei entstehende elektrische Strom macht den Vorgangphysikalischen Meßmethoden, insbesondere der hier verwendeten Patch-Clamp-Technik(Abschnitt 3.1) zugänglich.2.3 Kanäle und CarrierFür den passiven Transport von Ionen durch die Membran werden Carrier oder Kanälebenötigt. Kanäle können vereinfacht als Pore in der Membran betrachtet werden. Innerhalbder durch ein Protein gebildeten Pore wird dem Ion durch in die Pore gerichtete Carbonylgruppender Peptidbindungen eine Hydrathülle vorgetäuscht, es merkt gar nicht, daß esdas Wasser verlassen hat (Doyle et al., 1998; Zhou et al., 2001). Der Ersatz der Hydrathüllein der freien Lösung durch die Carbonylumgebung im Kanal ist energetisch so günstig, dasskeine nennenswerten Potentialbarrieren auftreten. Dies erklärt, die hohen Transportratender Kanäle, die bei einigen Kanälen 10 8 Ionen pro Sekunde erreichen (Morais-Cabral et al.,5

2001), aber trotzdem hochselektiv sind. Denn ein Na + passt nicht durch einen K + -Kanal,weil seine Hydrathülle eine ganz andere Struktur hat. Die Spezifität der Kanäle drücktsich in charakteristischen Aminosäureresten im Selektivitätsfilter (Abschnitt 2.3.1 aus, diehoch konserviert sind (sich im Laufe der Evolution nicht verändert haben): GYG (Glycin- Tyrosin - Glycin) ist das berühmte Motiv, das man bei allen K + -Kanälen findet.Carrier erreichen lediglich Transportraten von 10 3 -10 4 Ionen pro Sekunde. Sie nehmenjeweils ein Ion in eine Kavität auf, die ähnlich wie der Selektivitätsfilter des Kanals miteinwärtsgerichteten Carbonylgruppen eine Wasserhülle vortäuscht (Morais-Cabral et al.,2001). Da die Carrier selbst lipidlöslich sind, können sie mit dem Ion auf die andere Seiteder Membran diffundieren. Dort geben sie es dann wieder ab.Früher meinte man, dass der reguläre Ionentransport, insbesondere der Cotransportdurch Carrier geschieht, doch inzwischen hat sich gezeigt, dass nicht nur die Ionenkanäle,sondern auch die Cotransporter (Kaback, 1997) feste, membranspannende Proteine sind.Kinetisch allerdings sind die beiden Strukturformen nicht unterscheidbar. Die grundlegendenReaktionen Bindung, Translokation, Entlassen der Ionen und Rückstellung können beiCotransportern beider Modelle durch die gleichen reaktionskinetischen Modelle beschriebenwerden (Sanders et al., 1984). Echte Carrier sind relativ selten. Zu ihnen gehören dieQuinone in der Thylakoidmembran der Chloroplasten und in der inneren Membran derMitochondrien. Sie transportieren Protonen. Carrier für Kalium wie Valinomycin (Adamet al., 1995) werden von Pilzen als biologische Kampfstoffe eingesetzt. Sie werden in derMedizin als Antibiotika benutzt.2.3.1 KaliumkanäleDie frühe Elektrophysiologie beschäftigte sich mit zwei Arten von Kanälen, den K + -Kanälenund den Na + -Kanälen, denn durch ihr Verhalten konnte man den Nervenimpuls erklären(Hodgkin und Huxley, 1952), der damals im Mittelpunkt des Interesses stand. In tierischenZellen halten Kaliumkanäle das Ruhepotential aufrecht, während das kurzzeitige Öffnender Natriumkanäle den Impuls auslöst.Pflanzliche K + -Kanäle haben andere Aufgaben: Ladungsausgleich bei 2H + /1Anion-Kotransport (Keunecke und Hansen, 2000), Osmoregulation (Gradmann, 2001), Bewegungenz.B. bei der Stomata-Bewegung (Hedrich und Schröder, 1989). Die K + -Kanäle sindwegen ihres einfacheren Aufbaus (siehe unten) inzwischen wesentlich besser untersucht alsNa + -Kanäle.Den Einstieg in das Erkennen der Struktur-Funktionsbeziehung brachte die Sequenzierungder Aminosäurekette der Kanalproteine und darauf aufbauend, die Lipophilicity-Plots. Als die Kette der ca. 500 Aminosäurereste bekannt war, wurde eintragen, ob sie fettoderwasserliebend seien. Daraus entstand das Bild der membranspannenden Helices, dieinnen und aussen durch ,,Loops” verbunden waren (Abbildung 2.3).Hierdurch kam es zur ersten Einteilung der K + -Kanäle: Alle K + Kanäle bestehen ausvier gleichen Einheiten. Diese Einheiten (Subunits) können aus 2 oder 6 Helices bestehen.Die K + -Kanäle mit 4x2 Helices sind die sogenannten Einwärtsgleichrichter (KIR, unten inAbb. 2.3), die mit 4x6 Helices die spannungsabhängigen Kanäle (KV, oben in Abb. 2.3).6

Abbildung 2.3: Anordnung der Helices der Subunits von KV- (a) und Kir-Kanälen in derMembran. Die in die Pore hineinragenden P-Loops bilden den Selektivitätsfilter. Beim KV(a) fungiert die positiv geladene S4-Helix als Spannungssensor. Aus: Miller (2000).Figure 1. Standard model for membrane topology of K v channels.The lower cartoon represents an aerial view of the assembled tetramerfrom the extracellular side. The positions of S5, P-loop, andS6, encircled by heavy curve, are modeled to scale from a slicethrough the structure of the KcsA channel at the level of the externallipid headgroups. Helices are represented by circles of 11.8 Å diameter.Unlabeled helices represent hypothetical positions of S1–S4.Abbildung 2.4: Aus: Hong und Miller (2000).7

Dazu gibt es noch einen 1-Helix Kanal, den MinK (Minimaler Kaliumkanal), aber es istfraglich, ob er alleine oder nur zusammen mit anderen funktionstüchtig ist.Von den Loops, die die Helices verbinden, ist der P-Loop (Abb. 2.3) am wichtigsten.Die insgesamt vier P-Loops (einer aus jeder Subunit) sind in die Pore gerichtet und bildenden bereits oben genannte Selektivitätsfilter. Sie tragen auch die für die Selektivitätverantwortliche hochkonservierte Aminosäuresequenz GYG. Abb. 2.4 zeigt für einen 4x6K + -Kanal, wie die Helices sich um die durch die P-Loops gebildete Pore gruppieren (Hongund Miller, 2000).Der große Durchbruch bei der Strukturaufklärung kam 1998 aus der MacKinnon-Gruppe:Es gelang, den KcsA, einen 4x2 Inward Rectifier (KIR) aus einem Bakterium zu kristallisieren(Doyle et al., 1998). Die Röntgenstrukturuntersuchungen an diesem Kanal ergabennicht nur die Struktur, sondern sie enthüllten auch den bereits oben erwähnten Trick derNatur, dass nämlich der Kanal dem Ion eine Wasserhülle vortäuscht. Abb. 2.5A ist eineAufnahme von Kuo et al. (2003) eines bakteriellen KIR Kanals.Abbildung 2.5: Lage der drei Gates im Kaliumkanal. A: Die Struktur des KirBac1.1. DieMembran wird durch die Schattierung symbolisiert. Links: der vollständige Kanal. Rechts:zwei Untereinheiten, oben im Selektivitätsfilter sind drei Kaliumionen zu sehen (Kugeln).Aus: Kuo et al. (2003) B: Schematische Darstellung der drei Gates eines K + -Kanals. 1:inneres Gate. 2: Selektivitätsfilter. 3: Ball and Chain (fehlt im KirBac links). Aus: Zhenget al. (2001)Na + und K + Kanäle haben mehrere Gates, mit denen sie geöffnet oder geschlossen werdenkönnen. Ein Hauptanliegen der vorliegenden Arbeit ist es, einige der im Bereich desAMFE auftretenden Effekte dem einen oder anderen Gate zuzuordnen, also zu entscheiden,ob bestimmte Wechselwirkungen der verwendeten Meßlösungen mit dem Protein extrazellulär,intrazellulär oder in der Pore selbst stattfinden. In Abb. 2.5B sind sie schematischeingezeichnet. Nr 2 ist der Selektivitätsfilter an der Aussen-Seite, Nr. 1 das innere Gate.Nr. 3 nennt sich Ball and Chain. Das innere Gate ist sehr schön auf neuen Röntgenstrukturaufnahmenvon Kuo et al. (2003) (Die Verengung der Pore in der Mitte rechts in Abb.2.5A) zu sehen. Oben rechts in Abb. 2.5A ist zu sehen, wie die in den Kanal hineinragen-8

den Aminosäurereste des Selektivitätsfilters um die Kaliumionen (Kugeln) gruppiert sind.Ball und Chain (im KirBac der Abb. 2.5A nicht vorhanden) wird beim K + -Kanal von denN-Termini der Subunits gebildet. Sie rutschen wie ein Korken in den Kanal (Bentrop et al.,2001). Das innere Gate wird beim KcsA z.B. durch den pH-Wert verändert (Cortes et al.,2001) oder durch Einwirkung auf die großen Einheiten, die unten am KirBac von in Abb.2.5 zu sehen sind.Abbildung 2.6: Das Paddelmodell für die spannungssensitven S4-Einheiten nach Jiang et al.(2003).Bei den spannungsabhängigen Kanälen mit 4x6 Helices ist das innere Gate spannungsgesteuert.Die S4-Helix trägt 4 positive Ladungen (Abb. 2.3). Bis zum Sommer 2003 glaubteman, dass die S4-Helix sich im Feld der Membranspannung dreht (Benzanilla, 2000).Röntgenstrukturuntersuchungen an einem bakteriellen Kanal, wieder in der MacKinnon-Gruppe, brachte dann das überraschende Bild von den S4-Helices als ,,Paddel”, wie inAbb. 2.6 gezeigt. Es bleibt abzuwarten, welches Bild sich durchsetzen wird (Miller, 2003).Der in dieser Arbeit untersuchte Kanal im Tonoplasten von Chara ist wahrscheinlichein Maxi-K-Kanal, auch Big-K oder K(Ca) genannt (Tester, 1988). Der Maxi-K gehörtzu den spannungsabhängigen Kanälen mit 4x6 Helices. Allerdings wird bei dieser Zählungetwas geschummelt. Abb. 2.7 zeigt insgesamt 11 Helices pro Subunit. Sieben davon liegenin der Membran. Durch die zusätzliche Helix S0 gelang der N-Terminus auf die Außenseite.(Moss und Magleby, 2001). Das hat für den Experimentator einen großen Vorteil. Es gibtkeine N-Aktivierung, dass heißt ,,Ball and Chain” liegen auf der falschen Seite und könnenden Kanal nicht verschließen. Das bedeutet, dass der Maxi-K munter vor sich hin schaltetund nicht durch Ball and Chain blockiert wird. Weiterhin hat der Maxi-K 4 Helices,die außerhalb der Membran im Cytosol liegen. An ihnen liegen Bindestellen für Steuersubstanzen,wie z. B. Ca 2+ (Moss und Magleby, 2001). Bindung an diese Helices bewirktKonformationsänderungen, die sich auf die Gates in Abb. 2.5 auswirken.9

Abbildung 2.7: Die 11 Helices der Untereinheit des Maxi-K-Kanals nach Moss und Magleby(2001).2.4 Chara CorallinaFür die Experimente in dieser Arbeit wurde die Grünalge Chara corallina verwendet. Siegehört wie die früher in der Arbeitsgruppe verwendete Nitella flexilis zur Familie derCharaceen. Dieser Name beschreibt ihr charakteristisches Aussehen (Abb. 2.8). Auch diedeutsche Übersetzung, Armleuchteralgen, ist in Gebrauch. Die Süßwasseralgen bevorzugennährstoffarme kalte und stehende Gewässer. Die Internodialzellen dieser Art werden bis zu10 cm lang und 1,2 mm dick, die seitlich abzweigenden Radialzellen sind deutlich kleiner.Da diese Gattung keine Rindenzellen besitzt, ist sie mechanischen Belastungen wie etwaStrömungen gegenüber sehr empfindlich.Wegen ihrer Größe werden die Internodialzellen gerne für elektrophysiologische Experimenteverwendet. Besonders zu Beginn der Elektrophysiologie wurden sie als ,,green axon”benutzt, wenn keine Tintenfischaxone (Die Nervenbahnen mancher Tintenfische sind auchetwa 1 mm dick.) erhältlich waren (Cole und Curtis, 1938, 1939). Die Zellen sind fastvollständig mit der Vakuole angefüllt, die vom Tonoplasten begrenzt ist. Frühere Untersuchungenmit Einstichelektroden (Tester, 1988; Umrath, 1934) oder externen Elektroden(Hansen, 1969) wurden fast ausschließlich am Plasmalemma durchgeführt.Für Patch-Clamp-Messungen ist die Verwendung der Vakuolenmembran allerdings vieleinfacher (siehe Abschnitt 3.2.3).10

Abbildung 2.8: Chara corallina mit Reproduktionsorganen (orange)11

Kapitel 3Material und Messmethode3.1 Die Patch-Clamp-TechnikDie Technik der Patch-Clamp-Messungen wurde von Neher und Sakmann (1976) entwickelt,1991 erhielten sie dafür den Nobelpreis für Medizin. Das Revolutionäre dieserTechnik lag in der Eingrenzung einer so kleinen Membranfläche von ca. 1 µm Durchmesser(patch), dass sie nur einige wenige Ionenkanäle enthielt, zum Teil nur einen. Dies ermöglichtedie Einzelkanalmessung, die zeitaufgelöste Messung des elektrischen Stromes durch eineinzelnes Proteinmolekül. Damit war es erstmals möglich, das Schaltverhalten, den spontanenWechsel zwischen leitenden und nichtleitenden Zuständen direkt messtechnisch zuerfassen. Vorher konnte man nur aus Rauschmessungen indirekt auf dieses Schalten schliessen(Verveen und DeFelice, 1974; Conti und Wanke, 1975). Hinzu kam die Entwicklung einerVerstärkertechnik, die es ermöglichte, die kleinen Ströme im Bereich von einigen pA mithoher Zeitauflösung von 100 bis 300 kHz (Bandbreite des Verstärkers) zu registrieren.Um den Patch elektrisch von seiner Umgebung zu isolieren, muss eine sehr dichte Verbindungzwischen der Zellmembran und dem Rand einer Glaspipette mit einer Öffnung vonetwa 1 µm 2 geschaffen werden. Dazu wird die Pipette auf die Zelloberfläche aufgesetzt. Einleichter Unterdruck bewirkt, dass die Membran etwas in die Pipette hineingezogen wird.Der Abstand zwischen den Lipiden der Membran und dem Glas beträgt dabei weniger als1 nm (Corey und Stevens, 1983). Wasserstoffbrücken, Salzbrücken, Ca 2+ -Brücken und Vander-Waals-Kräftesind verantwortlich für die Dichte des Seals (Abdichtwiderstand zwischenPipette und Zellmembran, Corey und Stevens, 1983; Ophasi und Webb, 1994). Liegt derKriechwiderstand zwischen Glas und Membran im Bereich einiger Gigaohm (idealerweise10 GΩ oder noch größer), so spricht man von einem Gigaseal. Nachdem sich ein solchesGigaseal gebildet hat, kann der Strom für verschiedene Spannungen über der Membran miteinem Patch-Clamp-Verstärker gemessen (voltage clamp) oder bei vorgegebenem Strom dieSpannung bestimmt werden (current clamp).Für Patch-Clamp-Messungen sind vier verschiedene Konfigurationen üblich (Abb. 3.1):Cell-Attached: Die einfachste Methode: Der Kanal wird vollständig in seiner natürlichenUmgebung belassen, Stoffe aus dem Inneren der Zelle (beispielsweise wichtig bei ATP-13

Abbildung 3.1: Die vier Konfigurationen für Patch-Clamp-Messungen. Aus: Hille (1992)aktivierten Transportern) können weiterhin wirken. Nachteile: Das Medium auf dercytosolischen Seite kann nicht verändert werden, außerdem ist das Membranpotentialam Patch nicht genau bekannt, es setzt sich aus äußerer angelegter Spannung unddem Ruhepotential der Zelle zusammen.Inside-Out (auch einfach ,,excised” genannt): Gigaseals sind nicht nur elektrisch, sondernauch mechanisch stabil. Dadurch ist es möglich, durch eine ruckartige Rückwärtsbewegungder Pipette den Patch aus der Zelle herauszureißen, ohne daß das Sealbricht. Die cytosolische Seite der Membran ist nun der Badlösung ausgesetzt (insideout).Sowohl das cytosolische (Bad) als auch das luminale (Pipette) Medium könnenvom Experimentator vorgegeben werden, ebenso wie die über der Membran anliegendeSpannung. In dieser Arbeit wird ausschließlich die inside-out-Konfigurationverwendet.Whole-Cell: In der cell-attached-Konfiguration wird das unter der Pipette liegende Membranstückdurch Anlegen eines größeren Unterdruckes oder eines kurzen Spannungspulsesdurchbrochen. Die Pipette erhält Zugang zum Zellinneren, und es wird nunmehrder durch die gesamte Zellmembran fließende Strom gemessen. Die Pipettenlösungmischt sich mit dem Medium im Inneren der Zelle, so können z.B. Gifteappliziert werden.14

Outside-Out: Von der Whole-cell-Konfiguration ausgehend wird die Pipette zurückgezogen,und mit etwas Glück schließen sich die an der Spitze anhängenden Membranrestewieder.3.1.1 MeßaufbauAbbildung 3.2: Schema des MeßaufbausDer Versuchsaufbau ist eine Weiterentwicklung des Aufbaus von Albertsen (1992), Draber(1994), Blunck (1996) und Sutter (1996). Zur Abschirmung gegen elektrische Störquellenbefindet sich der gesamte Aufbau in einem Faraday-Käfig. Außerdem befinden sich,soweit möglich, alle Netzgeräte außerhalb des Käfigs (Der Patch-Verstärker benötigt leidereinen direkten Netzanschluß, seine Zuleitung wurde möglich kurz gehalten und ist gut abgeschirmtund geerdet.). Zum Schutz gegen Gebäudeschwingungen steht der Aufbau aufeinem luftgelagerten Tisch mit einer Betonplatte. Der Objekttisch und der Vorverstärkerwerden von je einer mit der Grundplatte fest verschraubten Aluminiumsäule getragen,dazwischen steht das inverse Mikroskop (Blickrichtung von unten). In einer Vertiefung imObjekttisch befindet sich das Präparat in der Meßkammer. Von oben kann in einem Winkelvon 45 ◦ mittels einer Zahnradstange, die direkt am Vorverstärker montierte Pipettenelektrodein die Petrischale hineingefahren werden. Zur genauen Positionierung sitzen der Ob-15

jekttisch (x-y) als auch die Halterung des Vorverstärkers (x-y-z) auf je einem Manipulator.Anfangs wurde für den Vorverstärker zusätzlich noch eine hydraulischer Fein-Manipulatorverwendet, der später aber ausgebaut wurde (siehe Abschnitt 3.1.3).Mit einen Schlauch, der über einen Drei-Wege-Hahn mit einer Wassersäule und einemMundstück verbunden ist (im Bild nicht gezeigt), kann an der Pipettenhalterung ein ÜberoderUnterdruck an die Pipette angelegt werden.Über die Badelektrode wird die Kommandospannung vorgegeben und das Meßsignalüber die Pipettenelektrode durch den Vorverstärker in den Patchverstärker geleitet. DasAusgangssignal des im Hauptgerät integrierten Besselfilters (=Tiefpaß) wird dann an einendigitalen Signal-Prozessor (DSP) weitergeleitet (Dalanco, Spry, USA). Dieses Board verfügtüber eine Abtastrate von bis zu 200 kHz (Albertsen, 1992). Die Datenaufnahme durchdas Aufnahmeprogramm ,,Sample”, das den DSP ansteuert, wird per Fernbedienung vomMeßplatz aus gestartet. Um eine On-line-Kontrolle der Messung zu ermöglichen, ist derzweite Ausgang des Patch-Verstärkers mit einem Oszilloskop verbunden.Der Patch-Clamp-VerstärkerAbbildung 3.3: vereinfachtes Schaltprinzip eines Patch-VerstärkersFür die Datenaufnahme steht der integrierende Patch-Clamp-Verstärker Dagan 3900A(DAGAN, Minneapolis, USA) zur Verfügung. Abbildung 3.3 zeigt das allen Patch-Verstärkerngemeinsame Schaltprinzip: Die erste Verstärkerstufe (OPA) hält die Membran aufvorgegebener Spannung (U soll , Voltage Clamp = Spannungsklemme) und mißt gleichzeitigden durch den Patch fließenden Strom. (Genauer: Der Strom, der zur Aufrechterhaltungder Membranspannung nötig ist (Punkt 1), fließt wegen des sehr großen Eingangswiderstandesdes OPs durch den Rückkopplungswiderstand R f und kann dort als Spannungsabfall(Punkt 2) gemessen werden.) In einer weiteren Stufe wird die Kommandospannungabgezogen, damit die gemessene Spannung sich auf das richtige Erdpotential bezieht.Der DAGAN hat zwei Besonderheiten, die ihn von anderen Patch-Verstärkern unterscheiden.Zum einen wird das Kommandopotential nicht durch die Pipetten-, sondern16

durch die Erdelektrode vorgegeben. Dies hat schaltungstechnische Vorteile, wie unten inAbschnitt 3.1.6 beschrieben. Zum anderen bietet der Verstärker die Möglichkeit, den RückkopplungswiderstandR f durch einen Kondensator zu ersetzen, der sich in bestimmtenAbständen entlädt. Dadurch entfällt das Widerstandsrauschen. Die Entladungsblitze desKondensators wirken sich aber störend auf manche der Auswerteprogramme aus, sie müssendann nachträglich aus der Zeitreihe entfernt werden. Insgesamt wird aber eine deutlicheRauschreduktion gegenüber vergleichbaren nicht-integrierenden Verstärkern erzielt.3.1.2 DifferenzverstärkerDamit durch das Signalkabel, welches vom Ausgang des Patch-Clamp-Verstärkers zur AD-Wandler-Karte im PC läuft, keine Störsignale in den Faradaykäfig gelangen können, befindetsich in der Wand des Käfigs ein Differenzverstärker, der die Erden voneinander trennt(siehe rechts in Abb. 3.2). Insgesamt wurden drei verschiedene Modelle getestet, Version 3erwies sich als am besten geeignet und wurde daher bei nahezu allen Messungen verwendet.Abbildung 3.4: Differenzverstärker Version 1• Version 1: Der ursprünglich vorhandene Differenzverstärker (von Horst Schlüter) bestandaus zwei Stufen. Dem Eingangsspannungsteiler folgt ein aus zwei Operationsverstärkern(OP37, Maxim) aufgebauter einfacher Differenzverstärker. Der DifferenzverstärkerINA105 (von Burr-Brown) bringt keine zusätzliche Verstärkung, sonderndient als Leitungstreiber. Leider belastete der zu niederohmig dimensionierter Eingangsspannungsteiler(links in 3.4) den Ausgang des Patch-Verstärkers. Dadurch entstandeine Signalreduktion, die sehr lästig, war, weil beispielsweise am Oszilloskopder Pipetten- bzw. Sealwiderstand nicht mehr direkt abgelesen werden konnte. Dereffektive Verstärkungsfaktor betrug etwa 1.17

Abbildung 3.5: Differenzverstärker Version 2• In einem ersten Verbesserungsversuch habe ich den Widerstand R3 deshalb umden Faktor 1000 vergrößert (3.5). Die Belastung des Dagans konnte auf diese Weisebeseitigt werden. Durch die Veränderung der Widerstandverhältnisse im Eingangsspannungsteileränderte sich jedoch auch die Verstärkung. Unter Berücksichtigungdes Eingangsspannungteilers (eigentlich unnötig, weil 2*270≪10 6 ) beträgt dieR3R5+R6Verstärkung dieser Schaltung V = (1 + ) = 0, 995 ∗ 5 ≈ 5. Da jedochR1+R2+R3 R4die Gesamtverstärkung (Patchverstärker+Differenzverstärker) wegen des begrenztenAufnahmebereichs der AD-Wandlerkarte (±5V ) nicht größer werden darf, mußte jetztzur Messung die Verstärkung am Stromspannungswandler des Patchverstärkers von100mV/pA auf 20mV/pA reduziert werden. Es ist jedoch ein grundlegendes Prinzipder Meßtechnik, daß kleine Signale immer möglichst früh auf ihre Endgröße verstärktwerden, damit später eingestreute Störungen nicht mitverstärkt werden. Insbesondere,wenn wie hier zwischen Dagan und Differenzverstärker mehrere Meter Kabelliegen. Auch dieser Differenzverstärker erwies sich also als ungünstig.• Die für die Messungen dann benutzte Schaltung kommt ohne den in Version 2 schonbeinahe wirkungslosen Eingangsspannungsteiler aus. Eine ausreichende Größe desEingangswiderstandes wird hier direkt durch die Eingangswiderstände der Operationsverstärkerder ersten Stufe gewährleistet. Um die Verstärkung zu reduzieren, habeich die Größe der Rückkopplungswiderstände R5 und R6 angepaßt. Die Verstärkungdieser Schaltung beträgt nur noch V = 1 + R5+R6 = 2 (Die beiden 270 Ω sind in Reihenschaltungmit den Eingangswiderständen der OP´s endgültig vernachlässigbar.).R4Die reduzierte Verstärkung erlaubt Messungen mit einer ausreichenden Verstärkungvon 50mV/pA.18

Abbildung 3.6: Differenzverstärker Version 33.1.3 Maßnahmen zur RauschreduktionEine gute Zeitauflösung bei Patch-Clamp-Experimenten erfordert ein möglichst rauscharmesStromsignal (Schultze und Draber, 1993). Die in Frage kommenden Rauschquellen undStrategien zur Reduktion sind in der einschlägigen Literatur ausführlich beschrieben (z.B.Benndorf, 1995; Numberger und Draguhn, 1996). Um Wiederholungen hierzu aus anderenArbeiten aus der Arbeitsgruppe (z.B. Keunecke, 1995; Farokhi, 2002) zu vermeiden, sollenhier nur die von Tobias Huth und mir vorgenommenen zusätzlichen Verbesserungenbeschrieben werden.Der ursprünglich verwandte Drucklufttisch zur Dämpfung von Gebäudeschwingungenwar unzureichend, weil er sich nur sehr schwer richtig einstellen ließ, oft setzte eine Ecke aufund machte dadurch ganze Meßreihen wegen der dem Signal überlagerten Schwingungenunbrauchbar. Durch einen Umzug auf einen anderen Tisch, der sich wesentlich besser regelnläßt und auch den Druck besser hält, ließ sich dieses Problem beseitigen.Die hochfrequenteren akustischen Schwingungen (Sprache, Telefonklingeln) haben wirdurch eine wesentlich kompaktere Gestaltung des Aufbaus ebenfalls weitgehend ausschaltenkönnen: Um die Hebelarme möglichst klein zu halten, wurden die beiden tragenden Säulendes Aufbaus (siehe Abb. 3.2) von der Werkstatt des Physikzentrum so dicht wie möglichzusammengerückt, sodaß das Mikroskop gerade eben noch dazwischenpasst.Der Vorverstärker muß sich zum Einsetzen der Pipetten in die Halterung ziemlich weitvom Objekttisch mit der Petrischale zurückfahren lassen. Dazu diente früher ein Mechanismus,mit dem der Verstärker einfach hochgeklappt wurde Diese Konstruktion haben wirdurch die in Abschnitt 3.1.1 beschriebene Zahnradstange ersetzt, mit der der Verstärkernun unter einem festen Winkel vor- und zurückgefahren werden kann. Dies ist nicht nurstabiler, sondern ermöglicht es auch, nach dem Wechsel der Pipette sofort ohne Benutzungder Mikromanipulatoren wieder dieselbe Stelle in der Petrischale zu erreichen.Eine Verkleinerung des Rauschens um den Faktor 2 ergab sich eher zufällig bei einem19

Austausch des Meßrechners, der alte war intern wohl schlecht geerdet.Als letztes wurden alle Erdungen durch Kupferlitzen mit mindestens 3 mm Durchmesserund sorgfältig gelöteten Kontakten versehen. Sternförmig wurden dann alle metallischenTeile des Aufbaus nacheinander an einem zentralen Punkt geerdet. Nach jedem neuenKabel wurde das Resultat am Oszilloskop überprüft. Unabsichtlich gelegte Erdschleifenverrieten sich sofort durch merkwürdige (vorher nicht vorhandene) Störsignale und konntenso weitgehend vermieden werden.3.1.4 PipettenziehenWegen des damit verbundenen Aufwandes (Farokhi, 2002) wurde auf Pipetten aus Quarzglasverzichtet, die aufgrund der höheren Wanddicke und der hohen Dielektrizitätskonstanteein sehr geringes Rauschen aufweisen. Stattdessen wurden Borosilikglaskapillaren(d aussen =1,5 mm, d innen =0,87 mm; Hilgenberg, Malsfeld) verwendet. Die Pipetten wurdenin zwei Heizstufen auf einem L/M-3P-A-Puller (List-Medical, Darmstadt; jetzt: HEKA)gezogen. Dabei wird der Glasrohling an beiden Enden eingespannt und in der Mitte durcheine Glühwendel geheizt; ein Gewicht am unteren Ende zieht das geschmolzene Glas auseinander.In der ersten Ziehstufe wird die Form der Flanken festgelegt, die zweite Stufe formtdie Spitze und trennt die beiden Pipetten voneinander. Zum Schutz vor Beschädigung undStaub werden die Pipetten bis unmittelbar vor der Messung in einem Plexiglasbehälteraufbewahrt, so halten sie sich mehrere Tage.Zum Befüllen der Pipetten haben sich Mikrofilamente (World Precision Instruments,Sarasota, USA) bewährt. Im Gegensatz zu Stahlkanülen reichen sie bis fast in die Spitzeder Pipette, die sich dadurch sehr einfach blasenfrei befüllen läßt. Jede Pipette kann nureinmal verwendet werden, da ihre Öffnung für die Sealbildung (Abschn. 3.3.3) absolutsauber und insbesondere frei von Membranresten sein muß.3.1.5 ElektrodenFür die beiden Elektroden werden chlorierte Silberdrähte verwendet. Die Chlorierung erfolgtin einem Elektrolysebad und sorgt für die Konstanthaltung der Offsetpotentiale (Numbergerund Draguhn, 1996).Als Referenzelektrode in der Badlösung dient eine Agarbrücke. Sie verhindert den Austrittder Elektrodenlösung in die Meßkammer. Insbesondere wird dadurch die Kontaminationdes Präparats mit toxischen Silberionen vermieden (Numberger und Draguhn, 1996).Die gewählte Elektrolytlösung (in diesem Falle 250mM KNO 3 wie in der späterenBadlösung) wird aufgekocht und mit 3 Gewichtsprozent Agar-Agar (Sigma, Deisenhofen)versetzt. Eine große abgeschnittene Glaspipette wird nun hineingetaucht und mit einemdurchbohrten Gummistopfen verschlossen. Nach etwa einem Tag, wenn der Agar fest ist,wird ein chlorierter Silberdraht von 1 mm Durchmesser durch den Stopfen gesteckt.20

3.1.6 VorzeichenkonventionDie internationale Konvention für Spannungsmessungen an biologischen Membranen entstandzu der Zeit, als noch meistens mit Einstichelektroden über dem Plasmalemma gemessenwurde. Dabei war die Erd- (Bezugs-) Elektrode ins Bad getaucht. Deshalb lautetdie Konvention so, dass die luminale (wässrige) Seite als Bezugspunkt genommen wird unddas Vorzeichen der cytosolischen Seite als Vorzeichen der gemessenen Spannung gilt. BeiMessungen am Plasmalemma ist eine Spannung also negativ, wenn das Zellinnere negativgegenüber dem Bad ist. Die verwendeten Tonoplastenvesikel können in diesem Sinne alsZellen betrachtet werden, weil sie umgekrempelt sind, die cytosolische Seite also innen liegt(siehe Abschnitt 3.2.3).Der Dagan 3900 benutzt im Gegensatz zu vielen anderen Patch-Verstärkern die Badelektrodenicht als Erde sondern als Kommandoelektrode. Daß die Haltespannung nichtüber die Pipette vorgegeben wird, hat z.B. den Vorteil, daß der Vorverstärker einfachergestaltet werden kann und nur noch den Strom-Spannungswandler (ohne Einspeisung desSpannungssollwertes) enthält. Außerdem erübrigt sich eine aktive Abschirmung des Vorverstärkers,sein Gehäuse kann einfach auf Meßerde gelegt werden. Insgesamt kann derVorverstärker dadurch kompakter gestaltet werden, was zusätzlich der mechanischen Stabilitätdes Systems zu Gute kommt.Der Verstärker ist so gebaut, daß er sich im whole-cell-Modus (siehe Abbildung 3.1)an die physiologische Vorzeichenkonvention hält: Ein negatives Potential im Inneren derZelle wird auch als negativ gezählt. Im whole-cell-Modus liegt das Zellinnere auf demselbenPotential wie die Pipettenelektrode. Bei inside-out-Messungen liegt die cytosolische(=ehemals innere) Seite der Membran jedoch außen und damit auf dem gleichen Potentialwie die Badelektrode. Das Kommandopotential an der Badelektrode gibt also bei insideout-Messungenin Wahrheit das invertierte Membranpotential vor. Deshalb sind auch alleStromwerte invertiert, für die Auswertung wurden daher alle Vorzeichen noch einmal umgekehrt,so daß in allen Bildern und Tabellen der vorliegenden Arbeit die physiologischeVorzeichenkonvention eingehalten wird.3.2 Das Meßobjekt3.2.1 Anzucht der AlgenChara corallina liebt kaltes, nährstoffarmes Wasser. In Ermangelung eines klimatisiertenRaumes führte dies im Sommer leider mitunter zu Ausfällen. In der Arbeitsgruppewird sie in etwa 60l fassenden Plastikwannen gezogen. Die Temperatur im Keller betrugdurchschnittlich 15 bis 20 ◦ C, die Beleuchtung erfolgte zwölf Stunden pro Tag mittels einergewöhnlichen 60 Watt-Glühlampe. Der Boden der Wanne ist mit einer circa 10 cm dickenTorfschicht (TKS II, freundlicherweise zur Verfügung gestellt vom Botanischen Garten)und einer dünnen Schicht aus grobem Sand bedeckt.Zur Vermeidung von Bakterien- und Pilzwachstum wurde beides vorher autoklaviert.Aufgefüllt wurde die Wanne nicht wie bei Farokhi (2002) mit APW (artificial pond water)21

sondern mit vollentsalztem Wasser. Die im Torf enthaltenen Nährstoffe reichen völlig aus,allerdings sollte man darauf achten, daß die Sandschicht nicht zu dick ist, weil die Wurzelnsie sonst nicht durchdringen können, die Algen hungern dann und wachsen zu langsamnach.Obwohl das Wasser bewußt nährstoffarm gehalten war, kam es gelegentlich zu einerTrübung, der durch Wasserwechsel nicht beizukommen war. In solchen Fällen wurde zeitweiligeine handelsübliche Aquarienpumpe mit Aktivkohlefilter in das Becken gehängt.Wegen der Strömungsempfindlichkeit der rindenlosen Algen wurde die Pumpe nach Beseitigungder Trübung wieder entfernt.3.2.2 Der Kaliumkanal in Chara corallinaDer dominierende Kaliumkanal im Tonoplasten von Chara wird in dieser und vielen anderenArbeiten (u.a. Klieber und Gradmann, 1993; Lühring, 1999; Tester, 1988, und vieleArbeiten aus unserer Gruppe) im wesentlichen aus zwei Gründen verwendet: Die Membranist leicht zu präparieren (siehe Abschnitt 3.2.3) und die Kanäle liefern außerordentlich hoheEinzelkanalströme von bis zu 20pA (Lühring, 1986). Zum Vergleich: Andere pflanzlicheKanäle wie z.B. in Mais-Bündelscheidenzellen liefern Ströme von höchstens 2pA (Keuneckeund Hansen, 2000). Ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis ist jedoch entscheidend fürdas zeitliche Auflösungsvermögen (Schultze und Draber, 1993).Die bei der Präparation (Kap. 3.2.3) entstehenden Tropfen sind von einer Tonoplastenmembranumgeben. Die Membran ist ,,umgekrempelt”, so daß die ehemaligen Außenseite(=cytosolische Seite bei der Vakuole) jetzt innen liegt. Die Vesikel sind mit Cytoplasmagefüllt, die größeren enthalten mitunter sogar noch Chloroplasten (Lühring, 1986; Tester,1988).Die in der Tonoplastenmembran enthaltenen K + -Kanäle konnten leider noch nicht sequenziertwerden, da Chara mehrkernig ist und sich daher allen Klonierungsversuchenhartnäckig widersetzt. Es kann aber davon ausgegangen werden, daß es sich bei den Kanälenum Maxi-K-Kanäle (Abschnitt 2.3.1) oder um einen zumindest sehr ähnlichen Typus handelt.Das wurde aus der für Maxi-K charakteristischen hohen Leitfähigkeit und der pharmakologischenEmpfindlichkeit, z.B. der Aktivierung durch Ca 2+ geschlossen (Lühring, 1999;Tester, 1988). Aufgrund dieser Ähnlichkeit und weil dies das vorherrschende Grundmusterfür K + -Kanäle ist, wurde in Hansen et al. (2003) bei der Entwicklung verschiedenerFunktionsmodelle zum anomalen Molfraktionseffekt (Kapitel 7) davon ausgegangen, dassder dominierende K + -Kanal in Chara corallina ebenso wie der Maxi-K-Kanal aus vieridentischen Untereinheiten (4-Segmenten) besteht.3.2.3 Präparation der VesikelWegen der Größe ihrer Zellen wurden verschiedene Characeen-Arten schon immer gern fürelektrophysiologische Messungen verwendet (z.B. Umrath, 1934; Hope et al., 1966; Tester,1988, und viele andere). Die ältere Technik der Einstichelektroden wurde fast immer für das22

Plasmalemma, also die äußere Zellmembran verwendet. Gute Seals für rauscharme Patch-Clamp-Messungen können jedoch nur an besonders sauberen Membranen erzielt werden.Bei tierischen Zellen stellt diese Forderung im Allgemeinen keine größere Einschränkungdar. Pflanzen besitzen jedoch eine feste Zellwand, die den Zugang zur Membran verwehrtund daher zunächst abgedaut werden muß (Keunecke et al., 1997). Um diese Schwierigkeitenzu vermeiden, begannen die ersten Patchversuche an Pflanzen an der die Vakuoleumschließenden Tonoplastenmembran (Hedrich und Schröder, 1989).Ausgewachsene Zellen sind fast vollständig von der Vakuole ausgefüllt. Zur Präparationwerden zunächst ein bis zwei ausgewachsene Internodialzellen dem Becken entnommen,die Radialzellen werden entfernt. Nach einigen Minuten hat sich durch Verdunstung derTurgordruck der Zelle abgebaut, sie kann nun direkt über der Meßkammer an einem Endeaufgeschnitten und vorsichtig in die Badlösung ausgedrückt werden. Aus den Membranrestender dabei zerstörten Vakuole bilden sich Vesikel von 50-500µm Durchmesser, die sichnach einigen Minuten am Boden der Kammer absetzen.Es zeigte sich, daß die Stabilität der Membran stark temperaturabhängig ist. Am stabilstenwar sie wie bei Keunecke (1995) bei 19±1 ◦ C, oberhalb von 25 ◦ C zerflossen die Vesikelbereits nach wenigen Minuten. Eine mobile Klimaanlage ermöglichte dennoch Messungenim Sommer.3.3 Durchführung der Messung3.3.1 Testmessung und StromeichungUm Verschlechterungen des Signal-Rausch-Verhältnisses, etwa durch gebrochene Erdkabel,elektrische Aktivitäten im Hause oder Bauarbeiten in der Nähe sofort zu erkennen, solltedas Rauschen zu Beginn jedes Meßtages überprüft werden. Dazu wird der Pipettenhalterentfernt und durch einen 1GΩ-Widerstand ersetzt, es muß immer dasselbe Exemplar sein,da sonst die Vergleichbarkeit nicht mehr gewährleistet ist. Eine Rechteckspannung wirdangelegt und das Rauschen am Computer überprüft.Um den Faktor für die Umrechnung ADW-Einheiten → pA für das Auswerteprogrammzu erhalten wurde das System einmalig über einen 10MΩ-Widerstand mit geringer Toleranzund 10mV Rechteckspannung kalibriert. Der aufgezeichnete Strom war innerhalb derAuflösung (12 Bit) exakt linear zum Vorverstärkungsfaktor, der Umrechnungsfaktor fürdie Auswertung ist also konstant. Die Umrechnung lautet:IpA =IAD-Einh. ·1, 257gain in mV/pA(3.1)3.3.2 Offset-KorrekturFür die Aufstellung korrekter Strom-Spannungskurven ist eine genaue Kenntnis der tatsächlichan der Membran anliegenden Spannung nötig. Elektrodenpotentiale und Liquid-Junction-Potentials (Abschnitt 5.5) müssen daher kompensiert werden. Dies muß kurz vor23

Bildung des Seals geschehen, wenn sich die Pipette in unmittelbarer Nähe des Vesikels abernoch nicht im Kontakt mit ihm befindet. Zur Offset-Korrektur wird ohne äußere angelegteSpannung der Strom durch die Pipette auf dem Oszilloskop beobachtet und mittels desKorrekturknopfes am Verstärker auf Null geregelt. Wird eine Potentialdrift beobachtet,muß die Messung abgebrochen werden. Ursache ist dann meist eine schlecht chlorierteElektrode oder in den Pipettenhalter eingedrungene Feuchtigkeit.3.3.3 Herstellung des Giga-Seals und DatenaufnahmeVor dem Eintauchen der Pipette in die Badlösung wird über das U-Rohr ein leichter Überdruckvon einigen 10 cm Wassersäule angelegt. Der dadurch erzeugte Ausstrom von Lösungaus der Pipettenöffnung schützt diese vor Verschmutzungen. Nachdem der Pipettenwiderstandmittels einer angelegten Rechteckspannung von 10mV kontrolliert wurde (er sollte fürEinzelkanalmessungen etwa 10 bis 50MΩ betragen), wird die Pipette mit den Mikromanipulatorendicht an ein geeignetes Vesikel herangefahren. Jetzt erfolgt die in Abschnitt 3.3.2beschriebene Korrektur des Elektrodenpotentials. Die Pipettenöffnung wird der Membransoweit angenähert, bis diese sich durch den Lösungsausstrom etwas eindellt. Der Überdruckwird abgelassen und über das Mundstück vorsichtig ein leichter Unterdruck angelegt.Die Sealbildung wird durch das Zusammenschrumpfen des Rechtecksignals am Oszilloskopsichtbar. Durch eine ruckartige Rückwärtsbewegung wird das Membranstück (der Patch)aus dem Vesikel herausgerissen. Für eine brauchbare Messung sollte der Sealwiderstandmindestens 2GΩ betragen.Ist dies der Fall, wird das Rechteck ausgeschaltet, und für Spannungen bis ±100mVder Strom durch den Patch für jeweils 10 Sekunden aufgezeichnet. Das Spannungsprotokollist dabei variabel. Meist lautete es 0, +20mV, -20mV, +40mV, ... . Wenn die Membrananfängt zu flackern, wird für einige Zeit die Spannung heruntergedreht, manchmal erholtsich das Seal dann wieder, und es kann weitergemessen werden. Damit das Abtasttheoremerfüllt ist, muß vor der Datenaufnahme am PC (Sampling rate = 200kHz) noch ein Anti-Aliasing-Filter (50kHz) zwischengeschaltet sein. Im verwendeten Verstärker (DAGAN) istzu diesem Zweck ein 4-poliger Besselfilter mit variabler Abknickfrequenz integriert.Die Messung findet ein Ende, wenn das Seal reißt, oder kein aktiver Kanal mehr zuerkennen ist.24

Kapitel 4Mathematische Methoden4.1 Markov-ModelleIonenkanäle schalten spontan zwischen leitfähigen und nichtleitfähigen Zuständen hin- undher. Dabei gibt es oft verschiedene Zustände gleicher Leitfähigkeit, die sich nur in ihrerdurchschnittlichen Verweildauer unterscheiden. In Abbildung 4.2A beispielsweise sindschon mit bloßem Auge ein langsamer (die langen Teilstücke auf der 0 pA-Linie) und einkurzer Geschlossenzustand (die kurzen Unterbrechungen des Offenzustandes) zu erkennen.Das kinetische Verhalten von Ionenkanälen wird am häufigsten durch Markov-Modellebeschrieben (z.B. Colquhoun und Hawkes, 1982). Andere Modelle, z.B. das fraktale Kanalmodell(Liebovitch et al., 1987; Calvacanti und Fontanazzi, 1999) werden seit einigenJahren diskutiert, haben sich aber nicht durchsetzen können (Korn und Horn, 1988).Markov-Modelle sind Sätze von diskreten Zuständen, zwischen denen das System stochastischhin- und herspringt. Dabei werden drei Annahmen gemacht:1. Das System hat kein Gedächtnis, i.e.: Die Übergangswahrscheinlichkeiten sind nuran den aktuellen Zustand gekoppelt.2. Das System befindet sich in einem stationären Zustand, i.e.: Die Übergangswahrscheinlichkeitensind zeitunabhängig.3. Das System ist linear, i.e.: Die Übergangswahrscheinlichkeiten sind unabhängig vonder Besetzungszahl der Zustände. Bei kooperativen Kanalmodellen wird diese Annahmefallengelassen.Haben zwei oder mehrere Zustände dieselbe Leitfähigkeit, so sind sie in der Zeitreihe ohnezeitliche Analyse nur durch Betrachtung der Stromniveaus nicht unterscheidbar, manspricht dann von einem Hidden-Markov-Prozeß.Ein Markov-Prozeß kann durch ein System von linearen Differentialgleichungen ersterOrdnung beschrieben werden:dQ= Q(t) · K (4.1)dt25

Sie haben die Lösungen:Q(t) = Q(0) · e Kt (4.2)Dabei ist Q(t) der Vektor der Besetzungswahrscheinlichkeiten q i (t) der einzelnen Zuständeund K die Matrix der Ratenkonstanten k ij . Ziel kinetischer Analysen ist es, die Zahl derZustände, ihre Anordnung und die Größe der Ratenkonstanten zu bestimmen.Der Argumentation von Farokhi et al. (2000) folgend, werde ich für den Chara-K + -Kanal ein lineares 5-Zustandsmodell zugrundelegen. Zur Unterscheidung erhalten die beidengleich-leitfähigen Offen- (A,O) und die drei Geschlossenzustände (G,C,Z) entgegen denKonvention für Hidden-Markov-Modelle unterschiedliche Symbole. Die Markov-Kette−−⇀ ↽−−−−⇀ ↽−−A k AOO k OGk OA k GO−−⇀ ↽−−−−⇀ ↽−− ZG k GCC k CZk CG k ZCwird im Folgenden der Kürze halber als AOGCZ-Modell bezeichnet.Manche Kanäle, so auch der hier untersuchte, besitzen allerdings Offenzustände verschiedenerLeitfähigkeit. Ein Zustand mit geringerer Leitfähigkeit als der ,,normale” Offenzustandwird als Sublevel bezeichnet (in dieser Arbeit meist mit dem Markov-Symbol ,,S”notiert). Das Sublevel des Chara-K + ist schwer zu beobachten, und deshalb in den Modellennoch nicht enthalten (siehe Abb. 8.5). Zur Erklärung des AMFE (Kapitel 6) scheintdas aber bis jetzt auch nicht nötig zu sein.4.2 Simulation von ZeitreihenEin wichtiges Hilfsmittel, beispielsweise um neue Fitalgorithmen zu testen, ist die Simulationvon Patch-Clamp-Zeitreihen aus einem vorgegebenen Markov-Modell. Dazu dient dasProgramm ,,simulat” (Rießner, 1994; Woelk, 2000). Die Anzahl der Zustände und Kanäle,die Ratenkonstanten des Markov-Modells (Abschnitt 4.1) die Stromniveaus der Zuständeund das Signal-Rausch-Verhältnis sind frei wählbar. Um eine Zeitreihe zu erhalten, die sichmit den gemessenen Daten hundertprozentig vergleichen läßt, muß außerdem die richtigeAbknickfrequenz des Tiefpaßfilters angegeben werden.Zwei Zufallsgeneratoren bestimmen jeweils den Zeitpunkt des nächsten Sprunges undden Zustand nach dem Sprung (beides abhängig von den k ij ).Die Wirkung des Anti-aliasing-Filters (Abb. 7.1) wird wie folgt berücksichtigt: DieAntwort eines vierpoligen Bessel-Filters wurde im Rechner gespeichert. Jedes Mal, wenn derZufallsgenerator einen Sprung verursacht, wird die Antwort des Filters aus dem Speicherentnommen und der Zeitreihe hinzugefügt.Als letztes wird das Rauschen überlagert. Es wird mit dem Programm ,,makenois”(Rießner, 1994) erzeugt, welches die Wirkung des Anti-aliasing-Filters ebenfalls berücksichtigt.Die simulierte Zeitreihe wird dann in einer Datei abgelegt, deren Format dem der gemessenenZeitreihen entspricht. Sie kann auf dieselbe Weise wie die gemessenen Daten mitden in diesem Kapitel beschriebenen Methoden analysiert werden.26

4.3 Ablauf der Analyse einer EinzelkanalaufzeichnungAbbildung 4.1: Gang der Analyse für Patch-Clamp-AufzeichnungenZiel der Analyse von Einzelkanal-Patch-Clamp-Aufzeichnungen (oder ,,Wenig-Kanal”)ist es, das ,,richtige” Markov-Modell ermitteln, also ein Modell, welches das kinetische Verhaltendes untersuchten Kanal möglichst exakt reproduziert. Im Einzelnen möchte mankennen: den Einzelkanalstrom, die Anzahl der Offen- und Geschlossenzustände (am liebstenauch ihre Anordnung, aber das ist schwer) und die Übergangsraten zwischen denZuständen.Für derartige Analysen stehen in unserem Labor verschiedene (in vielen Diplom- undDoktorarbeiten) selbstgeschriebene Programme zur Verfügung, die sich gegenseitig ergänzen.Der ,,Standard-Verlauf” zur Analyse einer Patch-Clamp-Zeitreihe ist in Abbildung 4.1gezeigt (die einzelne Programme werden in den nachfolgenden Abschnitten erläutert):Als erstes werden die einfachsten Parameter der Zeitreihe bestimmt: Die Anzahl der imPatch vorhandenen Kanäle, der Einzelkanalstrom und die Breite des Hintergrundrauschens.Die geschieht entweder per Auge (fit-by-eye, Abschnitt 4.4) oder mit dem automatischenLeveldetektor (Abschnitt 4.7.1). Für einen Großteil der Zeitreihen ist die Analyse an dieserStelle auch schon zu Ende. Denn für die Analyse des Zeitverhaltens können nur sehrgute Messungen mit geringem Rauschen und ohne Drift und Membranflackern verwendetwerden.Die im ersten Schritt ermittelten Daten dienen dem Sprungzeitendetektor als Grundlagefür die Rekonstruktion der rauschfreien Zeitreihe (Hinkley-Detektor, Abschnitt 4.5). Errekonstruiert für jeden Abtastzeitpunkt, ob der Kanal gerade offen oder geschlossen warund erstellt somit eine Liste sämtlicher Offen- und Geschlossenzeiten. Aus dieser Liste läßtsich im Dwell-Time-Fit (Abschnitt 4.7.3) die Anzahl der Zustände des Markov-Modellsbestimmen.27

All diese Informationen braucht im letzten Schritt der Analyse (Abb. 4.1) der HMM-Fit(Abschnitt 4.6), um die Übergangsraten k ij der Zustände zu ermitteln.4.4 Bestimmung von Einzelkanalstrom und RauschenAbbildung 4.2: A: Ausschnitt aus einer typische Patch-Clamp-Aufzeichnung mit zwei Chara-K+ -Kanälen mit einem Einzelkanalstrom von jeweils 3,84pA. Die durchgezogenen Liniengeben die Stromniveaus an. Meßlösungen: beidseitig 250mM KNO 3 + 5mM CaCl 2 .Membranspannung = +40mV. B: Das Amplitudenhistogramm derselben Messung. DieStromlevel und die Gausskurven (siehe Text) sind eingezeichnet.Der erste Schritt der Auswertung geschieht mit dem Programm ,,Patch” (Kirst, 1997;Radomski, 2000; mit Modifikationen von Huth, 2003). Die Zahl der Kanäle und die Lageder Stromniveaus wird zunächst per Auge bestimmt und markiert (horizontale Linien inAbb. 4.2A). Im Amplitudenhistogramm (=Zahl der Abtastpunkte pro Stromwert) wirdum jedes Niveau eine Gaußkurve gelegt (durchgezogene Kurven in Abb. 4.2B) und dieStandardabweichung an das Rauschen angepaßt (,,fit-by-eye”). Die Amplitudenfaktorenwerden automatisch berechnet. Aus der Fläche der einzelnen Gausskurven ergeben sich dieBesetzungswahrscheinlichkeiten der einzelnen Stromniveaus. Als letztes kann man einenSimplexalgorithmus noch eine Minimierung des quadratischen Fehlers im Amplitudenhistogrammvornehmen lassen, die Korrekturen sind aber meistens sehr gering.Dieses interaktive Verfahren erfordert zwar einige Erfahrung, ist aber besonders beischlechten Signal-Rauschverhältnissen weitaus zuverlässiger als das ,,blinde” Anfitten desAmplitudenhistogramms mit Gaußkurven (siehe auch Abschnitt 11.1).4.5 Hinkley-DetektorUm eine Auflistung sämtlicher Offen- und Geschlossenzeiten des Kanals für die spätereBestimmung der Anzahl der Zustände (Abschnitt 4.3) zu erstellen, ist es nötig, die ,,unverrauschteZeitreihe” zu rekonstruieren. Um festzustellen, in welchem Stromniveau der Kanal28

sich zu jedem Abtastzeitpunkt aufgehalten hat, gibt es verschiedene Detektionsalgorithmen.Alle folgen im Wesentlichen demselben Prinzip: Ein Filter läuft durch die Zeitreiheund berechnet für jeden Abtastzeitpunkt einen Testwert, der ansteigt, wenn ein Sprungerfolgte. Überschreitet der Testwert eine vorher festgelegte Schwelle, so wird der Sprungvom Algorithmus detektiert.In unserer Arbeitsgruppe wird ein im Programm ,,Patch” integrierter Hinkley-Detektorverwendet (Schultze und Draber, 1993; Hinkley, 1971). Der einfache Hinkley-Detektor berechnetden Testwert am Abtastpunkt t für den Sprung rekursiv:g t = g t−1 + (z t − µ 0 + µ 1) ; g t = 0 wenn g > 0 (4.3)2Dabei ist µ 0 das derzeitige angenommen Stromlevel, µ 1 dasjenige nach dem Sprung undz t der aktuelle Meßpunkt. Wird durch das Rauschen der Testwert kleiner als Null, wird erauf Null gesetzt, um den Detektor wach zu halten. Durch diese Nichtlinearität erreicht derHinkley-Detektor eine bessere zeitliche Auflösung als konventionelle Schwellwertdetektoren(Schultze und Draber, 1993). Ein Sprung erfolgt dann, wenn der Testwert die Schwelleλ = µ 0 − µ 1p (4.4)2überschreitet. Der Sprungzeitpunkt wird auf den letzten Zeitpunkt gesetzt, zu dem derTestwert gleich Null war. Der Faktor p berücksichtigt Farbe und Breite des Rauschens undbestimmt so die zeitliche Auflösung des Detektors (Schultze und Draber, 1993). Hinkley-Detektoren höherer Ordnung berechnen den Testwert rekursiv aus mehreren Vorgängernund können dadurch die rauschfreie Zeitreihe noch besser rekonstruieren (Schultze undDraber, 1993).4.5.1 Sublevel-Hinkley-Detektor (Draber und Schultze, 1994)Ein Hinkley Detektor (Gl. 4.3) wartet jeweils nur auf einen in Richtung und Größe festgelegtenSprung. Sind jedoch z.B. bei mehreren Kanälen Sprünge nach oben und nachunten oder nicht äquidistante Stromniveaus möglich, so müssen mehrere Detektoren parallellaufen. Der dynamische Hinkley-Detektor (Draber und Schultze, 1994) besitzt nuneine besonders raffinierte quadratische Gleichung für das Wachstum der Testwerte. DerTestwert aus Gleichung 4.3 wird für jeden möglichen Sprung (vom derzeitigen Level 0 nachi) ersetzt durchh i t = h i t−1 + µ i − µ 0(z t − µ 0 − µ i − µ 0) (4.5)22Alle parallel laufenden Detektoren erhalten dieselbe Schwelle vorgegeben. Die Entscheidung,welcher der möglichen Sprünge erfolgte, geschieht dadurch, daß nach einem Sprungin der verrauschten Zeitreihe der richtige Testwert am schnellsten ansteigt und daher alserster die Schwelle erreicht (Draber und Schultze, 1994). Nach dem Sprung werden alleTestwerte wieder auf Null gesetzt, und die Detektoren warten vom neuen Niveau aus aufden nächsten Sprung.29

4.5.2 Die Übergangsmatrix als ModellunterscheidungskriteriumDer Hinkley-Detektor führt in jedem Modus (einfach oder SHD) Buch über Anzahl und Artder gefundenen Sprünge. Diese Statistik wird in Form einer Übergangsmatrix dargestellt.Das Matrixelement a ij gibt an, wie viele Sprünge vom Stromniveau i nach j gefundenwurden. Bereits in dieser einfachen Darstellung kann der SHD zur Modellunterscheidunggenutzt werden:Die zwei Markov-ModelleC ⇋ S ⇋ O(= ein Kanal O mit Sublevel S) und(C ⇋ S) + (C ⇋ O)(= ein kleiner S und ein großer O Kanal) liefern zwar dieselben Stromniveaus aber unterschiedlicheÜbergangsmatritzen. Sind die Matrixelemente a S,O und a O,S groß, so ist daserste Modell sehr wahrscheinlich, da im zweiten Modell diese Übergänge nicht vorkommen(Draber und Schultze, 1994). Caliebe et al. (2002) verbesserten die Zuverlässigkeit diesesKriteriums, indem sie die Aussage ,,a ij ist groß/klein.” durch einen statistischen Testersetzten.4.6 Bestimmung der Ratenkonstanten mit dem direktenZeitreihenfit4.6.1 Der HMM-FitDer direkte Zeitreihenfit dient zur Bestimmung der Übergangsraten der verschiedenenZustände des Kanals (Abschnitt 4.1) direkt aus der Zeitreihe (Welche Eingaben er benötigt,ist in Abb. 4.1 gezeigt.).Der Fit beruht auf dem Ein-Schritt-Prädiktions-Algorithmus von Baum et al. (1970).Um die Ratenkonstanten k rs der Zustandsübergänge zu schätzen, nutzten Fredkin und Rice(1992) nur den Vorhersage-Schritt in Vorwärtsrichtung. Diese Näherung wurde von Albertsenund Hansen (1994) für die Mehr-Zustands-Mehr-Kanal-Analyse ausgeweitet. Dafürwerden mehrere Kanäle zu einem Makrokanal mit den Zuständen s ɛ [AA, AO, AG, AC, AZ,OA,...] (= 2 Kanäle) zusammengefaßt. Ausgehend von dem vorgegebenen Markov-Modellschätzt der Algorithmus rekursiv die Wahrscheinlichkeit a k (s), daß sich das System zumZeitpunkt k (diskrete Zeitpunkte, entsprechend der Abtastrate) im Zustand s befindet:a k (s) =n∑a k−1 (r)p rs f s (y k ) (4.6)r=1Die a k−1 geben die (rekursiv berechneten) Wahrscheinlichkeiten an, das Modell zum Zeitpunktk-1 im Zustand r zu finden. Summiert wird über alle Zustände gleicher Leitfähigkeit30

(beim AOGCZ-Modell also r ɛ [A,O] oder [G,C,Z], daher HMM-Fit=Hidden-Markov-Fit).Die Übergangswahrscheinlichkeiten p rs sind Funktionen der k ij und geben die Wahrscheinlichkeitenan, daß das System im Zeitintervall zwischen k-1 und k vom Zustand r in den Zustands wechselt. a k (s) ist also gleich der Summe der Wahrscheinlichkeiten, dass von einemZustand mit derselben Leitfähigkeit wie r nach s gewechselt wurde. Der Gewichtungsfaktorf s (y) realisiert den Vergleich zwischen gemessenem und vorhergesagtem Wert. Das Amplitudenhistogrammder gemessenen Zeitreihe wird entsprechend dem Signal-Rauschverhältnisin Einzelverteilungen aufgespalten:f(y) = ∑ sf s (y) (4.7)Die Wahrscheinlichkeiten a k sind dann am größten, wenn der Strom des vorhergesagtenZustandes am besten mit dem gemessenen Strom übereinstimmt. Aus den Schätzungen füralle Punkte der Zeitreihe wird die Likelihood L für den derzeit angenommenen Satz vonRatenkonstanten berechnet:L = ∏ ∑a k (s) (4.8)k sDie Ratenkonstanten k ij werden durch einen Simplexalgorithmus solange variiert, bis dieLikelihood in Gleichung 4.8 einen Maximalwert annimmt.Jede Zeitreihe wird mit drei verschiedenen Startwerten angefittet: Eine neutrale Startposition(alle k ij =1000) und je einmal mit den Werten die für ,,normales” und ,,AMFE-Verhalten” ungefähr erwartet werden (aus Hansen et al., 2003). Der Algorithmus erwiessich jedoch als erstaunlich robust. Abgesehen von eindeutigen Fehlläufen (keine Konvergenz,Offenwahrscheinlichkeit stimmt nicht, Ratenkonstanten ≪ 1 oder ≫ 1*10 6 s −1 ) sinddie Fitergebnisse nahezu unabhängig von den Startwerten (Bei einem Modell mit zweiKanälen mit je 5 Zuständen, also insgesamt 25 Makrozuständen und 8 Fitparametern giltein Faktor 2 zwischen zwei Durchläufen noch als konstant).Die Rechenzeit des Verfahrens ist proportional zur Länge der Zeitreihe und zum Quadratder Anzahl der Zustände. Wegen der Behandlung mehrerer Kanäle als Makrokanalsteigt jedoch die Zahl der Zustände mit der Zahl der Kanäle exponentiell an. Bei einemModell mit 5 Zuständen für den Einzelkanal sind es bei zwei Kanälen 5 2 =25, bei dreiKanälen schon 5 3 =125 usw. Aufzeichnungen mit mehr als zwei Kanälen lassen sich daherauch mit neueren Computern nicht mehr in akzeptabler Zeit fitten, besonders da in dieserArbeit viele Zeitreihen ausgewertet werden sollen und zusätzlich noch die in Abschnitt4.6.3 beschriebene nachträgliche Korrektur der Ratenkonstanten durchgeführt wird, dieerfordert, daß jeder Fit mit verschiedenen simulierten Zeitreihen noch mindestens dreimalwiederholt wird.4.6.2 Zerschneiden der ZeitreihenFür die meisten Meßlösungen gelangen leider keine für den direkten Zeitreihenfit geeignetenEin- oder Zweikanalmessungen. Folgende Überlegung erlaubte es dennoch, aus Aufzeichnungenmit drei oder mehr Kanälen die Ratenkonstanten zu ermitteln (vgl. Colquhoun31

und Hawkes, 1982): Werden aus einer Mehrkanalaufzeichnung Abschnitte mit jeweils nurzwei Stromleveln (nur ein offener Kanal zur Zeit) herausgeschnitten und wieder zusammengefügt,kann das Ergebnis wie eine Einkanalmessung analysiert werden. Dabei werdennatürlich die Ratenkonstanten der langsamen Geschlossenzustände zerstört, die schnellenRatenkonstanten zwischen A,O und G bleiben jedoch im Wesentlichen erhalten.Zunächst habe ich versucht, wirklich nur die Einkanalstücke herauszuschneiden. Bei denvorliegenden 3-5-Kanalmessungen sind aber dann mitunter nur 10 Prozent einer Zeitreihebrauchbar, der Fit wird jedoch um so genauer, je mehr Ereignisse er auswerten kann. Außerdembestehen die so gestückelten Zeitreihen aus bis zu 100 Teilstücken. Da aber jederkünstliche Schnitt in der Zeitreihe ein oder zwei falsche Ereignisse erzeugt, können bei einerGesamtanzahl von manchmal nur 100-1500 Ereignissen bereits erhebliche statistische Fehlerentstehen. Aus diesen beiden Gründen bin ich nach einigen Vorversuchen dazu übergegangen,lediglich alle Stücke aus den Zeitreihen zu entfernen, die mehr als zwei offenen Kanälegleichzeitig enthalten. Die größere statistische Sicherheit wird mit einem Erhöhung des Rechenaufwandesvon einer halben Stunde (,,Einkanal” mit 4-Zustandsmodell, der langsameGeschlossenzustand Z entfernt) auf bis zu 20 Stunden (,,Zweikanal” mit 5-Zustandsmodell)auf einem 1700’er Athlon erkauft. (Trotzdem sind natürlich die Fitergebnisse für mindestensden langsamsten Geschlossenzustand Z falsch.)Beim Zusammenschneiden der Zeitreihen wurden auch gleich Abschnitte mit leichtemMembranflackern oder eine unruhigen Nullinie aus den Daten entfernt, sie hätten ansonstendie Fitergebnisse zusätzlich verfälschen können.4.6.3 Korrektur der Ratenkonstanten und Bestimmung derStromreduktionDer direkte Zeitreihenfit bietet zwar eine sehr gute zeitliche Auflösung bei der Bestimmungder Ratenkonstanten, übersteigen sie jedoch Werte von etwa 10-50 ms −1 , tretensystematische Fehler auf. Farokhi et al. (2000) simulierten Zeitreihen mit einen vorgegebenenMarkov-Modell (Abschnitte 4.1 und 4.2). Dann variierten sie die Ratenkonstanten k OGund k GO um einen gemeinsamen Faktor, und analysierten die damit simulierten Zeitreihenmit dem HMM-Fit. Das Ergebnis ist in Abb. 4.3 gezeigt. Die mit dem Fit bestimmtenRatenkonstanten (k fit auf der y-Achse) weichen von den der simulierten Zeitreihe zugrundeliegenden(k sim auf der x-Achse) mit wachsender Größe immer weiter ab. Man sieht aberauch, daß k fit mit k sim trotzdem immer noch weiter ansteigt. Die Informationen gehen alsonicht verloren, man kann das Ergebnis mit Hilfe von Simulationen noch korrigieren.Diese Korrektur der Ratenkonstanten ist in Abb. 4.4 illustriert: Die zusammengeschnittenenZeitreihen werden zunächst mit verschieden Startwerten angefittet. Die so erhaltenenk e ij sind jedoch im allgemeinen zu klein (Abb. 4.3). Daher wird mit den Fitergebnissen eineZeitreihe simuliert und diese erneut gefittet. Die schnellen Ratenkonstanten im zweiten) sind bis zum Faktor 2 kleiner als die des Fits der Originalzeitreihe. DieRatenkonstanten für die nächste Simulation (k simij ) werden also um den jeweiligen Faktorvergrößert (selten auch verkleinert), wobei darauf geachtet werden muß, daß die Offenwahr-Fitergebnis (k fitij32

Abbildung 4.3: Zur Zeitauflösung des direkten Zeitreihenfits: Bei einem gegebenen Markov-Modell wurden in Simulationen die Ratenkonstanten k OG und k GO um einen gemeinsamenFaktor variiert (k sim ). Bei hohen Ratenkonstanten sind die Fitergebnisse (k fit ) zu klein.Verändert aus: Farokhi et al. (2000).Abbildung 4.4: Flußdiagramm zur Bestimmung und Korrektur der Ratenkonstanten mitdem direkten Zeitreihenfit33

scheinlichkeit des Modells (p A +p O ) im Rahmen der Genauigkeit auf jeden Fall erhaltenbleibt und gleich der Offenwahrscheinlichkeit der Meßdaten ist. Die letzten beiden Schrittewerden so oft iteriert, bis ein Modell vorliegt, welches im Fit dasselbe Ergebnis liefert wiedie Originaldaten (k e ij).Das Endergebnis wird weiteren Tests unterzogen: Nur wenn die simulierte Zeitreihe dergemessenen für das bloße Auge (und den gesunden Menschenverstand) sehr ähnlich sieht,und sowohl die Amplituden- als auch die 2D-Dwell-Time Histogramme (Abschnitte 4.4 und4.7.3) einigermaßen übereinstimmen, sind die ermittelten Ratenkonstanten glaubhaft. Esist jedoch trotzdem durchaus möglich, daß andere k sim exakt dieselben Ergebnisse liefernkönnten, aber wie so oft muß man sich auch hier vorerst mit einer Wahrheit erster Artzufriedengeben.Beim anomalen Molfraktionseffekt (AMFE) führt die Antwort des Anti-aliasing-Filtersauf das Schaltverhalten des Kanals dazu, daß bei der Auswertung der Zeitreihen ein niedrigererStrom gemessen wird, als tatsächlich durch den Kanal geflossen ist. Wie es dazukommt, wird in den Kapiteln 6 und 7 ausführlich erläutert. An dieser Stelle ist nurwichtig zu wissen, daß man eine solche Stromreduktion nur durch die Ermittlung der Ratenkonstantender Messung und anschließenden Simulationen finden kann. Nachdem dieRatenkonstanten bekannt sind, wird mit ihnen eine Zeitreihe mit vorgegebenem Strom i simsimuliert. Nach der Simulation werden die Daten noch durch denselben Tiefpaß-Filter wiedie gemessenen Daten geschickt, so daß sie mit diesen unmittelbar vergleichbar sind (Abschnitt4.2). Im Programm ,,Patch” wird dann genau wie bei einer gemessenen Zeitreihe derEinzelkanalstrom i fit bestimmt (Abschn. 4.4). Der Quotient i fiti simgibt die Stromreduktionan.Ein BeispielZum Test, ob das Zerschneiden der Zeitreihen die Ratenkonstanten nicht verfälscht, undob die Korrektur der Ratenkonstanten funktioniert, und zur Veranschaulichung, wird dasVerfahren auf eine simulierte Zeitreihe angewendet. Der direkte Zeitreihenfit soll in dieserArbeit dazu dienen, ähnlich wie Farokhi et al. (2000) eine Stromreduktion durch Gatingnachzuweisen. Deshalb bietet es sich an, den Test an einer Zeitreihe durchzuführen, diediesen Effekt aufweist.Es wurde also mit den von Farokhi et al. (2000) im AMFE-Minimum gefundenen Ratenkonstanten(erste Zeile in Tabelle 4.1) eine Zeitreihe mit vier Kanälen simuliert. DasModell lautet:A −−⇀ ↽−−600↽−−− −−−⇀ −−⇀ ↽−− −−⇀ ↽−−O 75000G 600C 200Z100 112000 400 20Das Signal-Rausch-Verhältnis betrug 1:4, ähnlich wie bei den gemessenen Daten.Dann wurden, wie oben beschrieben, alle Stücke mit mehr als zwei gleichzeitig offenenKanälen großzügig entfernt. Die Offenwahrscheinlichkeit (rechte Spalte in der Tabelle)für die beschnittene ,,Originalzeitreihe” wurde mit dem Hinkley-Detektor (Abschnitt 4.5)ermittelt, für alle anderen Zeilen wurde p A + p O mit dem Programm ,,p geleic” direkt ausden Ratenkonstanten (Gl. 4.2) berechnet.34

Zeitreihe k AO k OA k OG k GO k GC k CG k CZ k ZC p A + p O,,Original” 600 100 75000 112000 600 400 200 20 17-18%Fitergebnis 585 105 36563 61810 656 327 154 47 17,2%Sim1 585 105 36563 61810 656 327 154 47 17,2%Fit von Sim1 499 113 24991 42689 665 302 153 42Sim2 585 105 54845 92715 656 327 154 47 17,2%Fit von Sim2 531 102 32585 55887 678 316 177 46Sim3 585 105 61426 10384 0 656 327 154 47 17,2%Fit von Sim3 630 108 33627 59717 629 280 126 42Sim4 543 102 66789 107479 684 382 188 53 17,3%Fit von Sim4 524 107 35684 61319 633 333 192 40Tabelle 4.1: Iterative Korrektur der Ratenkonstanten. Alle k ij in s −1 .i fiti simA O G C ZOriginal 1,3% 7,3% 5,2% 7,8% 78,0% 0,87normiert auf A 1 5,6 4 6 60Sim4 2,7% 14,6% 9,0% 16,2% 57,5% 0,85normiert auf A 1 5,4 3,3 6 21,3Tabelle 4.2: Vergleich der simulierten und gefitteten Besetzungswahrscheinlichkeiten.Mit dem Fitergebnis der ,,Originaldaten” wurde erneut eine Zeitreihe (mit zwei Kanälen,,,Sim1”) simuliert. Im Fit der Simulation (,,Fit von Sim1”) fällt auf, das die beiden größtenRatenkonstanten k OG und k GO mit Abstand am meisten vom Fit des ,,Originals” abweichen.In den nächsten beiden Schritten werden sie daher erst als einzige korrigiert. Imletzten Schritt (,,Sim4”) werden alle Ratenkonstanten jeweils nochmal um den Faktor (Fitdes Originals)/(Fit von Sim3) korrigiert. Der Fit von Sim4 kommt dem Fit des Originalssehr nahe, weitere Korrekturen machen keinen Sinn, da das Fitverfahren natürlich nurüber eine gewisse Genauigkeit verfügt. Vergleicht man die Ratenkonstanten von Sim4 mitdenen des Originals (die beiden fettgedrucktem Zeilen in Tabelle 4.1), so erkennt man einesehr gute Übereinstimmung. An den Besetzungswahrscheinlichkeiten (Tabelle 4.2) wird dasnoch deutlicher: Die relativen Besetzungswahrscheinlichkeiten der Zustände A, O, G undsogar C werden sehr gut reproduziert. Die Besetzungswahrscheinlichkeit des langsamenGeschlossenzustandes Z wurde durch das Zerschneiden der Zeitreihe natürlich verändert.Deshalb wurden zum Vergleich auch alle Wahrscheinlichkeiten auf den Zustand A normiert.Die letzte Spalte gibt die wie oben beschrieben bestimmte Stromreduktion an. Auch siewird gut reproduziert.Das Verfahren scheint also zu funktionieren, das Zerschneiden der Zeitreihen wirkt sichauf die schnellen Zustände A, O und G, die für die Stromreduktion im AMFE verantwortlichsind, nicht aus.35

4.7 andere Verfahren4.7.1 LeveldetektorEine Alternative zur interaktiven Levelbestimmung (Abschnitt 4.4) ist der automatischeLeveldetektor (Rießer, 1998; Woelk, 2000). Er beruht auf folgender Idee: Ein Stück Zeitreihemit Sprüngen hat eine größere Standardabweichung als ein sprungfreies Stück. Auf dieserGrundlage wird die Zeitreihe in sprungfreie Stücke zerteilt d.h., die Software des Detektorsfährt die Zeitreihe entlang und immer, wenn die Streuung größer wird als die eine vorherals sprungfrei festgelegten Sektion der Zeitreihe, wird ein Sprung gemeldet. Die Sektionenzwischen den Sprungmeldungen gelten als sprungfrei. Die sprungfreien Teilstücke werdensortiert, und aus den Mittelwerten erhält man die Stromniveaus. Dieses Programm entsprichtziemlich genau dem intuitiven Vorgehen bei der Fit-by-Eye-Methode (Abschnitt4.4). Wohl deshalb haben sich beide Methoden als nahezu gleichwertig erwiesen.Das Programm des ,,leveldet” (Rießer, 1998; Woelk, 2000) läuft leider zur Zeit nochnicht richtig stabil. Deshalb benutze ich für die Auswertung meiner Messungen ausschließlichdie Fit-by-eye-Methode.4.7.2 BetafitDas Rauschen in Patch-Clamp-Aufzeichnungen ist im allgemeinen Gauss-verteilt. Das istaber nur wahr, solange die Zeitkonstanten der Zeitreihe langsam sind im Vergleich zurAbknickfrequenz des für die Digitalisierung und zur Rauschreduktion unvermeidlichenAnti-aliasing-Filters. Der Tiefpaß folgt den eigentlich (bis auf das Rauschen) rechteckigenStromsprüngen nur träge, dadurch werden die Ecken abgerundet, und es entstehen Abtastwertezwischen den Stromniveaus (Abb. 7.1). Je mehr schnelles Schalten (also je mehrSprünge pro Zeiteinheit), desto größer wird der Anteil der Punkte zwischen den Niveaus.Durch den Filter werden also kinetische Informationen auf das Amplitudenhistogrammübertragen. Die entstehenden Verteilungen lassen sich mit der Theorie der erweitertenBeta-Verteilungen beschreiben (Rießner, 1994). Die Übergangsraten der Messung fließenals Parameter in die Beta-Verteilung an und lassen sich durch Anfitten derselben bestimmen.Dieses Verfahrens ist allerdings auf langsame Ratenkonstanten, die nur sehr geringeVeränderungen im Amplitudenhistogramm erzeugen, nicht anwendbar, seine Stärke liegtim Finden der schnellen Konstanten.Harlfinger untersucht zur Zeit die Kombination aus direktem Zeitreihenfit und Betafit.Kontrollparameter ist ein gewichteter Quotient aus der Likelihood des HMM-Fits(Abschnitt 4.6) und der quadratischen Abweichung der Amplitudenhistogramme. Durchdiesen Trick wird erreicht, daß jeweils der Algorithmus schweigt, der für den jeweiligenParameter nicht zuständig ist (der HMM-Fit bei den schnellen und der Betafit bei denlangsamen Ratenkonstanten).36

4.7.3 Dwell-time/Target-FitDie mit dem Hinkley-Detektor (Abschnitt 4.5) bestimmten Verweildauer-Histogramme(=Dwell-Time) für die einzelnen Stromniveaus sind Summen von abfallenden Exponentialfunktionen.Die Anzahl von Zeitkonstanten, die für einen guten Fit benötigt werden,gibt die Anzahl von Zuständen gleicher Leitfähigkeit an (Kijima und Kijima, 1987). DieseAnzahl benötigt der direkte Zeitreihenfit als Eingabe (Abschnitte 4.3 und 4.6) für dieBestimmung der Ratenkonstanten.Aber auch mit den Dwell-Time-Histogrammen selbst kann man kinetische Analysendurchführen. Denn die Zeitkonstanten τ i und die zugehörigen Amplitudenfaktoren berechnensich direkt aus den Ratenkonstanten k ij . Bei Modellen mit mehr als zwei Zuständenfunktioniert der umgekehrte Weg leider nicht, man kann aus den τ i die k ij nicht mehrdirekt ausrechnen, weil die dazugehörigen Gleichungen keine eindeutige Lösung besitzen(Blunck et al., 1998). Stattdessen geht man folgendermaßen vor: Aus vorgegebenen k ijwerden Dwell-Time-Histogramme berechnet und mit den gemessenen Histogrammen verglichen.Die resultierende Fehlersumme leitet einen Simplexalgorithmus bei der Wahl desnächsten Satzes der k ij . Weil dieses Verfahren direkt die Zielparameter variiert, wird esauch als Target-Fit bezeichnet (Blunck et al., 1998).Für die Analyse des AMFE (Abschnitt 6) und schnellen Ratenkonstanten allgemein istdie Zeitauflösung dieser Methode jedoch nicht ausreichend, sie liegt bei etwa 10-20 ms −1 ,während die mit dem HMM-Fit im AMFE-Minimum ermittelten Ratenkonstanten bis zu10fach schneller sind (Farokhi et al., 2000). Zur Ermittlung der Anzahl der Zustände einesKanals bleiben die Dwell-Time-Histogramme jedoch unerläßlich.Die Untersuchung von 2D-Dwell-Time-Histogrammen, bei denen nicht nur die Länge,sondern auch die Abfolge der Ereignisse berücksichtigt wird (Colquhoun et al., 2003; Huth,2003) verspricht jedoch ein Zeitauflösungsvermögen, welches dem des HMM-Fits zumindestnahekommen wird.37

Kapitel 5Effekte durch die schlechteLöslichkeit von TlNO 35.1 MeßlösungenFür die Patch-Clamp-Messungen in den Kapiteln 8, 9 und 10 wurden verschiedene Meßlösungenmit gleichbleibender Gesamtkonzentration und wechselnden K + /Tl + -Verhältnissenverwendet. Messungen an Chara-Tropfen (Abschnitt 3.2.3) gelingen erfahrungsgemäß ambesten, wenn Cl − als Anion verwendet wird. Dies war hier leider nicht möglich, da TlCl inWasser nur sehr schlecht löslich ist. Deshalb wurden Nitratsalze verwendet. Allen Meßlösungenwar 5mM CaNO 3 hinzugefügt, um die Sealbildung (Abschnitt 3.3.3) zu erleichtern. Imweiteren Text wird das Ca + häufig nicht mehr erwähnt, weil es in vergleichsweise geringerKonzentration und auf beiden Seiten symmetrisch vorliegt. Bei Messungen mit viel Thalliumauf einer und wenig auf der anderen Seite (bei konstanter Summe [K + ]+[Tl + ]=250mM)traten unerwartete Komplikationen auf: Auch gute (=hochohmige) Seals rissen spätestens30 s nach ihrer Bildung wieder auf und machten Messungen dadurch zunächst unmöglich.Wie sich herausstellte, war die Ursache ein Unterschied in der Osmolarität der Meßlösungen.Obwohl die Ionenkonzentrationen nominell auf beiden Seiten gleich waren, trat einUnterschied in der Osmolarität aufgrund der gegenüber KNO 3 niedrigeren Löslichkeit vonTlNO 3 auf. Tabelle 5.1 gibt einen Überblick über die Meßlösungen und ihre Osmolaritäten(gemessen mit dem Gefrierpunktsosmometer Osmomat 030, Gonotec, Berlin), es ist deutlichzu sehen, daß mit steigendem Thalliumgehalt die Osmolarität trotz unveränderterGesamtkonzentration abnimmt.Um Messungen dennoch zu ermöglichen, wurde der osmotische Druck je nach Bedarfdurch Hinzufügen von Mannitol auf der Thallium-Seite angeglichen. Mannitol ist ein osmotischwirksamer ungeladener Zucker, der die Membran nicht passiert, er hat also keinenEinfluß auf die Strommessungen. Vor jeder Meßreihe wurde für den Ausgleich die Differenzder Osmolaritäten der jeweiligen Bad- und Pipettenlösung aus Tabelle 5.1 berechnet. Mannitol(C 16 H 14 O 6 ) dissoziiert im Gegensatz zu den Salzen nicht, in einem Mol des Zuckerssind daher auch genau ein Mol osmotisch wirksame Teilchen enthalten. Zum Ausgleich der39

[K + ] / mM [Tl + ] / mM [Ca 2+ ] / mM Anion Osmolarität / mOsm250 0 5 NO − 3 436230 20 5 NO − 3 427150 100 5 NO − 3 41220 230 5 NO − 3 2400 250 5 NO − 3 228Tabelle 5.1: Osmolaritäten der verwendeten Meßlösungenmaximalen Differenz von 436-228=208mOsm (oberste und unterste Zeile in Tabelle 5.1)wurden daher beispielsweise 208mM Mannitol zur niederosmolaren Lösung hinzugegeben.Durch den Ausgleich der Osmolaritäten konnte die Stabilität der Sealwiderstände erheblichverbessert werden, den optimalen ,,KCl”-Status (siehe oben) erreichten sie dennochnicht.5.2 LösungswechselBei Messungen mit 100mM und mehr Tl + in der Badlösung trat ein weiteres Problemauf: Zunächst war die Lösung ganz klar. Sobald aber der Inhalt einer Chara-Zelle in dieBadlösung gedrückt wurde (zu Präparation der Tonoplastenvesikel siehe Abschnitt 3.2.3),bildeten sich sofort sternförmige Salzkristalle an den Vesikeln. Das hatte verschiedene Folgen:Waren es sehr viele Kristalle, so bedeckten sie den Boden der Meßkammer so dicht,daß das Mikroskopbild sehr dunkel wurde, und die Vesikel kaum noch zu erkennen waren.Zusätzlich war der Zugang zu den Vesikeln mit der Pipette, wenn sie unter einer Salzschichtbegraben waren, verwehrt. Meistens kamen diese beiden Probleme jedoch gar nicht erstzum Tragen, weil die scharfkantigen Kristalle, die sich extrem schnell genau am Ort derVesikel bildeten, diese zerstachen, noch bevor sie sich am Boden absetzen konnten. DerGrund für die Entstehung der Kristalle ist konnte schnell gefunden werden: Bei Präparationder Vesikel ergießt sich der gesamte Inhalt der mit Elektrolytlösung gefüllten Vakuole indie Petrischale. Algen benutzen im Gegensatz zu höheren Pflanzen aber Chlorid und nichtNitrat als Anion (z.B. Hope et al., 1966). Wie im vorigen Abschnitt bereits erwähnt, istTlCl jedoch nahezu unlöslich, und fällt daher genau am Ort der Vesikel aus und zerstörtsie. Unter diesen Bedingungen waren Messungen unmöglich, bei mehr als zehn Präparationsversuchenmit jeweils frischer Meßlösung bildete sich kein einziges intaktes Vesikel, esmußte also ein anderer Weg gefunden werden.Dieser Weg fand sich in dem bereits von Keunecke (1995) verwendeten Spülsystem:Eine Schlauchpumpe ist gegenphasig an die zwei Anschlüsse einer speziellen Meßkammerangeschlossen, sodaß an einer Seite der Kammer die alte Lösung abgesaugt wird, währendauf der anderen Seite die neue nachfließt. Die Vesikel werden zunächst in reiner K + -Lösungpräpariert. Nach etwa einer Viertelstunde, wenn die Tröpfchen sich am Boden abgesetzt undstabilisiert haben, wird vorsichtig mit der Spülung begonnen. Die Tonoplastenvesikel sindsehr weich und empfindlich. Damit sie von der Strömung nicht zerstört oder mitgerissen40

werden, muß die Pumpe mit einer sehr geringen Leistung betrieben werden. In Vorversuchenmit verdünnter Tinte wurde die notwendige Spülzeit zu 20 Minuten bestimmt. Mitetwas Glück bleiben nach dieser Zeit noch einige Vesikel übrig, an denen dann gemessenwerden kann.Wegen des damit verbundenen Aufwandes wurde diese Technik nur für die reine Tl + -Badlösung (250mM Tl + ) verwendet (230mM Tl + + 20mM K + wurde nur als Pipettenlösungeingesetzt). Bildeten sich bei anderen Badlösungen einige (wenige, weil die Tl + -Konzentration geringer war) TlCl-Kristalle, so wurde lediglich zwei- bis dreimal mit einerSpritze die Hälfte der Badlösung vorsichtig abgesaugt und durch frische ersetzt, um dasteilweise ausgefallene Tl + zu ersetzen und das ursprüngliche K + /Tl + -Verhältnis wiederherzustellen.5.3 Ionenaktivität und Osmolarität1000Osmolarität / mOsm800600400200TlNO 3KNO 3KCl00 100 200 300 400 500Konzentration / mMAbbildung 5.1: Mit dem Gefrierpunktsosmometer gemessenen Osmolaritäten von KNO 3 ,KCl und TlNO 3 . Die durchgezogene Linie gibt die Osmolarität eines (hypothetischen)idealen Elektrolyts mit Aktivitätskoeffizient f = a c = 1 an.Weil eine reduzierte Ionenaktivität die Verfügbarkeit von Ionen am Porenmund verändertund daher die Strommessungen verfälscht, habe ich versucht, die Aktivitäten von K +und Tl + in den einzelnen Meßlösungen zu bestimmen. Als messbarer Kontrollparameterdient die Osmolarität, die mit der Aktivität der Ionen in linearem Zusammenhang steht(Gl. 5.1).Normalerweise werden Ionenaktivitäten aus der Debye-Hückel-Theorie berechnet, diedie elektrostatische Abschirmung der Ionen untereinander beschreibt (z.B. Wedler, 1985).Diese Theorie ist jedoch nur für sark verdünnte Lösungen geeignet, denn sie verwendet41

als Parameter lediglich die Ladungszahl des Ions, auf die Löslichkeit nimmt sie keinenBezug. Deshalb sagt die Debye-Hückel-Theorie für Kalium und Thallium (beide z=+1) beigleicher Konzentration gleiche Aktivitäten voraus. Betrachtet, man Abbildung 5.1, so istdas offensichtlich nicht der Fall, die verwendeten Konzentrationen sind für die DH-Theoriealso zu groß.Die Debye-Hückel-Theorie geht davon aus, daß bei starken Elektrolyten das gelöste Salzvollständig in einzelne Ionen dissoziiert und hydratisiert ist. Durch den Abschirmungseffektist die elektrochemisch und osmotisch wirksame Aktivität der Ionen (a) gegenüber dernominellen Konzentration (c) reduziert. Der Aktivitätskoeffizient f = a gibt den Grad dercReduzierung an, bei starker Verdünnung nähert er sich der Eins. Die verschiedenen Näherungsgleichungender Debye-Hückel-Theorie enthalten phänomenologische Anpassungsfaktoren,die theoretisch nicht genau begründbar sind (Heyrovska, 1996). Aus diesem Grundehat Heyrovska (1996) eine ursprünglich von Arrhenius (1887) diskutierte Idee wieder aufgegriffen:Auch starke Elektrolyte dissoziieren nicht vollständig, es besteht vielmehr einDissoziationsgleichgewicht, so daß sich sowohl Ionen als auch ,,Salzmoleküle” (z.B. NaCl,CaCl 2 , entsprechen der stöchiometrischen Zusammensetzung) in Lösung befinden. Setztman die Aktivität von Wasser näherungsweise auf 1, so erhält man für einen n:m Elektrolyteinen einfachen Zusammenhang zwischen Dissoziationsgrad und Osmolarität: Wenn imReaktionsgleichgewicht bei der Konzentration c der Anteil α des Salzes dissoziiert ist, soenthält die Lösung insgesamt (n+m)×α×c Ionen und (1-α)×c übriggebliebene ,,Moleküle”,alsoφ = (n + m)αc + (1 − α)c (5.1)osmotisch wirksame Teilchen (Heyrovska, 1996). KNO 3 und TlNO 3 sind 1:1-Salze. DurchAuflösen der Gleichung erhält man die effektive Kalium- bzw. Thalliumkonzentration(=Aktivität=a) in reiner Lösung aus der Osmolarität (φ):a = αc = φ − c (5.2)Mit Gleichung 5.2 erhält man nun aus den Osmolaritäten (Abbildung 5.1) die Aktivitäten(Abbildung 5.2). Aber immer noch verhält sich Thalliumnitrat jenseits von 150mM völligirregulär, die Aktivität und damit der Dissoziationsgrad kann unmöglich negativ (Ausrufezeichenin Abb. 5.2) sein. Auch diese Theorie ist hier also nicht mehr anwendbar.Die Löslichkeit von TlNO 3 wird in der Literatur mit 95g/l=357mM (Safety Data Sheet,Fisher Scientific) angegeben. Daß in den vorliegenden Experimenten die Lösung offensichtlichschon viel früher gesättigt ist (siehe Abb. 5.1), kann zwei Ursachen haben: 1. Der Literaturwertist falsch. Das halte ich jedoch für sehr unwahrscheinlich. 2. Der Literaturwertberuht auf einer anderen Definition der gesättigten Lösung. Das ist tatsächlich der Fall: Inder Praxis wird die Löslichkeit eines Salzes nämlich folgendermaßen bestimmt (und darüberdefiniert): Die Lösung ist dann gesättigt, wenn sich am Boden des Gefäßes ein sichtbareNiederschlag absetzt, der auch durch Rühren bei gleichbleibender Temperatur nicht dauerhaftaufzulösen ist. Der Zustand der in Lösung befindlichen Teilchen, ob einzelne Ionen,,,Moleküle” oder größere Cluster wird nicht betrachtet. Die in diesem Kapitel angestellten42

400KClIonenaktivit t / mM2000a max(Tl + )!KNO 3TlNO 3-2000 100 200 300 400 500Konzentration / mMAbbildung 5.2: Ionenaktivitäten nach Gleichung 5.2 von KNO 3 KCL und TlNO 3 . Die durchgezogeneLinie gibt die Aktivität eines (hypothetischen) idealen Elektrolyts mit Dissoziationsgradα = 1 an.und im wesentlichen aus der Arbeit von Heyrovska (1996) entnommenen Berechnungen gehenaber davon aus, daß die im Wasser gelösten Teilchen entweder als hydratisierte Ionenoder als Einzel-,,Moleküle” vorliegen. Da ab einer bestimmten Konzentration die einfacheTheorie offensichtlich versagt (Abb. 5.2), vermute ich, daß das Thalliumnitrat schon unterhalbder nominalen Löslichkeit teilweise in größeren Aggregaten vorliegt. Gleichung 5.1müßte also noch durch Glieder höherer Ordnung ergänzt werden.Eine genaue Bestimmung der Ionenaktivität über die Osmolarität ist also nicht möglich.Untersuchungen mit ionenselektiven Elektroden könnten hier Klarheit bringen, aber Tl + -selektive Elektroden waren im Labor nicht vorhandenUm die Situation zumindest halbwegs zu retten, werde ich näherungsweise folgendesannehmen: Für die beiden Kaliumsalze gilt Gleichung 5.2 ohne Einschränkung, denn diezugehörige Kurven weisen keinen Knick auf, der auf Phasenübergänge oder Glieder höhererOrdnung hinweisen würde (Abb. 5.2). Für Thalliumnitrat soll Gleichung 5.2 bis zum Knickin Abbildung 5.2 gelten, damit beträgt die maximal erreichbare Thalliumaktivität also etwa90mM. Bei Konzentrationen größer als c crit =150mM (=Knick der TlNO 3 -Kurve in Abb.5.2) wird die Aktivität als konstant angenommen. In den verwendeten Mischlösungen istaber nicht die Konzentration von Tl + allein sondern das Löslichkeitsprodukt von TlNO 3(L=[Tl + ][NO − 3 ]=[Tl + ]260mM) von Bedeutung. Die kritische Grenze wird also schon frühererreicht:[T l + ] = c2 crit[NO3 − ] = (150mM)2 ≈ 90mM (5.3)260mMDie gemessenen Ströme in der Meßlösung bestehend aus 100mM TlNO 3 und 150mM KNO 343

sollten also im Rahmen der Meßgenauigkeit noch einigermaßen mit dem reinen Kaliumstromvergleichbar sein. Bei den beiden konzentrierten Lösungen mit 230 und 250mM Tl +ist jedoch mit einer deutlichen Stromreduktion zu rechnen, für die der Ionenkanal nichtverantwortlich ist.5.4 Einfluß der Ionenaktivität auf den EinzelkanalstromAbbildung 5.3: Abhängigkeit des Einzelkanalstroms von der K + Aktivität. Gemessen wurdein xxmM KCl (kursive Zahlen) und 5mM CaCl 2 in Bad und Pipette bei einer Membranspannungvon +60mV. Eingesetzte Formel und durchgezogene Linie: Ergebnis des Fits mitder Michaelis-Menten-Gleichung.Im vorhergehenden Abschnitt wird beschrieben, wie Unterschiede in der Löslichkeitvon Kalium- und Thalliumnitrat die Ionenaktivität der Meßlösungen beeinflussen. Die resultierendeelektrische Leitfähigkeit der Lösungen ließe sich jetzt berechnen (z.B. Wedler,1985). Das würde jedoch nicht viel nützen, da der Zusammenhang zwischen Leitfähigkeitdes Mediums und Einzelkanalstrom nicht zwingend linear ist (Fisahn et al., 1986; Gradmannet al., 1987; Hansen, 1986), er muß daher experimentell bestimmt werden. Dazuwurden zusätzliche Messungen in 25, 50, 100, 150, 250 und 400mM KCl (wie immer plus5mM Ca 2+ ) an excised-Patches der Tonoplastenmembran von Chara durchgeführt (Methodebeschrieben in Abschnitt 3.3). Die Abhängigkeit des bei einer Membranspannung von+60mV gemessenen Einzelkanalstroms des Chara-K + -Kanals von der K + -Aktivität in derMeßlösung ist in Abbildung 5.3 gezeigt. Die Ionenaktivität wurde aus der Konzentration44

nach Gleichung 5.2 und der KCl-Kurve in Abbildung 5.2 bestimmt. Man sieht, daß diePunkte nicht auf einer Geraden liegen, vielmehr scheint es sich um eine Sättigungskinetikzu handeln. Weil der Durchtritt eines Ions durch den Kanal im Grunde nicht anderesals eine Protein-Liganden-Reaktion ist (reaktionskinetisches Modell Hansen et al., 1981;Hansen, 1986), wird ein Michaelis-Menten-Schema für die Bindung und Loslösung des K +an das Innere der Pore angenommen (Sakmann und Trube, 1984; Lindsay et al., 1991;Gradmann et al., 1987; Fisahn et al., 1986). Die Michaelis-Menten-Kinetik für Enzymreaktionenbesagt folgendes: Bei einer Erhöhung der Substratkonzentration [S] wächst dieReaktionsgeschwindigkeit V nicht linear an, sondern gehorcht der Gleichung,V = V max ·[S][S] + K m(5.4)wobei K m die Halbsättigungskonzentration bezeichnet. Betrachten wir den durch die Bewegungvon Ionen durch ein Kanalprotein verursachten Strom, so ist jener proportional zurDurchtrittsgeschwindigkeit der Ionen durch die Pore, also der Reaktionsgeschwindigkeit V.Die Substratkonzentration ist in diesem Falle die Aktivität der Kaliumionen a(K + ). DieGleichung 5.4 läßt sich in der Tat sehr gut an die Meßdaten anpassen. Die Halbsättigungliegt bei einer K + -Aktivität von 133±20mM, entsprechend nach Abb. 5.2 einer Konzentrationvon etwa 160mM KCl, bzw. 210mM KNO 3 . Der Sättigungsstrom beträgt 12,9±0,9pA.Zu Beginn dieser Messungen stand die Hoffnung, daß die Sättigung bereits wesentlichfrüher eintritt, so daß die Reduzierung der Ionenaktivität in reiner Thalliumlösunggegenüber der in reiner Kaliumlösung sich auf diese Weise doch nicht so sehr auf die gemessenenEinzelkanalströme auswirkt. Diese Hoffnung hat sich nicht erfüllt. Der Strom beieiner Aktivität von 90mM (dem für Tl + angenommenen Maximum) beträgt in Abb. 5.3etwa 5,1pA und bei einer Aktivität von 150mM (≈250mM KNO 3 -Konzentration) schon6,8pA, also ein Drittel mehr. Es ist also so, wie am Ende von Abschnitt 5.3 gesagt: dieStröme in 230 und 250mM Tl + sind höchstwahrscheinlich zu klein im Vergleich zu den K + -Strömen gleicher Konzentration. Dies muß besonders bei der Interpretation der AMFE-Kurven in den Kapiteln 9 und 10 beachtet werden. Aber wie auch später im Abschnitt 5.6gesagt, sind die meisten Schlüsse dieser Arbeit nicht auf einen quantitativen Vergleich derEinzelkanalströme angewiesen.Eine Korrektur der Ströme wird auch deshalb nicht versucht, weil sie zu unsicher wäre.Außerdem ist nicht gesagt, daß die Sättigungskurve für Thallium (soweit meßbar, wegender begrenzten Löslichkeit) genauso aussähe wie für Kalium.5.5 Liquid-Junction-PotentialeLiquid-Junction-Potentiale treten immer dann auf, wenn zwei Lösungen mit verschiedenenIonenkonzentrationen (genauer: Aktivitäten) direkt aufeinanderstossen. Das Potential wirddurch den elektrochemischen Gradienten und durch unterschiedliche Mobilitäten der verschiedenenIonen verursacht (Kenyon, 2002). Bei Patch-Clamp-Experimenten treten sie an45

der Verbindung Referenzelektrode-Badlösung und an der Pipettenspitze (Pipettenlösung-Badlösung/Zellinneres) auf. Das an der Badelektrode auftretende Potential kann in dieserArbeit ignoriert werden, da es konstant ist und vor der Messung kompensiert wird. (Dasist nur deshalb möglich, weil in dieser Arbeit während der Messung die Badlösung nichtausgetauscht wird, dann würde sich nämlich das Potential ändern.) Das an der GrenzflächePipettenlösung/Badlösung auftretende Potential kann jedoch ein Problem darstellen. DieOffset-Kompensation (Abschnitt 3.3.2) findet statt, bevor die Pipette die Zelle berührt.Nach dem Andocken an die Membran, liegen aber ganz andere Verhältnisse vor, denndie Spannungsentstehung an der Membran ist nicht wie das LJP an die Ionenbeweglichkeitensondern an die Permeabilität der Membran für die verschiedenen Ionen gekoppelt.Da die Nullpunktskorrektur am Verstärker jedoch auf das LJP mit der Pipette im Baddurchgeführt wird, ist es nötig, das LJP zu kennen, um eine nachträgliche Korrektur desNullpunktes vorzunehmen. (Beispiel: Betrug das JLP -10mV und wurde vor der Sealbildungdurch Addition von +10mV auf Null korrigiert, so liegt später an der Membran nichtdie Kommandospannung an, sondern U kommando +10mV.)Liquid-Junction-Potentiale lassen sich mit der generalisierten Henderson-Gleichung berechnen(Gilliham, 2002):LJP = RT ∑ NF S i=1F lnz2 i u i a P i∑ Ni=1 z2 i u (5.5)ia S i∑ Ni=1S F =[(z iu i )(a S i − a P i )]∑ Ni=1 [(z2 i u i)(a S i − a P i )] (5.6)In den Gleichungen repräsentieren z,u und a die Ladungszahl, Beweglichkeit und Aktivitätdes jeweiligen Ions (P=Pipette, S=Solution=Bad).Ion z uK + 1 1Tl + 1 1,02Ca 2+ 2 0,4NO − 3 -1 0,97Tabelle 5.2: Ladungszahlen und Mobilitäten der verwendeten Ionen. Entnommen auswww.med.unsw.edu.au/PHBSoft (siehe auch Barry und Lynch, 1991)Zunächst soll die Berechnung der Potentiale nach Gleichung 5.5 für den vereinfachtenFall durchgeführt werden, daß die Ionenaktivitäten gleich den Konzentrationen sind: Weildie Ca 2+ - und NO − 3 -Konzentrationen auf beiden Seiten gleich sind, tragen sie nicht zurBerechnung des Faktors S F bei (wegen a S − a P ). Nach Tabelle 5.2 gilt aber für Kaliumund Thallium z=z 2 , und weil auf beiden Seiten der Membran die Gesamtkonzentrationengleich sind, ist S F immer gleich 1. Setzt man jetzt in Gleichung 5.5 die Werte aus Tabelle5.2 ein, und bedenkt, daß c K +c T l =250mM, so erhält man:LJP = RTFc P K + 1, 02(250mM − cP K ) + 261mMc S K + 1, 02(250mM − cS K ) + 261mM (5.7)46

Weil die Gesamtionenkonzentration auf beiden Seiten gleich bleibt und K + , Tl + und NO − 3fast identische Ionenbeweglichkeiten haben (Tabelle 5.2), sind die so errechneten Werte fürdas Liquid-Junction-Potential extrem klein. Die Werte für die verschiedenen Kombinationender Meßlösungen aus Tabelle 5.1 sind alle betragsmäßig kleiner als 0,25mV und liegendamit weit unter der Meßgenauigkeit, deshalb gebe ich sie hier nicht an.Die hier gemachte Vereinfachung, mit Konzentrationen statt mit Aktivitäten zu rechnen,ist aber nur dann zulässig, wenn die Näherung für alle Ionensorten in gleicher Weisegültig ist, also wenn nicht nur die Konzentrationen sondern auch die Gesamtaktivität aufbeiden Seiten der Membran in etwa gleich ist. Das ist aber, wie eben in Abschnitt 5.3gesagt, gerade bei den verwendeten Kalium-Thallium-Mischlösungen nicht der Fall. Deshalbist die Vereinfachung unzulässig, es muß mit den wahren Ionenaktivitäten gerechnetwerden. Da diese aber wie ebenfalls dort erläutert wegen des seltsamen Verhaltens vonTl + nicht genau bekannt sind, dürfen die nachfolgenden Ergebnisse nur als Abschätzungbetrachtet werden.Eine Rechnung für den ,,worst case”, also reine Thalliumlösung im Bad (Konzentration=250mM→ Aktivität=90mM, siehe Abbildung 5.2 und die Argumentation am Endevon Abschnitt 5.3) und reine Kaliumlösung in der Pipette (c=250mM → a=155mM, dito)ergab ein Liquid-Junction-Potential von lediglich 0,002mV. Dieses Ergebnis scheint auf denersten Blick etwas verwunderlich, ist aber recht einfach zu veranschaulichen: Das Thalliumist in seiner Aktivität deshalb reduziert, weil es als Thalliumnitrat rekombiniert, weswegendie Aktivität von NO − 3 ebenfalls reduziert ist. In beiden Lösungen haben also Nitrat unddas jeweilige Kation fast dieselbe Ionenaktivität (Die 5mM Kalzium verursachen nur einenkleinen Fehler.). Der Konzentrationsgradient der Kationen K + →Tl + ist also gleich demGradienten des Anions NO − 3 . Frei nach Nernst interpretiert, verursachen beide ein Potential,Nitrat jedoch mit umgekehrtem Vorzeichen. Da alle drei Ionensorten fast identischeBeweglichkeiten haben (Tabelle 5.2), sind beide Potentiale etwa entgegengesetzt gleich undheben sich auf. Formelmäßig wird dies dadurch realisiert, daß der Zähler des Faktors S F(beinahe) Null wird. Denn setzt man alle Beweglichkeiten gleich 1, ignoriert das Kalziumund berücksichtigt, daß a(NO 3 ) P/S = a(T l + ) P/S + a(K + ) P/S , so wird Gleichung 5.6 zuS F = (a(K)S − a(K) P ) + (a(T l) S − a(T l) P ) + (−1)[(a(T l) S + a(K) S ) − (a(T l) P + a(K) P )](a(K) S − a(K) P ) + (a(T l) S − a(T l) P ) + (−1) 2 [(a(T l) S + a(K) S ) − (a(T l) P + a(K) P )] = 0(5.8)Diese Argumentation gilt genauso für alle Mischlösungen. Da die Ionenaktivitäten dortaber noch weniger bekannt sind (siehe Abschnitt 5.3), macht es keinen Sinn, die Potentialealle auszurechnen, es ist jedoch zu erwarten, daß sie ebenfalls sehr klein sind.Dieses Ergebnis ist insofern sehr beruhigend, da jetzt davon ausgegangen werden kann,daß die in Kapitel 3.3.2 beschriebene Offset-Korrektur vor Beginn jeder Messung auch beiunterschiedlichen Meßlösungen beiderseits der Membran im Rahmen der Meßgenauigkeitrichtig war, und die Meßkurven nicht durch ein unbekanntes Potential verschoben sind.Das nach Gleichung 5.5 berechnete Liquid Junction Potential beschreibt die Spannung,die auftritt, wenn zwei verschiedene Lösungen an einer Grenze frei ineinander diffundierenkönnen. In einer engen Glaskapillarenspitze ist diese Diffusion aber durch die Wandladungendes Glases (die hier allerdings durch die Sigmacote-Beschichtung in ihrer Wirkung47

gemildert sind) verändert. Das führt zu Elektrodenspitzenpotentialen. Ihre Existenz kannüberprüft werden, indem die Elektrode gegen den Boden der Petrischale gerammt wirdund abbricht. Danach ist die Elektrode zwar nicht mehr zu gebrauchen, aber man weiß,ob Elektroden der jeweiligen Fertigungsserie zu Elektrodenpotentialen neigen. Hier brachtedas Abbrechen der Elektroden Änderungen in der Offset-Einstellung von weniger als10 mV.5.6 DiskussionDie hohe Gesamtkonzentration von 250mM verwendete Farohki um ein großes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen und konnte damit die Zeitauflösung der Messungen verbessern.Dieser Ansatz wurde für die vorliegenden Diplomarbeit übernommen, da auch hier hoheZeitauflösung angestrebt wurde. Farokhi hatte aber keine Strom-Konzentrationskurvenüber das AMFE Minimum bei 20 mM Tl + hinaus aufgenommen. Insofern kristallisiertesich während der vorliegenden Arbeit erst nach einigen Monaten heraus, daß bei der Aufnahmeeiner vollständigen Strom-Konzentrationskurve von reiner Kalium- bis zu reinenThalliumlösung durch die geringe Löslichkeit von Thalliumnitrat Probleme auftreten. AlleStröme, die bei Thalliumkonzentrationen über 100mM gemessen wurden, sind also vermutlichgegenüber dem Strom der reinen Kaliumlösung schon durch die geringere Ionenaktivitätder Meßlösung und der damit verbundenen schlechteren Verfügbarkeit der Ionen amPorenmund reduziert. Dies erschwert etwas die Interpretation der AMFE-Kurven in denKapiteln 9 und 10. Andererseits stellte sich heraus, daß die wichtigsten Erkenntnisse überdie Thallium-Bindungsstellen trotzdem gezogen werden können. Insofern erwies es sich alsnicht allzu schwerwiegend, dass die Zeit nicht mehr ausreichte, um die Messungen bei einerniedrigeren Gesamtkonzentration zu wiederholen.Glücklicherweise stellte sich zusätzlich auch noch heraus, daß die durch unterschiedlicheIonenaktivitäten in Bad und Pipette entstehenden unerwünschten Liquid-Junction-Potentiale keine nennenswerte Größe haben, und daher bei der Interpretation der Meßergebnissein den folgenden Kapiteln vernachlässigt werden können.48

Kapitel 6Der anomale MolfraktionseffektDie meisten Ionenkanäle sind stark selektiv (Abschnitt 2.3.1, leiten oft jedoch auch unphysiologischeIonen (also solche, die im Organismus normalerweise nicht vorkommen), solangediese eine ähnliche Hydrathülle besitzen (Hille, 1992). Normalerweise hat der Kanal dannaber für die verschiedenen Ionensorten verschiedene Permeabilitäten (Leitfähigkeiten), d.h.in reiner Lösung gleicher Konzentration erhält man für verschiedene Ionensorten verschiedeneStröme. In einer Mischlösung würde man also erwarten, daß sich die einzelnen Strömeentsprechend der Molfraktionen einfach addieren.Unter dem anomalen Molfraktionseffekt (AMFE) wird nun folgendes Phänomen verstanden:Die Einzelkanalleitfähigkeit verläuft als Funktion des Verhältnisses der Konzentrationzweier etwa gleich permeabler Ionensorten bei konstanter Gesamtkonzentrationnicht wie erwartet linear, sondern durch ein Minimum (Hille, 1992, siehe beispielsweiseAbb. 6.1). Der AMFE tritt in K + /Tl + -Lösungen sowohl bei pflanzlichen (Tester, 1988;Draber et al., 1991) als auch bei tierischen Kanälen (Hagiwara et al., 1977) auf. Aber auchK + /Rb + - oder NH + 4 /Rb + -Lösungen lösen bei Kaliumkanälen einen AMFE aus (Wagonerund Oxford, 1987; Eisenman et al., 1986). Im Ca 2+ -Kanal (Ca 2+ /Ba 2+ : Friel und Tsien,1989; Hess und Tsien, 1984) und im Cl − -Kanal (Cl − /SCN − : z.B. Dietrich und Hedrich,1998) wurde der Effekt ebenfalls beobachtet.Das Ziel all dieser Untersuchungen ist es, ein mechanistisches Modell zu finden, welchesausgehend von der Proteinstruktur das Verhalten des Kanals erklärt. Zunächst mußjedoch eine viel grundlegendere Frage geklärt werden: Wie ,,echt” sind die Meßdaten? DieStromreduktion im Minimum der AMFE-Kurve kann zwei Ursachen haben: Ein sogenannterPermeationseffekt liegt dann vor, wenn der wahre Stromfluß durch den offenen Kanalkleiner wird, also der durchschnittliche Abstand der Ionen sich vergrößert. Bei Kanälen,die sehr schnell zwischen dem Offen- und Geschlossen-Zustand hin- und herschalten, kannes aber auch passieren, daß in den durch den im Meßaufbau vorhandenen Tiefpaß gefiltertenDaten später das Schalten nicht mehr zu erkennen ist. Der Filter nimmt danneine Zeitmittelung über den Strom vor, und als Ergebnis mißt man einen reduzierten Einzelkanalstrom.In diesem Fall, wenn eine scheinbare Stromreduzierung bei in Wahrheitunverändertem Einzelkanalstrom durch schnelles Schalten hervorgerufen wird, spricht manvon einem Gating-Effekt.49

Beim AMFE war lange Zeit nicht klar, welcher der beiden Effekte vorliegt. Bis Farokhiet al. (2000) nachweisen konnten, dass es sich um Gating und nicht um Permeation handelt,wurden für beide Varianten verschiedene Modelle entwickelt. Im folgenden werden einigeder bisherigen Ergebnisse über den K + /Tl + -AMFE (in erster Linie bei pflanzlichen Zellen)exemplarisch vorgestellt, eine genauere Behandlung der Modelle dazu erfolgt in Kapitel 7.6.1 Bisherige Meßergebnisse zum K + /Tl + -AMFE6.1.1 Ergebnisse von HagiwaraAbbildung 6.1: Membranleitfähigkeit einer Eizelle von Mediastera aequalis in einer K + /Tl + -Badlösung (Gesamtkonzentration 25mM). Die Einstichelektrode enthielt 4M KAc. Die dasMinimum erzeugende Tl + C-Molfraktion T lC T l +C Khängt von der Membranspannung ab (•:-70mV, ◦: -90mV, ×: -100mV). Aus: Hagiwara et al. (1977).Hagiwara et al. (1977) beobachteten bei Messungen mit Einstichelektroden an Eizellendes Seesterns Mediastera aequalis einen K + /Tl + -AMFE (Abb. 6.1). Sie variierten in derBadlösung die relativen Konzentrationen von Kalium und Thallium bei einer konstantenGesamtkonzentration von [K + ]+[Tl + ]=25mM. Das Minimum der Leitfähigkeit liegt näheran der reinen Kalium- als an der Thalliumlösung und verschiebt sich mit negativer werdendemMembranpotential zu immer kleineren Thalliumkonzentrationen.Zur Erklärung schlugen Hagiwara et al. ein Modell mit drei externen Bindungsstellenvor, deren Besetzung mit Kalium oder Thallium die Permeabilität zugunsten des jeweilsbesetzenden Ions verändert. Die Lage des Minimums bei kleinen Thalliumkonzentrationerklärten sie mit größeren Bindungskonstanten für Thallium. Dieses Modell war denGating-Modellen aus Hansen et al. (2003) (siehe Abschnitt 7.2) bereits sehr ähnlich, die50

Frage ,,Gating or Permeation?” (Farokhi et al., 2000) wurde damals jedoch noch nichtexplizit gestellt.6.1.2 Ergebnisse von Tester3,53,02,5G/S m -12,01,51,00,50,00,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0[Tl] ext/([Tl]+[K]) extAbbildung 6.2: Leitfähigkeit einer Chara-Zelle bei einer Membranspannung von etwa -30mV für verschiedene K + /Tl + -Verhältnisse in der Badlösung ([K + ]+[Tl + ]=5mM). Aus:Tester (1988).Tester (1988) fand als erster den AMFE an Kaliumkanälen in Chara, allerdings amPlasmalemma. Er maß die Leitfähigkeit der Zellmembran bei einer Gesamtkonzentrationvon 5mM in der Badlösung und stellte fest, daß sowohl das Ruhepotential (bei dem keinStrom fließt) als auch die Membranleitfähigkeit bei Veränderung des K + /Tl + -Verhältnissesein Minimum durchlaufen (Abbildung 6.2). Dies deutete er ebenso wie den von ihmuntersuchten Cs + -Effekt am selben Meßobjekt als Beweis für das Permeationsmodell vonHille und Schwarz (1978) (Abschnitt 7.1.1).6.1.3 Ergebnisse von KeuneckeMessungen von Draber (1990) am Plasmatropfen von Nitella hatten zum Verdacht geführt,daß die Stromreduktion beim AMFE durch die niedrige Filterfrequenz (1kHz) unentdecktesschnelles Schalten verursacht wird.In der Hoffnung, das vermutete schnelle Schalten aufzulösen, wiederholte Keunecke(1995) die Messungen am Plasmatropfen von Chara mit dem von Albertsen (1994) verbessertenDatenaufnahmesystem bei einer Filterfrequenz von nunmehr 50kHz. Im Gegensatzzu Draber verwendete sie zudem die excised-Patch- und nicht die on-cell-Konfiguration(Abb. 3.1), sodaß das Membranpotential genau bekannt war. Trotz der hohen Zeitauflösung51

Abbildung 6.3: Der anomale Molfraktionseffekt an der Grünalge Chara Corallina bei verschiedenenSpannungen (Keunecke, 1995). Tl + cyt wurde im Bereich von 0 bis 150 mM variiert,die Pipette enthielt 150mM K + . Die Messungen zeigen eine Symmetrie bzgl. derNullinie. Die Lage des Minimums bleibt im Bereich von 10mM Tl + für verschiedene Spannungenerhalten.trat der AMFE wieder auf (Abb. 6.3), wobei das Minimum der Leitfähigkeit bei 3 bis 6%Tl + lag und bei höheren Spannungswerten stärker ausgeprägt war. Bei einseitiger Tl + -Gabe trat der AMFE bei positiven und negativen Spannungen auf, die Lage der minimalenLeitfähigkeit war spannungsunabhängig (Abb. 6.3).Da trotz der erheblich verbesserten Zeitauflösung die Stromreduktion weiterhin auftrat,schien ein Permeationsmechanismus wieder wahrscheinlicher. Keunecke versuchte daher,das Permeationsmodell von Wu (1992) auf den AMFE anzuwenden (Abschnitt 7.1.2).Auf diese Weise konnte die Konzentrationsabhängigkeit jedoch nicht für den gesamtenSpannungsbereich erklärt werden. Zusätzlich stellte Keunecke fest, daß die Daten vomCl − /SCN − -AMFE des Cl − -Kanals in Vicia faba (Dietrich und Hedrich, 1998) ebenfallsnicht mit einem Permeationsmechanismus in Einklang zu bringen waren, so daß die erstmalsvon Draber et al. (1991) geäußerte Vorstellung eines Gating-Modells wieder in Betrachtgezogen wurde.Keunecke (1995) ermittelte aus ihren Daten mittels einer Dwell-Time-Analyse (Abschnitt4.7.3) in reiner K + - und Tl + -Lösung je einen schnellen und einen langsamen OffenundGeschlossenzustand. Die schnelle Zeitkonstante war in der Mischlösung aus K + - und52

Tl + -Ionen nicht mehr nachzuweisen. Es bestand die Möglichkeit, dass die schnelle Zeitkonstantehier nicht mehr im Bereich der zeitlichen Auflösung des Detektors lag. Diesesscheinbare Verschwinden der schnellen Zeitkonstanten in der Mischlösung war ein weitererGrund, die Suche zu intensivieren, ob beim AMFE nicht doch unentdecktes schnellesSchalten vorliegt (Hansen et al., 1997).6.1.4 Ergebnisse von FarokhiEinen weiteren Hinweis darauf, daß der AMFE durch schnelles Schalten verursacht wird,fand Farokhi (1998) in seiner Diplomarbeit: Bei 7 ◦ C deckten sich die Stromspannungskurvender reinen Kaliumlösung und der Mischlösung, es trat also keine Stromreduktion mehrauf. Dies führte er darauf zurück, daß bei niedrigeren Temperaturen molekulare Prozesselangsamer ablaufen (z.B. Adam et al., 1995) und dadurch die Zeitauflösung bei 7 ◦ Causreichend war.Interessant ist, daß in seinen Kontrollmessungen bei Zimmertemperatur im Widerspruchzu den Ergebnissen von Keunecke (1995) (Abschnitt 6.1.3) der AMFE bei einseitigerThalliumgabe bezüglich der Membranspannung asymmetrisch war und nur dann auftrat,wenn die Mischlösung in die Pore hineingezogen wurde (dies führte mit zur Entwicklungder beiden foot-in-the-door-Modelle in Hansen et al., 2003, Kapitel 7.2). Der Grund hierfürblieb ungeklärt, zumal in den Meßergebnisse der vorliegenden Arbeit wieder dieselbe Symmetriewie bei Keunecke auftritt (Kapitel 9).Das vermutete schnelle Schalten mit Hilfe des direkten Zeitreihenfits (Abschnitt 4.6)endlich aufzulösen, gelang Farokhi dann im Rahmen seiner Dissertation (Farokhi, 2002;Farokhi et al., 2000; Hansen et al., 2003). Die Ergebnisse dieser Arbeiten sind in Abschnitt7.2 genauer dargestellt.53

Kapitel 7Kanalmodelle zum AMFEAbbildung 7.1: Darstellung der Reduzierung des Einzelkanalstroms verursacht durchschnelles Schalten. Die Kreuze sind die Abtastwerte. ,,f” kennzeichnet das volle Niveauund ,,s” die scheinbare niedrigere Leitfähigkeit (Hansen et al., 1997).Wie schon zu Beginn des vorigen Kapitels erwähnt, entsprechen die aus der Zeitreihebestimmten scheinbaren Einzelkanalströme (Abschnitt 4.4) nur dann dem wahren Einzelkanalstrom,wenn die Zeitauflösung bei der Datenaufnahme ausreichend ist. Bei sehrkurzen Schaltereignissen erreicht der gemessene Strom aufgrund des unvermeidlichen Anti-Aliasing-Filters (Abschnitt 3.3.3) nicht mehr das wahre Stromniveau:Der Effekt des schnellen Schaltens wird durch Betrachtung der Antwort des Filters beiKanalöffnungen mit unterschiedlichen Längen deutlich (Abb. 7.1). Die Daten werden inäquidistanten Zeiten abgetastet. Bei langsamen Ereignissen (links in Abb. 7.1) erreicht derGroßteil der Abtastpunkte den korrekten Wert (f) des Einzelkanalstroms. Es werden auchdie Dauer und die Anzahl der Ereignisse, z.B. durch einen Hinkley-Detektor (Abschnitt4.5), richtig erkannt. Wenn die Länge der Ereignisse kürzer wird, erreichen mehr undmehr Abtastpunkte nur noch Werte, die tiefer liegen. Im Falle schnellen Flickerns, wenndie durchschnittliche Verweildauer im Offen- und Geschlossenzustand kürzer ist als dieAnsprechzeit des Tiefpaßfilters (rechts in Abb. 7.1), wird das volle Stromniveau gar nichtmehr erreicht. Es wird ein scheinbar erniedrigter Strom gemessen, dessen Wert von der55

Offenwahrscheinlichkeit des Kanals während des schnellen Flickerns abhängt. PermeationsundGating-Modelle können bei dieser Auflösung nicht mehr ohne weiteres unterschiedenwerden, beide Modelle können zu einer Reduzierung des Einzelkanalstroms führen.7.1 PermeationsmodelleLange Zeit wurde davon ausgegangen, daß die Reduzierung des Einzelkanalstroms beimAMFE echt ist, i.e., daß sich beim offenen Kanal der durchschnittliche Zeitabstand zwischenden Ionen vergrößert, also die Leitfähigkeit in der Mischlösung verringert ist. Die zweiwichtigsten Permeationsmodelle sollen im folgenden kurz vorgestellt werden.7.1.1 Das Modell von Hille und SchwarzDas Multi-Ion-single-File-Modell wurde 1978 von Hille und Schwarz vorgeschlagen. Esgeht vom Kanal als starrem Gebilde mit mehreren Bindungstellen innerhalb der Pore aus.Es dürfen sich mehrere Ionen zugleich in der Pore befinden (Multi-Ion), können sich jedochnicht aneinander vorbeibewegen (single-File). Damit ein Ion den Kanal verlassen undein Strom fließen kann, muß es vom nachfolgenden Ion aus der Bindungsstelle verdrängtwerden. Der AMFE wird in diesem Modell so erklärt, daß sich Ionen mit gleichen Bindungsenergieneffektiver gegenseitig verdrängen können. In einem Ionengemisch kann dasschwachbindende Ion das stärker bindende Ion schwerer vertreiben. So wird die Verweildauerder Ionen an den Bindungsstellen größer, der Strom also kleiner.Draber et al. (1991) waren die ersten, die an Nitella Einzelkanalmessungen zum AMFEdurchführten. Sie fanden, dass das Hille-Schwarz-Modell die Symmetrie der Stromspannungskurvennicht erklären konnte. Stattdessen nahmen sie ein Gating-Modell, das sogenannteLazy-State-Modell (Hansen et al., 1983) an. Zwar war die damalige Zeitauflösungauf 1 kHz beschränkt und die cell-attached-Messungen (Abb. 3.1) verhinderten die genaueKenntnis der tatsächlichen Membranspannung, aber trotzdem enthielt ihr Modell schon diewesentlichen Elemente der in Hansen et al. (2003) zur Erklärung herangezogenen Mechanismen,nämlich eine allosterische Bindungsstelle, die das Öffnen und Schließen des Kanalsreguliert.7.1.2 Das Wu-ModellDas Wu-Modell (Wu, 1992, 1991) nimmt nur eine Bindungsstelle für das permeierendeIon im Kanal an. Der Transport von Ionen durch die Pore findet statt, wenn ein vonder Temperaturbewegung getriebenes Ion seine kinetische Energie auf das gebundene Ionüberträgt und dann selbst an der Bindungstelle verbleibt. Dies funktioniert so bei gleichenIonen. Doch wieder kann das ,,schwächere” (Masse, Bindungskraft) Ion das andere mitgeringerer Wahrscheinlichkeit von der Bindungsstelle verdrängen (übertragbare Energie ∝Masse). So bleiben einige Transportschritte in Mischlösungen aus, und der mittlere Stromsinkt.56

In ihrer Diplomarbeit zeigte Keunecke (1995) jedoch, daß auch dieses Modell nicht inder Lage ist, das Auftreten des AMFE über den gesamten Spannungsbereich zu erklären(Abschn. 6.1.3).7.2 Die fünf Gating-Modelle aus Hansen et al. (2003)Im Gegenteil zu den Permeationsmodellen gehen Gating-Modelle davon aus, daß die Leitfähigkeit,also der mittlere zeitliche Abstand der Ionen, unverändert bleibt. Vielmehr sinddie Kanalöffnungen unterbrochen von kurzen Phasen der Inaktivität (Farokhi et al., 2000).Die Stromreduzierung im AMFE kommt hier durch eine Verringerung der Offenwahrscheinlichkeitwährend des schnellen Schaltens zustandeFarokhi et al. (2000) konnten nachweisen, daß das Hille-Schwarz-Modell und alle anderenPermeationsmodelle zumindest für den AMFE des Chara-Kanals falsch sind. Fürdie Analyse der Patch-Clamp-Zeitreihen mit dem HMM-Fit (Abschnitt 4.6) legten sie einFünf-Zustandsmodell (AOGCZ, siehe Abschnitt 4.1) zugrunde. Die Wahl des Modells wirdin Farokhi et al. (2000) begründet.Abbildung 7.2 zeigt die für das AOGCZ-Modell ermittelten Ratenkonstanten von achtZeitreihen an excised-Patches von Chara (Farokhi et al., 2000). Für reine Kaliumlösungund im AMFE-Minimum (jeweils gleiche Lösungen in Bad und Pipette) wurde die Analysebei ±80 und ±100mV durchgeführt. Mit der in Kapitel 4.6.3) beschriebenen Methode,wurde aus den für die Mischlösung ermittelten Ratenkonstanten eine Stromreduktion von14-25% ermittelt, die sich gut mit der gemessenen Stromreduktion im AMFE-Minimumgegenüber der reinen Kaliumlösung (Keunecke, 1995, Abschn. 6.1.3) deckt. Die Ursachedieser Reduktion ist in der Besetzungswahrscheinlichkeit der Zustände zu suchen (Zahlenin Prozent über den Zustandssymbolen in Abb 7.2): (Farokhi et al., 2000, Abb.7.1). DerChara-Kanal besitzt einen schnellen (O) und einen langlebigen Offenzustand (A). In reinerKalium- oder Thalliumlösung ist der langsame recht häufig besetzt (obere beiden Zeilenin Abb. 7.2) und ermöglicht so eine korrekte Strombestimmung. Im AMFE-Minimumändern sich die Ratenkonstanten k ij derart, daß dieser Zustand aber nur noch sehr selteneingenommen wird(unten in Abb 7.2), so daß bei den kurzen Besuchen im schnellen Offenzustandnur noch der im Zeitmittel reduzierte Strom gemessen wird (siehe Abb.7.1). DieBesetzungswahrscheinlichkeiten der Zustände berechnen sich aus den Ratenkonstanten desMarkov-Modells nach Gleichung 4.2.Für diese Modulation des Gating-Verhaltens werden in Hansen et al. (2003) fünf Modellevorgeschlagen und diskutiert. Aus der experimentellen Überprüfung des noch relativüberschaubaren Modells 1, welches von einer unmittelbaren Wirkung der Ionenbindung amKanalprotein auf das Gating ausgeht, ergaben sich einige Widersprüche, die Erweiterungender Theorie nötig machten. Diese führten schließlich zur Entwicklung der Modelle 3 bis 5,die bisher noch keine Widersprüche zu den Meßdaten aufweisen. Dafür war es nötig, anzunehmen,daß der Zustand des Kanals nicht direkt von der Besetzung der Bindungsstellenabhängt, sondern daß die Ratenkonstanten des AOGCZ-Modells durch die durchschnittlicheBesetzung moduliert werden. Die verantwortlichen Bindungsstellen werden bei Modell57

Abbildung 7.2: Ratenkonstanten (in s −1 ) des Chara-Kanals in reiner K + und in Mischlösungbei verschiedenen Membranspannungen. Zugrundegelegt wurde ein AOGCZ-Modell (A,O:Offenzustände; G,C,Z: Geschlossenzustände). Die Zahlen über den Zuständen geben dieBesetzungswahrscheinlichkeit in Prozent an. Aus: Farokhi et al. (2000).3 außen am Kanal vermutet (es wird jedoch noch offengelassen ob auf cytosolischer oderluminaler Seite). Modell 5 hingegen nimmt an, daß eine Wechselwirkung zwischen der Poreund der sie passierenden Ionen vorliegt. Zwischen den Modellen 3 bis 5 konnten Hansenet al. (2003) vorerst noch keine Entscheidung treffen. Die Untersuchung einiger Vorhersagendieser Modelle bezüglich der Selektivität und der Lokalisation der Bindungsstellen istAufgabe dieser Diplomarbeit.7.2.1 Modell 1: Direkter Einfluss der Ionenbindung auf das GatingDas sogenannte 4-Segment-Modell (Çakan, 2002), geht von einem Kanal aus, der aus vieridentischen Untereinheiten besteht, welche jeweils eine Bindungsstelle für Kalium oderThallium besitzen. Ferner wird angenommen, daß die Besetzung der Bindungsstellen direktden Zustand des Kanals (offen oder geschlossen) bestimmt.Ein Besetzungszustand des Modells wird mit [κK, 4-κ-φT, φF] notiert. Damit ist gemeint:κ Bindungsstellen sind mit Kalium besetzt, φ sind unbesetzt und die restlichen 4-κ-φtragen ein Tl + . Nullen werden der Kürze halber weggelassen, z.B.: [4K]=[4K, 0T, 0F]. Die58

Steady-State-Besetzungswahrscheinlichkeiten für jede einzelne Bindungsstelle ergeben sichaus den Ratenkonstanten für die Ionenbindung:p K =p T =p F = 1 − p K − p T l =k Kk −K[K + ]1 + k Kk −K[K + ] + k T lk −T l[T l + ]k T lk −T l[T l + ]1 + k Kk −K[K + ] + k T lk −T l[T l + ]11 + k Kk −K[K + ] + k T lk −T l[T l + ](7.1)(7.2)(7.3)Dabei sind p X die Wahrscheinlichkeiten für den Zustand X (K, T oder F) der Bindungsstelle,die k x , k −x sind die Ratenkonstanten für die Bindung und Loslösung der Ionensortex (K + oder Tl + ). Unter der Annahme, daß die Bindungsstellen jeweils unabhängigvoneinander besetzt werden (keine Kooperativität), ergibt sich die Wahrscheinlichkeit desGesamtzustandes [κK, 4-κ-φT, φF] als Produkt der Einzelwahrscheinlichkeiten:p(κ, 4 − κ − φ, φ) = p κ K · p 4−κ−φT· p φ F(7.4)Wenn sich der Kanal im Zustand des schnellen Schaltens befindet, nimmt der Filter eineMittelung über die Offen- und Geschlossenströme vor, gewichtet mit den Besetzungswahrscheinlichkeiten.Analog läßt sich der scheinbare Einzelkanalstrom über eine Mittelung derden Zuständen [κK, 4-κ-φT, φF] zugeordneten Einzelkanalströme I(κ ,4-κ-φ ,φ) über einesolche Mittelung berechnen:I =κ+φ=4∑κ,φ=0p(κ, 4 − κ − φ, φ) · I(κ, 4 − κ − φ, φ) (7.5)Freie Parameter in diesem Modell sind also die Reaktionskonstanten der Ionenbindungund die den Zuständen [κK, 4−κ−φT, φF ] zugeordneten Einzelkanalströme. Die vorliegendeModellierung wurde von Çakan (2002) in seiner Diplomarbeit vorgenommen. Abbildung7.3 zeigt seinen besten Fit an die Meßdaten von Keunecke (1995). Obwohl das Modell 1einen sehr guten Fit der gemessenen AMFE-Kurve ermöglicht, erwies es sich doch als zueinfach. Hier zeigte sich, dass es wichtig ist, neben der AMFE-Kurve auch das Zeitverhaltenzu berücksichtigen. Es war die von Modell 1 postulierte Abhängigkeit der Ratenkonstantenvon den Aktivitäten der Ionen K + und Tl + , die zur Falsifizierung des Modells führte:In Abb. 7.3 wurden 5 verschiedene Zustände mit einer Leitfähigkeit versehen. In reinerKaliumlösung existieren aber naturgemäß nur die Zustände 3KF und 4K, die in Hansenet al. (2003) den beiden Offenzuständen A und O des Markov-Modells zugeordnet werden.Die Zuordnung A=4K und O=3KF bedeutet, daß das Verhältnis der Ratenkonstantenk AOk OA= k Kk −K[K + ] proportional zur Kaliumkonzentration ist. Farokhi (2002) führte also Messungenin 25 und 250mM Kalium durch, fand aber nicht annähernd den erwarteten Faktor10 in den Ratenkonstanten vor.59

Abbildung 7.3: Die beste von Çakan (2002) mit Modell 1 gefundene Fit (durchgezogeneKurve) Anpassung an die Meßdaten von Keunecke (1995). Die den Zuständen für die Berechnungdes scheinbaren Stroms mit Gleichung 7.5 zugeordneten Ströme sind in der Graphikangegeben. Die Ratenkonstanten für die Ionenbindung für diese Kurve sind: k T =400,k −T =250, k K =40, k −K =250 (in s −1 ).Das gleich Bild ergab sich im Vergleich von Messungen in 250mM Kalium und 250mMThallium. Die Theorie mit den aus dem Fit bestimmten Parametern (Abbildung 7.3) forderteine zehnmal größere Bindungskonstante für Thallium als für Kalium. Aber auch indiesen Messungen trat keine signifikante Änderung des Verhältnisses k AO /k OA auf (Farokhi,2002).Modell 1 ist also falsch.7.2.2 Modell 2: Nichtlinearer Effekt der Ionenbindung auf dasGatingEine Möglichkeit, die einfache Grundidee von Modell 1 doch noch zu retten, war dieEinführung einer Sättigungskinetik in die Reaktionen an den Bindungsstellen. Dabei wirdentweder in die Bindungs- oder die Loslösungsreaktion ein langsame Konformationsänderungdes Proteins eingefügt, dessen Reaktionsgeschwindigkeit nicht von der Ionenkonzentrationabhängt.Dieses Modell entkoppelt das Verhältnis k OA /k AO von der Gesamt-Ionenkonzentration,und hebt somit den Widerspruch zwischen Modell 1 und den Meßdaten auf. Jedoch trittwieder ein ähnliches Problem auf: Farokhi et al. (2000) beobachteten daß sich k OA /k AOsehr wohl ändert, und zwar beim Übergang von reiner K + - zur Mischlösung. Modell 2 läßt60

k OA /k AO aber annähernd konstant, stattdessen ändert sich die Ratenkonstante k OG , die inden Messungen jedoch relativ konstant blieb (Abb. 7.2).Modell 2 ist also auch unwahrscheinlich, deshalb wird im folgenden Modell 3 die Kopplungzwischen den Ratenkonstanten der Ionenbindung und denen des AOGCZ-Modellsaufgehoben.7.2.3 Modell 3: Modulation des Gatings durch IonenbindungVorläufer: Diskretes aggregiertes Markov-ModellDieses Modell geht von einem ganz anderen Ansatz als seine beiden Vorgänger aus. Esnimmt an, dass der Kanal allein schon durch die temperaturgetriebene Proteinvibrationständig zwischen den fünf Zuständen des Markov-Modells hin- und herschaltet. Die Ionenbindungverändert die Ratenkonstanten dieser Übergänge. Daraus ergibt sich ein Markov-Modell, das aus verschiedenen Kopien des Basis-Schemas A-O-G-C-Z mit in jeder Kopieveränderten Ratenkonstanten besteht. Um die unübersehbare Zahl der Zustände etwaszu reduzieren, wird angenommen, dass der leere Zustand F selten ist. Das resultierendeMarkov-Schema ist in Gleichung 7.6 wiedergegeben.A 0Tk 0TAO−−−−⇀ ↽−−−−k 0TOAO 0Tk 0TOG−−−−⇀ ↽−−−−k 0TGOG 0Tk 0TGC−−−−⇀ ↽−−−−k 0TCGC 0Tk 0TCZ−−−−⇀ ↽−−−−k A T ⇃↾ kA −T k O T ⇃↾ kO −T k G T ⇃↾ kG −T k C T ⇃↾ kC −T k Z T ⇃↾ kZ −TA 1Tk 1TAO−−−−⇀ ↽−−−−k 1TOAO 1Tk 1TOG−−−−⇀ ↽−−−−k 1TGOG 1Tk 1TGC−−−−⇀ ↽−−−−k 1TCGC 1Tk 0TZGk 1TCZ−−−−⇀ ↽−−−−k A T ⇃↾ kA −T k O T ⇃↾ kO −T k G T ⇃↾ kG −T k C T ⇃↾ kC −T k Z T ⇃↾ kZ −TA 2Tk 2TAO−−−−⇀ ↽−−−−k 2TOAO 2Tk 2TOG−−−−⇀ ↽−−−−k 2TGOG 2Tk 2TGC−−−−⇀ ↽−−−−k 2TCGC 2Tk 1TZGk 2TCZ−−−−⇀ ↽−−−−k A T ⇃↾ kA −T k O T ⇃↾ kO −T k G T ⇃↾ kG −T k C T ⇃↾ kC −T k Z T ⇃↾ kZ −TA 3Tk 3TAO−−−−⇀ ↽−−−−k 3TOAO 3Tk 3TOG−−−−⇀ ↽−−−−k 3TGOG 3Tk 3TGC−−−−⇀ ↽−−−−k 3TCGC 3Tk 2TZGk 3TCZ−−−−⇀ ↽−−−−k A T ⇃↾ kA −T k O T ⇃↾ kO −T k G T ⇃↾ kG −T k C T ⇃↾ kC −T k Z T ⇃↾ kZ −TA 4Tk 4TAO−−−−⇀ ↽−−−−k 4TOAO 4Tk 4TOG−−−−⇀ ↽−−−−k 4TGOG 4Tk 4TGC−−−−⇀ ↽−−−−k 4TCGC 4Tk 3TZGk 4TCZ−−−−⇀ ↽−−−−k 4TZGZ 0TZ 1TZ 2TZ 3TZ 4T(7.6)Die Struktur des Modells 3 ist ähnlich dem allgemeinen allosterischen Modell des CNG-Kanals, das von Ruiz und Karpen (1999) vorgeschlagen wurde, oder des Ca 2+ -aktiviertenBK-(Maxi-K-)Kanals (Moss und Magleby, 2001), von dem angenommen wird, dass er ähnlichdem Chara-Kanal ist. Die Komplexität des Modells in Formel 7.6 ist viel höher alsdie des Modells 1. Jedoch kann, wie von Magleby (2001) ausgeführt wird, Komplexitätmanchmal zur Einfachheit führen, vor allem, wenn das komplexe Modell die strukturellenEigenschaften des Proteins in Betracht zieht.61

Im Falle reiner Lösungen schrumpft das Schema wieder zu einem einfachen 5-Zustandsmodellzusammen. Die Ratenkonstanten, die aus der Zeitreihe erhalten werden, sind direktdiejenigen des Reaktionsschemas der entsprechenden Zeile in Gleichung 7.6 (4K=0T):A 4Kk4K AO−−⇀ ↽−−k 4KOAO 4Kk4K OG−−⇀ ↽−−k 4KGOG 4Kk4K GC−−⇀ ↽−−k 4KCGC 4Kk4K CZ−−⇀ ↽−− Z 4K (7.7)k 4KZGA 4Tk4T AO−−⇀ ↽−−k 4TOAO 4Tk4T OG−−⇀ ↽−−k 4TGOG 4Tk4T GC↽−− −−⇀k 4TCGC 4Tk4T CZ−−⇀ ↽−− Z 4T (7.8)Die scheinbaren Ratenkonstanten in Mischlösungen ergeben sich aus Formel 7.6 (Hansenet al., 2003):k AO = k0T AO p0T Ak OA = k0T OA p0T O+ k1T AO p1T Ap 0TA+ p1T A+ k1T OA p1T Op 0TO+ p1T O+ k2T AO p2T A+ p2T A+ k2T OA p2T O+ p2T Ok 4TZG+ k3T AO p3T A+ p3T A+ p4T A+ k3T OA p3T O+ p3T O+ p4T O+ k4T AO p4T A+ k4T OA p4T O(7.9)(7.10)Die Besetzungswahrscheinlichkeiten für die Bindungsstellen sind durch Modell 1 gegeben(Gl. 7.1. Die numerischen Konsequenzen der Gleichungen 7.9 und 7.10 stehen wahrscheinlichim Widerspruch zu den gemessenen Daten (Farokhi et al., 2000). In einigen Messungentritt eine bis zu 100-fache Änderung in k AO zwischen den Zeitreihen bei 250mM K + unddem Minimum der AMFE-Kurve auf. Auch wenn diese Werte nicht exakt sind, so sind siedoch so weit entfernt von dem, was obige Gleichungen erlauben: Die maximale Abnahmeder Ratenkonstanten kann nicht größer sein als das Verhältnis A 4K /(alle A) und dafürkommt nach den Argumenten in Hansen et al. (2003) nur ein maximaler Faktor von 10 inFrage. Daher wird noch ein alternativer Mechanismus in Betracht gezogen:Ein Nicht-Markov-Modell für die Verknüpfung zweier Markov Modelle durchKonformationsänderungen des KanalproteinsÄhnlich wie in Modell 2 wird angenommen, daß die Konformationsänderungen des Proteinswesentlich langsamer vonstatten gehen als die Bindungsreaktionen von K + und Tl + . Indiesem Fall spürt das Protein eine mittlere Kraft für Konformationsänderungen (Abb. 7.4).Die daraus resultierende Änderung kann die Ratenkonstanten des A-O-G-C-Z-Schemasbeeinflussen ohne die numerischen Einschränkungen, die durch die Gleichungen 7.9 und7.10 gegeben sind. Jedoch kann die Beschreibung nicht länger mit Hilfe eines einzigengroßen Markov-Modells erfolgen, sondern bedarf eines Nicht-Markov-Elementes wie desIntegrators (Mittelungsprozess) in Abb. 7.4.Das Modell in Abb. 7.4 entkoppelt das Gating-Verhalten und Ionenbindung und istdaher in der Lage, all die beobachteten Eigenschaften zu erzeugen:• Unabhängigkeit der Gating-Ratenkonstanten von der K + -Konzentration in reiner Lösung.• Keine Notwendigkeit für die Annahme, dass die Ratenkonstanten in reiner K + - undreiner Tl + -Lösung das Verhältnis der K + - und Tl + -Bindungsraten wiedergeben.62

Abbildung 7.4: Das erweiterte Modell 3: Die zwei Markovmodelle für die Ligandenbindung(links) und die Zustände des Kanals (rechts) werden über ein nichtlineares Element (hierein Integrator) gekoppelt. Aus Hansen et al. (2003).Trotz des Erfolgs dieses Modells werden zwei zusätzliche Modelle diskutiert, die auf dermöglichen Interaktion der Ionen mit der Pore basieren und nicht an äußeren Bindungsstellen,da es in der Literatur viele Hinweise gibt, dass der ,,Foot-in-the-door”-Effekt (Kissund Korn, 1998; Lu et al., 2001) in Betracht gezogen werden muss.7.2.4 Modell 4: Direkte Wirkung des Foot-in-the-door-Effektsauf die BesetzungNeuere Ergebnisse verschiedener Arbeitsgruppen deuten darauf hin, dass die Ionen in derPore den Durchmesser kontrollieren (Kiss und Korn, 1998; Ogielska und Aldrich, 1999;Townsend und Horn, 1999; Lu et al., 2001). Wenn angenommen wird, dass die Besetzungder Pore mit zwei K + -Ionen den Radius des Selektivitätsfilters derartig anpaßt, dass dieWahrscheinlichkeit, in den Filter zu gelangen, für Tl + um den Faktor 1000 abnimmt (undumgekehrt), dann ergeben sich Offen-Zeiten im Bereich von einigen 10 µs, entsprechendden Werten, die Farokhi et al. (2000) aus dem Fit der gemessenen Zeitreihe erhielten. DerAMFE wird erzeugt, wenn die Pore zusammenbricht und undurchlässig wird, weil sich zweiverschiedene Ionen in der Pore befinden. Die Pore öffnet wieder, wenn durch die Statistikdas richtige Ion zurück in die Pore gelangt. Solch ein Modell könnte die AMFE-Kurven inAbb. 7.3 leicht erzeugen. Jedoch weisen die experimentellen Daten darauf hin, dass auchin reiner K + - oder Tl + -Lösung zwei Offenzustände involviert sind (Farokhi et al., 2000).Zwei Offenzustände in reiner Lösung sind jedoch keine inhärente Eigenschaft des obigeneinfachen Modells (Hansen et al., 2003).63

7.2.5 Modell 5: Modulationseffekt des Foot-in-the-door-Effektsauf die BesetzungModell 5 vereint den Foot-in-the-door-Effekt aus Modell 4 mit der Modulierung der inhärentenProteinschwingungen durch die Ionenbindung aus Modell 3.Es wird ein Mechanismus angenommen, der davon ausgeht, dass der Kanal zwei Offen-Zustände besitzt. Aus dem Geschlossen-Zustand G weitet sich die Pore zum Offen-ZustandO. Dann kann das Protein eine weitere Konformationsänderung erleiden in den Zustand A,der den Offen-Zustand weiter stabilisiert. Das Modell basiert auf der Annahme, dass dieÜbergangswahrscheinlichkeit vom Zustand O in den Zustand A von der Besetzung der Poreabhängt. Falls die Pore mit zwei gleichen Ionen (K + -K + oder Tl + -Tl + ) besetzt ist, ist dieWahrscheinlichkeit, dass Zustand A angenommen wird, hoch. Wenn die Pore mit verschiedenenIonen besetzt ist, werden die Ratenkonstanten langsamer. Kinetisch ist Modell 5sehr ähnlich zu Modell 3 (Abb. 7.4) mit dem Unterschied, dass wahrscheinlich anstelle vonvier Bindungsstellen nur zwei vorhanden sind. Die tatsächliche Anzahl der Bindungsstellenist nicht bekannt, bevor sie ermittelt werden kann, sollte jedoch zunächst die grundsätzlicheStruktur des Mechanismus bekannt sein. Der Unterschied zum Modell 3 in Abb. 7.4besteht darin, dass der Zugang zu den Bindungsstellen nicht unbegrenzt ist, da die Ionennur von der externen oder der internen Porenöffnung eintreten können. Dies würde bei einseitigerThalliumgabe zu einem bezüglich der Membranspannung asymmetrischen Effektführen. Die Abhängigkeit vom Tl + /K + -Verhältnis wird nach den Mechanismen in Abb.7.4 eingeführt: Die Vibrationen des Proteins, die sich auf die Übergänge zwischen A, Ound G beziehen, sind langsamer (Faktor 1000) als die Übergangszeiten der permeierendenIonen. Dadurch ist die Bewegung des Proteins durch das durchschnittliche Auftreten derK + -K + , K + -Tl + oder Tl + -Tl + -Besetzung in der Pore kontrolliert. Wiederum muss einenumerische Beschränkung wie diejenige in den Gleichungen 7.9 und 7.10 nicht notwendigerweiseauferlegt werden, da die Beziehung zwischen der Proteinvibration, dem mittlerenTl + /K + -Verhältnis in der Pore und dem K + /Tl + -Verhältnis in der Lösung als nichtlinearangenommen wird.7.2.6 Zusammenfassung der Modellvorhersagen und Ziel der DiplomarbeitIn Hansen et al. (2003) wurden bereits etliche Vorhersagen der fünf Modelle überprüft.Daraus ergab sich, dass das Modell 1, welches von einer direkten Wirkung der Besetzungallosterischer Bindungsstellen mit K + und Tl + auf das Gating ausgeht, die gemessenenStromspannungskurven zwar gut reproduzierte, aber zu falschen Vorhersagen für das Zeitverhaltendes Kanals beim AMFE führte. Auch die Einführung einer Sättigungskinetik fürdie Bindungsreaktionen in Modell 2 konnte dieses Problem nicht beseitigen. Diese beidenModelle wurden daher verworfen.In Modell 3 wird das Schalten des Kanals zwischen den verschiedenen Offen- und Geschlossenzuständendurch temperaturbedingte Proteinschwingungen verursacht. Die Ratenkonstantendiesen Modells werden durch die durchschnittliche Besetzung der Bindungs-64

stellen moduliert. Da äußere Bindungsstellen nur von einer Seite der Membran aus zuerreichen sind (aber von dort aus dann auch unbegrenzt), impliziert Modell 3 bei asymmetrischenLösungen einen bezüglich der Membranspannung symmetrischen AMFE, solangedie Mischlösung nur auf der richtigen Seite (auf der die Bindungsstellen liegen) appliziertwird.Die Modelle 4 und 5 entstanden aus dem Ansatz, die Bindungsstellen nicht außen amKanal sondern innerhalb der Pore anzusiedeln. Daher würde man eine Stromreduzierungnur dann erwarten, wenn die Mischlösung in die Pore hineingezogen wird, bei einseitigerThalliumgabe wäre der AMFE also asymmetrisch bezüglich der Spannung.In Modell 4 wird bei einer Besetzung der Pore durch zwei gleichartige Ionen der Durchmesserdes Selektivitätsfilters an die jeweilige Ionensorte angepaßt, der Kanal wäre alsomanchmal K + - und manchmal Tl + selektiv. Modell 5 hingegen geht von einer modulierendenWirkung der Besetzung auf die Ratenkonstanten aus, genau wie Modell 3. (DieModelle 3 und 5 schließen jedoch Selektivitätsänderungen nicht aus.)Für die Unterscheidung der Modelle 3, 4 und 5 lagen Hansen et al. (2003) noch nichtgenügend Meßdaten vor. Ziel meiner Diplomarbeit ist daher, anhand weiterer Messungenzur Modellunterscheidung beizutragen. Es soll vor allem versucht werden, die für den AM-FE verantwortlichen Bindungsstellen zu lokalisieren (Unterscheidung Modell 3 vs. 4/5).Außerdem wurden noch Messungen zur Selektivität durchgeführt.65

Kapitel 8Selektivitätswechsel8.1 Die FragestellungIn Hansen et al. (2003) blieb die Frage offen, ob der Permeationsmechanismus des Kanalszwischen Kalium und Thallium unterscheidet. Zwei der dort vorgeschlagenen Mechanismenzur Erklärung des AMFE, die Modelle 1 und 4 (Kapitel 7) implizieren einen Selektivitätswechsel.Die Hypothese ist wie folgt: Sind die Bindungsstellen bzw. die Pore mit K +besetzt, so passt sich der Durchmesser des Selektivitätsfilters dem des K + an: Der Kanalwird zum Kaliumkanal. Die Besetzung mit Tl + hingegen macht ihn zum Thalliumkanal.Solche Ionen-induzierten Durchmesserveränderungen wurden von Kiss et al. (1999) für dieC-Inaktivierung in K + /Na + -Lösung bereits nachgewiesen und erschienen deshalb auch alsgeeignetes Modell für den AMFE.Für die Modelle 3 und 5 (Kapitel 7) ist ein Selektivitätswechsel nicht erforderlich,sondern nur die Modulation der Offen- und Geschlossenzeiten für ein Selektivitätsfilter,das nicht zwischen K + und Tl + unterscheiden muß. Jedoch schließen diese beiden Modelleeinen Selektivitätswechsel nicht aus. Beispielsweise machen sie keine Aussage über diejeweilige Selektivität der beiden Offenzustände A und O (siehe Gl. 7.6). Wenn man davonausgeht, daß der Kanal manchmal Kalium- und manchmal Thallium-selektiv ist, so müßtees in Mischlösung Zeitabschnitte geben, in denen der Strom von Kalium getragen wird,und solche, in denen mehrheitlich Thallium die Pore passiert.8.2 MeßstrategieFür Selektivitätsmessungen an Ionenkanälen wird die Tatsache genutzt, daß die Ionen nichtnur durch elektrische Potentiale durch die Membran gezogen werden, sondern auch durchKonzentrationsgradienten. Beide zusammen ergeben das elektrochemische Potential, auchimf = ion-motive force genannt. Um Umkehrpotentiale zu messen, werden Stromspannungskurvenbenutzt, bei der die stationären Ströme für verschiedene äußere angelegteSpannungen gemessen werden. Aus der resultierenden Stromspannungskurve wird danndie Spannung interpoliert, bei der der Strom die Stromachse schneidet.67

Die Triebkraft aus dem Konzentrationsgradienten (das Umkehrpotential = reversalpotential E R ) berechnet sich bei nur einer einzigen Ionensorte einfach aus der Nernst-Gleichung (Gl. 8.4). Bei mehreren Ionensorten muß man die unterschiedlichen Permeabilitätender Membran, bzw. im Falle eines einzelnen Kanals dessen Selektivität für dieeinzelnen Spezies berücksichtigen. Zur Berechnung dieser Potentiale wird die Goldman-Gleichung verwendet (Gl. 8.1, Goldman, 1943). Sie ist wahrscheinlich nicht korrekt, aberist allgemein als erste Näherung akzeptiert. Eine bessere Gleichung benötigt ein Kanalmodell,aber die Ergebnisse der Arbeit von Gradmann et al. (1997) zeigen, dass der Weg zueinem solchen Modell noch lang ist.U R = RT ∑F ln ∑ Kation P i[X + i ] lum + ∑ Anion P i[X − i ] cytKation P i[X + i ] cyt + ∑ Anion P i[X − i ] (8.1)lumIn der Gleichung haben R,T und F die übliche Bedeutung, P i sind die Permeabilitätender Membran/des Kanals für die Ionensorten X i .Da hier aber nicht der Strom durch die gesamte Membran, sondern nur durch eineneinzelnen Kaliumkanal betrachtet wird, der für Anionen impermeabel sein sollte, wirdP Anion sehr klein, der Anionenterm kann daher vernachlässigt werden. Zur Berechnung desdurch die unterschiedlichen Kalium- und Thallium-Konzentrationen in den Meßlösungenverursachten Umkehrpotentials vereinfacht sich Gleichung 8.1 deshalb zu:U R = RTF ln ∑∑ Kation P i[X + i ] lumKation P i[X + i ] cyt≈ 60mV log [K+ ] lum P K + [T l + ] lum P T l[K + ] cyt P K + [T l + ] cyt P T l(8.2)Die Beteiligung von nur zwei Ionensorten erleichtert auch die Berechnung der Permeabilitätenerheblich, man kann die Gleichung nämlich direkt auflösen:P T lP K= [K+ ] lum − e U R FRTe U R F[K + ] cytRT [T l + ] cyt − [T l + ] lum(8.3)Um also Selektivitätswechsel des Chara-K + -Kanals im AMFE-Minimum zu finden,müssen die Umkehrpotentiale (Nernstpotentiale) für K + und Tl + verschieden sein. DieWahl der geeigneten Konzentrationen muss damit zwei Bedingungen erfüllen: 1. der AM-FE muss unter diesen Bedingungen noch auftreten.2. Die Nernstpotentiale sollten möglichst gegensinnig sein, damit I K und I T l in gegensätzlicherRichtung fließen.Ausgangspunkt ist der Befund, dass der AMFE in Chara sowohl bei Keunecke (1995)als auch bei Farokhi (2002) auftritt, wenn auf der cytosolischen Seite das Verhältnis K +zu Tl + etwa 10:1 ist, im Falle der hier verwendeten Konzentrationen also bei 230mM K ++ 20mM Tl + . In diesen Messungen war allerdings die Lösung auf der luminalen Seite 150bzw. 250mM KNO 3 .In Kapitel 10 wird sich herausstellen, daß die luminale Seite einen Einfluß auf denAMFE hat. Bei den dort verwendeten Meßlösungen (siehe unten) tritt die für den AMFEcharakteristische Stromreduktion nach wie vor auf, der Effekt wird allerdings asymmetrisch68

(Abb. 10.1B). Auf jeden Fall zeigen die Messungen in Abschnitt 10, dass ein AMFEähnlichesVerhalten bei positiven Spannungen auftritt, auch wenn die Tl + -Konzentrationauf luminaler Seite hoch ist.Die vermuteten Selektivitätswechsel werden am leichtesten dann aufzuspüren sein, wenndie elektrochemische Gradienten für Kalium und Thallium möglichst große Unterschiedeaufweisen. Die Badlösung (=cytosolische Seite, weil inside-out, Abbildung 3.1) ist durchdas bekannte AMFE-Minimum festgelegt. Die Badlösung (=luminale Seite) ist frei wählbar.Die größten Konzentrationsgradienten erhielte man mit einer reinen Thalliumlösungauf luminaler Seite. Für Kalium wäre die Driving-Force dann theoretisch sogar unendlich,obwohl mit einer gewissen Anreicherung von K + in luminaler Membrannähe durch Strömevon cytosolischer Seite zu her rechnen ist. Da man aber nicht weiß, wieviel, wären dieKonzentrationsverhältnisse unbekannt. Deshalb wähle ich die luminale Lösung genau antisymmetrischzur cytosolischen: 20mM K + + 230mM Tl + . Eine Vermischung durch denStromfluß durch Sealwiderstand und Kanal geschieht zwar trotzdem, bleibt bei 20 mM K +aber ohne messbare prozentuale Auswirkungen.Unter der Prämisse, daß das Zeitauflösungsvermögen während der Messungen ausreicht,um alle Stromniveaus klar zu trennen, sind für das Verhalten des Kanals bezüglich derSelektivität vier mögliche Szenarien denkbar:1. Die von den Modellen 1 und 4 (Kapitel 7.2) vorhergesagte Variante: Es gibt jeweilseinen stark selektiven Zustand für Kalium und für Thallium. Befindet der Kanal sichin einem dieser Zustände, so trägt das jeweils andere Ion weder zum Potential nochzum Strom bei. Das Umkehrpotential berechnet sich daher aus der Nernst-Gleichung:U Nernst = RTF ln [X+ ] lum[X + ] cyt(8.4)Bei Raumtemperatur ergibt sich dann aus obigen Meßlösungen ein Umkehrpotentialvon etwa -60mV für Kalium und +60mV für Thallium. In den Messungen müßten alsobei Spannungsbeträgen kleiner als 60mV Ströme verschiedener Vorzeichen zu sehensein. Man erhielte zwei Strom-Spannungskurven, die vom Nullpunkt um jeweils 60mV nach rechts oder links verschoben sind.2. Die entschärfte Möglichkeit 1: Die beiden Offenzustände A und O aus dem 5-Zustandsmodell(Abschnitt 7.2) sind für beide Ionensorten permeabel, aber in verschiedenenVerhältnissen: P KA ≠ P PT A KO Man erhielte weiterhin zwei Stromspannungskurven mit unterschiedlichenUmkehrpotentialen, die sich aber jetzt aus derl PT O lGoldman-Gleichungentsprechend den Verhältnissen P A KP A T lund P O KP O T lergeben (Gleichung 8.2).3. Der andere Grenzfall: Der Selektivitätsmechanismus des Kanals unterscheidet überhauptnicht zwischen Kalium und Thallium. K + - und Tl + -Ströme sind dann grundsätzlichmesstechnisch nicht unterscheidbar, es ergibt sich ein Umkehrpotential von0mV.69

4. Der Mischfall: Der Kanal besitzt verschiedene Selektivitäten für K + und Tl + , dieaber für alle Offenzustände identisch sind. Auch in diesem Fall erhielte man nur eineStromspannungskurve. Das Verhältnis der Permeabilitäten ließe sich nach Gleichung8.3 aus dem Umkehrpotential bestimmen.8.3 MeßmethodeEs wurde nach den Überlegungen im vorigen Abschnitt 8.2 für folgende Meßlösungen dieStromspannungskurve an inside-out-Patches der Tonoplastenmembran von Chara aufgenommen(Methode auch beschrieben in Abschnitt 3.3):Badlösung (=cytosolisch): 20mM TlNO 3 + 230mM KNO 3 + 5mM Ca(NO 3 ) 2Pipettenlösung (=luminal): 230mM TlNO 3 + 20mM KNO 3 + 5mM Ca(NO 3 ) 2Nach dem Eintauchen der Pipette ins Bad wurde das Offset-Potential auf Null korrigiert(Abschnitt 3.3.2). Wie in Kapitel 5 ausführlich erörtert, entspricht dann das über derMembran anliegende Potential der vom Patch-Verstärker vorgegebenen Spannung plus dendurch die Konzentrationsgradienten an der Membran entstehenden Diffusionspotentialen.Nach der Bildung des Gigaseals (Abschnitt 3.3.3) wurde der Patch vorsichtig aus demVesikel herausgezogen, um die inside-out-Konfiguration (Abschnitt 3.1) zu erreichen.Die wegen der extrem schlechten Löslichkeit von TlCl unvermeidbare Verwendung vonNitrat als Anion anstelle von Chlorid wirkt sich ungünstig auf die Membranstabilität aus.Deshalb waren die meisten Seals mechanisch nicht stabil genug, um sie zwecks Rauschreduktionmit der Pipette direkt unter die Wasseroberfläche zu ziehen (Keunecke, 1995).Wegen der großen Einzelkanalströme von bis zu 10pA und dem frisch optimierten Meßaufbau(Abschnitt 3.1.3), konnte trotzdem ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis erzieltwerde. Bei einer Filterfrequenz von 50kHz betrug die Standardabweichung des Rauschenje nach Sealwiderstand (2-10GΩ) etwa 0,8-1,5pA.Die Einzelkanalströme wurden nach dem in Abschnitt 3.3.3 beschriebenen variablenSpannungsprotokoll für Haltespannungen zwischen -100 und +100mV in 20mV-Schrittenfür jeweils 10 Sekunden aufgezeichnet. Die Werte in den Stromspannungskurven in Abbildung8.4 sind Mittelwerte aus 5-12 Messungen. Lediglich für -100mV gelang nur eine einzigeMessung, weil die Sealwiderstände durch negative Spannungen stärker belastet werden alsdurch positive8.4 Scheinbare SelektivitätsänderungenDie im folgenden gezeigte Messung soll illustrieren, was zu Beginn der Suche nach möglichenSelektivitätsänderungen als wünschenwertes Ergebnis angestrebt wurde. Weiterhin zeigtsie sehr deutlich, von welcher Hypothese ausgegangen wurde, und warum man ohne einegenauere Analyse bei der Interpretation der Messungen leicht in die Irre geführt werdenkann.70

Abbildung 8.1: Vergleich zweier Patch-Clamp-Aufzeichnungen, beide bei einer Membranspannungvon +20mV. A:,,normale” Einkanal-Messung bei beidseitig 250mM K + , das Nullniveau(unten) ist eindeutig zu identifizieren, da bei positiver Spannung und symmetrischenLösungen der Strom ebenfalls positiv sein muß. B: Sehr selten auftretendes Verhalten, beiüberkreuzten Lösungen (230mM K + +20mM Tl + cytosolisch und 20mM K + + 230mM Tl +luminal). Aus der Zeitreihe allein ist nicht zu entscheiden, ob das Nullniveau unten oderin der Mitte liegt, weil u. U. bei diesen Meßlösungen und der geringen äußeren angelegtenSpannung Ströme beider Richtungen auftreten könnten. Zur besseren Darstellung wurdedie Daten nachgefiltert.In Abb. 8.1B ist eine Messreihe zu sehen, bei der scheinbar Kanalöffnungen in positiverund in negativer Richtung auftreten, also entsprechend dem oben (Abschnitt 8.2)besprochenen Szenario 1 oder 2. Der Strom nach oben wäre entsprechend den anliegendenIonengradienten ein Kalium-Strom, der nach unten ein Thallium-Strom. Zwei Problemejedoch können das schöne Bild zerstören:1. Wird der Strom in beide Richtungen vom gleichen Kanal getragen? Oder sind zwei verschiedeneKanäle beteiligt.2. Wo liegt die wahre Nullinie?Zu 1. Leider trat dieser Effekt nur einmal auf, so dass die Umkehrpotentiale (mit denenman die transportierten Ionen identifiziert) der beiden Antworten nicht bestimmt werdenkonnte.Zu 2. Man sollte eigentlich denken, dass die Nullinie dort ist, wo der Patch-Clamp-Verstärker seine Null hat. Doch leider ist die Bestimmung des Nullstromes nicht ganzeinfach. Zum einen kann ein Strom durch den Sealwiderstand fließen. Dessen elektromotorischeKraft ist meistens unbekannt, da man nicht weiss, ob Ionen oder Elektronen undwenn Ionen, welche Ionen ihn tragen. Dann kann die Membran kontinuierlich arbeitendeTransportproteine wie Pumpen oder Cotransporter enthalten, die auch einen Strom erzeugen.Deshalb nimmt man als Stromnull immer den geschlossenen Zustand eines schaltendenKanals.Bei der Messung in Abbildung 8.1A ist eine Fehlzuordnung der Stomniveaus kaummöglich. Denn auf beiden Seiten der Membran befinden sich 250mM K + , die auf die Ionenwirkende elektromotorische Kraft entspricht also genau der äußeren angelegten Spannung.Und bei nur zwei Stromniveaus und einer Membranspannung von +20mV muß daher dasuntere Niveau das Nullniveau sein, denn der Einzelkanalstrom muß ebenfalls positiv sein.71

Treten mehrere Niveaus bei unterschiedlichen möglichen elektrochemischen Potentialenwie bei den hier vorliegenden Messungen auf, wird es schwieriger. Abbildung 8.1B zeigteinen Ausschnitt aus einer Messung, die in dieser Form bei den Messungen zu diesem Kapitel(230mM Tl + + 20mM K + auf luminaler und 20mM Tl + + 20mM K + auf cytosolischerSeite) nur ein einziges Mal auftrat. Da man die transportierte Ionenart nicht kennt unddaher nicht weiß, welches der möglichen elektrochemischen Potentiale wirkt, ist es nichtmehr möglich, vom Vorzeichen der angelegten Spannung auf die Stromrichtung zu schließen.Man könnte hier entweder das untere oder das mittlere Niveau der Null zuordnen.Dadurch verändert sich die Interpretation der Messung jedoch ganz entscheidend. Bevordies diskutiert wird, soll erst einmal ausgeschlossen werden, dass zwei verschiedene Kanälevorliegen. Zwei verschiedene Kanäle schalten statistisch unabhängig von einander, es mussdeshalb auch einmal der Summenstrom beider zu beobachten sein. Dies trat nicht auf, unddamit ist sicher, dass es sich bei der Messung in Abb. 8.1B um einen Kanal handelt.Liegt das Geschlossen-Niveau in der Mitte, so haben die beiden Offen-Ströme verschiedeneVorzeichen ( -1 und +2,5pA). Das würde nach den oben beschriebenen vier Szenarieneine Selektivitätsänderung bedeuten. Liegt das Nullniveau jedoch unten, so haben wir lediglichzwei verschiedenen Einzelkanalströme in die ,,richtige” Richtung (+1 und +3,5pA).Diese Situation ließe sich einfach mit einem Kanal mit zwei verschiedenen Leitfähigkeitenerklären, die Notwendigkeit einer Selektivitätsänderung entfällt.Bei solch mehrdeutigen Stromniveaus kann eine Zuordnung nicht aufgrund einer einzelnenZeitreihe bei einer festen Membranspannung erfolgen. Es ist vielmehr eine kompletteStrom-Spannungskurve nötig. Es gibt dann zwei Möglichkeiten, das richtige Nullniveau zuerkennen: 1. Die Schnittpunkte der Stromkurven für die drei Niveaus muss in sinnvollemZusammenhang zu den Umkehrpotentialen der beteiligten Ionen liegen.2. Die Kurve für den hypothetischen Nullstrom sollte möglichst linear von der Spannungabhängen. Dahinter steht die Hypothese, dass die Kennlinien von Sealwiderstand und dieder kontinuierlich arbeitenden Transporter (Pumpen, Cotransporter) linear sind.Wie gesagt, war die Messung aus 8.1B einzigartig, bei allen anderen Messungen mitdiesen Lösungen gab es keinerlei Hinweise auf Selektivitätsänderungen. Darum bliebenZweifel, denn der Patch, aus dem diese Messung stammt war leider instabil, es existiertkeine zugehörige Stromspannungskurve, wodurch eine Zuordnung der Niveaus durch denVergleich der Messungen bei anderen Spannungen nicht möglich ist.Daß die oben genannten Kriterien geeignet sind, falsch zugeordnete Nullniveaus beimVorhandensein einer kompletten Stromspannungskurve zu entlarven, soll hier an einemeinfachen Beispiel gezeigt werden: Bei einer Messung mit 250mM K + auf beiden Seiten derMembran trat einige Monate später dasselbe Phänomen wie in Abb. 8.1B auf. Einige derZeitreihen sahen so aus, als gäbe es Ströme in beide Richtungen. Alle Zeitreihen wurdennun einmal richtig (Das Nullniveau ist immer das unterste/oberste, je nach Spannungsvorzeichen,Abb. 8.3 links) und einmal falsch (Das Nullniveau ist das am häufigsten besetzte,Abb. 8.3 rechts.) ausgewertet. Die Fehlzuordnung des Nullniveaus geschieht bei diesenMeßlösungen, bei denen keine Diffusionspotentiale auftreten zwar mutwillig, sie soll aberhier auch nur zur Illustration dienen. Das Ergebnis ist in Abbildung 8.2 gezeigt: Für beideInterpretationen geht die Kennlinie des Nullstroms durch Null und beide sind linear (Abb.72

Abbildung 8.2: Falsche Zuordnungen sieht man in den Kennlinien: A: Nullstrom einerMeßreihe mit 250mM K + auf beiden Seiten der Membran, einmal sind die Niveaus richtig(•) und einmal mutwillig falsch (×) zugeordnet. B: Stromspannungskurve des Sublevelsder selben Messung (mit denselben beiden Auswertungen): Die falsche Zuordnung täuschteinen negativen Widerstand (×) vor.8.2A), sie können daher zu einer Entscheidung nicht beitragen. Die Stromspannungskurvedes Sublevels (8.2) jedoch entlarvt die falsche Auswertung der Zeitreihen: Das falsch zugeordneteNullniveau (rechts in Abb 8.3) führt zu einer recht absurden Stromspannungskurve:Der Kanal hätte hier einen durchgehend negativen Widerstand.Die Interpretation der Meßdaten, die den Punkten (und nicht den Kreuzen) in Abbildung8.2 zugrundeliegt, muß also die richtige sein.Abbildung 8.3: Ein Teil der Zeitreihe zu +20mV aus Abb. 8.2: Linke Seite=richtige Zuordnung= • in Abb. 8.2. Rechte Seite=falsche Zuordnung = ×.73

8.5 Analyse der Stromspannungskurven8642I / pA0-2-4-6-8-10-100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100U / mVAbbildung 8.4: Von Selektivitätsänderungen nichts zu sehen: Stromspannungskurven für230mM Tl + + 20mM K + auf luminaler und 20mM Tl + + 230mM K + auf cytosolischerSeite. Neben der Hauptleitfähigkeit des Chara-Kanals () trat ein Sublevel auf (◦). DiePunkte bei -100mM entstammen einer Einzelmessung, alle anderen sind Mittelwerte aus5-12 Messungen.Abb. 8.1B hat illustriert, was man vielleicht sehen könnte, falls wirklich Selektivitätsänderungenauftreten und wenn das Zeitauflösungsvermögen reichen würde. Aufzeichnungenwie in Abb. 8.1B blieben jedoch ein Einzelfall, bei allen anderen Messungen gab es keineZweifel bei der Zuordnung der Niveaus, alle Ströme hatten die ,,richtige” Richtung.Dies könnte heißen, daß die Ströme verschiedener Richtung in dieser Einzelmessung nurvorgetäuscht waren (siehe vorigen Abschnitt). Es könnte aber ebensogut bedeuten, daßder Kanal seine Selektivität ändert, aber nur bei dieser einen Aufzeichnung aus irgendeinemGrunde das Zeitauflösungsvermögen ausreichend war, um die K + - und Tl + -Niveausvoneinander zu trennen. In allen anderen Messungen entstünde dann der scheinbare Einzelkanalstromdurch ein Zeitmittel der verschiedenen Stromniveaus.Abbildung 8.4 zeigt die aus den ,,normalen” Messungen resultierenden Stromspannungskurven.Eine Besonderheit ist das Auftreten zweier Kurven. Der Zweig geringererLeitfähigkeit ist jedoch nicht der in den Szenarien 1 und 2 geforderten Zweig andererSelektivität. Stattdessen handelt es sich um ein Sublevel des Chara-Kanals, also einen74

Abbildung 8.5: Ausschnitt aus einer typischen Zeitreihe zu Abbildung 8.4. Das Hauptleitfähigkeitsniveau(4,46pA, Quadrate in Abb. 8.4) wird wesentlich häufiger angenommenals das Sublevel (Pfeil, 2,55pA, Kreise in Abb. 8.4). Die Membranspannung betrug +60mV.Zustand geringerer Leitfähigkeit, der ebenfalls in reiner Kaliumlösung beobachtet wird (eigeneMessungen und z.B. Lühring, 1986). Abbildung 8.5 zeigt einen Ausschnitt aus einerder Messungen zu Abbildung 8.4. Das Niveau voller Leitfähigkeit ist klar zu erkennen,den genauen Strom für das Sublevel (geringerer Strom) zu bestimmen, ist schon wesentlichschwieriger, weil es nur sehr selten besetzt ist. Deshalb, und weil das Sublevel auchmanchmal monatelang gar nicht beobachtet wird (warum, ist unbekannt), ist es bishernoch nicht eingehend untersucht worden. Es ist darum nicht in den Modellen aus Hansenet al. (2003) enthalten, auch weil es zur Erklärung der Stromreduktion im Zustand dervollen Leitfähigkeit nicht nötig ist. Aus diesen Gründen soll im Folgenden nur die Kurvegrößerer Leitfähigkeit diskutiert werden.Das Umkehrpotential des Einzelkanalstroms liegt trotz der erheblich asymmetrischenMeßlösungen im Rahmen der Meßgenauigkeit bei Null. Wäre das Zeitauflösungsvermögenausreichend, könnte man sofort schließen: ,,Es gibt keine Selektivitätsänderungen”. WelcheSchlüsse jedoch tatsächlich aus den Meßdaten gezogen werden könne, hängt hier genau wiebei der Untersuchung des AMFE (Kapitel 6 und 7) entscheidend von der Beantwortungder Frage ab, ob das Zeitauflösungsvermögen denn nun ausreichend ist oder nicht.8.6 DiskussionZur Interpretation der Meßergebnisse gibt es also zwei mögliche Ausgangspositionen:A Die Zeitauflösung der Messung war ausreichend. Dann dürfen die Meßwerte aus Abbildung8.4 ,,wörtlich” genommen werden. Es gibt nur eine Stromspannungskurve.Der Radius des Selektivitätsfilters ist also konstant und insbesondere unabhängigdavon ob die Pore oder äußere Bindungsstellen gerade mit K + oder Tl + besetzt sind.Ferner liegt das Umkehrpotential der vollen Leitfähigkeit in Abb. 8.4 bei Null. Aus75

Gleichung 8.3 ergibt sich somit P K =P T l . Wenn also das Zeitauflösungsvermögen ausreichendwäre, fiele die Entscheidung für Szenario 3 aus Abschnitt 8.2: Der Kanalunterscheidet in seiner Selektivität überhaupt nicht zwischen Kalium und Thallium.In Frage kommen würden dann von den fünf Gating-Modellen aus Hansen et al.(2003) nur noch die Modelle 3 und 5, die ohne Selektivitätswechsel auskommen (sieheAbschnitt 7.2).B Die Zeitauflösung war nicht ausreichend. Dann entstehen die beobachteten Stromwertedurch ein mit der Aufenthaltswahrscheinlichkeit gewichtetes Mittel der K + -Auswärtsströmeund der Tl + -Einwärtsströme der verschiedenen Zustände des Kanals.Aber selbst ohne ein geeignetes Modell für die Überlagerung (siehe unten), könnenschon weitreichende Aussagen über die Wahrscheinlichkeit der vier Szenarien ausAbschnitt 8.2 getroffen werden:Szenario 1, scharfes Umschalten zwischen K + und Tl + Strömen: Diese Möglichkeitkann im Grunde jetzt schon ausgeschlossen werden. Denn, wie im Kapitel 9 gezeigtwerden wird, ist der Kanal für Kalium und für Thallium etwa gleich leitfähig. Damitsich ein scheinbares Umkehrpotential von Null ergibt, müssen also der K + - und derTl + -selektive Zustand etwa gleich häufig vorliegen. In den Modellen 1 und 4 ausHansen et al. (2003) werden diese Zustände mit den beiden Offenzuständen A und Odes Markov-Modells identifiziert. A und O sind aber nach Farokhi et al. (2000) sowohlim AMFE-Minimum als auch in reiner Kaliumlösung niemals auch nur annäherndgleich besetzt (Abbildung 7.2).Szenario 2, das ,,weichere” Umschalten der Selektivität könnte ein scheinbares Umkehrpotentialvon Null liefern. Dafür müßten die Ströme der Zustände A und O abergenau im umgekehrten Verhältnis wie die Besetzungswahrscheinlichkeiten stehen.Das wäre schon ein sehr großer Zufall und scheint daher unwahrscheinlich.Die Szenarien 3 und 4 sagen für beide Offenzustände die gleiche Selektivität, also dengleichen Strom voraus. Eine Unterscheidung zwischen ihnen ist also unabhängig vonder Zeitauflösung während der Messung. Hier ist eindeutig Szenario 1 (P K =P T l ) zufavorisieren, weil eine Unterscheidung von Kalium und Thallium im Selektivitätsfilterzu einem von Null verschiedenen Umkehrpotential führen würde.Für eine endgültige Aussage in einer späteren Arbeit muß zunächst geklärt werden, obdie Zeitauflösung nun ausreichte oder nicht. Eine Möglichkeit ist die Abkühlung auf 7 ◦ C.Mit dieser Methode hatte Farokhi (1998) versucht, das Gating zu verlangsamen. Es ergabensich merkwürdige Effekte (Zusammenlaufen der scheinbaren Einzelkanalströme bei reinerK + - Lösung und bei AMFE-Mischung, Hansen et al., 1997).In jedem Fall sind weitere Messungen nötig. Zunächst einmal müssten die Ströme fürKalium und Thallium einzeln bestimmt werden: Für 230mM K + cytosolisch und 20mM K +luminal (beides ohne Tl + ) und umgekehrt für 20mM Tl + cytosolisch und 230mM Tl + luminal(ohne K + ). Dann muß eine Theorie entwickelt werden, die vorhersagt, wie genau sich dieSzenarien 1 bis 4 aus dem vorhergehenden Abschnitt (8.2) auf die Zusammensetzung des76

Stromes in Mischlösung sowohl bei ausreichender als ungenügender Zeitauflösung währendder Messung auswirken. Dies ist zur Zeit jedoch noch nicht möglich, denn die Ergebnissein den Abschnitten 9 und 10 werden zeigen, dass K + und Tl + den Einzelkanalstromnicht nur über ihre Driving Forces (elektroosmotischen Potentiale), sondern auch übernoch das Gating-Verhalten und die Einzelkanalleitfähigkeit allosterisch beeinflussen. Diehier notwendige Theorie wird wahrscheinlich ein sehr tiefes Verständnis der Tl + -Wirkungenerfordern, das frühestens am Ende einer nachfolgenden Dissertation erarbeitet sein wird.77

Kapitel 9Cytosolische Thalliumeffekte9.1 FragestellungBeim AMFE wird das Verhalten des Kanals durch Wechselwirkung mit den Ionen derMeßlösung beeinflußt. Grob eingeteilt gibt es drei mögliche Orte für die Wechselwirkung derIonen mit dem Protein: 1. Bindungsstellen auf der cytosolischen Seite. 2. Bindungsstellenauf der luminalen Seite. 3. Bindungsstellen oder andere Wechselwirkungen innerhalb derPore.In Farokhi et al. (2000) wurde gezeigt, daß der AMFE ein Gating-Effekt ist, es konntejedoch noch keine Entscheidung getroffen werden, ob die verantwortlichen Bindungsstelleninnerhalb oder außerhalb der Pore des Kanalproteins liegen. Ein ,,Foot-in-the-Door”-Effekt(Wirkung der Ionen innerhalb der Pore, siehe die Modelle 4 und 5 in Abschnitt 7.2) bedingt,daß die Mischlösung nur dann eine Stromreduzierung erzeugen kann, wenn sie in diePore hineingezogen wird. Hat man also auf einer Seite der Membran reine Kaliumlösungund auf der anderen die Mischlösung, so sollte die Wirkung in diesem Falle erheblich asymmetrischbezüglich der Spannung sein. Liegen die Bindungsstellen aber außen am Protein(wie bei den Modelle 1 bis 3 aus Kapitel 7.2, so wäre ihre Besetzungswahrscheinlichkeitmit Ionen einigermaßen spannungsunabhängig. Der AMFE wäre symmetrisch, solange sichdie Mischlösung nur auf der richtigen Seite befindet.Um hier eine Entscheidung zu treffen, sind Messungen mit rein Kalium auf der einen undMischlösung auf der anderen Seite nötig. Solche Messungen hatte zwar bereits Keunecke(1995) durchgeführt, aber zwischen ihren Ergebnissen und anderen aus der Arbeitsgruppe(Albertsen, 1994; Farokhi, 2002) gab es Widersprüche. Deshalb habe ich die Messungenzur Sicherheit noch einmal wiederholt.Dabei bestätigten sich die Meßergebnisse von Keunecke (1995), die für das Vorhandenseinvon cytosolischen Bindungsstellen beim AMFE sprechen. Eine Neuinterpretationder Daten von Keunecke im Lichte der neuen Erkenntnisse aus Farokhi et al. (2000) undHansen et al. (2003) führt außerdem zu der Hypothese, daß hohe cytosolische Thalliumkonzentrationeneinen zusätzlichen Permeationseffekt auslösen.79

9.2 MessungenDie Strom-Konzentrationskurve des AMFE ist aus den Untersuchungen von Keunecke(1995) im Wesentlichen bereits bekannt, deshalb kann man die Messungen hier auf wenigekritische Punkte beschränken. Es wurde nur für vier verschiedene K + /Tl + -Verhältnissegemessen: 0, 20, 100 und 250mM Tl + auf der cytosolischen Seite (=in der Badlösung),[K + ] ergab sich aus der Differenz zur Summenkonzentration von 250mM. Auf luminalerSeite (=in der Pipette) befanden sich stets 250mM K + . Zu Unterstützung der Sealbildungwar auf beiden Seiten wieder 5mM Ca 2+ hinzugefügt.Nachdem der Inhalt einer Chara-Zelle in die Badlösung gegeben wurde, dauerte es nocheinige Minuten, bis sich die Vesikel am Boden der Schale abgesetzt und stabilisiert hatten.Dann erst konnte mit dem Patchen begonnen werden. Denn damit der Patch aus der Membranin die excised-Patch-Konfiguration herausgezogen werden kann, muss der Plasmatropfenam Glasboden haften, sonst wird er einfach in Gänze angehoben. Je mehr Thallium inder Badlösung enthalten war, desto instabiler waren die Vesikel und desto schwieriger dieBildung eines stabilen Seals. Durch die Angleichung der Osmolaritäten auf beiden Seitender Membran mit Mannitol (Abschnitt 5.1) konnte die Stabilität der Membran zumindestwieder etwas verbessert werden. Für die Messungen mit 0 bzw. 20mM Tl + waren keinespeziellen Maßnahmen nötig, die Vesikel konnten ganz normal in der Meßlösung präpariertwerden. Bei 100mM Tl + im Bad fiel aufgrund des hohen Chlorid-Gehalts von Chara bereitsetwas TlCl aus. Um das dadurch verfälschte K + /Tl + -Verhältnis wiederherzustellen,wurde mit einer Spritze vorsichtig zwei- bis dreimal die Hälfte der Badlösung abgesaugtund durch frische Lösung ersetzt. In 250mM Tl + war eine erfolgreiche Präparation derVesikel aufgrund der vielen TlCl-Kristalle gar nicht erst möglich. Deshalb wurden die Vesikelzunächst in 250mM K + präpariert. Nach einer Ruhezeit von 15 Minuten wurde danndie Badlösung mittels eines Spülsystems ausgetauscht (Zur genaueren Beschreibung derdurch die geringe Löslichkeit von Tl + verursachten Probleme und der dagegen getroffenenMaßnahmen siehe Kapitel 5).Abbildung 9.1A zeigt Stromkonzentrationskurven für 250mM K + auf luminaler undK + /Tl + -Mischlösung auf cytosolischer Seite (Gesamtkonzentration auch 250mM) Die Messungenwurden am Plasmatropfen von Chara in der excised-Patch-Konfiguration durchgeführt.In der Abbildung ist deutlich zu sehen, daß sowohl bei positiven als auch beinegativen Membranspannungen eine Reduktion des Einzelkanalstroms in Mischlösung auftritt.Da nur Messungen bei vier verschiedenen Konzentrationsverhältnissen durchgeführtwurden, ist die Lage den Minimums allerdings nicht bestimmbar. Damit die Symmetriebesser zu erkennen ist, wurden für Bild 9.2A die Stromwerte für -60mV gespiegelt undüber die Kurve für +60mV gelegt. Bis auf eine Abweichung bei 0mM Tl + , die aber nochinnerhalb der Fehlerbalken liegt und bei reiner Kaliumlösung ohnehin kein Thalliumeffektsein kann, decken sich beide Kurven.Es wurde darauf verzichtet, durch Messungen bei noch anderen Molfraktionen die Lagedes Minimums zu lokalisieren. Denn die wenigen Daten reichen bereits aus, um zu erkennen,daß sich die neuen Ergebnisse sehr gut mit den 8 Jahre alten Messungen von Keuneckeebenfalls an Chara (Abschnitt 6.1.3 und Abb. 9.1B und 9.2B.) decken. Auch sie fand bei80

Abbildung 9.1: Abhängigkeit des Einzelkanalstroms vom K + /T + -Mischungsverhältnis aufcytosolischer Seite, luminal rein K + . A: Eigene Messungen, die Gesamtkonzentration beträgt250mM. : ± 60mV , •: ± 40mV, : ± 20mV. Mittelwerte aus 3-12 Messungen.B: Messungen von Keunecke (1995), Gesamtkonzentration=150mM. Die Stromeichungenstimmen vermutlich nicht exakt überein.Abbildung 9.2: Der AMFE mit rein K + auf luminaler Seite ist symmetrisch bzgl. derMembranspannung: Vergleich der Stromkonzentrationskurven aus Abb. 9.1 für +60mV() und -60mV (•, gespiegelt). A: Eigene Messungen. B:Messungen von Keunecke.81

einseitig cytosolischer Thalliumgabe bei rein K + auf luminaler Seite einen bezüglich derSpannung vollkommen symmetrischen Effekt (Keunecke, 1995).Abbildung 9.3: Bei Erhöhung der Gesamtkonzentration verschiebt sich das Minimum: Vergleichder Stromkonzentrationskurve bei +60mV (×) mit den Messungen von Keunecke(1995) (). Für die Darstellung wurde der Strom auf den jeweiligen Rein-K + -Wert normiert.Einen Unterschied zwischen den alten und den neuen Messungen gibt es aber doch: Abbildung9.3 vergleicht die AMFE-Kurve von Keunecke (1995) mit den neuen Messungen.Der einzige Unterschied in den Versuchsbedingungen liegt in der Erhöhung der Gesamt-Ionenkonzentration von 150 auf 250mM. Trotz der wenigen Meßpunkte bei den neuen Messungen,ist deutlich zu sehen, daß es nicht genügt, die Strom- und die Konzentrationsachsezu normieren. Die Kurven unterscheiden sich in ihrer Form voneinander, das Minimum istbei den neueren Messungen zu höheren (relativen) Thalliumkonzentrationen verschoben.Die Ursache hierfür ist vermutlich in der im Vergleich zu den Messungen von Keuneckeverminderten relativen Thalliumaktivität zu suchen: In Kapitel 5 wird ausgeführt, daßbei geringem Thalliumanteil in der Mischlösung die Gesamtleitfähigkeit der Lösung nichtwesentlich reduziert wird. Weil jedoch auch schon bei diesen Konzentrationen durch die82

schlechte Löslichkeit von TlNO 3 die Tl + -Aktivität prozentual stärker reduziert wird als dieK + -Aktivität, verschieben sich die Mischungsverhältnisse. Zusätzlich dazu könnten auchbereits bei 20mM Tl + geringe (und deshalb nicht sichtbare) Mengen an TlCl ausgefallensein, was die Tl + -Aktivität zusätzlich reduzieren würde. Die in den Abbildungen angegebenenKonzentrationsverhältnisse geben dann nicht mehr die für den physikalischen Effektwirksamen Verhältnisse der Ionenaktivitäten wieder.9.3 Diskussion9.3.1 Lokalisation der BindungsstellenDie Abbildungen 9.2A und B belegen, dass sowohl die Messungen von Keunecke bei 150mMGesamtkonzentration als auch die Wiederholung 8 Jahre später bei 250mM Gesamtkonzentrationeine perfekte Symmetrie hinsichtlich der Membranspannung zeigen. Dies istein starkes Argument für das Vorhanden von cytosolischen K + /Tl + -Bindungsstellen undgegen einen ,,Foot-in-the-door”-Effekt beim AMFE. Man kann sogar noch etwas weitergehen: Die Kurven sind derartig symmetrisch, daß die Konformation des Proteins an denBindungsstellen nicht allzusehr spannungsabhängig sein darf. Das bedeutet, dass die Bindungsstellenan einem Teil des Proteins liegen, der von der Drehung der S4-Helix (demSpannungssensor des Kanals) nicht sehr stark betroffen ist.Diese Schlüsse hätten im Grunde schon wesentlich früher gezogen werden können. Eingroßes Problem sind jedoch die widersprüchlichen Meßdaten. Schon lange gibt es in der Arbeitsgruppeeine Diskussion darüber, ob der AMFE bei einseitiger Thalliumgabe bezüglichder Membranspannung nun symmetrisch ist oder nicht. Es sah so aus, als würden Frauen(Draber, 1990; Keunecke, 1995) immer einen symmetrischen und Männer (Albertsen, 1994;Farokhi, 2002) einen asymmetrischen Effekt messen. Daß das Geschlecht des Experimentatorsnicht Ursache des Effektes ist, ist allen klar, der wahre Grund bleibt jedoch ungeklärt.Zum Teil sind die Versuchsbedingungen verschieden gewesen, doch auch dies reicht nichtzur vollständigen Klärung, wie im folgenden diskutiert wird.Silke Draber´s (1990) AMFE an Nitella, einer nahen Verwandten von Chara war symmetrischbei einseitig luminaler Thalliumgabe. Ihre Kurven hatten aber im Gegensatzzu allen Nachfolgearbeiten ihr Minimum bei einem Tl + /K + -Verhältnis von ungefähr1:1. Dieser Befund scheint für luminale Bindungsstellen zu sprechen, fügt sich aber beinäherer Betrachtung nahtlos in obige Argumentation ein: Draber (1990) führte ihreMessungen im on-cell-Modus durch und hatte die Mischlösung nicht nur in der Pipettesondern auch in der Badlösung. Die Tonoplastenvesikel besitzen nun aber nichtnur den Kanal, den man gerade mißt, sondern sehr viele über die gesamte Oberflächeverteilt. Die gesamte Membran ist daher durchlässig für K + und Tl + , ein Teil derBadlösung diffundiert also in das Vesikel hinein. Dadurch aber gelangt auch Thalliumauf die cytosolische Seite der Membran und kann dort an den oben postulierten cytosolischeBindungsstellen einen AMFE auslösen. Auch die Lage des Stromminimums83

ei relativ hohen Thallium-Konzentrationen läßt sich damit erklären: Das cytosolischeMedium wird nicht vollständig durch die Badlösung ersetzt, sondern vermischtsich nur mit ihr, deshalb ist der wirksame Thalliumanteil auf cytosolischer Seite wesentlichgeringer als in der Badlösung.Arne Albertsen (1994) fand einen asymmetrischen Effekt bei ebenfalls einseitig luminalerMischlösung. Er maß an excised-Patches mit einer Filterfrequenz von 50kHz. Außerdemfand er den bis heute ebenfalls noch nicht wieder beobachteten Effekt, daß derEinzelkanalstrom bei negativen Spannungen sogar ein Minimum (also ein Maximumim Betrag) aufwies. Diese Messungen sind schwierig zu interpretieren. Es mag sichhier um einem luminalen Effekt handeln, der nicht mit dem bisherigen cytosolischenGating-Effekt korrespondiert. Auf luminale Effekte wird im Kapitel 10 eingegangen.Die Meßergebnisse von Afshin Farokhi (2002) wollen nicht so recht ins Bild passen. Erverwendete nahezu dieselben Versuchsbedingungen wie Keunecke, erhöhte jedoch dieGesamtkonzentration K + +Tl + von 150 auf 250mM (Also exakt dieselben Bedingungenwie in den vorliegenden Messungen). Bei einseitiger Thalliumgabe fand er einenasymmetrischen Effekt. Bei seinen Messungen mit 20mM Tl + und 230mM K + auf cytosolischerSeite war der Strom gegenüber dem reinen Kaliumstrom nur bei positivenSpannungen erniedrigt, also dann, wenn die Mischlösung in den Kanal hineingezogenwird. Bei zusätzlichen Messungen mit Thallium auf beiden Seiten war der Effektwieder symmetrisch. Ein solches Verhalten würde man bei einem ,,Foot-in-the-Door”-Effekt erwarten. Warum diese Messungen denen von Keunecke (1995) und meineneigenen widersprechen, ist im Nachhinein nicht zu rekonstruieren.Es sind also hauptsächlich die Messungen von Farokhi (1998), die den Messungen vonKeunecke (1995) und meinen eigenen widersprechen. Was unterschiedlich war, ist im Nachhineinnicht zu rekonstruieren. Insofern halte ich mich bei der zu Begin dieses Abschnittsausgeführten Interpretation an meine eigenen Messungen.9.3.2 Ein zweiter Tl + -Effekt: Hohe cytosolische Thalliumkonzentrationerhöht die LeitfähigkeitIn Abb. 9.1A und Abb. 9.1B sehr ausgeprägt sieht man, dass auf der linken Seite der AMFE-Kurve (beidseitig 250mM K + ) der Strom kleiner ist als auf der rechten Seite (250mM Tl +luminal und 250mM K + cytosolisch). Als Ursache für die Erhöhung des gemessenen Einzelkanalstromsbei 250mM Tl + aus cytosolischer Seite kommen wieder zwei Mechanismenin Frage: Gating und Permeation. Ein Gating-Effekt kann es hier aber nicht sein. Denndurch Gating kann der scheinbare Strom allenfalls kleiner und nicht größer werden. Farokhiet al. (2000) haben jedoch gezeigt, daß bereits in symmetrischer Kaliumlösung keineStromreduktion durch Gating vorliegt. Es muß also ein Permeationseffekt vorliegen. EinPermeationseffekt kann wiederum zwei Ursachen haben:1. Eine ion-spezifische Anpassung an die Transporteigenschaften (z.B. Radius des Selektivitätsfilters)eines unveränderten Kanals.84

2. Eine unspezifische Leitfähigkeitserhöhung durch Veränderung des Kanals.Im Falle 1 würde man argumentieren, daß der Kanal für Thallium leitfähiger sei als fürKalium. Dann dürfte der Strom aber nur dann größer werden, wenn er von Thallium getragenwird, also bei positiven Spannungen auf der rechten Seite von Abbildung 9.1B. Doches gibt eine gleich große Stromerhöhung, wenn bei negativen Spannungen K + -Träger desStromes ist. Abb. 9.1B zeigt, daß mit 150mM Tl + auf cytosolischer Seite die Ströme überden gesamten Spannungsbereich größer sind als in symmetrischer Kaliumlösung.Dieser Widerspruch führt auf den Fall 2: Hohe cytosolische Thalliumkonzentrationenscheinen also die Einzelkanalleitfähigkeit des Kanals sowohl für Thallium selbst als auchfür Kalium zu erhöhen. Die Betrachtung der Spannungsabhängigkeit in Abb. 9.1 machtdeutlich, dass das Umkehrpotential bei 0mV liegt (die Ströme bei +20 mV und -20 mVhaben gleichen Abstand von der Nullinie). Eine Umkehrspannung von 0 mV bei einerMembran, bei der auf einer Seite 250 mM K + und auf der anderen Seite 250 mM Tl +vorliegen, scheint auf den ersten Blick zu bedeuten, daß der Leitfähigkeitsmechanismus desKanals nicht zwischen Kalium und Thallium unterscheidet, da der Kaliumstrom (negativeSpannungen) und der Thalliumstrom (positive Spannungen) gleich groß sind(Abb. 9.2Aund B).Es ist jedoch schwer, diese Aussage in Übereinstimmung mit den Ergebnissen des Kapitels5 zu bringen. Es sind zwei Argumentationslinien denkbar:1. Nach Abb. 5.3 im Kapitel 5 ist bei einer Konzentration von 250 mM Tl + bzw. K +zu erwarten, daß das Verhältnis der Ionenaktivitäten K + : Tl + etwa 1,5 : 1 beträgt. Auchwenn nach Kapitel 5.4 erwarten ist, dass Sättigungseffekte (Abb. 5.3) den Strom in 250mMK + etwas senken gegenüber einer linearen Extrapolation von niedrigen Konzentrationen,würde bei gleichen Permeabilitäten ein Umkehrpotential ungleich null entstehen. Wenndie effektive Tl + -Konzentration um den Faktor 1.5 unter der effektiven K + Konzentrationliegt, wäre das Umkehrpotential bei E R = 60mV log 1.5 = 10mV. Die Frage ist, ob derNullpunktsabgleich wirklich so sicher ist, dass ausgeschlossen werden kann, dass 10mVaußerhalb des Messfehlers liegt. Andernfalls müsste im Sinne der Goldmangleichung (Gl.8.1) eine um den Faktor 1.5 höhere Tl + Leitfähigkeit angenommen werden.2. Die niedrigere Aktivität in Tl + -Lösung entsteht nach Kapitel 5 durch die Bildung vonTlNO 3 -Molekülen und vielleicht auch größeren Aggregaten. Diese Moleküle oder Aggregatestehen im dynamischen Gleichgewicht mit den dissoziierten Ionen. Die Frage ist, was voreinem Kanal geschieht. Wenn massiv Ionen durch den Kanal verschwinden, dissoziierendann die Moleküle bzw. Aggregate? Dann wäre die effektive Aktivität am Porenmunderheblich höher als sich aus den osmotischen Messungen in Kapitel 5 ergibt. In diesemFalle sind die unter 1. angestellten Überlegungen gar nicht erforderlich, weil dann dochfast gleiche effektive Ionenaktivitäten auf beiden Seiten des Kanals vorliegen. Abgesehenvon dem Problem der unbekannten Tl + -Aktivität am Porenmund, ist dennoch folgendeFeststellung zu treffen:Neben dem Effekt von cytosolischem Tl + auf das Gating (Farokhi et al., 2000) gibt esnoch einen cytosolischen allosterischen Effekt, der die Leitfähigkeit nicht-ionen-spezifischerhöht.85

Kapitel 10Luminale Thallium-Effekte10.1 MotivationDie vorliegenden Messungen standen eigentlich im Zusammenhang mit der im Kapitel 8besprochenen Suche nach einem möglichen Selektivitätswechsel des Kanals. Sie begannenzu einer Zeit, als der von Farokhi et al. (2000) festgestellte Gating-Effekt im Zentrum desInteresses stand. Als dann bei den Messungen mit 230mM Tl + und 20mM K + auf luminalerSeite ein geringerer Strom als bei 250mM K + gefunden wurde (unten links Fig. 10.1B bei0mM Tl + auf cytosolischer Seite), wurde versucht, dies damit zu erklären, dass durch denelektrischen Strom von der Pipette auf die cytosolische Seite geschwemmtes Tl + Gatingverursacht. Als dieses Gating nicht gefunden wurde (unten, Abschnitt 10.3, begann einesystematische Untersuchung der Tl + -Wirkung auf beiden Seiten der Membran.Die Ergebnisse, die in den Abb. 10.1 und 10.2 dargestellt sind, führten auf eine Erweiterungdes Bildes von der Tl + -Wirkung auf den Chara-Kanal. Zum bereits bekanntenGating-Effekt kommen insgesamt noch zwei Effekte hinzu. Der cytosolische Effektauf die Einzelkanalleitfähigkeit wurde bereits in Abschnitt 9.3.2 diskutiert. Ein luminalerThallium-Effekt wurde gefunden, als die Messungen zu Kapitel 8 zu einer vollständigenStromkonzentrationskurve wie in Kapitel 9 ergänzt wurden.10.2 MeßergebnisseDie Messbedingungen sind identisch zu denen im vorigen Kapitel 9. Die einzige Änderungbesteht in der Verwendung von 230mM Tl + + 20mM K + statt 250mM K + als Pipettenlösung.Dadurch veränderte sich die AMFE-Kurve in auffallender Weise an gleich mehrerenPunkten (vgl. Abb. 10.1B mit Abb. 10.1A bzw. 9.1). Zur besseren Vergleichbarkeitwurden die Kurven zu -60 und +60mV aus den Abbildungen 10.1A und B in Abbildung10.2 übereinandergelegt. Im Einzelnen traten in Abbildung 10.1B folgende Effekte auf:1. Die hohe luminale Tl + Konzentration verhindert den Anstieg des Stromes bei hohencytosolischen Tl + -Konzentrationen für positive und negative Spannungen (rechts inAbb. 10.2 bzw. 10.1B).87

Abbildung 10.1: Einfluß der luminalen Seite auf den anomalen Molfraktionseffekt des Einzelkanalstromsin Chara, der Thalliumgehalt im Bad=Cytosol ist auf der x-Achse angegeben,die Gesamtkonzentration [K + ] + [T l + ] betrug 250mM. A: 250mM K + auf luminalerSeite. B: 230mM Tl + +20mM K + auf luminaler Seite.88

2. Hohe Thalliumkonzentrationen auf luminaler Seite zerstören die Symmetrie des AM-FE bezüglich der Spannung. Bei positiven Spannungen sieht man zumindest noch dieStromreduzierung in Mischlösung gegenüber reiner K + -Lösung. Bei negativen Spannungen,also wenn fast reine Thalliumlösung durch die Pore des Kanals gezogen wird,sind die Einzelkanalströme unabhängig vom K + /Tl + -Verhältnis auf cytosolischer Seite,d.h. es tritt kein AMFE mehr auf (unten in Abb. 10.2).3. Ganz links in Abb. 10.2: Die hohe luminale Tl + -Konzentration reduziert den Tl + -Einwärtsstrom (negative Spannungen), hat aber keinen Einfluß auf den K + -Auswärtsstrom(positive Spannungen).4. Dort wo Stromreduzierung durch Gating vermutet wird (in Mischlösungen auf cytosolischerSeite) hat die luminale Ionenart keinen Einfluß, sowohl bei Einwärtsströmenals auch bei Auswärtsströmen (jeweils die beiden mittleren Punkte in Abb. 10.2).Vor der Interpretation der Stromspannungskurven sollen erst noch die Ergebnisse derHidden-Markov-Analyse präsentiert werden.8642I / pA0-2-4-6-8-100 50 100 150 200 250[Tl + ] cyt/ mMAbbildung 10.2: Zum besseren Vergleich: Luminales Thallium zerstört die Symmetrie, undverhindert, daß der Strom nach dem Minimum wieder anwächst.89

10.3 RatenkonstantenEines der wesentlichen Erkenntnisse unserer Arbeitsgruppe war, dass die Stromreduzierungbeim AMFE in Abb. 10.1A auf Mittelung über schnelles Schalten beruht (Farokhi et al.,2000, Abb. 7.1). Insofern war erwartet worden, dass auch die Stromreduzierung in denMessungen mit viel Tl + in der Pipette (Abb. 10.1B) ein Gating Effekt ist. Der Nachweisdieser Stromreduzierung sollte wie bei Farokhi et al. (2000) geschehen:1. HMM-Fit der Zeitreihen (Abschnitt 4.6) mit dem Modell:−−⇀ ↽−−−−⇀ ↽−−A k AOO k OGk OA k GO−−⇀ ↽−−−−⇀ ↽−− ZG k GCC k CZk CG k ZC(Abschnitt 4.1:A und O offen, G,C,Z geschlossen).2. Simulation der Zeitreihen mit den aus dem Fit erhaltenen Ratenkonstanten.3. Bestimmung der Amplitudenniveaus in den gefilterten Zeitreihen.Die HMM-Analysen der Meßdaten wurden mit der in Abschnitt 4.6.3 beschriebenenVorgehensweise durchgeführt: Zuerst wurden geeignete Zeitreihen mit möglichst wenigKanälen und geringem Rauschen ausgewählt. Da nicht genügend Ein- oder Zweikanalmessungenvorhanden waren, wurden Aufzeichnungen mit drei oder vier Kanälen so zerschnitten,daß nur noch zwei Kanäle zur Zeit offen waren. Nach Colquhoun und Hawkes(1982) werden damit nur die Eigenschaften der langsamen Geschlossenzustände (C und Zin Tabelle 10.1) verfälscht, die Zustände A, O und G, um die es beim schnellen Schalten imwesentlichen geht, werden nicht verändert. Die so präparierten Zeitreihen werden mit demHMM-Fit analysiert, und die Ergebnisse über Simulationen dann noch einmal korrigiert.Die Ergebnisse der Analysen sind in Tabelle 10.1 zusammengefaßt. Da für jede Meßlösungnur ein oder zwei Zeitreihen analysiert werden konnten, wird auf die Angabe vonstatistischen Fehlern verzichtet. Die statistische Zuverlässigkeit der Aussage ergibt sichstattdessen aus der Ähnlichkeit der Ergebnisse in allen 8 Zeilen der Tabelle 10.1. Es wurdenfür jede der vier cytosolischen Meßlösungen (0-250mM Tl + ) die Analysen für jeweils -60mVund +60mV (die beiden Blöcke in Tabelle 10.1) durchgeführt. Über den Zustandssymbolen(A - Z) stehen die Besetzungswahrscheinlichkeiten, die aus den Ratenkonstanten berechnetwurden. Damit sie besser vergleichbar sind, wurden sie jeweils auf den Zustand A normiert.Die Besetzungswahrscheinlichkeiten der Zustände A, O, G und sogar C bleiben nahezukonstant. Daß p Z so stark schwankt, liegt daran, daß die Zeitreihen zerschnitten wurden,und ist daher nicht signifikant (Abschnitt 4.6.2).Die Ratenkonstanten in Tabelle 10.1 liegen in der auch von Farokhi et al. (2000) gefundenenGrößenordnung. Was auffällt ist allerdings, dass in 20mM Tl + sich die Besetzung vonO gegenüber A nicht so dramatisch erhöht wie in den Daten von Farokhi et al. (2000) undHansen et al. (2003). Dies ist die Ursache, dass auch keine nennenswerte Stromreduzierung(0.97 bis 0.99 durchgehend in der letzten Spalte von Tabelle 10.1) auftritt.Das völlige Fehlen einer Stromreduktion durch Gating war einigermaßen überraschendund kann zwei Ursachen haben:1. Die Meßdaten waren zu schlecht oder eine Modifikation im Fitprogramm hat ungewolltdie Zeitauflösung herabgesetzt. Dann könnte ein in Wahrheit vorhandener Gating-Effekt90

-60mVi fit /i sim0mM Tl + :10,09 0,16 1,15 14,5−−−⇀ ↽−−− O −−−⇀ ↽−−−93000G −−−⇀ ↽−−−18000C −−⇀ ↽−−500Z 0,9953000 2600 40A 20002100020mM Tl + :10,17 0,18 1,27 15,73−−−⇀ ↽−−− O −−−⇀ ↽−−−89500G −−−⇀ ↽−−−21200C −−⇀ ↽−−720Z 0,9881600 3000 60A 220014400100mM Tl + :10,16 0,25 2,24 39,89−−−⇀ ↽−−− O ↽−−−154000−−−⇀ G −−−⇀ ↽−−−13200C −−⇀ ↽−−440Z 0,9798000 1500 25A 270017100250mM Tl + :10,21 0,34 1,77 15,62−−−⇀ ↽−−− O −−−⇀ ↽−−−95000G −−−⇀ ↽−−−13300C −−⇀ ↽−−900Z 0,9770800 2800 80A 250014700+60mV:0mM Tl + :10,12 0,11 0,48 7,75−−−⇀ ↽−−− O −−−⇀ ↽−−−72500G −−−⇀ ↽−−−10500C −−⇀ ↽−−700Z 0,9870A 19001620082700280020mM Tl + :10,16 0,23 1,35 6,24−−⇀ ↽−− O ↽−−−133000−−−⇀ G −−−⇀ ↽−−−11900C −−⇀ ↽−−400Z 0,9797900 1900 100A 10005900100mM Tl + :10,16 0,24 1,12 4,35−−−⇀ ↽−−− O ↽−−−122000−−−⇀ G −−−⇀ ↽−−−11500C −−⇀ ↽−−550Z 0,9766000 2600 150A 250021000250mM Tl + :10,10 0,20 1,70 15,50−−−⇀ ↽−−− O ↽−−−125000−−−⇀ G −−−⇀ ↽−−−14800C −−⇀ ↽−−900Z 0,9980000 1700 90A 210017000Tabelle 10.1: Mit dem HMM-Fit ermittelte Ratenkonstanten zu den Messungen aus Abbildung10.1B. Meßlösungen: luminal 230mM Tl + + 20mM K + , cytosolisch: xmM Tl + (linkeSpalte) + (250-x)mM K + . Abknickfrequenz des 4-Pol-Bessel-Filters: 50kHz. Sampling-Frequenz: 200kHz.91

unentdeckt geblieben sein.2. Mit viel Thallium auf luminaler Seite gibt es den Gatingeffekt tatsächlich nicht mehr.Das hätte folgende Aussage: Obwohl sich die Kurven bei positiven Spannungen in Abb.10.2 decken, wäre zumindest der eine Effekt kein Gating-AMFE, sondern ein Permeations-AMFE.Möglichkeit 2 scheint etwas wahrscheinlicher zu sein. Denn das Beispiel im Abschnitt4.6.3 hat gezeigt, daß das verwendete Analyseverfahren durchaus in der Lage ist, einevorhandene Stromreduzierung durch Gating zu entdecken. Das in dem Beispiel verwendeteSignal-Rausch-Verhältnis entsprach auch in etwa dem der Meßdaten zu Tabelle 10.1.Natürlich ist das nicht sicher. Bei echten Messungen kann es immer sein, daß die Analysendurch verschiedene Faktoren, z.B. ein ungünstiges Rauschspektrum oder eine dochnicht ganz stabile Nullinie verfälscht werden. Leider lagen für die Kurven in 10.1A keineMessungen in der Qualität vor, dass eine HMM-Auswertung möglich gewesen wäre. Eskonnte deshalb nicht überprüft werden, ob die Stromreduktion in den Messungen mit reinK + auf luminaler Seite tatsächlich auf Gating beruht wie bei Farokhi et al. (2000). Wenndas so wäre, müsste angenommen werden, daß die Kanäle in dieser Arbeit und in Farokhiet al. (2000) nicht gleich waren und sich daher unterschiedlich verhielten. Der Verdachtwird durch die Tatsache unterstützt, daß mit rein K + auf luminaler Seite das Minimumdes Stroms nicht dort liegt, wo Keunecke (1995) und Farokhi (2002) es fanden, sonderneher an der Stelle, wo es bei Draber (1990) lag. Das Schaltverhalten von Maxi-K-Kanälen(die man mit den Chara-Kanälen gleichsetzt) wird durch die Coexpression einer optionalensogenannten β-Unit beeinflußt, und durch Schwankungen in den Haltungsbedingungen derAlgen, die nicht zu vermeiden sind, kann die Genexpression durchaus beeinflußt wordensein.Um hier eine größere Sicherheit zu erlangen, müßten bessere Meßreihen für die Datenzu Abbildung 10.1A erzeugt werden. Wird hier eine Stromreduktion durch Gating nachgewiesen,dann ist es relativ sicher, daß das Fehlen dieser Reduktion in Tabelle 10.1 echt ist.Denn die Messungen zu den Abbildungen 10.1A und B fanden unter Versuchsbedingungenstatt, die sich ähnlicher hätten kaum sein können. Aus den obengenannten Gründen konnteeine solche zusätzliche Analyse leider nicht mehr durchgeführt werden, so daß ersteinmalnicht geklärt werden konnte, ob der AMFE mit rein K + auf luminaler Seite ein Gating- oderein Permeationseffekt ist. Zum Glück beeinflußt diese ungelöste Frage, nicht das Ergebnisdieser Arbeit, dass zusätzlich zu dem von Farokhi et al. (2000) gefundenen Gating-Effektnoch ein cytosolischer und ein luminaler Effekt auf die Permeation berücksichtigt werdenmüssen.10.4 DiskussionSolange die Frage ,,Permeation oder Gating” ungeklärt ist, muß sich die Diskussion aufdie Punkte in Abb. 10.2 beschränken, bei der kein Gating erwartet wird, also bei reinerLösung auf cytosolischer Seite. Das wären dann die Punkte ganz links (rein K + ) und ganzrechts (rein Tl + ) in den Abbildungen 10.1A und B bzw. 10.2.92

Die Entscheidung ist auch dadurch begründet, dass in Mischlösung auf cytosolischerSeite (jeweils die beiden mittleren Punkte in den Abbildungen) luminales Thallium keinensignifikanten Einfluß zeigt und die Entdeckung neuer Effekte in diesem Bereich unwahrscheinlichist. Neue Effekte treten aber sicher an den Rändern der Abb. 10.2 auf, unddeshalb ist hier die Aussicht auf neue Erkenntnisse größer.Als Erstes ist die Stromreduzierung bei 0mM Tl + bei negativen Spannungen in Abb.10.2 zu besprechen (unten links im Bild 10.2:Da die kinetischen Analysen im vorherigen Abschnitt keine Stromreduzierung durchGating nachweisen konnten, muss eine luminale Tl + Bindungsstelle mit allosterischer Wirkungauf die Einzelkanalleitfähigkeit angenommen werden (Permeationseffekt).Alle in Abschnitt 10.2 beschriebenen Effekte müssen von der Hypothese erfaßt werden:1. Stromreduzierung bei cytosolisch 0mM Tl + nur wenn Tl + den Strom trägt (negativeSpannung).2. Stromreduzierung wenn symmetrisch hoch Tl + (230 bzw. 250mM) auf beiden Seitenvorliegt (beide Spannungen).In allen drei Punkten in 10.2, in denen der Strom bei luminalem Tl + geringer als beiluminalem K + ist, wird der Strom von Thallium getragen. Man könnte jetzt argumentieren,das sei gar kein Effekt des Kanals, sondern die Löslichkeit von Thallium sei eben so gering,daß durch die schlechtere Verfügbarkeit von Ionen am Porenmund der Strom reduziertwird. Das kann aber so nicht ganz stimmen, denn auch oben rechts in Abb. 10.1A wird derStrom von Thallium getragen, und hier ist er groß.Die einfachste Möglichkeit die Stromreduktion an den oben erwähnten drei Punkten widerspruchsfreizu erklären, ist die Annahme, daß cytosolische und luminale Bindungsstelleneinen kooperativen Effekt auslösen:An allen Punkten, an denen der Strom mit viel luminalem Thallium gegenüber demmit rein K + in der Pipette reduziert ist, haben wir Tl sowohl auf cytosolischer, als auchauf luminaler Seite. Dies ist trivial bei den Messungen mit 250mM cytosolischem Tl + inAbb. 10.2 rechts. Beim dritten Punkt (0mM K + cytosolisch, negative Spannung) wirdangenommen, dass der Strom Tl + durch den Kanal zur cytosolischen Bindungsstelle trägt.Wenn dies zutrifft, dann liegt ein kooperativer Effekt von luminalen und cytosolischenBindungsstellen vor. Die Besetzung der cytosolischen Bindestelle allein bringt einen Stromerhöhungwie in Kapitel 9 diskutiert. Eine gleichzeitige Besetzung von cytosolischer undluminaler Bindungsstelle bringt eine Stromerniedrigung. Luminale Bindung allein (ohneTl + auf cytosolischer Seite) scheint nicht zu wirken, denn bei positiven Spannungen und0mM Tl + cytosolisch ist keine Stromerniedrigung in Abb. 10.2 zu sehen. Deshalb muss einkooperativer Effekt angenommen werden. Dies ist auch gar nicht so weit hergeholt, weilProteinmoleküle in sich stark gekoppelt sind und daher großräumig verformen können.Damit ist gezeigt, dass insgesamt drei Effekte die Wirkung von Tl + auf die Leitfähigkeitdes K + -Kanals im Tonoplasten von Chara corallina beeinflussen:1. Cytosolisch: Stromreduzierung durch Gating (Farokhi et al., 2000; Hansen et al., 2003).2. Cytosolisch: Stromerhöhung durch einen Permeationseffekt (Kapitel 9.)3. Luminal/cytosolisch: kooperative Stromerniedrigung durch einen Permeationseffekt (diesesKapitel).93

Wie gesagt, ob alle diese drei Effekte auch in cytosolischer Mischlösung in Abb. 10.2mitwirken, kann erst eine erweiterte experimentelle Analyse ergeben, die aber den Rahmeneiner Diplomarbeit sprengen würde.94

Kapitel 11Amplitudenverteilung pro LevelDie Entdeckung des Gatings als Ursache des AMFE durch Farokhi et al. (2000) wurdedadurch möglich, dass die Arbeitsgruppe inzwischen ein sehr hohes zeitliches Auflösungsvermögenerreicht hatte. Insofern hatten Bemühungen, das Zeitauflösungsvermögenzu erhöhen, stets eine hohe Priorität. Der HMM-Fit (Abschnitt 4.6) hat zur Zeit nochimmer die Führungsrolle inne. Doch bereits in der Arbeit von Rießer (1998) begannen Versuche,den Beta-Verteilungsfit (siehe Abschnitt 4.7.2) für die Analyse des schnellen Schaltenszu nutzen. Zur Zeit verspricht die Kombination von HMM-Fit und Beta-Verteilung inder Dissertation von Harlfinger (2003) eine weiter Erhöhung Zeitauflösungsvermögens zuermöglichen.In dieser Arbeit wurde alternativ oder als Ergänzung zum Harlfingerschen Verfahreneine Methode entwickelt, Beta-Verteilungen besser sichtbar zu machen. Denn häufig ist dieBeta-Verteilung eines Levels von den Verteilungen benachbarter Level verdeckt. Der neueAnsatz, um den es hier geht, ist die Erzeugung getrennter Amplitudenhistogramme für dieeinzelnen Stromniveaus einer Patch-Clamp-Aufzeichnung. Es stellte sich aber recht baldheraus, dass für die Messungen in dieser Arbeit die Auflösung des HMM-Fits ausreichte,und das neue Verfahren kam deshalb beim AMFE nicht mehr zum Einsatz. Andererseitsbietet dieses einfache Verfahren viele verschiedene Anwendungsmöglichkeiten, wodurch eskünftig als zusätzliches Hilfsmittel bei der Analyse von Patch-Clamp-Daten dienen könnte.Aus diesem Grunde wird das Verfahren hier beschrieben. Außerdem sind die meistender in diesem Kapitel angesprochenen Aspekte bereits zur Veröffentlichung im Journal ofMembrane Biology eingereicht (Schröder et al., 2003).Weiterhin war nicht nur der Wunsch der besseren Sichtbarmachung der Beta-VerteilungenUrsache für die Entwicklung des Verfahrens. Die Amplitudenverteilungen pro Levelerhöhen auch die Zuverlässigkeit der bereits in der Arbeitsgruppe benutzten Verfahren,denn sie alle hängen von der genauen Kenntnis der Stromniveaus (Level) ab (Abschnitt4.3).Für die kinetische Analyse einer Patch-Clamp-Zeitreihe (d.h. die Bestimmung des Markov-Modellsund seiner Ratenkonstanten, Abschnitt 4.1) stehen in unserem Labor dreiMethoden zur Verfügung:1. Die Verwendung von Level- (automatisch oder by-eye, Abschnitte 4.4 und 4.7.1) und95

Sprungdetektoren (Abschnitt 4.5) zur Erstellung von Dwell-Time-Histogrammen undanschließendem Dwell-Time-Target-Fit (Abschnitt 4.7.3).2. Der direkte Zeitreihenfit (Abschnitt 4.6) in Kombination mit einem Leveldetektor.3. Der Fit des Amplitudenhistogramms mit Beta-Verteilungen (Abschnitt 4.7.2).Der direkte Zeitreihenfit erreicht im Vergleich zum Dwell-Time-Target-Fit eine höhereZeitauflösung, unter anderem, weil er keinen Sprungzeitendetektor benötigt (Farokhi et al.,2000). Er erfordert aber auch wesentlich längere Rechenzeiten als der Dwell-Time-Target-Fit (bis zu zwei Tage für die Auswertung einer 10 s-Zeitreihe mit einem 5-Zustandsmodellund 2 Kanälen). Der Amplitudenhistogrammfit benötigt gar keinen Detektor, hat allerdingsden Nachteil, daß er oft keine eindeutigen Ergebnisse liefert und bei langsamen Übergangsratenauch mal ganz versagt (Harlfinger, 2000).Der direkte Zeitreihenfit und der Amplitudenhistogrammfit selbst benötigen keinenSprungzeitendetektor mehr. Sie brauchen jedoch als Vorgabe ein Markov-Modell mit einerbekannten Anzahl von Offen- und Geschlossenzuständen. Diese Anzahl wird nach wievor aus den Dwell-Time-Histogrammen bestimmt, welche wiederum den Sprungdetektorvoraussetzen.Obige Übersicht zeigt, dass Level- und Sprungdetektoren noch immer eine wichtigeFunktion bei der Analyse von Patch-Clamp-Daten spielen. Doch bisher war es kaummöglich, ihre Effizienz im Einzelnen zu überprüfen. Ihre Entwickler (automatischer Leveldetektor(Abschn. 4.7.1): Rießer, 1998, Rießner et al., 2002 und Woelk, 2000; Hinkley-Detektor (Abschn. 4.5): Schultze und Draber, 1993) haben die Programme zwar ausführlichmit Simulationen (Abschnitt 4.2) getestet, aber trotzdem bestand der Wunsch nach eineranschaulichen Kontrolle der Ergebnisse bei echten Daten auf ihre Glaubwürdigkeit, wiesie beispielsweise beim Exponentialfit von Dwell-Time-Histogrammen (Abschn. 4.7.3) vonNatur aus gegeben ist (Blunck et al., 1998).Eine Methode hierfür ist die Generierung getrennter Amplitudenhistogramme für jedeseinzelne Stromlevel. Dies ist durch eine von Tobias Huth durchgeführte Modifikationim Auswerteprogramm möglich: Der Routine des Sublevel-Hinkley-Detektors (DHD, Abschnitt4.5) wurde eine Buchhalterfunktion hinzugefügt, die für jedes Stromlevel einen Datenpoolerstellt und jeden Meßpunkt einem dieser Pools zuordnet, entsprechend dem vomDetektor festgestellten Level. So erhält man Amplitudenverteilungen für jeden im Stromunterscheidbaren Zustand des Kanals (zu Hidden-Markov, s.u.), aus denen man Erkenntnisseüber die Zuverlässigkeit der Detektoren und der zugrundegelegten Markov-Modellegewinnen kann (Abbildung 11.1 rechts).Ein perfekt arbeitender Sprungdetektor würde bei simulierten Daten für jedes Leveleine Gaussverteilung mit der in der Simulation vorgegebenen Breite liefern, wie es z.Bin Abb. 11.1 der Fall ist. Die Verteilungen echter Zeitreihen wären entweder gauss- oderbetaförmig, je nach der Geschwindigkeit des Schaltens (siehe Abschnitt 4.7.2). Durch Filtereffekte(Abschnitt 4.7.2), missed events und Fehlalarme des Sprungdetektors (Abschnitt4.5) entstehen Abweichungen von der idealen Verteilung. Unter bestimmten Bedingungenkönnen aber gerade diese kleinen Fehler wertvolle Informationen liefern.96

Abbildung 11.1: Erstellung getrennter Amplitudenhistogramme (rechts) für jedes Stromlevelmit dem Hinkley-Detektor. Die waagerechten roten und grünen Linien im Ausschnittaus der Zeitreihe links geben die Abschnitte in der rekonstruierten, rauschfreien Zeitreihean, in denen das untere oder obere Niveau besetzt sind.In vorliegendem Kapitel sollen anhand von simulierten Daten einige Anwendungsmöglichkeitendes neuen Verfahrens aufgezeigt werden. Dabei wird auf die Verwendung vonHidden-Markov-Modellen (Abschnitt 4.1) verzichtet, weil Level- und Sprungdetektorenzwischen verschiedenen Zuständen gleicher Leitfähigkeit nicht unterscheiden können.11.1 Amplitudenhistogramme pro Level als Kontrollefür LeveldetektorenDer erste Schritt bei der Auswertung von Patch-Clamp-Zeitreihen ist die Ermittlung derAnzahl der im Patch vorhandenen Kanäle und des Einzelkanalstroms (Abschnitt 4.4). Zahlund Lage der Stromniveaus sind die Grundlage für alle folgenden Schritte der Auswertung(Abschnitt 4.3). Deshalb wäre gerade an dieser Stelle eine Kontrolle der Ergebnisse auf ihreRichtigkeit wünschenswert. Um zu testen, ob die Amplitudenverteilungen pro Level diesleisten können, wurden zwei Zeitreihen simuliert. Das erste Modell besteht aus einem Kanalmit zwei Zuständen (C und O), die zugehörigen Stromniveaus sind in Abbildung 11.2C alsgestrichelte Linien eingezeichnet. Das zweite Modell besteht aus zweien dieser Kanäle, alsoden Stromniveaus C, O und 2O, die ebenfalls gestrichelt in Abbildung 11.2D eingezeichnetsind. Beide Zeitreihen wurden mit der falschen Anzahl von Kanälen ausgewertet. Dies zeigtesich dann in den Amplitudenhistogrammen der einzelnen Niveaus, sodaß der Schwindelauffiel:Abbildung 11.2A zeigt das Amplitudenhistogramm der simulierten Zeitreihe mit zweiZuständen (C und O in Abb. 11.2C). Aufgrund des schlechten Signal-Rausch-Verhältnissesist jedoch die Zahl der Zustände am Histogramm nicht erkennbar. Abbildung 11.2A97

Abbildung 11.2: A: Amplitudenhistogramm einer simulierter Zeitreihe mit zwei Leveln,die als gestrichelte Linien C und O in C dargestellt sind, gefittet mit drei Gausskurven.B: Histogramm einer simulierten Zeitreihe mit 3 Leveln, die als gestrichelte Linien C, Ound 2O in D dargestellt sind, gefittet mit zwei Gausskurven. C: Aus der Zeitreihe zu Aresultierende Levelhistogramme. Die Maxima der Gaussverteilung zu Z und F liegen beiC und O. D: Aus der Zeitreihe zu B resultierende Levelhistogramme: die Verteilungen zuZ und F sind nicht gaussförmig. Die durchgezogenen Kurven zeigen zum Vergleich jeweilsden besten mit einer Gaussfunktion erreichbaren Fit. Simulationsparameter: A: ein Kanalmit C=0pA, O=2pA, Standardabweichung des Rauschens σ= 2pA. B: zwei Kanäle mitC=0pA, O=2pA (⇒ 2O=4pA), σ=2pA. Alle Ratenkonstanten=1000s −1 .98

zeigt, dass sich das Histogramm ebensogut mit drei Niveaus (Z, F und 2F ) anfitten lässt(Zum Gauss-Fit des Amplitudenhistogramms siehe Abschnitt 4.4). Erstellt man jetzt dieAmplitudenverteilungen pro Level, so zeigt sich, dass die zu den hypothetischen (falschen)Zuständen Z und 2F gehörenden Verteilungen ihre Maxima nicht an den hypothetischenStromniveaus annehmen, sondern daneben und zwar an den (richtigen) Stellen C und O(Abb. 11.2C). So entlarven sie die falsche Annahme über Zahl und Lage der Level:Der Zustand F hat sein Maximum zwar genau an der Stelle F und sieht daher beioberflächlicher Betrachtung zunächst richtig aus, dies ist aber Zufall, da das Histogrammsymmetrisch ist und F genau in der Mitte liegt. Er verrät sich aber dadurch, dass seineAmplitude im Gauss-Fit des Originalhistogramms (mittlere Kurve in Abb. 11.1A) mit dervom Sprungdetektor gefundenen Verteilung (mittlere Kurve in Abb.11.1C) nicht einmalannähernd übereinstimmt. Die Verteilung zu F hat nämlich in Abb. 11.1A etwa dieselbeAmplitude wie die Zustände Z und 2F . In Abb.11.1C ist sie um mindestens den Faktor100 kleiner. Dieser Befund läßt sich auch keinesfalls mit der Annahme zweier gleicher,unabhängig voneinander operierender Kanäle mit jeweils den Zuständen Z und F in Einklangbringen. Die Aufenthaltswahrscheinlichkeit in den Zuständen Z, F und 2F müßteeiner Binomialverteilung genügen (Draber et al., 1993). Bezeichnet man die Offenwahrscheinlichkeiteines Kanals (Z ⇋ F ) mit p (⇒p geschlossen =1-p), so müsste für die Aufenthaltswahrscheinlichkeitengelten:p Z = (1 − p)(1 − p) = (1 − p) 2 (11.1)p F = p(1 − p) + (1 − p)P = 2p − 2p 2 (11.2)p 2F = p 2 (11.3)Sowohl aus Abbildung 11.1A als auch aus 11.1C liest man p Z = p 2F . Daraus folgt mit denGleichungen 11.2 bis 11.3 p=0,5 (dies folgt auch aus den symmetrischen Ratenkonstantender Simulation, aber das weiß man nicht bei gemessenen Daten) und somit:p F = 0, 5 > 0, 25 = p Z = p 2FAuch ohne genaue Kenntnis der Amplitudenfaktoren ist das in Abb. 11.1C offensichtlichnicht der Fall. Es besteht also keiner der drei falsch postulierten Zustände die Kontrolledurch die Levelhistogramme.Die Abbildungen 11.1B und D zeigen den umgekehrten Fall: Den Versuch, das Amplitudenhistogrammeiner Zeitreihe mit drei Stromniveaus (=2 Kanälen) mit einem (natürlichfalschen) 2-Zustandsmodell zu analysieren. Im diesem Fall funktioniert das Kriterium derLage der Maxima nicht. Auch die Binomialverteilungen sind hier nicht anwendbar, denn siegreifen nur bei mehreren Kanälen, wenn man die aus den verschiedenen Niveaus erhaltenenOffenwahrscheinlichkeiten miteinander vergleichen kann. Aber dafür verrät die Form derVerteilungen den falschen Fitansatz:In Abbildung 11.2B wird das Amplitudenhistogramm einer verrauschten simuliertenZeitreihe mit drei Stromleveln (C, O und 2O in Abb. 11.1D) mit zwei Gausskurven (Zund F ) nahezu perfekt angefittet. Die Amplitudenverteilungen der Level Z und F habenihre Maxima jedoch trotz der falschen Annahme genau an den Positionen Z und F99

(wiederum wegen der symmetrischen Verteilung). Den einzigen Hinweis auf die Annahmeeines falschen Modells liefert die Form der Kurven: Im Vergleich zu den angefittetenGauss-Kurven (durchgezogene Linien in Abb. 11.2D) ist ihre Basis deutlich zu schmal.Dies fällt besonders deshalb auf, weil die Erfahrung gezeigt hat, daß bei der Annahme desrichtigen Modells die Verteilungen durch missed-events und Schaltflanken nach unten hingrundsätzlich breiter werden.Durch die Rekonstruktion der Zeitreihe mit dem Hinkley-Detektor erzeugen also falscheAnnahmen für Zahl und Lage der Stromniveaus Auffälligkeiten in den Amplitudenhistogrammen.Besonders bei stark verrauschten Daten und nicht äquidistanten Stromniveauswird die Leveldetektion schwierig. Das Verfahren der Amplitudenverteilungen pro Levelkönnte in Zukunft für solche Fälle eine zumindest qualitative Kontrolle der Ergebnisse derLeveldetektion (egal ob automatisch oder by-eye) auf anderem Wege als durch die bloßeBetrachtung der Zeitreihe bieten.11.2 Unterscheidung verschiedener Markov-Modelle11.2.1 Vergleich verschiedener linearer ModelleBei der Überprüfung eines Markov-Modells sind nicht nur Anzahl und Lage der Zuständevon Bedeutung, sondern auch ihre Anordnung. Die ergibt Einschränkungen, welche Übergängeerlaubt sind. In dem ModellC ⇋ S ⇋ Osind beispielsweise die Übergänge C → O und O → C nicht erlaubt. Die Auswertung dervom Hinkley-Detektor ermittelten Übergangsmatrix (Draber und Schultze, 1994; Caliebeet al., 2002, Abschnitt 4.5.2) liefert hier bereits sehr weitgehende Informationen, bietetaber keine anschauliche Kontrolle.Abbildung 11.3: Amplitudenverteilungen pro Level für Simulationsparameter i C =pA,i S =2pA, i O =4pA, σ=0,5pA. Alle Ratenkonstanten=1000s −1 . Anordnung der Zustände sieheAbbildung.100

Abb.11.3 zeigt Amplitudenverteilungen von zwei simulierten Zeitreihen mit jeweils einemgeschlossenen (C) und zwei leitfähigen Zuständen (S und O). Die Simulationsparameterunterscheiden sich lediglich in der Anordnung der Zustände, wie in der Graphikangegeben: Im Modell A kann der Kanal direkt zwischen S und O hin- und- herschalten,im Modell B muß er über den Geschlossenzustand C gehen.Durch den Tiefpaßfilter (Abschnitt 4.7.2) entstehen in der Zeitreihe bei jedem SprungPunkte zwischen den Niveaus. Außerdem werden kurze Ereignisse mitunter nicht erkannt(missed events) und dadurch die Punkte dem vorhergehenden Niveau fälschlicherweisezugeordnet. Deshalb weisen in Abb. 11.3A die oben exakt gaussförmigen Kurven untenkleine Ausbuchtungen zum nächsten Nachbarn (bezogen auf das Markov-Modell C ⇋S ⇋ O) auf.In Abbildung 11.3B dagegen sind die Flanken der Zustände C und O deutlich breiterausgefallen, weil sie nicht durch den Übergang zum auf der Stromachse nächsten Zustandwie in 11.3A zustandekommen, sondern durch den größeren Sprung C ⇋ O. Der ÜbergangC ⇋ S hingegen ist in beiden Modellen identisch, deshalb sind auch in Abb. 11.3A undB auch die jeweils linken (zum Zustand C hinweisenden) Flanken der S-Verteilung gleich.Weil der Übergang S ⇋ O im Modell B in Abb. 11.3B nicht vorkommt, kann es hiernicht zu Fehlzuordnungen zwischen den Zuständen S und O kommen. Folglich fehlt der S-Verteilung die Ausbuchtung an der rechten Flanke, sie ist hier nahezu perfekt gaussförmig.Liegt also eine Zeitreihe mit zwei leitfähigen Zuständen (S und O) vor, kann mananhand der Amplitudenverteilungen pro Level auf das Vorhandensein oder Fehlen einzelnerÜbergänge schließen. Dies kann als Ergänzung zu der Untersuchung der Übergangsmatrix(Abschnitt 4.5.2) eine Hilfe zur Rekonstruktion des zugrundeliegenden Markov-Modellssein. Ob das auch bei gemessenen und nicht nur bei simulierten Zeitreihen funktioniert,bleibt abzuwarten. Es steht aber zu befürchten, daß zumindest die Unterscheidung derschmalen C ⇋ S-Flanken (Abb. 11.3A) von den breiten C ⇋ O-Flanken (Abb. 11.3B)Schwierigkeiten bereiten wird. In ersten Vorversuchen hat sich nämlich gezeigt, daß dieAusbuchtungen der Flanken bei echten Daten viel undeutlicher ausfallen als bei simuliertenZeitreihen. Der kleine zusätzliche Trick im folgenden Abschnitt kann jedoch diese Art derModellunterscheidung noch wesentlich verbessern.11.2.2 Vergleich zyklischer und linearer ModelleDer dynamische Hinkley-Detektor (Abschn. 4.5.1), bietet die Möglichkeit, einzelne Übergängezu verbieten. Wird ein solcher verbotener Sprung von einem der parallel laufendenDetektoren registriert, so wird er ignoriert, dergestalt, daß das angenommene Level nichtverändert wird.Verbietet man jetzt dem Detektor einen Übergang, der aber in Wahrheit im simuliertenMarkov-Modell vorhanden ist, so muß dies offensichtlich zu Fehlern in der Zuordnung derMeßpunkte in die Levelhistogramme führen. Abbildung 11.4 zeigt dazu zwei Beispiele:Der Zeitreihe liegt ein zyklisches C-S-O-Modell zugrunde, d.h. alle denkbaren Übergängezwischen den drei Zuständen sind erlaubt. Dem Hinkley-Detektor wurden jedoch dieÜbergänge S → O und O → S verboten. An Punkt 1 in Abb. 11.4 sieht man deutlich, wie101

Abbildung 11.4: Beispiel zur Verfälschung der Rekonstruktion der rauschfreien Zeitreihedurch Übergangsverbote: Der Zeitreihe (Punkte) liegt ein zyklisches Modell zugrunde, derHinkley-Detektor (durchgezogene Linie) nimmt ein lineares Modell ander Kanal von O nach S springt, Der Detektor darf jedoch nicht folgen und verbleibt imZustand O. Wie in Kapitel 4.5.1 beschrieben, steigt auch der Testwert für den Sprung nachC. Er erreicht die Schwelle für die Detektion eines Sprunges später als der Testwert fürS und würde deshalb beim normalen DHD ignoriert. Aufgrund des Verbotes des richtigenÜbergangs jedoch wird sein Alarm ernstgenommen. Dies lässt den Detektor einen (falschen)Sprung nach C erkennen. Von hier kann jetzt der Sprung in den korrekten Zustand Serfolgen, denn der Übergang C → S ist dem Detektor erlaubt. Der Sprungzeitpunkt von Onach S wird sogar noch richtig eingeschätzt, die Verweildauer in C ist extrem kurz (Abb.11.4). Am Punkt 2 in Abb. 11.4 springt der Kanal von O nach S. Wiederum erreicht derrichtige Detektor die Schwelle als erster, wird aber wegen des Verbotes ignoriert. Der fürden Sprung von O nach C zuständige Detektor müßte jetzt wieder einspringen, aber dieVerweildauer in S ist so kurz, dass er die Schwelle nicht erreicht. Dadurch wird der Sprungkomplett ignoriert, und die Punkte, obwohl sie eigentlich zum Zustand S gehören, demHistogramm zum Zustand O hinzugefügt.Abbildung 11.5 zeigt die Auswirkung dieser falschen Zuordnungen auf die Levelhistogramme:11.5A zeigt die ,,normalen” Histogramme, die ohne Beschränkungen für den Sprungdetektorvon der Zeitreihe aus Abb. 11.4 erstellt wurden. Wenn sowohl die Simulationder Zeitreihe als auch die Rekonstruktion durch den Hinkley-Detektor von demselben zyklischenModell ausgehen, ergibt sich ein Bild ähnlich der Abbildung 11.3. Bis auf dienormalen Ausbuchtungen durch schnelles Schalten (erklärt im Abschnitt 11.2.1) sind alledrei Einzel-Histogramme in Abb. 11.5A gaussförmig.In Abb. 11.5B wurden bei der Analyse derselben Zeitreihe, die auch Abb. 11.5A zu-102

Abbildung 11.5: Verteilungen pro Level für ein zyklisches (A und B) und ein lineares SCO-Modell (C und D). Das simulierte Signal-Rausch-Verhältnis beträgt 4:1, alle Ratenkonstantenwurden auf 1000s −1 gesetzt. In den Bildern A und C wurden dem Hinkley-Detektorkeinerlei Beschränkungen auferlegt. In B und D wurde der Übergang S-O verboten. In Bsind die Verzerrungen der Verteilungen deutlich zu sehen.grundeliegt, dem Hinkley-Detektor die Übergänge S ⇋ O verboten, obwohl sie in derZeitreihe vorhanden sind. Es handelt sich hier also um die gleiche Situation wie in Abb.11.4. Die Folge der Fehlzuordnungen der Art 2 in Abb. 11.4 sind an den Histogrammender Zustände S und O in Abb. 11.5B klar zu erkennen: Beide weisen ein deutliches Nebenmaximumauf, weil viele Abtastpunkte nicht dem richtigen sondern dem Nachbarniveauzugeordnet wurden.In den Abbildungen 11.5C und D wird die mit dem linearen S ⇋ C ⇋ O Modellsimulierte Zeitreihe aus Abbildung 11.3B auf die gleiche Weise behandelt. Da die ÜbergängeS ⇋ O im Modell nicht vorkommen, dürfte ihr Verbot keine Auswirkungen auf die Arbeitdes Hinkley-Detektors und somit auf die Amplitudenhistogramme haben. Tatsächlich istder im Vergleich zu Abb. 11.5C in 11.5D neu auftretende Buckel an der rechten Flankeder S-Verteilung erheblich kleiner als in Abb. 11.5B. Warum er aber dennoch vorhandenist, läßt sich nur vermuten: Der Hinkley-Detektor arbeitet nicht perfekt. Er findet hinund wieder Sprünge zwischen S und O obwohl sie nicht auftreten dürfen. Bei endlichemZeitauflösungsvermögen kann es aber vorkommen, dass der Kanal von O nach C und dann103

weiter nach S springt. Wenn er dabei nur kurz in C verweilt, sieht es aus als sei er von Onach S gesprungen. Verbietet man ihm dies, kann es durchaus wieder zu Fehlzuordnungenwie in Abbildung 11.4 kommen. Weil diese Ereignisse jedoch nur sehr selten auftreten, sinddie Auswirkungen auf die Histogramme sehr gering, sie liegen in der Größenordnung deroben beschriebenen ,,normalen” Ausbuchtungen.Bei dem einfacheren Modellunterscheidungskriterium über das Vorhandensein oder Fehlender Schaltflanken (Abschnitt 11.2.1) besteht die Gefahr, dass die kleinen Ausbuchtungender Verteilungen in Abb. 11.3 im Rauschen und Flackern einer gemessenen Zeitreiheuntergehen. Die durch das Verbot existenter Übergänge entstehenden Satellitenpeaks inAbb. 11.5B sind jedoch wesentlich größer. Je nach Verteilung der Besetzungswahrscheinlichkeitenkönnen sie sogar in der Größenordnung der Hauptpeaks liegen. Deshalb solltensie in echten Daten guter Qualität auch erkennbar sein.Anwendung auf gemessenen DatenAbbildung 11.6: Ausschnitt einer Patch-Clamp-Aufzeichnung an Chara. Das Besondere andieser Messung ist das extrem aktive Sublevel (S1).Möglichkeiten und Probleme der Modellunterscheidung bei gemessenen Daten seienan folgendem Beispiel illustriert: Abbildung 11.6 zeigt einen Ausschnitt aus einer gemessenenZeitreihe mit 4 Stromniveaus: geschlossen (C), kleine Leitfähigkeit (S1), mittlereLeitfähigkeit (S2), und grosse Leitfähigkeit (O) . In dieser Aufnahme ist das Sublevel S1ungewöhnlich aktiv, während es bei den meisten Chara-Messungen nur selten auftritt.Die Modellunterscheidung, um die es hier geht, ist folgende: Szenario 1 entspricht derin Abb. 11.6 eingeführten Nomenklatur: Ein Kanal mit drei Leitfähigkeitsstufen. Szenario2 geht von der Annahme aus, dass zwei Kanäle vorliegen: Kanal A hat die Zustände Cund S1, Kanal B die Zustände C und S2. Dann müssten die Level in Abb. 11.6 wie folgt104

Abbildung 11.7: Amplitudenhistogramme pro Level zur Zeitreihe aus Abb. 11.6. A:Dem Hinkley-Detektor sind alle Übergänge erlaubt, die resultierenden Verteilungensind gaussförmig. Durchgezogenen dünne Linien: Gauss-Fit. B: Dem Detektor sind dieÜbergänge S1 ⇋ S2 verboten. Als Folge davon werden die Verteilungen zu S1 und S2schief (Pfeile). Zum Vergleich sind dieselben Gausskurven wie in A eingezeichnet.umbenannt werden: O = S1 + S2. Die numerische Bedingung, dass O in Abb. 11.6 sich alsSumme von S1 plus S2 ergibt, ist erfüllt. Es soll jetzt untersucht werden, ob die Amplitudenhistogrammeper Level eine Unterscheidung der beiden Szenarien ermöglichen. EinVerbot des Übergangs S1 zu S2 würde bei Szenario 2 wirkungslos bleiben. Aber Szenario1 mit dem Markovmodell C - S1 -S2 -O würde von der Einschränkung betroffen.Abbildung 11.7A zeigt die Amplitudenhistogramme per Level für den Fall, dass demSublevel-Hinkley-Detektor keine Beschränkungen auferlegt werden. Das Ergebnis sind fastgaussförmiges Levelhistogramme. Die durchgezogenen Linen markieren den Gauss-Fit. InAbb. 11.7B hingegen wurden dem Detektor die Übergänge S1 ⇋ S2 verboten, zum Vergleichsind dieselben Gausskurven wie in Abb. 11.7A eingezeichnet. Man sieht, dass dieVerteilungen der Zustände S1 und S2 in Abb. 11.7B gegenüber der Gaussverteilung verzerrtsind (Pfeile).Der Effekt ist zwar nicht so deutlich wie bei den simulierten Daten in Abb. 11.5, aberder Zustand S2 ist eindeutig in Richtung S1 verformt und umgekehrt. Das bedeutet, daßin den Originaldaten Übergänge zwischen den Zuständen S1 und S2 stattgefunden haben.Das ist entsprechend den oben ausgeführten Szenarien nur möglich, wenn beide Zuständezu einem Kanal gehören. Szenario 2 mit einem Kanal mit der Leitfähigkeit S2 und einenweiteren mit der Leitfähigkeit S1 scheidet aus.Die Frage ist, ob die Abweichungen von der Gaussverteilung in Abb. 11.7 signifikantsind. Kleine Abweichungen in Abb. 11.5D wurden mit dem Argument als nicht signifikantbezeichnet, dass Doppelsprünge innerhalb der Zeitauflösung auch vom Verbot betroffenwerden. Nun ist es so, dass die Verformungen in Abb. 11.7B bei sehr viel höheren Wertenals in Abb. 11.5D liegen. Hier müsste eine statistische Abschätzung der Häufigkeit vonDoppelsprüngen folgen. Dazu benötigt man die Ratenkonstanten des Modells, die aus einem105

HMM-Fit der Zeitreihe (Abschnitt 4.6) zu bestimmen wären. All dies ist aber so aufwendig,dass es den Rahmen einer Diplomarbeit sprengen würde.Das Beispiel hier hat also in erster Linie nur demonstrativen Charakter. Es zeigt, daß dieModellunterscheidung mit den Amplitudenhistogrammen pro Level durchaus auch bei echtenDaten funktionieren könnte. Man sieht aber auch die Schwierigkeiten: Die Veränderungender Amplitudenhistogramme bei echten Daten sind aufgrund des schlechteren Signal-Rausch-Verhältnisses und ungleich verteilten Besetzungswahrscheinlichkeiten kleiner alsbei simulierten Zeitreihen (vergleiche Abb. 11.5B mit Abb. 11.7B). Sicherheit gewinnenkönnte man hier aber über die Statistik bei der Auswertung nicht einzelner, sondern vielerZeitreihen. Außerdem fehlt noch eine Möglichkeit, die Aussagen zu quantisieren, einenmöglichen Weg hierfür stelle ich im folgenden Abschnitt vor.Eine Vorschlag zur Quantisierung100001000counts100101i CA OCA OSi Si OA OOcurrentAbbildung 11.8: Zur Zeichenerklärung von Gleichung 11.4 : Das Amplitudenhistogrammzum Zustand O wird mit einer Summe von Gausskurven mit den Mittelwerten i C , i S undi O angefittet.Die Satellitenpeaks an den S- und O-Verteilungen in Abbildung 11.5B entstehen durchFehlzuordnungen von Abtastpunkten durch den Hinkley-Detektor. Wie groß der Anteildieser Irrtümer an der Gesamtverteilung ist, läßt sich feststellen. Hier wird folgendes Verfahrenvorgeschlagen: Man erstellt wie in Abb. 11.5B die Amplitudenhistogramme perLevel. Dann muss wird ein Maß konstruiert, dass angibt, wieviel aus dem richtigen Niveauin die anderen hineintropft.Hier wird eine Methode vorgeschlagen und diskutiert, die etwas grob, aber mit einfachenMitteln durchführbar ist. Wie in Abb. 11.8 gezeigt werden die Amplitudenhistogramme per106

Level durch eine Summe von Gaussfunktionen angefittet.f X (i) = ∑ YA Y Xe −(i−i Y )22σ 2 (11.4)Dabei ist i Y das Stromlevel des Zustandes Y ɛ{C, S, O}. Es wird im Fit als bekannt vorausgesetzt.σ ist die allen Kurven gemeinsame Standardabweichung (joint-Fit). Die AmplitudenfaktorenA Y X liefern ein Maß dafür, wieviel vom Zustand Y in den Zustand Xhineingetropft ist (Zur Zeichenerklärung siehe auch Abb. 11.8).Dieses Kriterium wird im folgenden benutzt, um den Einfluß des Rauschens auf dieLeistungsfähigkeit der Übergangsverbote beim Erstellen von Amplitudenhistogrammen perLevel bei einem Beispiel zu untersuchen. Als Beispiel dient das zyklische C-S-O Modell ausAbbildung 11.4.Es werden Zeitreihen mit verschiedenen Signal-Rausch-Verhältnissen simuliert, und getrennteLevelhistogramme mit und ohne Beschränkungen für den Hinkley-Detektor erzeugt.Die resultierenden Kurven der Zustände X werden mit einer Summe von Gaussfunktionenentsprechend Gleichung 11.4 gefittet.Um einen Vergleich bei verschiedenen Signal-Rausch-Verhältnissen zu ermöglichen werdendie Quotienten AY Xals Maß für die Anzahl der falsch zugeordneten Punkte betrachtetA X X(dargestellt in Abb. 11.9). Vergleicht man die Quotienten für den Fall, daß dem Hinkley-Detektor Übergänge zwischen O und S verboten sind mit dem unbeschränkten Fall, sosieht man, daß an den fälschlicherweise verbotenen Übergängen (Abb. 11.9B und D) wesentlichhöhere Anteile des fremden Levels im Histogramm enthalten sind (Dies ist nichtsanderes als die Quantisierung der Buckel in Abb. 11.5B). In in Abb.11.9 sind die Ergebnissesehr überzeugend bei Signal/Rausch-Verhältnissen (SNR) von 1:2 bis 1:5. Bei höheremSNR tritt in Abb.11.9A und bei niedrigerem (SNR = 1) in Abb.11.9A,C und E ein Unterschiedauf, wo keiner sein sollte. Beruhigenderweise sind in Abb.11.9A und C die Werteder Nebenbuckel aber so klein im Vergleich zu denen in Abb.11.9B und D dass man sieignorieren kann. Abb.11.9E hingegen kann bei SNR =1 eine Vertiefung der Untersuchungerfordern, derart, dass aus der Zeitreihe das Modell mit Ratenkonstanten ermittelt undmit Simulationen das Verhalten der Amplitudenverteilungen getestet wird.Um aus diesen Beobachtungen ein genaues Kriterium für das Vorhandensein eines bestimmtenÜbergangs zu erhalten, wäre es denkbar, beispielsweise eine bestimmte Grenzefür die Quotienten in Abb. 11.9 B und D festzulegen. Hierfür müßte man anhand vonSimulationen die genaue Abhängigkeit der Quotienten von den Parametern der Zeitreihe(Signal-Rausch-Verhältnis, Besetzungswahrscheinlichkeiten, Größe der Ratenkonstanten,Filterfrequenz) bestimmen. Dies aber soll Bestandteil einer späteren Arbeit sein.107

A O C /A OO0,008AA O S /A OO0,2B0,004ohnemit Verbot0,000mit Verbot0,1-0,0040 2 4 6 8 10SNRA C SS/A SCohne0,00 2 4 6 8 10SNRA O SS/A S0,4D0,04mit Verbotmit Verbot0,020,20,00 ohne0 2 4 6 8 10SNRohne0,00 2 4 6 8 10SNRA C S /A CCA C O /A CCEmit Verbot0,008F0,020,01ohne0,004mit Verbot0,000 2 4 6 8 10SNR0,000ohne0 2 4 6 8 10SNRAbbildung 11.9: Quotienten der Amplitudenfaktoren für die Fits aus Gleichung 11.4. A,B:Histogramm für O, relative Anteile von C (A) und S (B). C,D: Anteile von C (C) und O(D) im Histogramm für S. E,F: Anteile von S (E) und O (F) im Histogramm für C. Essind jeweils die Quotienten für den Hinkley-Detektor ohne Beschränkung und für den Fall,daß Übergänge zwischen S und O verboten sind, dargestellt.108

11.3 Sublevel durch schnelles SchaltenAbbildung 11.10: Sublevel können durch schnelles Schalten erzeugt werden. A: Amplitudenhistogrammeeines C k CO−−⇀ ↽−− O-Modells. Die Ratenkonstanten k CO =k OC sind jeweils ink OCder Graphik angegeben. Überschreiten sie die Abknickfrequenz des mitsimulierten Tiefpaßfilters(50kHz), so sind die Zustände C und O nicht mehr zu trennen, es entsteht ein scheinbaresNiveau in der Mitte. B: Amplitudenhistogramme pro Level für zwei der Zeitreihenaus A. Bei einer Schaltfrequenz von 50kHz sind die beiden Level bereits deutlich verzerrt(Abschn. 4.7.2). C: Amplitudenhistogramme pro Level einer Chara-Messung mit Sublevel.Das Sublevel S ist etwa 10% breiter als C und O (Vergleich der beiden Gauss-Kurven inder Mitte). D: Original-Amplitudenhistogramm zu C. Von der Verbreiterung des ZustandesS ist in dieser herkömmlichen Darstellung nichts zu erkennen.Am Chara-K + -Kanal werden häufig Sublevel beobachtet (z.B. Lühring, 1986, und eigeneMessungen wie in Abb. 11.6). Sublevel sind Unterleitfähigkeitsstufen, d.h. der Kanalist geöffnet, aber es fließt ein kleinerer Strom als der normale Einzelkanalstrom.Es ist in der Arbeitsgruppe in den letzten Jahren immer wieder diskutiert worden, obes sich dabei um ein echtes Sublevel oder um eine durch schnelles Schalten vorgetäuschteReduzierung des vollen Einzelkanalstroms ähnlich wie beim AMFE handelt (zu den zweiMöglichkeiten der Stromreduktion siehe auch den Abschnitt 7).Die Abbildungen 11.10C und D zeigen das levelspezifische und das komplette Amplitudenhistogrammeiner Einzelkanalaufzeichnung an Chara, bei der ein Sublevel auftrat.Entsprechend der Theorie der Beta-Verteilungen würde verborgenes schnelles Schalten zueiner Verbreiterung der Verteilungsfunktion von S führen. Ob eine Verbreiterung auftritt,109

kann durch den Vergleich mit den Breiten der Amplitudenverteilung der vollen Niveausvon C oder O geschehen. Für diesen Vergleich gibt die innere durchgezogene Linie in derVerteilung zum Zustand S in Abb. 11.10C die Breite an, die bei den Verteilungen zu Ound C auftritt. Abb. 11.10C zeigt, dass die aus den Meßdaten bestimmte Verteilung zu S10% breiter ist Diese Verbreiterung kann ein Hinweis auf nichtaufgelöstes schnelles Schaltensein. Ohne die Auftrennung des Amplitudenhistogramms wäre sie nicht zu entdecken(Abb. 11.10D)Um diese Verbreiterung quantitativ auszuwerten, wurden Simulationen durchgeführt.Die Beschränkung nur auf das hypothetische Flickern (schnelles Schalten) erlaubt die Beschränkungauf ein C-O Teilmodell. Da das Sublevel genau in der Mitte zwischen den vollenNiveaus C und O liegt, kommt nur ein symmetrische Modell (Hin- und Rückreaktion gleich)in Frage. Mit Hilfe dieses Modells wurden Zeitreihen mit verschiedenen Ratenkonstanten k= k OC = k CO simuliert. Die simulierten Zeitreihen mussten genau wie die gemessene einen4-Pol-Besselfilter mit einer Abknickfrequenz von 50kHz passieren. Abbildung 11.10A zeigtdie resultierenden Amplitudenhistogramme.Es ist deutlich zu erkennen, daß der Filter bei Ratenkonstanten oberhalb der Abknickfrequenz(5·10 4 in Abbildung 11.10A) dem Schalten nicht mehr folgen kann. Dadurch entstehtim Amplitudenhistogramm ein einziges, scheinbares Level, das bei einer weiterenErhöhung der Ratenkonstanten auch wieder gaussförmig wird, jedoch breiter ist als dassimulierte Rauschen. Die bei den realen Daten (Abbildung 11.10C) auftretende Verbreiterungvon 10% erhält man in Abb. 11.10A bei etwa 1MHz.1MHz ist eine so hohe Frequenz , daß beim heutigen Stand der Technik keinerlei Hoffnungbesteht, diese direkt aufzulösen. Bei einer Erhöhung der Filterfrequenz um den Faktor20 oder noch höher wäre das Rauschen viel zu groß. Das neue Verfahren von Harlfinger(2003), der Analyse mit der Kombination aus direktem Zeitreihenfit und Betaverteilungsfit(Abschnitt 4.7.2) liefert hier auch keine Kontrollmöglichkeit der Aussage aus Abbildung11.10A und C, denn es ist in diesem Zeitbereich identisch mit dem Ansatz in Abbildung11.10: der Auswertung von Beta-Verteilungen.So bleibt das Problem, ob die mit 10% doch recht geringe Verbreiterung des LevelsS in Abb. 11.10C ,,echt” oder nur durch die in den vorigen Abschnitten beschriebenenFehlermöglichkeiten des Hinkley-Detektors entstanden ist. Der derzeit mögliche Ansatzbeschränkt sich darauf, durch neue Messungen und kontrollierende Simulationen die Echtheitder Verbreitung der Verteilungsfunktion zum Level S nachzuweisen. Diese Diplomarbeithier kann nur den Weg aufweisen. Der gründlichen Analyse steht der Zeitbedarf dererforderlichen Simulationen entgegen.110

Kapitel 12Fazit und AusblickDer gesuchte Effekt des Selektivitätswechsels in K + /Tl + -Lösung im Bereich des AMFEwurde nicht gefunden. Die Ergebnisse deuten mit ziemlicher Sicherheit darauf hin, dasser auch nicht stattfindet, doch müssen die Einschränkungen, die in Abschnitt 8.6 genanntwerden, ernst genommen werden.Ein unerwartetes Ergebnis ist, dass die Stromreduzierung in Abb. 10.1B (mit luminalemTl + ) nach der kinetischen Analyse des Zeitverhaltens in Tabelle 10.1 nicht auf Gatingzu beruhen scheint. Unbefriedigend in diesen Zusammenhang ist, dass keine Messungenausreichender Qualität für den ,,Normalfall”, also Abb. 10.1A (K + luminal) vorlagen, dieeine Gating-Analyse ermöglicht hätten. Auf diese Messungen war anfangs nicht so vielWert gelegt worden, weil sie unter den Bedingungen geschahen, bei denen Farokhi et al.(2000) die Analyse schon durchgeführt hatten und daher das Verhalten als bekannt vorausgesetztworden war. Doch zur Probe, ob ein Problem in der Analyse-Software vorlag(ist bei solchen Fitverfahren im ,,dunklen Tunnel” nie ganz auszuschließen), ob die Algensich verändert hatten, oder ob zwischen luminal Tl + und luminal K + wirklich ein fundamentalerUnterschied besteht, wäre der Nachweis des Gating beim AMFE in Abb. 10.1Adoch sehr günstig gewesen. Hier wirkte sich negativ aus, das zu Beginn dieser Arbeit imSommer die kälteliebende Chara-Kultur zusammengebrochen war, zur Regeneration mehrereMonate benötigte und damit die Qualität und Anzahl der Messungen stark litt. Dochdiese Launenhaftigkeit ist ein bei biologischen Objekten bekanntes Problem und nur durchGeduld zu überwinden, für die in einer Diplomarbeit keine Zeit ist.Das überraschende Ergebnis der vorliegenden Arbeit ist der Befund, dass es insgesamtdrei Tl + -Wirkungen gibt: Cytosolisch wirkt Tl + auf das Gating und den effektivenPorenradius, luminal in Kooperativität mit cytosolischen Tl + wahrscheinlich nur auf deneffektiven Porenradius. Damit stehen folgende Aufgaben für die Fortführung der Arbeit an:1. Vertiefung der Untersuchungen zur sauberen Trennung der drei Effekte. 2. Lokalisationder luminalen und cytosolischen Bindungsstellen für die den AMFE auslösenden Ionen,insbesondere Klärung der Frage, ob es sich um einen Foot-in-the-door-Effekt handelt oderob allosterische Bindungsstellen beteiligt sind. 3. Lokalisation der am AMFE beteiligtenProzesse d.h., Zuordnung der drei Tl + -Effekte jeweils zum inneren (Kuo et al., 2003) oderäußeren Gate (Selektivitätsfilter). 4. Ausweitung der Untersuchungen auf andere, wahr-111

scheinlich mit Gating zusammenhängende Effekte, wie den Na + -Block und das Auftretenvon Subleveln, wie zum Beispiel in Abb. 8.5.Besonders Punkt 2 und Punkt 3 sind nicht mehr ohne molekularbiologische Methodenzu bearbeiten. Es ist bereits in Kooperation mit Praktikanten aus dem BCM-Studienganggezeigt worden, dass Stromreduzierung durch Gating in K + /Tl + -Lösung auch in Maxi-K-Kanälen auftritt, die in HEK-Zellen exprimiert sind. Der Maxi-K entspricht sehr wahrscheinlichdem hier benutzten Chara Kanal (Abschnitt 2.3.1) hat aber den Vorteil, dass ersequenziert ist und damit die Voraussetzungen für molekularbiologische Arbeiten erfüllt.Diese Arbeiten werden sich auf Punktmutationen stützen. Dadurch kann man gezielt dieRolle einzelner Aminosäuren des Proteins bei der Bindung der Ionen oder bei der Erzeugungdes AMFE untersuchen. Weiterhin eröffnen Punktmutationen die Möglichkeit, diehypothetischen Verformungen im Kanalprotein mit Fluoreszenz-Farbstoffen messtechnischzu verfolgen (Benzanilla, 2000). Eine Kooperation ist mit ehemaligen Mitgliedern der Arbeitsgruppeangestrebt, z.B. mit Martin Beutler, der mit dieser Methode MAP-Kinasenuntersuchen wird oder mit Rikard Blunck, der die Technik bei Bezanilla in Los Angelesfür Ionenkanäle erlernt. Der Weg zur vollständigen Klärung des AMFE ist also noch weit.Wenn er zu dem führen soll, was moderne Biophysik ausmacht, das Studium zwischenProteindynamik und Funktion, wird er sich der anspruchsvollsten Methoden von Molekularbiologieund Biophysik bedienen müssen, die weit über den Rahmen dieser Arbeithinausgehen. Trotzdem kommt den Untersuchungen dieser Arbeit der Verdienst zu, diebeteiligten Effekte erstmals unterschieden zu haben, eine unabdingbare Voraussetzung fürdie weitere Detaillierung.112

Kapitel 13ZusammenfassungEin Aspekt dieser Arbeit war die Frage, wo am Kanalprotein die für den AMFE verantwortlichenTl + -Bindungsstellen sitzen. Dafür wurden Patch-Clamp-Messungen mit 250 mM K +auf luminaler Seite und K + /Tl + -Mischlösung (Gesamtkonzentration [K + ]+[Tl + ]=250 mM)auf der cytosolischen Seite des Kanals durchgeführt. Die sich ergebenden Stromkonzentrationskurven(Abbildung 9.1) wiesen genau wie bei Keunecke (1995) und Farokhi (2002)ein Minimum des Einzelkanalstroms in Mischlösung auf, das allerdings bei etwas höherenTl + -Konzentrationen als in den Vorgängerarbeiten lag. Die Kurven waren außerdem genauwie bei Keunecke (1995) (allerdings im Widerspruch zu Farokhi, 2002) symmetrischbezüglich der Membranspannung. Dies ist nur dann möglich, wenn die Bindungsstellenunabhängig von der Bewegungsrichtung der Ionen (=Stromrichtung) jederzeit von der cytosolischenSeite aus zu erreichen sind (denn nur dort war das Tl + ). Daraus folgt, daß dieBindungsstellen für dem AMFE höchstwahrscheinlich außerhalb der Pore auf der cytosolischenSeite des Proteins liegen, und zwar an einer Stelle, die nicht oder nur wenig an denSpannungssensor (S4-Helix) gekoppelt ist.In einem zweiten Meßabschnitt wurde untersucht, ob der Chara-Kanal im AMFE-Minimum Selektivitätsänderungen erleidet. Dazu wurde die Tatsache genutzt, daß die Ionennicht nur durch elektrische Potentiale durch die Membran gezogen werden, sondernauch durch Konzentrationsgradienten. Um möglichst unterschiedliche Konzentrationsgradientenfür K + und Tl + aufzubauen, wurden asymmetrische Meßlösungen verwendet, wobeidie cytosolische Lösung durch das AMFE-Minimum vorgegeben war:cytosolisch: 230 mM K + + 20 mM Tl +luminal: 20 mM K + + 230 mM Tl +Das resultierende Umkehrpotential wurde durch die Messung von Stromspannungskurvenbestimmt.Für sein Verhalten bezüglich der Selektivität hat ein Kanal mit zwei Offenzuständenvier Möglichkeiten:1.) Es gibt jeweils einen stark selektiven Zustand für Kalium und für Thallium. Man erhieltezwei Strom-Spannungskurven, die vom Nullpunkt um jeweils 60 mV nach rechts oderlinks verschoben sind.2.) Die beiden Offenzustände A und O aus dem 5-Zustandsmodell (Abschnitt 7.2) sind113

für beide Ionensorten permeabel, aber in verschiedenen Verhältnissen. Man erhielte zweiStromspannungskurven mit unterschiedlichen Umkehrpotentialen im Betrag kleiner als 60mV.3.) Der Selektivitätsmechanismus des Kanals unterscheidet überhaupt nicht zwischen Kaliumund Thallium. Es ergibt sich ein Umkehrpotential von 0 mV.4.) Der Kanal besitzt verschiedene Selektivitäten für K + und Tl + , die aber für alle Offenzuständeidentisch sind. Man erhielte eine Stromspannungskurve mit von Null verschiedenemUmkehrpotential.Es ergaben sich in den Messungen zwei Stromspannungskurven (Abb. 8.4), die jedochnicht Punkt 1 oder 2 unterstützen. Denn es gehört nur eine der Kurven zu den regulärenOffenzuständen A und O. Die andere entstand durch eine Unterleitfähigkeit (Sublevel) desKanals und hat hier keine Aussagekraft. Das Umkehrpotential der Kurve zur normalenLeitfähigkeit betrug in den Messungen genau Null. Bei der Interpretation dieser Daten wardie Frage des zeitlichen Auflösungsvermögens von Bedeutung. Reichte es aus, dann gibt eskeine Selektivitätsänderungen. Reichte es nicht, dann ist die Aussage gleicher Selektivitätnach wie vor die wahrscheinlichste, aber nicht mehr so sicher.Bei den Messungen zum Selektivitätswechsel fiel auf, daß fast reine Thalliumlösung aufluminaler Seite zusätzliche Effekte auslöst. Deshalb wurde im Anschluß dieses Phänomennäher untersucht. Mit 230 mM Tl + und 20 mM K + auf luminaler Seite wurden analogzu den oben genannten Messungen zur Lokalisation der Bindungsstellen Messungen mitverschiedenen K + /Tl + -Verhältnissen auf cytosolischer Seite durchgeführt. Dabei ergabensich einige interessante Effekte (Abbildung 10.2):1.) Das luminale Thallium bewirkt, daß im Gegensatz zu den Messungen mit reinem K +auf luminaler Seite, der Strom bei hohen cytosolischen Thalliumkonzentrationen nicht wiederansteigt.2.) Mit Thallium auf luminaler Seite wird der AMFE asymmetrisch: Bei negativen Spannungentritt er nicht mehr auf, der Strom wird unabhängig vom K + /Tl + -Verhältnis aufcytosolischer Seite.3.) Eine hohe luminale Tl + -Konzentration reduziert bei rein K + auf cytosolischer Seite denTl + -Einwärtsstrom, hat aber keinen Einfluß auf den K + -Auswärtsstrom.In Hidden-Markov-Analysen ergaben sich Ratenkonstanten etwa in der Größenordnung,wie Farokhi et al. (2000) sie für den AMFE mit rein K + auf luminaler Seite fanden. Eswurde jedoch im Gegensatz zu Farokhi et al. (2000) in keinem Fall eine Stromreduktiondurch Gating gefunden. Diese Effekte mussten untereinander und zusätzlich mit demvorher gefundenen Effekt, daß viel cytosolisches Thallium den Strom erhöht, in Einklanggebracht werden. Das führte schließlich zu der Hypothese, daß luminale und cytosolischeTl + Bindungsstellen einen kooperativen Effekt auslösen. Damit sind bisher insgesamt dreiThalliumeffekte auf den Chara-K + -Kanal identifiziert:luminal cytosolisch1.) wenig Tl + wenig Tl + Stromreduktion durch Gating (Farokhi et al., 2000)2.) kein Tl + viel Tl + Stromerhöhung durch Permeationseffekt (Kapitel 9)3.) viel Tl + viel Tl + Stromreduktion vermutlich durch Permeation (Kap. 10)114

Bei der Interpretation der Stromreduktion durch Punkt 3 mußte noch ein Problemgelöst werden:Bei Messungen mit unterschiedlichen K + /Tl + -Verhältnissen auf beiden Seiten der Membrantraten Unterschiede in den Osmolaritäten auf, die durch Zugabe von Zucker ausgeglichenwerden mussten. Die osmotische Druckdifferenz hätte ansonsten die Membran starkbelastet und dadurch Messungen unmöglich gemacht. Das Problem lag in der von Farokhiet al. (2000) zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses übernommenen erhöhtenGesamt-Elektrolyt-Konzentration. Es stellte sich heraus, daß 250 mM TlNO 3 gar nichtmehr richtig löslich sind, und deshalb eine Verminderung der Tl + -Aktivität gegenüber derK + -Aktivität auftrat. Deswegen ist in Messungen mit hohem Thalliumanteil der Stromvermutlich gegenüber dem reinen Kaliumstrom reduziert. Dies musste bei der Interpretationder Meßdaten berücksichtigt werden, beeinträchtigte die in den Kapiteln 8, 9 und 10gezogenen Schlüsse jedoch nicht wesentlich. Es bestand auch die Gefahr, daß bei der Verwendungunterschiedlicher Lösungen beiderseits der Membran durch die schlechte Löslichkeitvon Thallium Liquid-Junction-Potentiale hätten auftreten können. Dadurch wären dieUmkehrpotentiale bei den Messungen verfälscht worden, was besonders bei den Untersuchungenzur Selektivität fatale Folgen gehabt hätte. Durch Messung der Osmolarität derunterschiedlichen Lösungen konnten die Ionenaktivitäten abgeschätzt und daraus das resultierendePotential berechnet werden. Es stellte sich jedoch heraus, daß es extrem kleinund somit vernachlässigbar ist.Neben den Messungen zum AMFE wurde auch an einen Methode zur weiteren Verbesserungder vorhandene Analysewerkzeuge gearbeitet:Harlfinger (2003) entwickelt zur Zeit eine Kombination aus direktem Zeitreihenfit undBeta-Verteilungsfit. Dieses Verfahren verspricht ein noch höheres Zeitauflösungsvermögenals der direkte Zeitreihenfit allein. Als Ergänzung dazu wurde in dieser Arbeit eine Möglichkeitentwickelt, Beta-Verteilungen besser darzustellen und sie vor allem direkt aus denMeßdaten zu entnehmen. Dazu werden mit Hilfe des Hinkley-Detektors aus der ZeitreiheAmplitudenverteilungen für jedes einzelne Stromlevel konstruiert. Dies gibt gegenüberdem Gesamt-Amplitudenhistogramm, in dem die Verteilungen der Niveaus sich gegenseitigüberdecken, einen großen Informationsgewinn. Für die Untersuchungen zum AMFE wardas Auflösungsvermögen des HMM-Fits jedoch ausreichend, so daß das neue Verfahrennicht mehr zum Einsatz kam. Es stellte sich aber recht bald heraus, daß die Amplitudenverteilungenpro Level noch ganz andere Funktionen erfüllen können, namentlich beider Unterscheidung von Markov-Modellen und zur Kontrolle der Ergebnisse von Level- undSprungdetektoren. Auch die Frage, ob die Sublevel des Chara-Kanals echt oder ein Gating-Effekt sind wurde kurz angeschnitten. Aus der Verbreiterung der Verteilung des Sublevelskonnte geschlossen werden, daß dieses, wenn überhaupt durch Gating mit einer Frequenzvon wenigstens 1 MHz entsteht, was derzeit noch weit jenseits des Auflösungsvermögensbei Patch-Clamp-Experimenten liegt.115

116

LiteraturverzeichnisAdam, G., Läuger, P. und Stark, G. (1995) Physikalische Chemie und Biophysik. Springer3. Auflage.Albertsen, A. (1992) Erfassung und Auswertung schneller Schaltvorgänge bei Patch-ClampUntersuchungen. Diplomarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.Albertsen, A. (1994) Fast patch-clamp data acquisition and kinetic analysis of multi-channelrecords. Doktorarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.Albertsen, A. und Hansen, U.-P. (1994) Estimation of kinetic rate constants from multichannelrecordings by a direct fit of the time series. Biophys. J. 67: 1393–1403.Arrhenius, S. (1887) Über die Dissociation der Wasser in gelösten Stoffe. Z. Phys. Chem.631(1).Barry, P. und Lynch, J. (1991) Topical Review. Liquid junction potentials and small celleffects in patch clamp analysis. J. Membr. Biol. 121: 101–117.Baum, L. E., Petrie, T., Soules, G. und Weiss, N. (1970) A maximation technique ocurringin the statistical analysis of probabilistic functions of Markov chains. Ann. Math. Statist.41: 164–171.Benndorf, K. (1995) Low-noise recording. In Sakmann, B. und Neher, E., Editoren, Single-Channel Recording Seiten 129–146. Plenum Press 2. Auflage.Bentrop, D., Beyermann, M., Wissmann, R. und Fakler, B. (2001) NMR structure of the,,Ball-and-chain” domain of KCNMB2, the β2-subunit of large conductance Ca 2+ andvoltage-activated potassium channels. . J. Biol. Chem. 276: 42116–42121.Benzanilla, F. (2000) The voltage sensor in voltage-dependet ion channels. Physiol. Rev.80: 555–592.Bernèche, S. und Roux, B. (2001) Energetics of ion conduction through the K + channel.Nature 414: 73–76.Blunck, R. (1996) Nachweis des schnellen Schaltens beim Na + -Block des K + -Kanals inChara. Diplomarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.117

Blunck, R., Kirst, U., Rießner, T. und Hansen, U. (1998) How powerful is the dwell-timeanalysis of multi-channel records? J. Membr. Biol. 165: 19–35.Caliebe, A., Rösler, U. und Hansen, U.-P. (2002) A χ 2 test for model determination andsublevel detection in ion channel analysis. J. Membr. Biol. 185: 25–41.Calvacanti, S. und Fontanazzi, F. (1999) Deterministic model of ion channel flipping withfractal scaling of kinitic rates. Ann Biomed Eng. 165: 682–695.Çakan, O. (2002) Reaktionskinetische Modellierung, Computersimulation und Analyse gemessenerZeitreihen zur Rolle der Ionenbindung beim schnellen Schalten im Proteindes K + -Kanals beim anomalen Molfraktionseffekt in Chara corallina. Diplomarbeit,Christian-Albrechts-Universität Kiel.Cole, K. S. und Curtis, H. J. (1938) Electric impedance of nitella during activity. J. Gen.Physiol. 22: 37–64.Cole, K. S. und Curtis, H. J. (1939) Electric impedance of nitella during activity. J. Gen.Physiol. 22: 649–670.Colquhoun, D., Hatton, C. J. und Hawkes, A. G. (2003) The quality of maximum likelihoodestimates of ion channel rate constants. J. Physiol 347.3: 699–728.Colquhoun, D. und Hawkes, A. (1982) On the stochastic properties of bursts of singleion-channel openings and of clusters of bursts. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 300: 1–59.Conti, F. und Wanke, E. (1975) Channel noise in nerve membranes and lipid bilayers. Q.Rev. of Biophys. 8(4): 451–506.Corey, D. und Stevens, C. (1983) Science and technology of patch-recording electrodes. InSakmann, B. Neher, E., Editor, Single Channel Recording Seiten 53–68. Plenum Press.Cortes, D. M., Cuello, L. G. und Perozo, E. (2001) Molecular architecture of full-lengthKcsA: role of cytoplasmic domains in ion permeation and activation gating. J. Gen.Physiol. 117(2): 165–180.Dietrich, P. und Hedrich, R. (1998) Anions permeate and gate GCAC1, a voltage-dependentguard cell anion channel. Plant J. 15: 479–487.Doyle, D., Cabral, J., Pfuetzner, R., Kuo, A., Gulbis, J., Cohen, S., Chait, B. und MacKinnon,R. (1998) The structure of potassium channel: Molecular basis of K + conductionand selectivity. Science 280: 69–77.Draber, S. (1990) Untersuchung des anomalen Molfraktionseffektes mit Hilfe der Patch-Clamp Technik. Diplomarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.118

Draber, S. (1994) Methods for Analyzing Fast Single-Channel Data and Studies on the K +Channel under Cs + Blockade and under Control Conditions. Doktorarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.Draber, S. und Schultze, R. (1994) Detection of jumps in single-channel data containingsubductance levels. Biophys. J. 67: 1404–1413.Draber, S., Schultze, R. und Hansen, U. (1991) Patch-Clamp studies an the anomalousmole fraction effect of the K + -Channel in cytoplasmic droplets of nitella: An attempt todistinguish between a multi-ion-single-file pore and an enzyme kinetic model with lazystate. J. Membr. Biol. 123: 183–190.Draber, S., Schultze, R. und Hansen, U.-P. (1993) Cooperative behavior of K + channels inthe tonoplast of Chara corallina. Biophys. J. 65: 1553–1559.Durell, S., Hao, Y. und Guy, H. (1998) Structural models of the transmembrane region ofvoltage-gated and other K + channels in open, closed, and inactivated conformations. J.Struct. Biol. 121(2): 263–284.Eisenman, G., Latorre, R. und Miller, C. (1986) Multi-ion conduction and selectivity inthe high-conductance Ca 2+ -activated K + channel from skeletal muscle. Biophys. J. 50:1025–1034.Farokhi, A. (1998) Analyse von Strom-Spannungskurven und Markov-Schalten des K + -Kanals in Chara in Hinblick auf die Beteiligung schnellen Schaltens beim anomalen Molfraktionseffektin Anwesenheit von Tl + . Diplomarbeit, Christian-Albrechts-UniversitätKiel.Farokhi, A. (2002) Nachweis und Modellierung des Gatingmechanismus bein anomalenTl + /K + -Molfraktionseffekt im Vergleich zu spontanen Stromänderungen in Na + /K + -Lösung. Doktorarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.Farokhi, A., Keunecke, M. und Hansen, U.-P. (2000) The anomalous mole fraction effectin Chara: gating at the edge of temporal resolution. Biophys. J. 79: 3072–3082.Fisahn, J., Hansen, U.-P. und Gradmann, D. (1986) Determination of charge, stoichiometryand reaction constants from I-V curve studies on a K + transporter in Nitella. J. Membr.Biol. 94: 245–252.Fredkin, D. und Rice, J. (1992) Bayesian restoration of single-channel patch clamp recordings.Biometrics 48: 427–448.Friel, D. und Tsien, R. (1989) Voltage-gated calcium channels: direct observation of theanomalous mole fraction effect at the single-channel level. Proc. Natl. Acad. Sci. 86(13)::5207–5211.119

Gilliham, M. (2002) Regulation of ion loading to maize root xylem. Doktorarbeit, Universityof Cambridge.Goldman, D. (1943) Potential, impedance and rectification in membranes. J. Gen. Physiol.27: 37–60.Gradmann, D. (2001) Models for oscillations in plants. Aust. J. Plant Physiol. 28(7): 577– 590.Gradmann, D., Johannes, E. und Hansen, U.-P. (1997) Kinetic Analysis of Ca 2+ /K + Selectivityof an Ion Channel by Single-Binding-Site Models. J. Membr. Biol. 159: 169–178.Gradmann, D., Klieber, H.-G. und Hansen, U.-P. (1987) Reaction-kinetic parameters forion transport from steady-state current-voltage curves. Biophys. J. 51: 569–585.Hagiwara, S., Miyazaki, S., Krasne, S. und Ciani, S. (1977) Anomalous permeabilities ofthe egg cell membrane of a starfish in K + -Tl + mixtures. J. Gen. Physiol. 70: 269–281.Hansen, U.-P. (1969) Das Abklingen des Strahleneffekts bei wiederholter Bestrahlung vonNitella im Vergleich mit der Wirkung auf den Erregungsmechanismus. Atomkernenergie14: 207–210.Hansen, U.-P. (1986) Reaction kinetic models of pumps, cotransporters and channels. In:Ion Channels and Electrogenic Pumps in Biomembranes. Abstracts of Lectures andPosters, Osaka University Seiten L13–L33.Hansen, U.-P., Çakan, O., Abshagen, M. und Farokhi, A. (2003) Gating models of theanomalous mole fraction effect of single-channel current in Chara. J. Membr. Biol. 192:45–63.Hansen, U.-P., Gradmann, D., Sanders, D. und Slayman, C. (1981) Interpretation ofcurrent-voltage relationships for ,,active” ion transport systems: I. Steady-state reactionkineticanalysis of Class-I mechanisms. J. Membr. Biol. 60: 165–190.Hansen, U.-P., Keuneke, M. und Blunck, R. (1997) Gating and permeation models of plantchannels,. J. Exp. Bot. 48: 365–382.Hansen, U.-P., Tittor, J. und Gradmann, D. (1983) Interpretation of current-voltage relationshipsfor ,,active” ion transport systems: II Nonsteady-state reaction kinetic analysisof class I mechanisms with one slow time-constant. J. Membr. Biol. 75: 141–169.Harlfinger, P. (2000) Bestimmung sehr schneller Übergangsraten in Markov-Prozessendurch verbesserte Berücksichtigung der Amplitudenverteilung im direkten Zeitreihenfit.Diplomarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.Harlfinger, P. (2003) Neue Algorithmen zur Erhöhung der Zeitauflösung bei der Gewinnungvon Markov-Modelen aus Zeitreihen. (in Arbeit). Doktorarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.120

Hedrich, R. und Schröder, J. (1989) The physiology of ion channels and electrogenic pumpsin higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 40: 539–569.Heldt, H. (1999) Pflanzenbiochemie. Spektrum, Akad. Verl. Heidelberg, Berlin.Hess, P. und Tsien, R. (1984) Mechanism of ion permeation through calcium channels.Nature 309(5967): 453–456.Heyrovska, R. (1996) Physical electrochemistry of strong electrolytes based on partial dissociationand hydration: Quantitative interpretation of the thermodynamic properties ofNaCl(aq) from ,,Zero to Saruration”. J. of Electrochemical Society 143(6): 1789–1793.Hille, B. (1992) Ionic channels of excitable membranes. Sinauer Associates Inc. Sunderland,MA.Hille, B. und Schwarz, W. (1978) Potassium channels as multi-ion single-file pores. J. Gen.Physiol. 72: 409–442.Hinkley, D. V. (1971) Interference about the change-point from cumulative-sum-tests. Biometrika57: 1–17.Hodgkin, A. L. und Huxley, A. F. (1952) The dual effect of membrane potential on sodiumconductance in the giant axon of Loligo. J. Physiol. (Lond.) 116: 497–506.Hong, K. L. und Miller, C. (2000) The Lipid–Protein Interface of a Shaker K + Channel.J. Gen. Physiol. 115: 51–58.Hope, A., A., S. und Walker, N. (1966) The efflux of chloride from cells of Nitella andChara. Aust. J. Biol. Sci. 19: 355–362.Huth, T. (2003) Untersuchung der Inaktivierung von vergifteten und mutierten Na + -Kanälen mit verschiedenen Methoden der Markov-Modellierung. (in Arbeit). Doktorarbeit,Christian-Albrechts-Universität Kiel.Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., Ruta, V., Cadene, M., Chait, B. T. und MacKinnon, R. (2003)X-ray structure of a voltage-dependent K + channel. Nature 423: 33–41.Kaback, H. R. (1997) A molecular mechanism for energy coupling in a membrane transportprotein, the lactose permease of Escherichia coli. PNAS 414: 5539–5543.Kenyon, J. L. (2002). Primer on junction potentials for the patchologist. University ofNevada.Keunecke, M. (1995) Untersuchung des anomalen Molfraktionseffektes an der GrünalgeChara corallina. Diplomarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.Keunecke, M. und Hansen, U. (2000) Different pH-dependence of K + channel activity inbundle sheath and mesophyll cells of maize leaves. Planta 196: 792–800.121

Keunecke, M., Sutter, J. U. und Sattelmacher, B. und Hansen, U.-P. (1997) Isolation andpatch clamp measurements of xylem contact cells for the study of their role in theexchange between apoplast and symplast of leaves. Plant and Soil 196: 239–244.Kijima, S. und Kijima, H. (1987) Statistical analysis of channel current from a membranepatch: I. Some stochastic properties of ion channels or molecular systems in equilibrium.J. Theor. Biol. 128: 423–434.Kirst, U. (1997) Modellierung und Softwareentwicklung für die statistische Analyse vonPatch-Clamp-Daten. Diplomarbeit, Christian Albrechts Universität Kiel.Kiss, T. und Korn, S. J. (1998) Modulation of C-type inactivation by K + at the potassiumchannel selectivity filter. Biophys. J. 74: 1840–1849.Kiss, T., LoTurco, J. und Korn, S. J. (1999) Contribution of the selectivity filter to inactivationin potassium channels. Biophys. J. 76: 253–263.Klieber, H.-G. und Gradmann, D. (1993) Enzyme kinetics of the prime K + channel in thetonoplast of Chara: selectivity and inhibition. J. Membr. Biol. 132: 253–265.Korn, S. und Horn, R. (1988) Statistical discrimination of fractal and Markov models ofsingle-channel gating. Biophys. J. 54: 871–877.Kuo, A., Gulbis, J. M., Antcliff, J. F., Rahman, T., Lowe, E. D., Zimmer, J., Cuthbertson,J., Ashcroft, F. M., Ezaki, T. und Doyle, D. A. (2003) Crystal structure of the potassiumchannel KirBac1.1 in the closed state. Science 300: 1922–1926.Liebovitch, L., Fischbarg, J. und Koniarek, J. (1987) Ion channel kinetics: a model basedon fractal scaling rather than multistate Markov processes. Math. Biosci. 84: 37–68.Lindsay, A. R., Manning, S. D. und Williams, A. J. (1991) Monovalent cation conductancein the ryanodine receptor-channel of sheep cardiac muscle sarcoplasmic reticulum. J.Physiology 439(1): 463–480.Lu, T., Wu, L., Xiao, J. und Yang, J. (2001) Permeant ion-dependent changes in gating ofKir2.1 inward rectifier potassium channels. J. Gen. Physiol. 118(5): 509–522.Lühring (1986) Recordings of single K + channels in the membrane of cytoplasmic drop ofChara australis. Protoplasma 133: 19–28.Lühring (1999) pH-sensitive gating kinetics of the Maxi-K channel in the tonoplast ofChara australis. J. Membr. Biol. 168: 47–61.Maathuis, F. J. M. und Sanders, D. (1992) Plant membrane transport. Current Opinionin Cell Biology 4: 661–669.Magleby, K. (2001) Commentary: Kinetic gating mechanisms for BK channels: When complexityleads to simplicity. J. Gen. Physiol. 118: 583–587.122

Miller, C. (2000) An overview of the potassium channel family. Genome Biology 1(4):4.1–4.5.Miller, G. (2003) The puzzling portrait of a pore. Science 300: 2020–2022.Morais-Cabral, J., Zhou, Y. und MacKinnon, R. (2001) Energetic optimization of ionconduction rate by the K + selectivity filter. Nature 414: 37–42.Moss, B. und Magleby, K. (2001) Gating and conductance properties of BK channels aremodulated by the S9-S10 tail domain of the a subunit. A study of mSlo1 and mSlo3wild-type and chimeric channels. J. Gen. Physiol. 118: 711–734.Neher, E. und Sakmann, B. (1976) Single-channel currents recorded from membrane ofdenervated frog muscle fibres. Nature 260: 799–802.Numberger, M. und Draguhn, A. (1996) Patch-Clamp-Technik. Spektrum.Ogielska, E. und Aldrich, R. (1999) Functional consequences of a decreased potassiumaffinity in a potassium channel pore: Ion interaction and C-type inactivation. J. Gen.Physiol. 113: 347–358.Ophasi, L. und Webb, W. (1994) Lipid-glass adhesion in giga-seal patch-clamp membranes.Biophys. J. 66: 75–79.Radomski, O. (2000) Programmentwurf zur modellgestützten Analyse von Zeitreihen verrauschterMarkovprozesse mit ein- und zweidimensionalen Dwell-Time Histogrammen.Diplomarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.Rießer, T. (1998) Level detection and extended beta distributions for the analysis of fastrate constants of Markov processes in sampled data. Doktorarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.Rießner, T. (1994) Statistische Analyse von schnellen Schaltereignissen in Patch-Clamp-Daten mit Hilfe von erweiterten Beta-Verteilungen. Diplomarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.Rießner, T., Woelk, F., Abshagen-Keunecke, M., Caliebe, A. und Hansen, U.-P. (2002) Anew level detector for ion channel analysis. J. Membr. Biol. 189(2): 105–118.Ruiz, M. und Karpen, J. (1999) Opening mechanism of a cyclic nucleotide-gated channelbased on analysis of single channels locked in each liganded state. J. Gen. Physiol. 113:873–895.Sakmann, B. und Trube, G. (1984) Conductance properties of single inwardly rectifyingpotassium channels in ventricular cells from guinea-pig heart. J. Physiol. 347(1): 641–657.123

Sanders, D., Hansen, U.-P., Gradmann, D. und Slayman, C. (1984) Generalized kineticanalysis of ion-gradient driven cotransport systems: a unified interpretation of selectiveionic effects on Michaelis-Menton parameters. J. Membr. Biol. 77: 123–152.Schröder, I., Huth, T., Suitchmezian, V., Jarosik, S., Schnell, S. und Hansen, U. (2003)Distributions-per-level: A means of testing level detectors and models of patch clampdata. J. Membr. Biol. (submitted).Schultze, R. und Draber, S. (1993) A nonlinear filter algorithm for the detection of jumpsin patch-clamp data. J. Membr. Biol. 132: 41–52.Sutter, U. (1996) Biophysikalische Untersuchungen an Xylemkontaktzellen: Präparation,Messtechnik, Transporteigenschaften und Modellentwicklung. Diplomarbeit, Christian-Albrechts-Universität Kiel.Tester, M. (1988) Potassium channels in the plasmalemma of Chara corallina are multiion-pores:Voltage-dependent blockade by Cs + and anomalous permeabilities. J. Membr.Biol. 103: 159–169.Townsend, C. und Horn (1999) Interaction between the pore and a fast gate of the cardiacsodium channel. J. Gen. Physiol. 113: 321–331.Umrath, K. (1934) Der Einfluss der Temperatur auf das elektrische Potential, den Aktionsstromund die Protoplasmaströmung bei Nitella mucronata. Protoplasma 21: 329–334.Verveen, A. und DeFelice, L. (1974) Membrane noise. Progress in Biophys. and Mol. Biol.28: 189–265.Wagoner, P. und Oxford, G. (1987) Cation permeation through the voltage-dependentpotassium channel in the squid axon. Characteristics and mechanisms. J. Gen. Physiol.90: 261–290.Wedler, G. (1985) Lehrbuch der physikalischen Chemie. VCH 2 Auflage.Woelk, F. (2000) Signaldetektion bei verrauschten Markov-Prozessen.Christian-Albrechts-Universität Kiel.Diplomarbeit,Wu, J. (1991) Microscopic model for selective permeation in ion channels. Biopys. J. 60:238–251.Wu, J. (1992) Dynamic ion-ion and water-ion interactions in ion channels. Biophys. J. 61:1316–1331.Zheng, J., Vankataramanan, L. und Sigworth, F. J. (2001) Hidden Markov Model Analysisof Intermediate Gating Steps Associated with the Pore Gate of Shaker PotassiumChannels. J. Gen. Physiol. 118: 547–562.124

Zhou, Y., Morais-Chabral, J. H., Kaufman, A. und MacKinnon, R. (2001) Chemistry of ioncoordination and hydration revealed by a K + channel-Fab complex at 2.0Å resolution.Nature 414: 43–48.125

126

DanksagungMein Dank gilt all den Menschen, die auf vielfältige Weise zum Gelingen dieser Arbeitbeigetragen haben:Allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Biophysik und des ZBM’s für die tolle Arbeitsatmosphäreund die lustigen Teerunden, insbesondere:Meinem Chef, Prof. U.-P. Hansen, der mich mit einem spannenden Thema und demnötigen Freiraum für die Bearbeitung ausstattete. Dennoch war er jederzeit ansprechbarund wußte Rat in den vielen Fällen in denen ich nicht weiterkam.Tobias Huth danke ich dafür, daß er mich unter seine Fittiche nahm, für die vielengroßen und kleinen Hilfen, die vielen konstruktiven und ganz besonders die unsinnigenGespräche.Enno Hammes war die Rettung aus so manchem Computernotfall und hat geduldigKorrektur gelesen, und Philip Harlfinger baute für mich sein Fitprogramm um.Dr. Christoph Plieth hatte im rechten Moment eine Backup-Kultur parat, als mir dieAlgen starben, und Dr. Maike Abshagen zeigte mit so manchen Trick im Umgang mit denwiderborstigen Dingern.Meinen Mitbewohnern Alfred und Patrick danke ich dafür, daß sie einfach da warenund klaglos mein Gejammer ertrugen, wenn mal wieder alles schief lief.Zu ganz besonderem Dank bin ich meinen Eltern verpflichtet, die bei allem was ichtat, immer hinter mir gestanden haben. Ihre Unterstützung hat mir das Studium erstermöglicht.127

128

ErklärungHiermit erkläre ich an Eides Statt, daß ich die vorliegende Diplomarbeit selbständig unterAnleitung meiner akademischen Lehrer angefertigt und dabei nur die genannten Quellenals Hilfsmittel verwendet habe.Kiel, den 9.September 2003................................................................................