Validierung des MELISA -Tests zum Nachweis einer Metallu - biovis ...
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526 E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: Validierung des MELISA very low positive (ns4) in MELISA . MELISA reactivity is directly dependent on lymphocyte concentration: the higher the lymphocyte concentration per test, the stronger the reactivity. Concentrations of inorganic mercury )0.5 mg/ml cause non antigen-specific (mitogenic) reactions in a majority of patients. The reproducibility rate was 94% using a cut-off of Stimulation Index G3 or 99% using a cut-off of G5. While the absolute intra- and interassay Stimulation Index values may vary, the qualitative results are highly reproducible. The MELISA Test is reproducible, sensitive, specific, and reliable for detecting metal sensitivity in metal-sensitive patients. Keywords: lymphocyte transformation test; MELISA - Test; mercury; metal allergy; nickel. Einleitung Metallallergien werden konventionell im Epikutan-Test oder ‘‘Patch-Test’’ festgestellt, bei denen die vermutete allergisierende Substanz auf die Haut aufgebracht und nach 3–4 Tagen die Entwicklung von Erythemen, Papeln oder Bläschen an den Applikationsstellen geprüft wird. Eine positive Hautreaktion kann für eine spezifische Metallallergie sprechen, allerdings ist der Test nicht in der Lage, allergische von irritativen Reaktionen zu unterscheiden. Außerdem hat er eine geringe Sensitivität und eine schlechte Reproduzierbarkeit. Dazu scheint er nur für Allergene geeignet zu sein, für die die Haut das Zielorgan der Sensibilisierung ist. Ferner kann er selbst in vivo-Sensibilisierungen induzieren und bei bereits sensibilisierten Personen eine Exazerbation der Symptome verursachen w1–5x. Eine Alternative ist der Lymphozyten- Transformations-Test (LTT), bei dem Lymphozyten (Gedächtniszellen) des betreffenden Patienten zusammen mit dem zu untersuchenden Allergen 5–6 Tage kultiviert werden. Die dabei erfolgende Lymphoblastentransformation wird morphologisch nachgewiesen, die Messung der Lymphozytenproliferation erfolgt aufgrund des 3 H-Thymidin-Einbaus. Der ursprünglich Mitte der sechziger Jahre für die Untersuchung der Histoinkompatibilität der HLA-Antigene der Klasse II entwickelte LTT w6, 7x wurde für die HLA Klasse II-Antigentypisierung modifiziert w8x und auch vielfach zum Nachweis von Typ IV-Allergien gegen Medikamente, Metabolite, Krankheitserreger und Metalle verwendet w9–17x. Der LTT wurde ein Standard-Test zum Nachweis von Allergien gegen Nickel, Gold, Cobalt, Chrom und Palladium w1, 18–20x. Der LTT für Beryllium ist inzwischen der ‘‘Gold-Standard’’ für die Diagnose der Lungen-Berylliose w21, 22x. 1994 veröffentlichten Stejskal et al. eine Modifikation des LTT zum Nachweis von Metallsensibilisierungen, den MELISA -Test (memory lymphocyte immunostimulation assay) w23x. Durch eine höhere Lymphozytenzahl im Test, die Wahl einer weder zytotoxischen noch mitogenen Metallkonzentration, die Depletion von Monozyten aus der Population der mononukleären Zellen und die Ergänzung der radiometrischen Ergebnisse durch eine morphologische Untersuchung konnten Sensitivität und Spezifität verbessert werden. In den letzten sechs Jahren wurden weltweit mehrere Laboratorien für die Durchführung des MELISA -Tests lizenziert und eine Reihe von wissenschaftlichen Arbeiten, die seine klinische Wertigkeit zeigen, veröffentlicht w24–26x oder befinden sich in Vorbereitung w27x. Das ehemalige Labor Dr. Schiwara & Partner in Bremen erhielt 1999 die Lizenz für die Durchführung des MELI- SA -Tests. Um die Kriterien für die Akkreditierung nach ISO 17025 zu erfüllen, wurde der Test hinsichtlich Sensitivität, Spezifität, Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit validiert. In der vorliegenden Studie werden die Ergebnisse dieser Validierung des MELISA -Tests zum Nachweis einer Metallsensibilisierung dargestellt. Material und Methoden Blutproben Für alle Untersuchungen, ausgenommen die Bestimmung der Reproduzierbarkeit, wurde das Blut von 250 konsekutiven Proben verwendet, die im Laufe des Jahres 2001 an das Labor für die routinemäßige Durchführung des MELISA -Tests geschickt wurden. Die meisten Proben stammten von Patienten mit klinischem Verdacht auf eine Typ IV Metall-Allergie. Für die Untersuchung der Reproduzierbarkeit wurde Blut eingesetzt, das im Laufe des Jahres 2000 eingeschickt wurde und aus dem genügend Lymphozyten für Doppelbestimmungen gewonnen werden konnten. Sie wurden am selben Tag von ein und derselben oder zwei verschiedenen technischen Assistenten durchgeführt. Alle Blutproben wurden mit CPDA-Monovetten (SAR- STEDT AG & Co., Nümbrecht) oder in ACD Solution A Vakutainer Röhrchen (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg) gewonnen, mit der normalen Post oder mit privaten Kurieren transportiert und trafen im Labor in der Regel innerhalb von 24 Stunden, maximal 48 Stunden nach der Blutentnahme ein. Die Lymphozyten wurden unmittelbar nach dem Eintreffen im Labor isoliert und entweder direkt für den MELISA -Test verwendet oder über Nacht bei 48C in einem Medium, das 20% gepooltes hitzeinaktiviertes humanes AB-Serum enthielt (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen), gelagert und dann für den Test eingesetzt. Die einsendenden Ärzte waren hauptsächlich Allgemeinmediziner, Allergologen und Dermatologen, Umweltmediziner oder Homöopathen, seltener Zahnärzte oder Psychiater. Die meisten hatten ihre Praxis in Deutschland, ein kleiner Teil in Australien, Belgien, England, Frankreich, Griechenland, Niederlanden, Israel, Italien, Schweden, Schweiz und USA.
E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: Validierung des MELISA 527 Tabelle 1 MELISA Doppelbestimmungen bei einem Patienten. Test 1 Test 2 Antigen cpm SI cpm SI q Kontrolle 421 481 240,0 275 182 136,6 y Kontrolle 1 756 1,0 2 030 1,0 Be 1 1 508 0,9 1 691 0,8 2 1 311 0,8 1 676 0,8 Pb 1 1 394 0,8 1 615 0,8 2 2 339 1,3 1 797 0,9 Cd 1 1 816 1,0 1 492 0,7 2 989 0,6 1 165 0,6 Au 1 1 083 0,6 1 014 0,5 2 1 050 0,6 1 210 0,6 Ni 1 7 580 4,3 6 472 3,3 2 34 544 19,7 23 153 11,4 Pd 1 1 063 0,6 1 443 0,7 2 934 0,5 1 669 0,8 HgCl 1 1 483 0,8 2 413 1,2 2 1 720 1,0 1 958 1,0 HgMe 1 1 340 0,8 1 640 0,8 2 1 360 0,8 1 274 0,6 Ti 1 2 763 1,6 2 489 1,2 2 1 125 0,6 1 804 0,9 Sn 1 1 383 0,8 2 188 1,1 2 1 664 1,0 2 309 1,1 y Kontrolle: cpm Wert ist der Mittelwert von 3 Bestimmungen. 1, 2: zwei Verdünnungen des getesteten Metalls. MELISA Der MELISA -Test wurde mit geringen Modifikationen im Wesentlichen so durchgeführt wie früher beschrieben w14x. Die Lymphozyten wurden aus antikoaguliertem (anstelle von defibriniertem) Blut mit Ficoll Histopaque (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) isoliert, zweimal mit Medium wRPMI-1640, das Hepes (Life Technologies GmbH, Karlsruhe), 8 mg/l Gentamycin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH) und 6,25 mmol/l L-Glutamin (Biochrom AG Seromed, Berlin) enthieltx gewaschen, resuspendiert in 20% gepooltem, hitzeinaktiviertes Humanserum enthaltendes Medium, bei 378C unter 5% CO 2 30 Minuten lang in einer Kunstoff-Zellkulturflasche inkubiert (erste Monozytendepletion) und resuspendiert in Medium mit 10% gepooltem, hitzeinaktiviertem Humanserum (10% Medium) auf eine Konzentration von 1=10 6 Lymphozyten/ml. Jeweils 1 ml Zellsuspension wurde dann in die Vertiefungen einer 24-well (anstelle einer 48-well) Zellkultur-Platte (Dunn Labortechnik GmbH, Asbach) pipettiert, die mit Metall-Lösungen in 2–3 Konzentrationen vorbeschichtet war. Die Platten wurden dann 5 Tage lang bei 378C und 5% CO 2 inkubiert. Drei Negativkontrollen (nur Lymphozyten in 10% Medium) und 1 Positivkontrolle wLymphozyten in 10% Medium plus PWM (Poke Weed Mitogen, Sigma-Aldrich Chemie GmbH) (anstelle von PPD, gereinigten Proteinderivaten)x wurden bei jedem Test mitgeführt. Nach 5 Tagen wurden 600 ml der Zellsuspension aus jeder Vertiefung auf eine neue 24-well-Platte transferriert (zweite Monozytendepletion) und 4 Stunden lang mit 3 mC Methyl- 3 H-Thymidin, spezifische Aktivität 185 GBq/mmol (Amersham Buchler GmbH & Co. KG, Braunschweig) markiert. Die Zellen wurden auf Filterpapier geerntet (Inotech Cell Harvester, Wallac Distribution GmbH, Freiburg). Das Filterpapier wurde in der Mikrowelle (nicht bei Raumtemperatur über Nacht) getrocknet und die Radioaktivität in einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen (1450 Microbeta Trilux, Wallac Distribution GmbH). Als positiv wurde ein Stimulations-Index (SI) von G3 definiert. Ein SI zwischen 2 und 3 wurde als ‘‘Sensibilisierung möglich’’, ein SI -2 als negativ bewertet. Der SI wird wie folgt berechnet: SIscpm in Test-Vertiefung dividiert durch den Mittelwert der cpm in den Negativkontroll-Vertiefungen. Die Zellen der 5-Tage-Kulturen wurden außerdem morphologisch nach Färbung der Cytospin Präparationen mit einer Rapid Differential Hematology Staining Färbelösung (Dade Behring AG, Marburg) untersucht. Nur Tests, die aufgrund der radiometrischen Messung positiv und bei denen Lymphoblasten mikroskopisch nachweisbar waren, sowie umgekehrt radiometrisch negative Tests, die ausschließlich kleine vitale (weder zytoxischgeschädigte noch stimulierte) Lymphozyten zeigten, wurden als valide akzeptiert. Ergebnisse Reproduzierbarkeit Die Reproduzierbarkeit des MELISA -Tests wurde auf dreierlei Weise untersucht:
- Seite 1: J Lab Med 2004;28(6):525-533 2004
- Seite 5 und 6: E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwar
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E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: <strong>Validierung</strong> <strong>des</strong> <strong>MELISA</strong> 527<br />
Tabelle 1<br />
<strong>MELISA</strong> Doppelbestimmungen bei einem Patienten.<br />
Test 1 Test 2<br />
Antigen cpm SI cpm SI<br />
q Kontrolle 421 481 240,0 275 182 136,6<br />
y Kontrolle 1 756 1,0 2 030 1,0<br />
Be 1 1 508 0,9 1 691 0,8<br />
2 1 311 0,8 1 676 0,8<br />
Pb 1 1 394 0,8 1 615 0,8<br />
2 2 339 1,3 1 797 0,9<br />
Cd 1 1 816 1,0 1 492 0,7<br />
2 989 0,6 1 165 0,6<br />
Au 1 1 083 0,6 1 014 0,5<br />
2 1 050 0,6 1 210 0,6<br />
Ni 1 7 580 4,3 6 472 3,3<br />
2 34 544 19,7 23 153 11,4<br />
Pd 1 1 063 0,6 1 443 0,7<br />
2 934 0,5 1 669 0,8<br />
HgCl 1 1 483 0,8 2 413 1,2<br />
2 1 720 1,0 1 958 1,0<br />
HgMe 1 1 340 0,8 1 640 0,8<br />
2 1 360 0,8 1 274 0,6<br />
Ti 1 2 763 1,6 2 489 1,2<br />
2 1 125 0,6 1 804 0,9<br />
Sn 1 1 383 0,8 2 188 1,1<br />
2 1 664 1,0 2 309 1,1<br />
y Kontrolle: cpm Wert ist der Mittelwert von 3 Bestimmungen. 1, 2: zwei Verdünnungen <strong>des</strong> getesteten Metalls.<br />
<strong>MELISA</strong> <br />
Der <strong>MELISA</strong> -Test wurde mit geringen Modifikationen im<br />
Wesentlichen so durchgeführt wie früher beschrieben<br />
w14x. Die Lymphozyten wurden aus antikoaguliertem<br />
(anstelle von defibriniertem) Blut mit Ficoll Histopaque<br />
(Sigma-Aldrich Chemie GmbH) isoliert, zweimal mit<br />
Medium wRPMI-1640, das Hepes (Life Technologies<br />
GmbH, Karlsruhe), 8 mg/l Gentamycin (Sigma-Aldrich<br />
Chemie GmbH) und 6,25 mmol/l L-Glutamin (Biochrom<br />
AG Seromed, Berlin) enthieltx gewaschen, resuspendiert<br />
in 20% gepooltem, hitzeinaktiviertes<br />
Humanserum enthalten<strong>des</strong> Medium, bei 378C unter 5%<br />
CO 2 30 Minuten lang in <strong>einer</strong> Kunstoff-Zellkulturflasche<br />
inkubiert (erste Monozytendepletion) und resuspendiert<br />
in Medium mit 10% gepooltem, hitzeinaktiviertem<br />
Humanserum (10% Medium) auf eine Konzentration von<br />
1=10 6 Lymphozyten/ml. Jeweils 1 ml Zellsuspension<br />
wurde dann in die Vertiefungen <strong>einer</strong> 24-well (anstelle<br />
<strong>einer</strong> 48-well) Zellkultur-Platte (Dunn Labortechnik<br />
GmbH, Asbach) pipettiert, die mit Metall-Lösungen in<br />
2–3 Konzentrationen vorbeschichtet war. Die Platten<br />
wurden dann 5 Tage lang bei 378C und 5% CO 2 inkubiert.<br />
Drei Negativkontrollen (nur Lymphozyten in 10% Medium)<br />
und 1 Positivkontrolle wLymphozyten in 10% Medium<br />
plus PWM (Poke Weed Mitogen, Sigma-Aldrich Chemie<br />
GmbH) (anstelle von PPD, gereinigten Proteinderivaten)x<br />
wurden bei jedem Test mitgeführt. Nach 5 Tagen wurden<br />
600 ml der Zellsuspension aus jeder Vertiefung auf eine<br />
neue 24-well-Platte transferriert (zweite Monozytendepletion)<br />
und 4 Stunden lang mit 3 mC Methyl- 3 H-Thymidin,<br />
spezifische Aktivität 185 GBq/mmol (Amersham Buchler<br />
GmbH & Co. KG, Braunschweig) markiert. Die Zellen<br />
wurden auf Filterpapier geerntet (Inotech Cell Harvester,<br />
Wallac Distribution GmbH, Freiburg). Das Filterpapier<br />
wurde in der Mikrowelle (nicht bei Raumtemperatur über<br />
Nacht) getrocknet und die Radioaktivität in einem Flüssigkeitsszintillationszähler<br />
gemessen (1450 Microbeta<br />
Trilux, Wallac Distribution GmbH).<br />
Als positiv wurde ein Stimulations-Index (SI) von G3<br />
definiert. Ein SI zwischen 2 und 3 wurde als ‘‘Sensibilisierung<br />
möglich’’, ein SI -2 als negativ bewertet. Der SI<br />
wird wie folgt berechnet: SIscpm in Test-Vertiefung dividiert<br />
durch den Mittelwert der cpm in den Negativkontroll-Vertiefungen.<br />
Die Zellen der 5-Tage-Kulturen wurden außerdem morphologisch<br />
nach Färbung der Cytospin Präparationen mit<br />
<strong>einer</strong> Rapid Differential Hematology Staining Färbelösung<br />
(Dade Behring AG, Marburg) untersucht. Nur <strong>Tests</strong>, die<br />
aufgrund der radiometrischen Messung positiv und bei<br />
denen Lymphoblasten mikroskopisch nachweisbar<br />
waren, sowie umgekehrt radiometrisch negative <strong>Tests</strong>,<br />
die ausschließlich kleine vitale (weder zytoxischgeschädigte<br />
noch stimulierte) Lymphozyten zeigten, wurden als<br />
valide akzeptiert.<br />
Ergebnisse<br />
Reproduzierbarkeit<br />
Die Reproduzierbarkeit <strong>des</strong> <strong>MELISA</strong> -<strong>Tests</strong> wurde auf<br />
dreierlei Weise untersucht:
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