Validierung des MELISA -Tests zum Nachweis einer Metallu - biovis ...
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530 E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: Validierung des MELISA Tabelle 7 Nickel-Sensitivität und -Spezifität. Nickelallergie bestätigt/vermutet SI Geschlecht q 31,0 F q 24,4 F q 21,9 F q 19,3 F q 18,2 F q 18,2 F q 17,3 F q 15,4 F q 13,5 F q 12,9 F q 12,9 F q 9,5 F q 8,4 F q 8,2 F q 8,0 F y 6,4 M y 6,3 M y 5,8 M y 4,3 M y 1,9 M y 1,9 M y 1,4 F y 1,2 M y 1,0 F y 0,8 F Fünftel ‘‘schwach reaktive’’ und in der Hälfte der Fälle ‘‘stark reaktive’’ Ergebnisse. Nickel-Sensitivität und -Spezifität Fünfzehn Personen mit gesicherter (Epikutan-Test positiv) oder vermuteter (Hautreaktion auf Schmuck oder Jeansknöpfe) Nickelallergie und 10 Personen ohne Hinweise auf eine Nickelallergie wurden im MELISA getestet (Tabelle 7). Alle 15 Personen mit nachgewiesener oder vermuteter Nickelallergie waren im MELISA positiv (SI 8,0–31,0); alle untersuchten Personen waren Frauen. Von den Personen ohne Hinweise auf eine Nickelallergie waren 6 negativ (SIF1,9), 4 zeigten eine geringe Reaktivität (SI 4,3–6,4). Diskussion Seit seiner Einführung vor 40 Jahren wurde der LTT für die Labordiagnostik von T-Zell-Reaktivität sowohl gegen Medikamente, Metabolite, Krankheitserreger und Metalle als auch zum Nachweis von antigen-spezifischer zellulärer Immunreaktivität bei stark immunkomprimierten Patienten eingesetzt w9–17x. Seine allgemeine Anwendung und Akzeptanz wurde allerdings durch die begrenzten und manchmal widersprüchlichen Daten über seine Zuverlässigkeit behindert w17, 28, 29x. In dieser Studie evaluieren wir die Reproduzierbarkeit, Sensitivität, Spezifität und Zuverlässigkeit eines solchen Proliferationstests, des MELISA -Tests, der zuerst 1994 veröffentlicht w23x und 1999 in unserem Labor eingeführt wurde. Diese Evaluierung wurde in Verbindung mit der Akkreditierung des Labors (ISO 17025) im Jahre 2001 durchgeführt. Wie bei jedem komplexen biologischen Assay hängt der MELISA von der systematischen Feinabstimmung einer Reihe von Faktoren wie Zellkonzentration, Metallkonzentration, Kulturbedingungen und Zusammensetzung der Medien ab. Alle diese Faktoren bedingen erhebliche technische Variationen. Aus diesem Grund ist der Nachweis einer akzeptablen Intra- und Interassay- Reproduzierbarkeit wichtig. Die hier veröffentlichten Daten zeigen eine hohe qualitative Intra- und Interassay- Übereinstimmung der Ergebnisse und eine Gesamt- Reproduzierbarkeitsrate von 94% bei einem Standard-Cut-off von G3,0. Die 6% diskordanten Messergebnisse weisen mit einer Ausnahme nur schwach positive Reaktivitäten (SIF4,6) auf. Ein geringer Anteil von schwach positiven MELISA -Ergebnissen liegt offensichtlich in einer ‘‘Grauzone’’, die für die meisten labordiagnostischen Tests nicht ungewöhnlich ist. Falls solche Ergebnisse klinisch relevant scheinen, sollten sie durch eine Wiederholungsuntersuchung bestätigt werden. Wenn ein Cut-off von G5,0 angewandt wird, wie in einigen MELISA Studien berichtet w24x, liegt die Reproduzierbarkeit bei 99%. Es ist bemerkenswert, dass es keine Unterschiede in der Reproduzierbarkeit gibt, wenn Doppelbestimmungen von ein und derselben oder zwei verschiedenen technischen Assistenten durchgeführt werden (eigene Beobachtung). Mroz et al. beobachteten in 9 von 10 Proben, die aufgeteilt und in zwei verschiedenen Laboratorien mit dem LTT untersucht worden waren, eine Übereinstimmung der Reaktivität gegenüber Beryllium w21x. Unseres Wissens stellen die Daten unserer Studie im Vergleich zu bisherigen Veröffentlichungen die umfangreichste Evaluierung der Reproduzierbarkeit eines LTT dar. Die Verwendung einer höheren Zahl an Lymphozyten im MELISA -Test (1=10 6 Zellen/Test) im Vergleich zu konventionellen LTTs (100 000 bis 250 000 Zellen/Test) soll seine Sensitivität erhöhen w23x. Die hier präsentierten Ergebnisse von seriellen Verdünnungen der Lymphozyten von quecksilber- und nickel-sensibilisierten Patienten stützen diese Behauptung. Die antigenspezifische Reaktivität wird durch die Proliferation eines kleinen Teils der Gedächtniszellen hervorgerufen und ist daher zwangsläufig direkt von der Anzahl der untersuchten Lymphozyten abhängig. Im Gegensatz dazu ist die durch Mitogene (z.B. PWM) erzeugte polyklonale Proliferation viel weniger von der Zellzahl abhängig. Mroz et al. berichteten über eine verbesserte Sensitivität gegen Beryllium mit einem LTT, der 250 000 Lymphozyten/Test im Vergleich zu 100 000 Lymphozyten/Test hatte w21x. Verglichen mit dem MELISA werden LTTs mit -1=10 6 Zellen/ Test eine geringere Sensitivität und daher einen höheren Anteil an falsch-negativen Ergebnissen zeigen. Nicht nur die Lymphozytenkonzentration sondern auch
E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: Validierung des MELISA 531 die Metallkonzentration kann die Ergebnisse im Lymphozytentransformationstests beeinflussen. Frühe LTTs für Metalle, e.g. anorganisches Quecksilber, zeigten unspezifische Stimulierungen bei nicht sensibilisierten Patienten w28, 29x. Später zeigte sich, dass dieser Effekt auf der Verwendung hoher mitogener Konzentrationen des anorganischen Quecksilbers von )0,5 mg/ml beruhte w14x. Die in dieser Studie an 10 Patienten mit einer seriellen Verdünnung von anorganischem Quecksilber gewonnenen Ergebnisse bestätigen diese Beobachtung. Nur bei Konzentrationen von F0,5 mg/ml, wie sie in allen anderen Tests dieser Studie Standard sind, können positive Reaktionen als quecksilber-spezifische Sensibilisierungen bewertet werden. Es wurde berichtet, dass hohe Nickelkonzentrationen von G10 mg/ml ebenso nichtspezifische Proliferation induzieren w18x. In unserer Studie lagen die Nickelkonzentrationen bei F5 mg/ml. Da alle 250 Patienten unserer Studie auf eine Metallsensibilisierung verdächtige klinische Symptome aufwiesen, war es nicht überraschend, dass die Mehrzahl (74%) positiv gegen eines oder mehrere der bis zu 20 getesteten Metalle war. In einer Untersuchung von 930 Patienten in Södertälje (Schweden) waren 62% im MELISA positiv gegen ein oder mehrere Metalle w24x. Die niedrigere Zahl mag auf einem höheren Cut-off (SIG5) und weniger getesteten Metallen (ns15) als in unserer Studie beruhen. Eine noch niedrigere Zahl (58%) wurde in einer Studie mit über 5 000 Patienten gefunden, die mit einem modifizierten MELISA , dem so genannten LTT-CITA , untersucht worden waren w30x. Diese verminderte Sensitivität dürfte auf dem Einsatz der geringen Zahl an Lymphozyten (250 000/Test) und der begrenzten Zahl an getesteten Metallen (ns10) liegen. Die 26% der Patienten unserer Studie mit klinischen Symptomen einer Metallallergie, aber negativer Reaktion gegen alle getesteten Metalle könnten gegen ein hier nicht untersuchtes Metall sensibilisiert sein, unter toxischen Effekten einer Metallbelastung leiden (nicht mit dem MELISA -Test nachweisbar) oder eine Erkrankung anderer Ätiologie haben. In allen bisherigen Studien war Nickel das Metall, gegen das am häufigsten Sensibilisierungen gefunden wurden, und zwar häufiger bei Frauen als bei Männern und unabhängig davon, ob der Epikutan-Test oder ein Lymphozytenproliferationstest verwendet wurde w18, 24–26x. Auch in unserer Studie wies Nickel die höchste Reaktivitätsrate (73%) auf. Die von drei unabhängigen Gruppen mitgeteilten Raten, die denselben MELISA - Test einsetzten, aber einen Cut-off von G5 wählten, variierten, lagen aber alle niedriger: ca. 22% für München, ca. 36% für Södertälje und ca. 47% für Uppsala w24x. Selbst wenn die 20,8% der Nickel-Reaktivitäten unserer Studie mit einem SI von 3–5 als negativ bewertet wären, läge die Nickel-Reaktivität mit 57% (statt 73%) immer noch etwas höher als die für Uppsala berichtete. In dem weniger empfindlichen LTT-CITA reagierten ungefähr 28% der Patienten positiv auf Nickel w30x. Für die weitere Analyse der Sensitivität und Spezifität der Reaktivität gegen Nickel in unserer Studie wurden Patienten mit und ohne Verdacht auf eine Nickel-Allergie im MELISA getestet. Während die Sensitivität 100% betrug, schien die Spezifität niedriger zu sein: vier Personen ohne Verdacht auf eine Nickel-Allergie zeigten niedrige Nickel-Reaktivitäten (SI 4,3–6,4). Epikutan- Test-Ergebnisse waren von diesen Patienten nicht erhältlich. Eine Wiederholungsuntersuchung des MELISA war nicht möglich. Der Patient mit dem höchsten SI von 6,4 in dieser Gruppe hatte Diabetes, Psoriasis und Nahrungsmittel-Allergien. Einerseits könnten diese 4 Patienten falsch positiv gegen Nickel reagieren, andererseits könnten sie eine nur geringe asymptomatische Nickel- Allergie haben. Alle vier waren Männer, die möglicherweise kaum Schmuck tragen und daher keine Haut-Sensibilisierung beobachten. Außerdem wurde über nickel-reaktive T-Zellen bei Personen mit negativem Epikutan-Test und ohne Kontaktdermatitis bereits berichtet w31x. Eine größere Differenz der Reaktivität gegen Titan wurde in unserer Studie (42%) im Vergleich zu den MELISA Studien in München (ca. 1,5%), Södertälje (ca. 6%) und Uppsala (10%) gefunden w24x. Selbst wenn wegen der besseren Vergleichbarkeit mit den oben erwähnten Studien, die einen höheren Cut-off verwenden, die Reaktivitäten im Bereich SI 3–5 (35,7%) eliminiert wurden, war die Rate positiver Befunde mit 27% noch erheblich höher. Eine mitogene Titankonzentration scheidet als Erklärung aus, da erstens über solche Titanwirkungen niemals berichtet wurde, zweitens in unserer Studie dieselben Titankonzentrationen getestet wurden wie in den drei erwähnten Untersuchungen und drittens die Mehrzahl unserer Patienten (58%) nicht auf Titan reagierte. Die höhere Rate in unserer Studie könnte auf einer stärkeren Exposition unserer Patienten im Jahre 2001, z.B. gegen Titan in Zahnimplantaten, im Vergleich zu denen aus den Jahren 1996/1997 beruhen w24x. Eine Korrelation mit dem Epikutan-Test ist nicht möglich, da der Epikutan-Test auf Titan im Allgemeinen nicht durchgeführt wird. Während der wahre Umfang der Titan-Sensibilisierung noch geklärt werden muss, sind die hier mitgeteilten Titan- Reaktivitäten reproduzierbar, korrelieren (soweit klinische Daten verfügbar waren) mit einer Titan-Exposition (Kosmetika, Zahnimplantate, orthopädische Prothesen) und sind klinisch relevant, d.h. Reduktion der Titanexposition bewirkt eine Abnahme der Reaktivität bei titan-positiven Patienten und eine Verbesserung der klinischen Symptome w27x. In unserer Studie war die Reaktivität gegen anorganisches Quecksilber etwas niedriger (8%) im Vergleich zu München (ca. 14%), Södertälje (ca. 21%) und Uppsala (ca. 33%) w24x, aber ähnlich wie in der mit dem LTT-CITA getesteten Gruppe (8%) w30x. Die höhere Rate in den schwedischen Gruppen könnte auf der bewussten Aufnahme einer größeren Zahl von Patienten mit positivem Epikutan-Test gegen Quecksilber und der höheren Rate von Amalgamträgern (VDM Stejskal, persönliche Mittei-
- Seite 1 und 2: J Lab Med 2004;28(6):525-533 2004
- Seite 3 und 4: E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwar
- Seite 5: E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwar
- Seite 9: E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwar
530 E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: <strong>Validierung</strong> <strong>des</strong> <strong>MELISA</strong> <br />
Tabelle 7<br />
Nickel-Sensitivität und -Spezifität.<br />
Nickelallergie bestätigt/vermutet SI Geschlecht<br />
q 31,0 F<br />
q 24,4 F<br />
q 21,9 F<br />
q 19,3 F<br />
q 18,2 F<br />
q 18,2 F<br />
q 17,3 F<br />
q 15,4 F<br />
q 13,5 F<br />
q 12,9 F<br />
q 12,9 F<br />
q 9,5 F<br />
q 8,4 F<br />
q 8,2 F<br />
q 8,0 F<br />
y 6,4 M<br />
y 6,3 M<br />
y 5,8 M<br />
y 4,3 M<br />
y 1,9 M<br />
y 1,9 M<br />
y 1,4 F<br />
y 1,2 M<br />
y 1,0 F<br />
y 0,8 F<br />
Fünftel ‘‘schwach reaktive’’ und in der Hälfte der Fälle<br />
‘‘stark reaktive’’ Ergebnisse.<br />
Nickel-Sensitivität und -Spezifität<br />
Fünfzehn Personen mit gesicherter (Epikutan-Test positiv)<br />
oder vermuteter (Hautreaktion auf Schmuck oder<br />
Jeansknöpfe) Nickelallergie und 10 Personen ohne Hinweise<br />
auf eine Nickelallergie wurden im <strong>MELISA</strong> getestet<br />
(Tabelle 7). Alle 15 Personen mit nachgewiesener<br />
oder vermuteter Nickelallergie waren im <strong>MELISA</strong> positiv<br />
(SI 8,0–31,0); alle untersuchten Personen waren Frauen.<br />
Von den Personen ohne Hinweise auf eine Nickelallergie<br />
waren 6 negativ (SIF1,9), 4 zeigten eine geringe Reaktivität<br />
(SI 4,3–6,4).<br />
Diskussion<br />
Seit s<strong>einer</strong> Einführung vor 40 Jahren wurde der LTT für<br />
die Labordiagnostik von T-Zell-Reaktivität sowohl gegen<br />
Medikamente, Metabolite, Krankheitserreger und Metalle<br />
als auch <strong>zum</strong> <strong>Nachweis</strong> von antigen-spezifischer zellulärer<br />
Immunreaktivität bei stark immunkomprimierten<br />
Patienten eingesetzt w9–17x. Seine allgemeine Anwendung<br />
und Akzeptanz wurde allerdings durch die begrenzten<br />
und manchmal widersprüchlichen Daten über seine<br />
Zuverlässigkeit behindert w17, 28, 29x. In dieser Studie<br />
evaluieren wir die Reproduzierbarkeit, Sensitivität, Spezifität<br />
und Zuverlässigkeit eines solchen Proliferationstests,<br />
<strong>des</strong> <strong>MELISA</strong> -<strong>Tests</strong>, der zuerst 1994 veröffentlicht<br />
w23x und 1999 in unserem Labor eingeführt wurde. Diese<br />
Evaluierung wurde in Verbindung mit der Akkreditierung<br />
<strong>des</strong> Labors (ISO 17025) im Jahre 2001 durchgeführt.<br />
Wie bei jedem komplexen biologischen Assay hängt<br />
der <strong>MELISA</strong> von der systematischen Feinabstimmung<br />
<strong>einer</strong> Reihe von Faktoren wie Zellkonzentration, Metallkonzentration,<br />
Kulturbedingungen und Zusammensetzung<br />
der Medien ab. Alle diese Faktoren bedingen<br />
erhebliche technische Variationen. Aus diesem Grund ist<br />
der <strong>Nachweis</strong> <strong>einer</strong> akzeptablen Intra- und Interassay-<br />
Reproduzierbarkeit wichtig. Die hier veröffentlichten<br />
Daten zeigen eine hohe qualitative Intra- und Interassay-<br />
Übereinstimmung der Ergebnisse und eine Gesamt-<br />
Reproduzierbarkeitsrate von 94% bei einem<br />
Standard-Cut-off von G3,0. Die 6% diskordanten Messergebnisse<br />
weisen mit <strong>einer</strong> Ausnahme nur schwach<br />
positive Reaktivitäten (SIF4,6) auf. Ein geringer Anteil<br />
von schwach positiven <strong>MELISA</strong> -Ergebnissen liegt offensichtlich<br />
in <strong>einer</strong> ‘‘Grauzone’’, die für die meisten labordiagnostischen<br />
<strong>Tests</strong> nicht ungewöhnlich ist. Falls solche<br />
Ergebnisse klinisch relevant scheinen, sollten sie durch<br />
eine Wiederholungsuntersuchung bestätigt werden.<br />
Wenn ein Cut-off von G5,0 angewandt wird, wie in einigen<br />
<strong>MELISA</strong> Studien berichtet w24x, liegt die Reproduzierbarkeit<br />
bei 99%. Es ist bemerkenswert, dass es<br />
keine Unterschiede in der Reproduzierbarkeit gibt, wenn<br />
Doppelbestimmungen von ein und derselben oder zwei<br />
verschiedenen technischen Assistenten durchgeführt<br />
werden (eigene Beobachtung). Mroz et al. beobachteten<br />
in 9 von 10 Proben, die aufgeteilt und in zwei verschiedenen<br />
Laboratorien mit dem LTT untersucht worden<br />
waren, eine Übereinstimmung der Reaktivität gegenüber<br />
Beryllium w21x.<br />
Unseres Wissens stellen die Daten unserer Studie im<br />
Vergleich zu bisherigen Veröffentlichungen die umfangreichste<br />
Evaluierung der Reproduzierbarkeit eines LTT<br />
dar.<br />
Die Verwendung <strong>einer</strong> höheren Zahl an Lymphozyten<br />
im <strong>MELISA</strong> -Test (1=10 6 Zellen/Test) im Vergleich zu<br />
konventionellen LTTs (100 000 bis 250 000 Zellen/Test)<br />
soll seine Sensitivität erhöhen w23x. Die hier präsentierten<br />
Ergebnisse von seriellen Verdünnungen der Lymphozyten<br />
von quecksilber- und nickel-sensibilisierten Patienten<br />
stützen diese Behauptung. Die antigenspezifische Reaktivität<br />
wird durch die Proliferation eines kleinen Teils der<br />
Gedächtniszellen hervorgerufen und ist daher zwangsläufig<br />
direkt von der Anzahl der untersuchten Lymphozyten<br />
abhängig. Im Gegensatz dazu ist die durch<br />
Mitogene (z.B. PWM) erzeugte polyklonale Proliferation<br />
viel weniger von der Zellzahl abhängig. Mroz et al. berichteten<br />
über eine verbesserte Sensitivität gegen Beryllium<br />
mit einem LTT, der 250 000 Lymphozyten/Test im Vergleich<br />
zu 100 000 Lymphozyten/Test hatte w21x. Verglichen<br />
mit dem <strong>MELISA</strong> werden LTTs mit -1=10 6 Zellen/<br />
Test eine geringere Sensitivität und daher einen höheren<br />
Anteil an falsch-negativen Ergebnissen zeigen.<br />
Nicht nur die Lymphozytenkonzentration sondern auch
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