MutaREX ® Enterovirus real time - bei Immundiagnostik

MutaREX ®
Enterovirus
real time RT-PCR Kit
Screening Test für den Nachweis humaner Enterovirus RNA (Polio-,
Coxsackie A-, Coxsackie B- und Echoviren) im real time PCR Kapillarsystem
(z.B. LightCycler ® , Roche) und gleichzeitiger Überprüfung der
RNA-Extraktionseffizienz aus Stuhlproben.
KG290232
KG290296
Nur für in vitro Diagnostik
Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Germany
www.immundiagnostik.com Tel.: +49 (0)6251/ 701900
info@immundiagnostik.com Fax: +49 (0)6251/ 849430
Stand: 23.09.2010 1
N:WINDAT/AL/MB/K/MRex

1. VERWENDUNGSZWECK
Der MutaREX ® Enterovirus real time RT-PCR Kit ist ein qualitativer Screening-Test zum
Nachweis von Enterovirus RNA (Polio-, Coxsackie A-, Coxsackie B- und Echoviren) in klinischen
Proben (Vollblut, Plasma, Respirationstraktproben, CSF (cerebrospinal fluid) und anderen Körperflüssigkeiten)
mittels real time PCR-Kapillarsystem (z. B. LightCycler ® (Roche). Gleichzeitig ist
eine Überprüfung der RNA-Extraktionseffizienz über eine separate interne PCR-Kontrolle möglich.
2. EINLEITUNG
Humane Enteroviren sind ubiquitär vorkommende, hochinfektiöse Krankheitserreger, die zur
Familie der Picornaviridae gehören. Die mit hoher Inzidenz (weltweit ca. 500 Millionen Infektionen/
Jahr) vorkommenden Pathogene sind kleine unbehüllte RNA-Viren, die sehr resistent gegenüber
Umwelteinflüssen sind. So behalten Enteroviren selbst bei pH-Werten 3 – 9 sowie in Anwesenheit
von Detergenzien ihre Infektiosität. Bislang sind ca. 70 verschiedene Serotypen beschrieben aber
kein effektives antivirales Chemotherapeutikum zur Bekämpfung der Viren ist verfügbar. Die
Übertragung der Viren erfolgt von Mensch zu Mensch fäkal-oral , d.h. ausschließlich über Kontakt-
und Schmierinfektion. Kontaminierte Lebensmittel/ Trink-wasser stellen dabei eine wichtige
Infektionsquelle dar. Das Virus kann noch über Wochen nach der akuten Erkrankung mit dem
Stuhl ausgeschieden werden.
Enterovirusinfektionen können das ganze Jahr über auftreten und lebensbedrohende Infektionen
hervorrufen (insbesondere bei Kindern). Im Sommer kommt es in Deutschland zu Häufungen der
Infektionen aufgrund kontaminierter Badegewässer (Schwimmbad, See). Enteroviren lösen
zahlreiche Krankheitsbilder aus, z. B. Infektionen des oberen Respirations-trakts, „Sommergrippe“,
Herpangina, Hand-Fuß-Mund-Krankheit, jugendlicher Diabetes mellitus, Infektionen des Gastrointestinaltrakts,
Augeninfektionen, oder epidemische Myalgie. Aber auch Myocarditis, Paralysis,
multiples Organversagen, Meningitis und Encephalitis sind häufig mit einer Enterovirusinfektionen
assoziiert.
3. TESTPRINZIP
MutaREX ® Enterovirus real time RT-PCR enthält spezifische Primer, Hydrolysis-Sonden und
weitere Reagenzien zur Detektion von Enterovirus RNA in klinischen Proben im LightCycler ® -
Instrument (Roche). Zielsequenz ist innerhalb der 5`-untranslatierten Genomregion (5`-UTR).
Die im Kit enthaltene reverse Transkriptase schreibt das virale ssRNA-Genom in cDNA um und
eine thermostabile DNA-Polymerase amplifiziert mittels PCR (polymerase chain reaction) ein
enterovirusspezifisches DNA-Fragment. Nachfolgend wird die Spezifität des entstandenen
Amplikons durch real time Hybridisierung und anschließende Hydrolyse der Enterovirus-
spezifischen Sonden (mit Fluorophor- und Quenchermolekül markierte Oligonukleotide) überprüft.
Das dabei emittierte Fluoreszenssignal wird von der optischen Einheit des real time PCR-
Kapillarsystems (z. B. Light Cycler ® , Roche) gemessen. Die Detektion spezifischer Enterovirus-
Amplifikate in den real time PCR-Reaktionsgefäßen erfolgt bei 530 nm (z. B. LightCycler ®
Fluorimeter-Kanal F1).
Zusätzlich verfügt MutaREX ® Enterovirus über eine separate RNA-Extraktionskontrolle, die vor
der eigentlichen Nukleinsäureisolierung dem Ausgangsmaterial zugefügt und dann in einem
zweiten heterologen Amplifikationssystem nachgewiesen wird.
Diese interne Kontrollreaktion (IC) ermöglicht zum einen das Aufdecken von Fehlern bei der RNA-
Extraktion, zum andern kann eine mögliche Inhibition der Reversen Transkription bzw. PCR
identifiziert werden. Das Risiko Falsch-Negativer Ergebnisse wird dadurch deutlich minimiert.
Die Detektion der RNA-Extraktionskontrolle (= interne Kontrolle für die PCR) wird bei 705 nm
durchgeführt (z.B. LightCycler ® Fluorimeter-Kanal F3 bei 1.5 bzw. F6 bei 2.0).
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N:WINDAT/AL/MB/K/MRex

4. KITBESTANDTEILE
Jedes Testkit enthält Reagenzien zur Durchführung von 32 bzw. 96 Bestimmungen, sowie
eine Gebrauchsanleitung.
Ref. Reagenz Konfektion 32 Konfektion 96 Deckelfarbe
A1
A2
A3
A4
A5
Enzym-Mix
Primer-/ Sonden-Mix
Positivkontrolle
Negativkontrolle
Extraktionskontrolle
1x 30 µl
1x 500 µl
1x 30 µl
1x 200 µl
1x 200 µl
3x 30 µl
3x 500 µl
2x 30 µl
1x 200 µl
3x 200 µl
5. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL
Benötigte Materialien - mitgeliefert:
• Reagenzien für die real time RT-PCR
• Gebrauchsanweisung
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N:WINDAT/AL/MB/K/MRex
blau
gelb
rot
grün
transparent
Benötigte Materialien - nicht mitgeliefert:
• real time PCR-Kapillarsystem (z. B. LightCycler ® Instrument, Roche)
• PCR-Reaktionsgefäße (z. B. LightCycler ® Kapillaren, Roche)
• Tischzentrifuge (z. B. LightCycler ® Kapillar-Zentrifuge, Roche)
• Kryobehälter für PCR-Reaktionsgefäße (z.B. LightCycler ® Cooling Block, Roche)
• Color Compensation Kit (z. B. LightCycler ® - Roche)
• RNA-Extraktionskit für Stuhlproben (z. B. MutaCLEAN ® Stool (Viral RNA), Immundiagnostik,
KG1035)
• Pipetten (0,5 – 1000 µl)
• sterile Filterspitzen für Mikropipetten
• sterile Reaktionsgefäße (1,5 und 2,0 ml)
6. LAGERUNG UND HALTBARKEIT
• Alle Reagenzien (A1 bis A4) sollten bis zum unmittelbaren Gebrauch bei

7. HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN
• Nur zur in vitro Diagnostik.
• Dieser Test muss durch speziell in Molekularbiologie-Techniken geschultes Personal
durchgeführt werden.
• Die klinischen Proben müssen als potentiell infektiöses Material angesehen und
entsprechend auch entsorgt werden.
• Die Regeln der Good Laboratory Practice (GLP) müssen eingehalten werden.
• Testkit nach Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatum nicht mehr verwenden.
AMPLIFIKATION: Die PCR-Technologie ist sehr sensitiv, d. h. die Vermehrung eines
einzelnen Moleküls generiert Millionen identischer Kopien. Diese Kopien können in Form
von Aerosolen entweichen und sich auf Unterlagen in der Umgebung festsetzen. Um eine
Kontamination von Proben mit Amplifikaten aus vorausgegangenen Experimenten zu
vermeiden, sollte in drei (möglichst auch räumlich) von einander getrennten Bereichen
gearbeitet werden und zwar:
1) Bereich, in dem die Proben vorbereitet werden.
2) Bereich, in dem der Master-Mix angesetzt wird.
3) Bereich, in dem der Master-Mix und die Proben-RNA in PCR-Gefäße pipettiert wird.
Pipetten, Reaktionsgefäße und andere Arbeitsmittel sollten nicht innerhalb dieser drei
verschiedenen Arbeitsbereiche zirkulieren.
• Sterile Pipettenspitzen mit Filtereinsatz benutzen.
• Für jeden Arbeitsplatz neue Handschuhe benutzen und Kittel tragen.
• Aerosolbildung vermeiden.
• Regelmäßig Pipetten und Laborbänke dekontaminieren (keine ethanolhaltigen Lösungen
benutzen).
8. TESTDURCHFÜHRUNG
Die gesamte Durchführung ist in folgende drei Schritte aufgeteilt:
A) RNA-Extraktion aus klinischen Proben (z.B. Stuhl).
B) Reverse Transkription der RNA und nachfolgende Amplifikation/ kombinierte Detektion der
entstandenen cDNA-Templates mittels der Hybridisierungssonden.
C) Interpretation der Ergebnisse mit Hilfe der Software des verwendeten real time PCR-
Kapillarsystems.
A) ROBENVORBEREITUNG
1) Die Extraktion viraler RNA wird mit Hilfe eines kommerziellen RNA-Isolierungs-Kits (z. B.
MutaCLEAN ® Stool (Viral RNA), Immundiagnostik, KG1035) aus Stuhlproben bzw.
anderen klinischen Proben (Vollblut, Plasma, Respirationstraktproben, CSF [cerebrospinal
fluid] etc.) durchgeführt und erfolgt entsprechend den Angaben des Herstellers. Dazu bei:
a) Stuhlproben: eine „erbsengroße“ Stuhlmenge in ca. 1,5 ml sterilem (Reinst-) Wasser
(keine Puffer verwenden) aufschwemmen, gut vortexen und nach Absinken der festen
Bestandteile (gegebenenfalls 2 min bei 5000 rpm in einer Tischzentrifuge zentrifugieren)
den Überstand als Ausgangsmaterial verwenden. Sehr flüssige Stuhlproben
können auch direkt, also ohne vorherige Aufschwemmung, zur Extraktion eingesetzt
werden; aber auch hier ebenfalls gut vortexen und (nach ggf. notwendigem
zentrifugieren, 2 min 5000 rpm) den Überstand unverdünnt verwenden.
b) Liquor: Liquorproben werden direkt („nativ“) in die Extraktion eingesetzt.
c) Abstrichtupfer (Bläscheninhalt): Tupfer zunächst in 500 µl sterilem (Reinst-) Wasser
einweichen lassen, dann gut vortexen. Anschließend den Tupfer entnehmen und die
Flüssigkeit in die Extraktion einsetzen.
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2) Wichtig: Unabhängig vom verwendeten Probenmaterial sollte zusätzlich zu den
Proben eine Wasserkontrolle (200 µl steriles [Reinst-] Wasser) extrahiert werden,
anhand derer sich eventuell auftretende Inhibitionen ablesen lassen. Diese
Wasserkontrolle muss analog einer Stuhlprobe behandelt werden.
3) die im MutaRex ® Enterovirus-Kit mitgelieferte Extraktionskontrolle (A5) ist eine Kontroll-
RNA, die zum einen der Überprüfung der RNA-Extraktion dient, zum anderen als interne
Kontrolle (IC) mögliche Inhibitionen der Reversen Transkription bzw. der PCR aufzeigt. Sie
wird jeder Probe vor der eigentlichen Extraktion beigemischt.
Zunächst eine „working solution“ aus dem ersten Puffer des RNA-Isolierungskit (plus
eventuelle Zusätze wie „Poly A“) und der Extraktionskontrolle (A5) herstellen. Dazu das für
jeweils eine Extraktion benötigte Puffervolumen (bei MutaCLEAN ® Stool (Viral RNA) z.B.
200 µl) mit der Anzahl (N) der insgesamt durchzuführenden Extraktionen multiplizieren
(dabei die Wasserkontrolle nicht vergessen und zum Ausgleich der Pipettierungenauigkeit
einen zusätzlichen virtuellen Ansatz mit einrechnen). Von der Extraktionskontrolle je 5 µl
pro Ansatz hinzupipettieren; also (Puffervolumen + 5 µl A5) x (N+1). Anschließend die
Extraktion laut Herstellerangaben durchführen.
OPTIONAL: Wird eine Kontrolle der Extraktions-Effizienz nicht gewünscht, wohl aber eine
Kontrolle der RT-PCR, dann wird die Extraktionskontroll-RNA (A5) beim Ansetzen der PCR
direkt (als interne Kontrolle) dem PCR-Master Mix zugesetzt: In diesem Fall muss sie aber
zuerst 1:10 mit sterilem Reinstwasser verdünnt werden (z. B. 1 µl + 9 µl):
Von dieser Verdünnung dann 0,2 µl / Probe dem PCR-Master-Mix zusetzen!
4) Falls die real time PCR nicht sofort durchgeführt wird, müssen die Proben bei < -20°C
aufbewahrt werden.
B) REAL TIME Enterovirus (MutaREX ® ) RT-PCR PROTOKOLL
Es ist ratsam, das gesamte Protokoll zu lesen, bevor mit der Durchführung begonnen wird. Der
Ansatz einer Gesamtmenge an Master-Mix für die jeweilige Anzahl an Proben und die
entsprechenden Kontrollen sollte folgendermaßen erfolgen:
1) Die Enzym-Mix Menge für eine Reaktion mit der Anzahl (N) der durchzuführenden
Reaktionen (inklusive Kontrollen A3 und A4) multiplizieren und zum Ausgleich der
Pipettierungenauigkeit einen zusätzlichen (virtuellen) Ansatz berechnen. Mit allen weiteren
Reagenzien in der gleichen Weise verfahren.
Reagenzien während der Arbeitsschritte stets geeignet kühlen!
Reaktionsvolumen Master-Mix Volumen
0,8 µl Enzym-Mix (A1) 0,8 µl x (n +1)
14,2 µl Primer- und Sonden-Mix (A2) 14,2 µl x (n +1)
2) Die folgenden Reagenzien in einem sterilen Reaktionsgefäß vorsichtig mischen (15 – 20x !
Nicht vortexen!): Enzym-Mix (A1) und Primer-/ Sonden-Mix (A2). Diese Mischung stellt
den Master-Mix dar; kurz in einer Tischzentrifuge abzentrifugieren.
3) 15 µl des Master-Mix mit einer Mikropipette und sterilen Filterspitzen in jede der Light
Cycler ® Kapillaren pipettieren. 5 µl der Proben-RNA bzw. Positiv- und Negativ- Kontrollen
(A3 und A4) zu den jeweiligen Kapillaren zupipettieren (es empfiehlt sich zuerst die
Negativkontrolle zu pipettieren und diese erst am Schluss zu verschließen, um
Kontaminationen zu überprüfen). Die Kapillaren jeweils unverzüglich verschließen, um
Kontaminationen zu vermeiden und dann kurz in einer LightCycler ® Kapillar-Zentrifuge
abzentrifugieren.
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N:WINDAT/AL/MB/K/MRex

4) Folgendes LightCycler ® RT-PCR Protokoll durchführen:
50°C für 10 min reverse Transkription
95°C für 10 min initiale Denaturierung
95°C für 15 sec 45 Zyklen
53°C für 30 sec ramping time: 20°C/sec – aqu. mode here: SINGLE
72°C für 15 sec
4°C für 10 sec Abkühlung
C) RT-PCR ANALYSE UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
1) Durchführung der LightCycler ® PCR.
2) Schalten Sie den Color Compensation – Filter ein, welcher für die gleichzeitige Nutzung
der verschieden Farbstoff-markierten Hydrolysis-Sonden benötigt wird (durch
Aktivierung des Felds Choose CCC File).
3) Das Ergebnis der Enterovirus Amplifikation wird im Kanal F1 angezeigt; das der
internen Kontrolle im Kanal F3.
4) Folgende Resultate sind möglich:
• im Kanal F1 wird ein Signal detektiert. Das Ergebnis ist positiv: die Probe
enthält Enterovirus - RNA. In diesem Fall ist die Detektion eines Signals in
Kanal F3 nicht notwendig, da hohe Enterovirus RNA -Konzentrationen
verminderte bzw. fehlende Fluoreszenzsignale der internen Kontrolle im Kanal
F3 bedingen können (Kompetition).
• Im Kanal F1 wird kein Signal detektiert, jedoch im Kanal F3 (Signal der internen
Kontrolle). Die Probe enthält keine Enterovirus - RNA.
Das detektierte Signal der internen Kontrolle schließt die Möglichkeit einer RT-
PCR-Inhibition aus.
• Weder im Kanal F1 noch im Kanal F3 wird ein Signal detektiert. Es kann keine
diagnostische Aussage gemacht werden. RT-PCR-Reaktion wurde inhibiert.
Stand: 23.09.2010 6
N:WINDAT/AL/MB/K/MRex
PK
NK

MutaREX ®
Enterovirus
real time RT-PCR Kit
Screening assay for the real time detection of human enterovirus RNA
(Polio-, Coxsackie A-, Coxsackie B- and Echovirus) in clinical samples
using real time PCR capillary systems (e. g. LightCycler ® , Roche) and
parallel control of RNA extraction efficiency.
KG290232
KG290296
For in vitro Diagnostic use only
Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Germany
www.immundiagnostik.com Tel.: +49 (0)6251/ 701900
info@immundiagnostik.com Fax: +49 (0)6251/ 849430
Date: 2010/09/22 1
N:WINDAT/AL/MB/K/eMRexEV

1. INTENDED USE
The MutaREX ® Enterovirus real time RT-PCR Kit is a qualitative screening assay for detection
of enterovirus (Polio-, Coxsackie A-, Coxsackie B- and Echovirus) RNA in stool or other clinical
sample matrices (whole blood, plasma, respiratory samples, CSF [cerebrospinal fluid] etc.) in
real time PCR capillary systems (e.g. LightCycler ® , Roche). In parallel, the RNA extraction
efficiency from stool samples is controlled by a separate internal control.
2. INTRODUCTION
Human enteroviruses are ubiquitous high-infectious pathogens belonging to the family of
Picornavirida. They have a high incidence worldwide (about 500 million infections/ year). The
non-enveloped viruses (with ss-RNA genome of 6-7 kb) are high resistant even against pH
values from 3-9. Thus far, there is no effective antiviral chemotherapeutics available. Until now
about 70 serotypes are known. Route of transmission in human is fecal-oral by contact and
smear infection. Contaminated food and water (also knifes and forkes) are an important source
of infection for this highly contagious viruses which can be secreted with stool from infected
patients for several weeks.
Enteroviruses may trigger many (even life-threatening) infections, especially among children. In
summer period very often contaminated waters (swimming pools, lakes) change for the worse.
Enteroviruses cause several diseases, e.g. infection of upper respiratory tract, summer flue,
herpangina, hand-foot-mouth-disease, juvenile diabetes mellitus, infection of gastrointestinal
tract, eye-infections or epidemic myalgie. But also myocarditis, paralysis, multiple organ failure,
meningitis and encephalitis may be associated with enterovirus infections.
3. PRINCIPLE OF THE TEST
MutaREX ® Enterovirus real time RT-PCR contains specific primers, hydrolysis probes and
additional material for detection of enterovirus RNA in clinical samples by use of the LightCycler ®
instrument (Roche). Target sequence for the detection is within the 5`-untranslated region (5`-
UTR)
of the genome.
The assay uses a reverse transcriptase to convert viral RNA into cDNA and a thermostable DNA
polymerase to amplify an enterovirus-specific gene fragment by means of PCR (polymerase
chain reaction).
Detection of enterovirus amplificates is achieved in real time by hybridization and subsequent
hydrolysis of enterovirus-specific fluorescence probes (oligonucleotides labelled with a fluorophore
and a quencher molecule). Their emitted signal is measured (during PCR process) by the
optical unit of the real time PCR system (LightCycler ® 1.5 respectively 2.0- software). Specific
enterovirus amplification is measured at 530 nm (in F1-channel).
Furthermore, MutaREX ® Enterovirus real time RT-PCR - kit contains also a separate RNA
extraction control. This is added initially prior to the nucleic acid extraction procedure and
detected in the follow-up by an independent (heterologous) amplification system.
This internal control (IC) allows on the one hand the exposure of errors during RNA extraction
procedure and identifies on the other hand a potential inhibition of reverse transcription and PCR
respectively. Doing this, the risk for false-negative results is minimized extensively. The
detection of this RNA extraction control (= internal control for PCR) is measured at 705 nm in
channel F3 (LightCycler ® 1.5) or F6 (LightCycler ® 2.0).
Date: 2010/09/22 2
N:WINDAT/AL/MB/K/eMRexEV

4. KIT CONTENT
Each kit contains enough reagents to perform 32 or 96 tests and also a package insert.
A1
A2
A3
Reagent Confection 32
Enzyme Mix
Primer-/ Probe Mix
1x 30 µl
1 x 500 µl
Positive Control 1 x 30 µl
A4 Negative Control
Confection 96 Colour
3 x 30 µl
3 x 500 µl
2 x 30 µl
Date: 2010/09/22 3
N:WINDAT/AL/MB/K/eMRexEV
blue
yellow
red
1 x 200 µl 1 x 200 µl green
A5 Extraction Control (IC) 1 x 200 µl 3 x 200 µl transparent
5. TEST PERFORMANCE
Required materials - provided:
• Reagents for real time RT-PCR
• Package insert
Required materials - not provided:
• real time PCR capillary system (e. g. LightCycler ® instrument, Roche)
• real time PCR reaction tubes (e. g. LightCycler ® capillaries, Roche)
• Table centrifuge (e. g. LightCycler ® capillary centrifuge, Roche)
• Cryocontainer for PCR reaction tubes (e. g. LightCycler ® cooling block, Roche)
• Color Compensation Kit for the used real time PCR system
• RNA extraction kit for stool samples (e. g. MutaCLEAN ® Stool (Viral RNA), KG1035,
Immundiagnostik)
• Pipets (0.5 µl – 1000 µl) with sterile filter tips
• sterile reaction tubes (1,5 ml and 2,0 ml)
6. STORAGE AND HANDLING
• All reagents (A1 to A5) should be stored until immediate use at

AMPLIFICATION: The PCR technology is utmost sensitive. Thus, amplification of a single
molecule generates millions of identical copies. These copies may evade through aerosols and
sit on surfaces. In order to avoid contamination of samples with RNA which previously was
amplified, it is important to physically strictly divide sample and reagent preparation units from
sample amplification units. Set up three separate working areas:
1) Area for sample preparation.
2) Area for preparation of Master Mix.
3) Area for pipetting Master Mix and samples to the PCR tubes.
Pipets, vials and other working materials should not circulate among working units!
• Use always sterile pipette tips with filters and avoid aerosols.
• Wear separate coats and gloves in each area.
• Routinely decontaminate your pipettes and laboratory benches with decontaminant (do
not use ethanol solutions).
8. PROCEDURE
The complete procedure is separated in three steps:
A) RNA extraction from stool samples (e.g. with MutaCLEAN ® Stool (Viral RNA), KG1035
from Immundiagnostik) or other clinical samples using a commercial extraction kit.
B) Reverse transcription (RT) of RNA and subsequent amplification/ combined detection of
generated cDNA templates using hybridisation probes.
C) Result interpretation with the software of real time PCR instrument (LightCycler 1.5/ 2.0).
A) SAMPLE PREPARATION
1) RNA Extraction (by use of a commercial available RNA isolation kit): Extract viral RNA
from stool (e. g. with MutaCLEAN ® Stool (Viral RNA), KG1035 from Immundiagnostik)
or from other clinical sample matrices by use of a commercial RNA isolation kit (suited for
whole blood, plasma, respiratory samples, CSF [cerebrospinal fluid] etc.) according to the
manufacturer`s instructions. For doing this:
a) Stool Samples: resuspend a “pea-sized” stool sample in 1.5 ml sterile water (do not use
buffers!) by intensive vortexing and let sediment solid particles (if necessary support by
centrifugation for 2 min at 5000 rpm in table centrifuge). Use the supernatant for RNA
extraction without any further dilution. Very liquid stool samples should be used directly
(without further resuspension) for the RNA extraction, but also here vortex intensively and
proceed as before described.
b) Liquor: Liquor samples can be used directly (“native”) for extraction procedure.
c) Swab: soak the pad in 500 µl sterile water (do not use buffers!) and resuspend
thoroughly by vortexing. Remove pad-device and use remaining solution for the extraction
procedure.
2) Important: independent from the used sample matrix also a water control should be
extracted additionally: this is for identification of possible occurrence of inhibiting matrix
effects. Treat this water control analogous to the samples.
3) The extraction control A5 from MutaREX ® Enterovirus is added to each sample
BEFORE begin of the extraction procedure: Prepare a “working solution“ with first buffer
Date: 2010/09/22 4
N:WINDAT/AL/MB/K/eMRexEV

of the used RNA isolation kit (eventually plus supplements as „Poly A“) and the extraction
control (A5). Multiply the buffer volume necessary for one extraction (e.g. 200 µl for
MutaCLEAN ® Stool (Viral RNA) from Immundiagnostik) with the number (N) of
extractions performed in total (do not forget the water control and add also one additional
sample volume for reasons of inaccurate pipetting) and add for each extraction 5 µl of A5:
= (extraction buffer volume + 5 µl A5) x (N+1). Perform extraction procedure according to
the manufacturer`s manual afterwards.
OPTIONAL: If no control of extraction efficiency is needed, but still an internal control (IC)
of PCR, reagent A5 must be added (during preparation of PCR) directly to the PCR
Master Mix. In that case use only 0.2 µl from a 1:10 dilution of A5 per reaction!
4) If real time RT-PCR is not performed immediately, store the extracted RNA at < -20°C.
B) Real time Enterovirus (MutaREX ® ) RT- PCR PROTOCOL
Please read carefully the manual before starting the procedure! The Master Mix volume for the
respective number of samples and controls should be pipetted as follows:
1) The Enzyme Mix volume per reaction and sample (N) should be multiplied with the
number of samples to be performed, including controls A3 and A4. For reasons of
inaccurate pipetting, add an additional sample volume. Proceed in the same manner with
all additional reagents! Cool all reagents during the working steps!
Reaction Volume Master Mix volume
0.8 µl Enzyme Mix (A1) 0.8 µl x (N+1)
14.2 µl Primer-/ Probe Mix (A2) 14.2 µl x (N+1)
2) Mix gently but thoroughly by pipetting about 15 – 20 x ! (do not vortex) the following
reagents in a sterile tube: Enzyme Mix (A1) and Primer-/ Probe-Mix (A2). This mixture is
the Master Mix. Spin down briefly in a table centrifuge.
3) Pipette 15 µl of Master Mix using micropipettes with sterile filter tips in each of the Light
Cycler ® capillaries. Add 5 µl of the RNA sample, the positive (A3), the negative (A4) and
the water control to each of these capillaries. Immediately lock the capillaries to avoid
contamination (as contamination control, it is recommended to pipette the negative
control first but to close last) and spin down briefly (in a LightCycler ® capillary centrifuge).
4) Perform the following LightCycler ® RT-PCR protocol:
50°C for 10 min reverse transcription
95°C for 10 min initial denaturation
95°C for 15 sec 45 cycles
53°C for 30 sec ramping time: 20°C/sec – aqu. mode here: SINGLE
72°C for 15 sec
4°C for 10 sec cooling
Date: 2010/09/22 5
N:WINDAT/AL/MB/K/eMRexEV

D) RT- PCR ANALYSIS AND INTERPRETATION OF RESULTS
1) Perform the LightCycler ® PCR.
2) Switch on the Colour Compensation Filter (required because of the simultaneous use of
two differently labelled hydrolysis probes) by activating the field Choose CCC File.
3) The result for enterovirus specific amplification is shown in channel F1, the result for the
internal control is shown in channel F3.
4) Following results can occure:
• A signal is detected in channel F1.
The result is positive: The sample contains enterovirus RNA.
In this case, the detection of a signal in channel F3 is inessential, as high
concentrations of enterovirus RNA can lead to a reduced or absent fluorescence
signal of the internal control in channel F3 (competition).
• No signal is detected In channel F1, but in channel F3 (signal of the internal
control).
The sample does not contain any enterovirus RNA.
The detected signal of the internal control excludes the possibility of an RT-PCR
inhibition.
• Neither in channel F1 nor in channel F3 a signal is detected.
A diagnostic statement can not be made.
Inhibition of the RT-PCR reaction.
Date: 2010/09/22 6
N:WINDAT/AL/MB/K/eMRexEV
PC
NC