TgAb IEMA WELL REF KT26IW - Radim S.p.A.

REF KT26IW
TgAb
IEMA WELL
Deutsch
96
M326.de – Rev.3 – 10/2007

Kitreagenzien
MTP
Materials Supplied Menge Formulation Physical state
1 x 96
Wells
gebrauchsfertig
CAL 6 x 2 mL gebrauchsfertig flüssig
CONJ 1 x 15 mL gebrauchsfertig flüssig
CTR 2 x 2 mL gebrauchsfertig Flüssig
DIL 1 x 15 mL Konzentrat flüssig
WASH 1 x 50 mL Konzentrat flüssig
SUBS 1 x 15 mL gebrauchsfertig flüssig
TMB 1 x 15 mL gebrauchsfertig flüssig
STOP 1 x 14 mL gebrauchsfertig flüssig
KT26IW – TgAb IEMA WELL
M326.de – Rev.3 – 10/2007

IMMUNOENZYMOMETRISCHER ASSAY ZUR QUANTITATIVEN
BESTIMMUNG VON ANTI–THYREOGLOBULIN-AUTOANTIKÖRPERN (TgAb)
IN HUMANEM SERUM ODER PLASMA
NUR ZUR IN-VITRO-DIAGNOSTIK
1. KLINISCHE BEDEUTUNG
Autoimmune Schilddrüsenerkrankungen umfassen ein weites Spektrum verschiedener
klinischer Symptome, von Hypo- bis Hyperthyreose (Hashimoto bis Morbus Basedow).
Die Verbindung zwischen diesen Extremen ist das Auftreten von Serum-Autoantikörpern
gegen das mikrosomale Antigen (TMAb) und/oder Thyreoglobulin (TgAb).
Schilddrüsenautoimmunität tritt häufiger bei Frauen auf. Die Häufigkeit von Antikörpern
steigt bei Frauen mit dem Alter an, von ca. 10 % im Alter von 18-24 Jahre bis zu 30 %
im Alter von 55-65 Jahre, für Tg-Antikörper von ca. 15 % im Alter von 18-24 Jahre bis zu
55-65 Jahre für mikrosomale Antikörper. Diese signifikanten Tg- und TM-Antikörpertiter
können zur Entwicklung einer chronischen Thyreoiditis führen und mit einer
Hypothyreose enden. Das mikrosomale Hauptagens, das für die Autoimmunität
verantwortlich ist, ist ein Enzym: Thyreoperoxidase (TPO). Der Nachweis von
Autoantikörpern gegen Thyreoperoxidase (TPOAb) ist bekannt als ein hochsensitives
und spezifisches Hilfsmittel für die Diagnose einer Autoimmunerkrankung.
Asymptomatische Schilddrüsenerkrankungen mit vorübergehender Hyperthyreose
wurden häufig nach der Geburt beobachtet. Patienten mit kleinerer Struma haben hohe
TPOAb-Level. Ein Anstieg von Tg- und TPO-Antikörpern wurde kürzlich als
unabhängiger Marker für Risikoschwangerschaften vorgeschlagen. Bei primärem
Myxödem zeigen signifikante Tg- und TPOAb-Level das Endstadium von autoimmuner
atrophisch chronischer Thyreoiditis an. Bei jüngeren Patienten ist eine feste Struma in
Kombination mit hohen TgAb- und TPOAb-Leveln generell ein Zeichen für Morbus
Hashimoto, charakterisiert durch eine fortschreitende Abnahme der
Schilddrüsenfunktion, die zu einer Hypothyreose führt. Bei Morbus Basedow tritt die
toxische Struma in Verbindung mit chronischer Thyreoiditis auf, wie durch hohe TgAb-
und TPOAb-Level bestätigt. Die Bestimmung von TgAb-, TMAb- und TPOAb-Leveln
wird häufig für eine Therapieüberwachung eingesetzt. TgAb können auch als Marker für
die Erkennung von Familienmitgliedern verwendet werden, die ein hohes Risiko für die
Übertragung von Autoimmunerkrankungen in sich tragen.
2. TESTPRINZIP
TgAb ist ein immunenzymometrischer Assay (IEMA).
Die Festphase (Polystyrol-Mikrowells) ist mit humanem Thyreoglobulin (Reinheit >90%)
beschichtet.
Während der ersten Inkubation binden die Autoantikörper in den Proben an das Antigen
an der Festphase. Nach einem Waschschritt wird das Konjugat (Anti-hIgG-Antikörper,
gekoppelt mit Meerrettich-Peroxidase) zugefügt. Es bindet an den Antikörper, der im
ersten Schritt erfasst wurde. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe einer Säurelösung
gestoppt. Die entstandene Farbintensität ist direkt proportional zur TgAb-Konzentration
in den Kalibratoren und Proben und wird bei 450 nm in einem Photometer gemessen.
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3. KITINHALT
─ Die Reagenzien sind ausreichend für 96 Wells.
─ Lagerung bei 2-8°C.
─ Das Verfallsdatum für jede Komponente ist auf dem Fläschchenetikett
angegeben.
─ Der Kit ist nach dem ersten Öffnen bei 2-8 °C einen Monat nach dem ersten
Öffnen haltbar.
3.1 Spezifische Reagenzien
MTP Coated Microtiterplate: 1 Mikrotiterplatte mit 96 Wells (einzeln brechbar),
beschichtet mit humanem Thyreoglobulin. Lagern Sie ungenutzte Wells bei
2-8°C im gut verschlossenen mitgelieferten Plastikbeutel zum Schutz gegen
Feuchtigkeit.
CAL Calibrators: 6 Fläschchen (2 ml) mit TgAb in vorverdünntem Humanserum in
folgenden Konzentrationen: 0, 50, 150, 500, 1500 und 5000 IU/ml.
Gebrauchsfertig. Konservierungsmittel: NaN3 (

SUBS Substrate Buffer: 1 Fläschchen (15 ml) Zitrat-Phosphatpuffer mit H2O2.
Hinweis: Mischen Sie Chromogen und Substrat-Puffer zu gleichen Teilen, um
die Substratlösung herzustellen. Nicht direktem Sonnenlicht aussetzen.
STOP Blocking Reagent: 1 Flasche (14 ml) 1N H2SO4. Gebrauchsfertig.
CPA selbsthaftende Abdeckung für Mikrotiterplatten
- durchsichtiger Plastikbeutel
4. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE MATERIALIEN
4.1 Manuelle Testdurchführung
− Justierbare, automatische Mikropipetten mit Einwegspitzen.
− Messzylinder
− thermostatischer Mikrotiterplatten-Shaker bei 37°C ± 2°C und 1200 rpm.
− Absaugpumpe oder automatisierter Mikrotiterplatten-Washer.
− Spektrophotometer für die Messung innerhalb eines 0-3,0 A Intervalls bei 450 und
405 nm Wellenlänge.
− Millimeterpapier
− Destilliertes H2O.
4.2 Automatisierte Testdurchführung
− Dieser Test kann auf automatisierten ELISA-Analysegeräten für Mikrotiterplatten
durchgeführt werden.
− Wir garantieren die Verwendbarkeit auf den RADIM und/oder SEAC automatisierten
Analysegeräten.
− Bei Verwendung anderer automatisierter Mikrotiterplatten-Analysegeräte als RADIM
oder SEAC liegt es in der Verantwortung des Benutzers, dass die Eignung für
ELISA-Kits entprechend getestet wurde.
5. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
Für fehlerfreie und reproduzierbare Ergebnisse müssen folgende Regeln
eingehalten werden:
− Mischen Sie keine spezifischen Reagenzien aus unterschiedlichen Chargen (s. 3.1).
− Universalreagenzien aus unterschiedlichen Chargen dürfen gemischt werden (s.
3.2).
− Verwenden Sie keine Reagenzien über das Verfallsdatum hinaus.
− Lagern oder belassen Sie die Reagenzien nicht bei hohen Temperaturen oder in
Bereichen mit möglicher Kontamination.
− Verwenden Sie gründlich gesäuberte Glasbehälter, frei von Metallionenkontamination
oder oxidierenden Substanzen.
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− Verwenden Sie destilliertes oder deionisiertes Wasser, das in absolut sauberen
Behältern gelagert wurde.
− Vermeiden Sie sorgfältig eine Kontamination der Proben untereinander; aus diesem
Grunde sollten Einwegspitzen für jede Probe und jedes Reagenz verwendet werden.
− Verändern Sie die Testdurchführung in keiner Weise. Eine Änderung der
• Reagenzienvolumina
• exakten Temperaturen und Inkubationszeiten
kann zu falschen klinischen Ergebnissen führen.
− Bei manueller Testdurchführung benötigen Sie geeignete technische Handbücher
und es ist wichtig, kalibrierte Pipetten zu verwenden. Es ist wichtig, die Reagenzien
genau vorzubereiten und zu pipettieren.
− Stellen Sie sicher, dass alle verwendeten Arbeitsmaterialien (Glasbehälter, Platten-
Shaker, Platten-Washer, Spektrophotometer und Kühl-/ Gefriergeräte für die
Lagerung der Reagenzien und Proben) perfekt arbeitsbereit und richtig kalibriert
sind, und regelmäßig gewartet werden. Jede Abweichung vom korrekten Gebrauch
der aufgelisteten Arbeitsmaterialien kann zu Fehlern im System führen und die
Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der erhaltenen klinischen Ergebnisse
beeinflussen.
− Verwenden Sie eine geeignete Methode für die korrekte Identifizierung von
Patientenproben. Eine falsche Probenidentifizierung kann zu einer niedrigeren
Spezifität des Systems und falschen klinischen Ergebnissen führen.
Um eine eigene Kontamination und der Umgebung zu vermeiden, müssen
folgende Vorsichtsmaßnahmen eingehalten werden:
− Verwenden Sie Einweghandschuhe beim Umgang mit potentiell infektiösem Material
und während der Testdurchführung.
− Pipettieren Sie nicht mit dem Mund.
− Während der Testdurchführung nicht rauchen, essen, trinken oder Kosmetika
anwenden.
− Chromogen und Blocking Reagent sollten mit Vorsicht behandelt werden. Vermeiden
Sie Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhaut. Bei versehentlichem Kontakt
gründlich unter fließendem Wasser abspülen.
− Alle Materialien humanen Ursprungs, die für die Herstellung dieses Kits verwendet
wurden, wurden negativ auf HBsAg, Anti-HIV und Anti-HCV getestet. Da zurzeit kein
Test die völlige Freiheit von diesen Viren garantieren kann, müssen alle Proben und
Reagenzien, die biologisches Material enthalten, als potentiell infektiös betrachtet
werden.
− Vermeiden Sie Spritzer und die Bildung von Aerosolen; reinigen Sie in solchen
Fällen sorgfältig mit 3%iger Hydrochloridlösung. Das verwendete Reinigungsmaterial
muss als potentiell infektiös betrachtet und entsprechend entsorgt werden.
− Einige Reagenzien enthalten Natriumazid als Konservierungsmittel. Um die Bildung
von explosiven Metallaziden aus Blei und Kupfer zu vermeiden, sollte bei der
Entsorgung der Reagenzien mit viel Wasser nachgespült werden.
− Entsprechend der italienischen Verordnung D.L.Nr.22 vom 5.2.97 und gemäß der
EEC-Direktiven 91/156/EEC, 91/689/EEC und 94/62/EEC werden alle Abfallprodukte
aus manueller und/oder automatisierter Testbearbeitung als gefährlicher
Sonderabfall klassifiziert (Europäische Klassifizierung, Code 180103). Als solcher
müssen sie durch Abgabe an ein Spezialunternehmen, das für die Abfallsammlung
und -entsorgung qualifiziert ist, abgegeben werden.
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6. PROBENGEWINNUNG UND -VORBEREITUNG
Der Test kann mit Serum- oder Plasmaproben durchgeführt werden. Stark lipämische
oder hämolysierte Proben dürfen nicht eingesetzt werden. Die Proben können 1-2 Tage
bei 2-8°C gelagert werden, für einen längeren Zeitraum sollten sie bei -20°C eingefroren
werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben sollte vermieden werden.
Plasmaproben können Fibrin-Filamente enthalten, die in diesem Assay interferieren
können. Stellen Sie sicher, dass die Proben vor der Bestimmung immer völlig klar sind.
Probenverdünnung
Vor der Testdurchführung müssen die Proben 1:101 verdünnt werden:
10 µl Probe + 1000 µl Diluent.
Die Kalibratoren und Kontrollseren sind gebrauchsfertig.
7. TESTDURCHFÜHRUNG (*)
− Bringen Sie alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur.
− Mischen Sie die Proben vor Gebrauch durch Umdrehen über Kopf.
7.1 Bereiten Sie die Wells vor für: Blank, Kalibratoren, Kontrollseren und Proben.
7.2 100 µl jedes Kalibrators, Kontrollserums und jeder verdünnten Probe in die
entsprechenden Wells pipettieren. Pipettieren Sie direkt auf den Boden jedes
Wells.
7.3 60 Minuten bei 37°C schütteln.
7.4 Die Wells 4-mal mit 350 µl verdünnter Waschlösung waschen. Die gesamte
Flüssigkeit aus den Wells absaugen.
7.5 100 µl Enzyme Conjugate in jedes Well außer Blank pipettieren.
7.6 30 Minuten bei 37°C schütteln.
7.7 Die Wells 4-mal mit 350 µl verdünnter Waschlösung waschen. Die gesamte
Flüssigkeit aus den Wells absaugen.
7.8 100 µl Substrate-Chromogen-Lösung (siehe Abschnitt “Reagenzien”) in alle Wells
pipettieren.
7.9 15 Minuten bei 37°C schütteln. Nicht direktem Sonnenlicht aussetzen.
7.10 100 µl Blocking Reagent in alle Wells pipettieren.
7.11 Messen Sie die Extinktion der Wells bei 450 nm mit einem möglichst
bichromatischen Spektrophotometer bei einer Referenzwellenlänge von 620 nm
(das Gerät mit dem Blankwell auf Null einstellen). Bei überschießenden
Extinktionswerten messen Sie bei 405 nm. Die Messung muss innerhalb von 20
Minuten nach der Testdurchführung beendet sein.
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*Falls Sie für die Testdurchführung ein automatisiertes Analysengerät für
Mikrotiterplatten von RADIM verwenden, beachten Sie die entsprechende
Bedienungsanleitung.
8. ASSAYSCHEMA: siehe Seite 23.
9. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE
Für eine bessere Sensitivität beinhaltet die hier verwendete Methode
spektrophotometrische Messungen bei zwei Wellenlängen (450 and 405 nm).
Proben mit TgAb-Konzentrationen von 0 bis 500 IU/ml werden bei 450 nm gemessen,
Proben mit TgAb-Konzentrationen höher als 500 IU/ml bei 405 nm.
Zeichnen Sie eine Eichkurve auf Millimeterpapier, indem Sie die Kalibratorkonzentration
(x-Achse) gegen die Extinktion jedes Kalibrators (y-Achse) auftragen. Die TgAb-
Konzentrationen in IU/ml erhalten Sie durch Interpolieren der Extinktion jeder Probe auf
der Eichkurve.
* Falls Sie ein automatisiertes Analysengerät für Mikrotiterplatten von RADIM und/oder
SEAC verwenden, wird automatisch eine spektrophotometrische Messung bei 3
verschiedenen Wellenlängen durchgeführt: 450, 405 und 620 nm, was einen weiteren
Kurvenbereich ermöglicht.
9.1 Berechnungsbeispiel
Die folgenden Werte dienen nur als Beispiel und dürfen nicht anstelle der tatsächlich
ermittelten Daten verwendet werden.
U/ml O.D.
Mittelwert
CAL 0 0 0,012
CAL 1 50 0,264
CAL 2 150 0,719
CAL 3 500 2,009
CAL 4 1500 3,674
CAL 5 5000 4,683
CTR 1
CTR 2
< 100
200 ÷350
0,139
1,118
TgAb
IU/ml
25,2
258,2
Probe 2094 551
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O.D.
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
Typische Eichkurve
TgAb IEMA
0
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
dose
9.2 Akzeptable Grenzen
Die Ergebnisse sind gültig, wenn folgende Grenzen eingehalten werden:
Blank < 0,100 OD
Control Serum 1 (negativ) < 100 IU/ml
Control Serum 2 (positiv) siehe beigefügtes Q.C.-Datenblatt
9.3 Interpretation der Ergebnisse
Die angegebenen Werte wurden anhand von 300 Proben ermittelt. Sie dienen nur der
Orientierung, da sie durch verschiedene Faktoren (Klima, geographische Lage, Diät
etc.) beeinflusst werden. Nach Möglichkeit sollte jedes Labor seine eigenen
Normalbereiche ermitteln.
Normalwerte für TgAb < 100 IU/ml
grenzwertig für TgAb 100 – 120 IU/ml
erhöhte Werte für TgAb > 120 IU/ml
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10. TESTCHARAKTERISTIKA
10.1 Spezifität
Es wurden keine Kreuzreaktionen zu im Serum vorhandenen Anti-TPO-Antikörpern
beobachtet.
10.2 Sensitivität
Die Sensitivität wurde anhand der Eichkurve ermittelt und angegeben als kleinster vom
Nullkalibrator unterscheidbarer Wert (Mittelwert OD + 2s). Er liegt bei 3,7 IU/ml.
10.3 Präzision
Die Präzision wurde durch die Bestimmung der Intra- und Interassay-Varianz (%CV)
anhand von 4 bzw. 3 Seren mit verschiedenen TgAb-Konzentrationen ermittelt.
Wiederholbarkeit (Intraassay)
4 Seren wurden in 10 Replikaten gemessen.
Serum Mittelw. SD
CV Replikate
(IU/ml) (IU/ml) (%)
n
a 77,9 7,1 9,2 10
b 266 20,9 7,8 10
c 495 37,5 7,6 10
d 3280 218,2 6,7 10
Reproduzierbarkeit (Interassay)
2 Replikate jedes Serums wurden in verschiedenen Testruns gemessen.
Serum Mittelw. SD
CV Testrun
(U/ml) (U/ml) (%)
n
a 90,4 9,6 10,6 10
b 253,8 15,1 5,9 12
c 487 32 6,6 12
10.4 Richtigkeit
Die Richtigkeit der Methode wurde anhand eines Parallelitätstest bei Verdünnungen
ermittelt.
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Parallelitätstest
Zwei Seren mit verschiedenen TgAb-Konzentrationen wurden bei verschiedenen
Verdünnungen mit Nullkalibrator gemessen.
Verdünnung erwartet gemessen Wiederfindung
(IU/ml) (IU/ml) (%)
S1 unverdünnt - 224 -
1/2 112 104 92,8
1/4 56 55 98,2
1/8 28 33 117,9
1/16 14 20 142,9
S2 unverdünnt - 479 -
1/2 240 226 94,2
1/4 120 126 105
1/8 60 67 111,6
1/16 30 36 120
Hinweis: Aufgrund der Heterogenität von Autoantikörpern kann für einige Patienten eine
nichtlineare Verdünnung auftreten.
11. GRENZEN DES VERFAHRENS
Wie bei allen diagnostischen Tests sollte eine endgültige klinische Diagnose nicht auf
einem einzelnen Testergebnis basieren, sondern durch den Arzt gestellt werden,
nachdem alle klinischen und laboratorischen Ergebnisse evaluiert wurden.
12. SYMBOLLEGENDE: siehe Seite 12
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REF
LOT
Referenz oder Bestellnummer
Lotnummer
Verfallsdatum
SYMBOLE
EN 980 – EDMA
IVD Für den Gebrauch in der IN-VITRO-DIAGNOSTIK
96
CE-Markierung bei Erfüllung der IVD Richtlinie 98/79 EG
Lagerung bei 2-8°C
produkt der
Biogefährdung
Schauen Sie die Arbeitsanleitung an
genügend für 96 Tests
RCNS rekonstituiren mit
H2O
Deionisiertes oder Destilliertes Wasser
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Bibliografia – References - Literatur
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iodothyronine absorption and conversion of L-thyroxine (T4) to L-triiodothyronine (T3)
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8 - Ekins, R. : Measurements of free hormones in blood. Endocrine Reviews, 1990, 11 (1),
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10 - Midgley J. E. M. Direct and indirect free thyroxine assay methods: theory and practice.
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ASSAYSCHEMA
Probenverdünnung : 1/101
10 µl Probe + 1000 µl Diluent
Wells Blank CAL
(0-5)
CTR Proben
CAL (0 – 5) ---- 100 µl ---- ----
CTR 1, 2 ---- ---- 100 µl ----
Proben ---- ---- ---- 100 µl
Inkubieren und schütteln: 37 °C x 60'
Absaugen und waschen: 4 x 350 µl
CONJ ---- 100 µl 100 µl 100 µl
Inkubieren und schütteln : 37°C x 30'
Absaugen und waschen: 4 x 350 µl
TMB SUBS 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl
Inkubieren und schütteln: 37°C x 15'
STOP 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl
Messen bei 450 nm – 405 nm
Referenzwellenlänge 620 nm
RADIM S.p.A. - Via del Mare, 125 - 00040 Pomezia (Roma) Italia
Tel.: +39 06 91.249.1 - Fax: +39 06 91.249.443
National Order Entry: +39 06 91.249.702
Export Department: +39 06 91.249.701
Customer Care: +39 06 91.249.700
info@radim.it - www.radim.com

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