Validierung des MELISA -Tests zum Nachweis einer Metallu - biovis ...

J Lab Med 2004;28(6):525–533 2004 by Walter de Gruyter • Berlin • New York. DOI 10.1515/LabMed.2004.070
Validierung des MELISA -Tests zum Nachweis einer
Metallüberempfindlichkeit 1)
Validity of MELISA for metal sensitivity testing
Elizabeth Valentine-Thon 1, * und Hans-Walter
Schiwara 2
1
MELISA (LTT) Center, Gemeinschaftspraxis für
Laboratoriumsmedizin Dr. M. Sandkamp, B. Köster, Dr.
R. Hiller, Bremen, Ge Deutschland
2
im Ruhestand, ehemals Labor Dr. Schiwara & Partner,
Bremen, Ge Deutschland
Zusammenfassung
In dieser Studie wurden Reproduzierbarkeit, Sensitivität,
Spezifität und Zuverlässigkeit des MELISA -Tests zum
Nachweis von Metallüberempfindlichkeiten bei Patienten
mit klinischen Symptomen einer Typ IV-Allergie gegen
Metalle untersucht.
Von 250 Patienten wurde Blut im MELISA gegen bis
zu 20 Metalle in 2 bis 3 verschiedenen Konzentrationen
getestet. Häufigkeit und Verteilung positiver Testergebnisse,
Sensitivität und Spezifität des Tests bei Patienten
mit und ohne gesicherte oder vermutete Nickelallergie
sowie die Bedeutung der Lymphozytenzahl und der Konzentration
von anorganischem Quecksilber im Testsystem
wurden untersucht. Darüberhinaus wurden für die
Reproduzierbarkeitstestung 196 MELISA -Tests im Doppelansatz
durchgeführt und die Intra- und Interassay-
Variationen bei Patienten mit positivem Epikutan-Test für
die entsprechenden Metalle bestimmt.
Von den 250 Patienten reagierten 26% gegen kein
Metall, 36% gegen 1, 15% gegen 2, 12% gegen 3, 6%
gegen 4 und 5% gegen G5 Metalle positiv im MELISA -
Test. Die positiven Ergebnisse gegen die einzelnen Metalle
wiesen folgende Häufigkeiten auf: Nickel (73%), Titan
(42%), Cadmium (18%), Gold (17%), Palladium (13%),
Blei (11%), Beryllium (9%), anorganisches Quecksilber
(8%), Zinn (8%) und Phenylquecksilber (6%). Alle Patienten,
bei denen eine Nickelallergie vermutet oder gesichert
wurde (ns15), reagierten im MELISA -Test positiv, wäh-
1)
Übersetzt nach dem Artikel: Valentine-Thon E and H-W
Schiwara: Validity of MELISA for metal sensitivity testing.
Neuroendocrinology Letters 2003;24:57-64 mit freundlicher
Genehmigung von PG Fedor-Freybergh, Editor-in-Chief,
Neuroendocrinology Letters
*Korrespondenz: Dr. Elizabeth Valentine-Thon, MELISA (LTT)
Center, Gemeinschaftspraxis für Laboratoriumsmedizin Dr. M.
Sandkamp, B. Köster, Dr. R. Hiller, Norderoog 2, 28259
Bremen, Germany
Tel: 0049-421-5725369
Fax: 0049-421-571249
E-mail: evt@lanisa.de
rend Patienten ohne Verdacht auf eine Nickelallergie entweder
negativ (ns6) oder sehr schwach positiv (ns4)
reagierten. Die Reaktivität des MELISA -Tests hängt von
der Lymphozytenkonzentration ab: je höher die Lymphozytenkonzentration
im Test, desto stärker die Reaktion.
Eine Konzentration von )0,5 mg/ml anorganischem
Quecksilber verursacht bei den meisten Patienten eine
nicht antigen-spezifische (mitogene) Reaktion. Die
Reproduzierbarkeit betrug 94% bei einem Stimulationsindex
von G3 und 99% bei einem Index von G5 als Cutoff.
Während die absoluten Intra- und Interassay-
Stimulations-Indices variieren können, sind die qualitativen
Ergebnisse in hohem Grade reproduzierbar.
Der MELISA -Test ist also reproduzierbar, sensitiv,
spezifisch und zuverlässig für den Nachweis einer Metallunverträglichkeit
bei gegen Metalle sensibilisierten
Patienten.
Schlüsselwörter: Lymphozyten-Transformations-Test;
MELISA -Test; Metallunverträglichkeit; Nickel; Quecksilber.
Abstract
This study was carried out to evaluate the reproducibility,
sensitivity, specificity, and reliability of the MELISA Test
for detecting metal sensitivity in patients with clinical
symptoms of a type IV hypersensitivity to metal.
Blood from 250 patients was tested in MELISA
against up to 20 different metals in 2 to 3 concentrations.
The frequency and distribution of metal reactivities, the
sensitivity and specificity of nickel reactivity in patients
with and without confirmed or suspected sensitivity to
nickel, and the roles of lymphocyte concentration and
concentration of inorganic mercury were analyzed. In
addition, for reproducibility testing, 196 metal tests were
performed in duplicate, and intra- and interassay variations
of MELISA results were examined in patients
patch-test positive for the relevant metal.
Among the 250 patients, reactivity to 0, 1, 2, 3, 4, or
G5 metals was 26%, 36%, 15%, 12%, 6%, and 5%,
respectively. Reactivity was most frequent to nickel
(73%), followed by titanium (42%), cadmium (18%), gold
(17%), palladium (13%), lead (11%), beryllium (9%), inorganic
mercury (8%), tin (8%), and phenylmercury (6%).
All patients (ns15) with confirmed or suspected nickel
allergy were positive in MELISA , while patients with no
suspicion of nickel allergy were either negative (ns6) or

526 E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: Validierung des MELISA
very low positive (ns4) in MELISA . MELISA reactivity
is directly dependent on lymphocyte concentration: the
higher the lymphocyte concentration per test, the stronger
the reactivity. Concentrations of inorganic mercury
)0.5 mg/ml cause non antigen-specific (mitogenic) reactions
in a majority of patients. The reproducibility rate
was 94% using a cut-off of Stimulation Index G3 or 99%
using a cut-off of G5. While the absolute intra- and interassay
Stimulation Index values may vary, the qualitative
results are highly reproducible.
The MELISA Test is reproducible, sensitive, specific,
and reliable for detecting metal sensitivity in metal-sensitive
patients.
Keywords: lymphocyte transformation test; MELISA -
Test; mercury; metal allergy; nickel.
Einleitung
Metallallergien werden konventionell im Epikutan-Test
oder ‘‘Patch-Test’’ festgestellt, bei denen die vermutete
allergisierende Substanz auf die Haut aufgebracht und
nach 3–4 Tagen die Entwicklung von Erythemen, Papeln
oder Bläschen an den Applikationsstellen geprüft wird.
Eine positive Hautreaktion kann für eine spezifische
Metallallergie sprechen, allerdings ist der Test nicht in der
Lage, allergische von irritativen Reaktionen zu unterscheiden.
Außerdem hat er eine geringe Sensitivität und
eine schlechte Reproduzierbarkeit. Dazu scheint er nur
für Allergene geeignet zu sein, für die die Haut das Zielorgan
der Sensibilisierung ist. Ferner kann er selbst in
vivo-Sensibilisierungen induzieren und bei bereits sensibilisierten
Personen eine Exazerbation der Symptome
verursachen w1–5x. Eine Alternative ist der Lymphozyten-
Transformations-Test (LTT), bei dem Lymphozyten
(Gedächtniszellen) des betreffenden Patienten zusammen
mit dem zu untersuchenden Allergen 5–6 Tage kultiviert
werden. Die dabei erfolgende Lymphoblastentransformation
wird morphologisch nachgewiesen,
die Messung der Lymphozytenproliferation erfolgt
aufgrund des 3 H-Thymidin-Einbaus. Der ursprünglich
Mitte der sechziger Jahre für die Untersuchung der
Histoinkompatibilität der HLA-Antigene der Klasse II entwickelte
LTT w6, 7x wurde für die HLA Klasse II-Antigentypisierung
modifiziert w8x und auch vielfach zum
Nachweis von Typ IV-Allergien gegen Medikamente,
Metabolite, Krankheitserreger und Metalle verwendet
w9–17x. Der LTT wurde ein Standard-Test zum Nachweis
von Allergien gegen Nickel, Gold, Cobalt, Chrom und Palladium
w1, 18–20x. Der LTT für Beryllium ist inzwischen
der ‘‘Gold-Standard’’ für die Diagnose der Lungen-Berylliose
w21, 22x.
1994 veröffentlichten Stejskal et al. eine Modifikation
des LTT zum Nachweis von Metallsensibilisierungen, den
MELISA -Test (memory lymphocyte immunostimulation
assay) w23x. Durch eine höhere Lymphozytenzahl im Test,
die Wahl einer weder zytotoxischen noch mitogenen
Metallkonzentration, die Depletion von Monozyten aus
der Population der mononukleären Zellen und die Ergänzung
der radiometrischen Ergebnisse durch eine morphologische
Untersuchung konnten Sensitivität und
Spezifität verbessert werden. In den letzten sechs Jahren
wurden weltweit mehrere Laboratorien für die Durchführung
des MELISA -Tests lizenziert und eine Reihe von
wissenschaftlichen Arbeiten, die seine klinische Wertigkeit
zeigen, veröffentlicht w24–26x oder befinden sich in
Vorbereitung w27x.
Das ehemalige Labor Dr. Schiwara & Partner in Bremen
erhielt 1999 die Lizenz für die Durchführung des MELI-
SA -Tests. Um die Kriterien für die Akkreditierung nach
ISO 17025 zu erfüllen, wurde der Test hinsichtlich Sensitivität,
Spezifität, Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit
validiert. In der vorliegenden Studie werden die
Ergebnisse dieser Validierung des MELISA -Tests zum
Nachweis einer Metallsensibilisierung dargestellt.
Material und Methoden
Blutproben
Für alle Untersuchungen, ausgenommen die Bestimmung
der Reproduzierbarkeit, wurde das Blut von 250
konsekutiven Proben verwendet, die im Laufe des Jahres
2001 an das Labor für die routinemäßige Durchführung
des MELISA -Tests geschickt wurden. Die meisten Proben
stammten von Patienten mit klinischem Verdacht auf
eine Typ IV Metall-Allergie.
Für die Untersuchung der Reproduzierbarkeit wurde
Blut eingesetzt, das im Laufe des Jahres 2000 eingeschickt
wurde und aus dem genügend Lymphozyten für
Doppelbestimmungen gewonnen werden konnten. Sie
wurden am selben Tag von ein und derselben oder zwei
verschiedenen technischen Assistenten durchgeführt.
Alle Blutproben wurden mit CPDA-Monovetten (SAR-
STEDT AG & Co., Nümbrecht) oder in ACD Solution A
Vakutainer Röhrchen (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg)
gewonnen, mit der normalen Post oder mit privaten
Kurieren transportiert und trafen im Labor in der Regel
innerhalb von 24 Stunden, maximal 48 Stunden nach der
Blutentnahme ein. Die Lymphozyten wurden unmittelbar
nach dem Eintreffen im Labor isoliert und entweder direkt
für den MELISA -Test verwendet oder über Nacht bei
48C in einem Medium, das 20% gepooltes hitzeinaktiviertes
humanes AB-Serum enthielt (Sigma-Aldrich Chemie
GmbH, Taufkirchen), gelagert und dann für den Test
eingesetzt.
Die einsendenden Ärzte waren hauptsächlich Allgemeinmediziner,
Allergologen und Dermatologen, Umweltmediziner
oder Homöopathen, seltener Zahnärzte oder
Psychiater. Die meisten hatten ihre Praxis in Deutschland,
ein kleiner Teil in Australien, Belgien, England, Frankreich,
Griechenland, Niederlanden, Israel, Italien, Schweden,
Schweiz und USA.

E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: Validierung des MELISA 527
Tabelle 1
MELISA Doppelbestimmungen bei einem Patienten.
Test 1 Test 2
Antigen cpm SI cpm SI
q Kontrolle 421 481 240,0 275 182 136,6
y Kontrolle 1 756 1,0 2 030 1,0
Be 1 1 508 0,9 1 691 0,8
2 1 311 0,8 1 676 0,8
Pb 1 1 394 0,8 1 615 0,8
2 2 339 1,3 1 797 0,9
Cd 1 1 816 1,0 1 492 0,7
2 989 0,6 1 165 0,6
Au 1 1 083 0,6 1 014 0,5
2 1 050 0,6 1 210 0,6
Ni 1 7 580 4,3 6 472 3,3
2 34 544 19,7 23 153 11,4
Pd 1 1 063 0,6 1 443 0,7
2 934 0,5 1 669 0,8
HgCl 1 1 483 0,8 2 413 1,2
2 1 720 1,0 1 958 1,0
HgMe 1 1 340 0,8 1 640 0,8
2 1 360 0,8 1 274 0,6
Ti 1 2 763 1,6 2 489 1,2
2 1 125 0,6 1 804 0,9
Sn 1 1 383 0,8 2 188 1,1
2 1 664 1,0 2 309 1,1
y Kontrolle: cpm Wert ist der Mittelwert von 3 Bestimmungen. 1, 2: zwei Verdünnungen des getesteten Metalls.
MELISA
Der MELISA -Test wurde mit geringen Modifikationen im
Wesentlichen so durchgeführt wie früher beschrieben
w14x. Die Lymphozyten wurden aus antikoaguliertem
(anstelle von defibriniertem) Blut mit Ficoll Histopaque
(Sigma-Aldrich Chemie GmbH) isoliert, zweimal mit
Medium wRPMI-1640, das Hepes (Life Technologies
GmbH, Karlsruhe), 8 mg/l Gentamycin (Sigma-Aldrich
Chemie GmbH) und 6,25 mmol/l L-Glutamin (Biochrom
AG Seromed, Berlin) enthieltx gewaschen, resuspendiert
in 20% gepooltem, hitzeinaktiviertes
Humanserum enthaltendes Medium, bei 378C unter 5%
CO 2 30 Minuten lang in einer Kunstoff-Zellkulturflasche
inkubiert (erste Monozytendepletion) und resuspendiert
in Medium mit 10% gepooltem, hitzeinaktiviertem
Humanserum (10% Medium) auf eine Konzentration von
1=10 6 Lymphozyten/ml. Jeweils 1 ml Zellsuspension
wurde dann in die Vertiefungen einer 24-well (anstelle
einer 48-well) Zellkultur-Platte (Dunn Labortechnik
GmbH, Asbach) pipettiert, die mit Metall-Lösungen in
2–3 Konzentrationen vorbeschichtet war. Die Platten
wurden dann 5 Tage lang bei 378C und 5% CO 2 inkubiert.
Drei Negativkontrollen (nur Lymphozyten in 10% Medium)
und 1 Positivkontrolle wLymphozyten in 10% Medium
plus PWM (Poke Weed Mitogen, Sigma-Aldrich Chemie
GmbH) (anstelle von PPD, gereinigten Proteinderivaten)x
wurden bei jedem Test mitgeführt. Nach 5 Tagen wurden
600 ml der Zellsuspension aus jeder Vertiefung auf eine
neue 24-well-Platte transferriert (zweite Monozytendepletion)
und 4 Stunden lang mit 3 mC Methyl- 3 H-Thymidin,
spezifische Aktivität 185 GBq/mmol (Amersham Buchler
GmbH & Co. KG, Braunschweig) markiert. Die Zellen
wurden auf Filterpapier geerntet (Inotech Cell Harvester,
Wallac Distribution GmbH, Freiburg). Das Filterpapier
wurde in der Mikrowelle (nicht bei Raumtemperatur über
Nacht) getrocknet und die Radioaktivität in einem Flüssigkeitsszintillationszähler
gemessen (1450 Microbeta
Trilux, Wallac Distribution GmbH).
Als positiv wurde ein Stimulations-Index (SI) von G3
definiert. Ein SI zwischen 2 und 3 wurde als ‘‘Sensibilisierung
möglich’’, ein SI -2 als negativ bewertet. Der SI
wird wie folgt berechnet: SIscpm in Test-Vertiefung dividiert
durch den Mittelwert der cpm in den Negativkontroll-Vertiefungen.
Die Zellen der 5-Tage-Kulturen wurden außerdem morphologisch
nach Färbung der Cytospin Präparationen mit
einer Rapid Differential Hematology Staining Färbelösung
(Dade Behring AG, Marburg) untersucht. Nur Tests, die
aufgrund der radiometrischen Messung positiv und bei
denen Lymphoblasten mikroskopisch nachweisbar
waren, sowie umgekehrt radiometrisch negative Tests,
die ausschließlich kleine vitale (weder zytoxischgeschädigte
noch stimulierte) Lymphozyten zeigten, wurden als
valide akzeptiert.
Ergebnisse
Reproduzierbarkeit
Die Reproduzierbarkeit des MELISA -Tests wurde auf
dreierlei Weise untersucht:

528 E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: Validierung des MELISA
Tabelle 2
Interassay Variation des MELISA -Tests.
Antigen Test 1 Test 2 Test 3 Test 4 Test 5
HgCl (SI) 38,0 48,6 38,8 24,4 21,3
q Kontrolle (SI) 30,8 62,0 68,5 47,0 39,8
y Kontrolle (cpm) 2392 2732 1835 2733 2190
y Kontrolle: cpm Wert ist der Mittelwert von 3 Bestimmungen.
Tabelle 3
Wiederholungsuntersuchungen (ns196).
Test 1
q
y
Test 2 q 32 0
y 12 152
Tabelle 4
Positiv (SIG3)
Diskordante Ergebnisse (ns12).
3,0 1,7
3,1 0,6
3,2 1,3
3,4 1,0
3,4 1,5
3,5 2,1
3,7 2,4
3,7 2,8
4,0 2,1
4,3 2,9
4,6 2,8
10,1 1,8
Negativ (SI-3)
Einmal wurde Blut von Patienten in Doppelbestimmung
am selben Tag von zwei verschiedenen technischen
Assistenten getestet. Typische Ergebnisse sind in Tabelle
1für Patient 1, der im Epikutan-Test positiv auf Nickel
reagierte, dargestellt. Während die quantitativen SI-Werte
zwischen den Wiederholungsmessungen gering schwanken,
stimmen die qualitativen Ergebnisse gut überein und
zeigen deutlich die positive Reaktion auf Nickel und eine
negative Reaktion auf alle anderen getesteten Metalle.
Zum anderen wurde das Blut von Patient 2 (Epikutan-
Test stark positiv auf Quecksilber) an 5 verschiedenen
Tagen in zwei- bis vierwöchentlichen Intervallen getestet
(Tabelle 2). Trotz der Variation der aktuellen SI-Werte reagiert
der Patient reproduzierbar positiv auf anorganisches
Quecksilber (SI-Mittelwert: 34,2"11,2) Die Ergebnisse
mit Ethyl-, Methyl- und Phenylquecksilber waren negativ
(SIF1,3, Ergebnisse nicht dargestellt) und sprechen für
die Spezifität der positiven Reaktion auf anorganisches
Quecksilber. Die Hintergrundproliferation (Negativkontrollwert)
blieb konstant (cpm Mittelwerts2376"381).
Ähnliche Befunde wurden bei einem Patienten erhoben,
der im Epikutan-Test postiv auf Nickel reagierte (Ergebnisse
nicht dargestellt).
Schließlich wurden 196 Testungen in Doppelbestimmung
jeweils am selben Tag von derselben oder unterschiedlichen
technischen Assistenten durchgeführt
(Tabelle 3). Die Ergebnisse zeigen eine Konkordanz-Rate
von 94%. Elf der 12 diskordanten Ergebnisse hatten ein
positives Ergebnis mit einem niedrigen SI von F4,6
(Tabelle 4). Die Reproduzierbarkeit betrug also 94% bei
einem Cut-off des SI von G3, oder 99% bei einem Cutoff
von G5.
Die Rolle der Lymphozytenkonzentration
Um den Einfluss der Lymphozytenkonzentration auf die
Ergebnisse des MELISA -Tests zu untersuchen, wurden
serielle Verdünnungen der Lymphozyten von Patient 2
(oben beschrieben) und Patient 3 (Epikutan-Test positiv
auf Nickel) gegen Quecksilber bzw. Nickel getestet
(Tabelle 5). In beiden Fällen fiel die metallspezifische
Reaktivität schnell ab und wurde bei einer Zellkonzentration
von 250 000 Zellen/ml (Quecksilber) und 62 500 Zellen/ml
(Nickel) negativ, während die nicht-spezifische
mitogene Reaktivität in beiden Fällen bis zu einer Zellkonzentration
von 7813 Zellen/ml positiv blieb. Die
Hintergrundproliferation wurde weniger durch die Zellkonzentration
beeinflusst und bewegte sich zwischen
2698 und 964 cpm (Mittelwert: 1048 cpm) für Quecksilber
und zwischen 2823 und 678 cpm (Mittelwert:
1398 cpm) für Nickel (Ergebnisse nicht dargestellt).
Die Rolle der Metallkonzentration
Um die berichtete mitogene Aktivität hoher Konzentrationen
von anorganischem Quecksilber ()0,5 mg/ml) zu
untersuchen, wurden Lymphozyten von 10 randomisierten
Patienten mit seriellen Verdünnungen von HgCl
gestestet (Abbildung 1). HgCl-Konzentrationen von
)0,5 mg/ml induzierten positive Stimulationen bei 8 von
10 Patienten (80%); nur einer dieser Patienten zeigte eine
schwache Antwort (SIs3,2) auf Konzentrationen von
F0,5 mg/ml.
Tabelle 5
Rolle der Lymphozytenkonzentration.
Zellen/ml Hg PWM Ni PWM
(SI) (SI) (SI) (SI)
1 000 000 21,3 39,8 41,1 104,8
500 000 4,4 45,6 26,0 154,3
250 000 0,5 61,5 13,0 98,5
125 000 0,6 11,5 7,3 131,3
62 500 1,0 15,0 2,9 147,2
31 250 1,2 6,3 1,4 50,5
15 625 1,3 5,7 0,8 10,4
7813 1,0 2,3 2,1 1,8
PWMsPoke Weed Mitogen (Positivkontrolle).

E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: Validierung des MELISA 529
Abbildung 1
Reaktivität bei unterschiedlichen HgCl-Konzentrationen. Jede der 10 Säulen repräsentiert einen Patienten
Häufigkeit der Metall-Reaktivitäten
In der untersuchten Patientengruppe (ns250) waren
26% gegen alle getesteten Metalle (bis zu 20) negativ,
36% waren positiv gegen 1 Metall, 15% gegen 2 Metalle,
12% gegen 3 Metalle, 6% gegen 4 Metalle und 5%
gegen 5 oder mehr Metalle (Abbildung 2).
Die häufigsten positiven Metall-Reaktivitäten
Abbildung 2 Häufigkeit positiver Befunde im MELISA gegen
Anzahl verschiedener Metalle bei 250 Patienten.
Die 10 Metalle, auf die die 250 Patienten am häufigsten
reagierten waren Nickel (73%), Titan (42%), Cadmium
(18%), Gold (17%), Palladium (13%), Blei (11%), Beryllium
(9%), anorganisches Quecksilber (9%), Zinn (8%) und
Phenylquecksilber (6%) (Abbildung 3). Positive Reaktionen
mit einer Häufigkeit von -3,6% wurden für Aluminium,
Chrom, Kupfer, Ethylquecksilber (Thiomersal),
Indium, Methylquecksilber, Platin und Silber gefunden.
Keine Reaktivität wiesen Molybdän und Cobalt auf.
Um die Vergleichbarkeit der veröffentlichten Daten zu
erleichtern, wurden die MELISA Reaktivitäten gegen
Titan und Nickel zusätzlich nach ihrer Stärke, nämlich
‘‘schwach reaktiv’’ (SI 3–5), ‘‘reaktiv’’ (SI 5–10) oder
‘‘stark reaktiv’’ (SI)10) analysiert (Tabelle 6). Während ein
Drittel der Titanergebnisse ‘‘schwach reaktiv’’ und nur ein
Fünftel ‘‘stark reaktiv’’ waren, zeigte Nickel umgekehrt ein
Tabelle 6 Verteilung der MELISA -Reaktivitäten gegen Titan
und Nickel bei 250 Patienten.
Abbildung 3 Prozentuale Häufigkeit positiver Ergebnisse im
MELISA der 10 am häufigsten reaktiven Metalle bei 250
Patienten.
SI Bereich Ti Ni
% %
3–5 35,7 20,8
5–10 42,9 28,9
)10 21,4 50,3

530 E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: Validierung des MELISA
Tabelle 7
Nickel-Sensitivität und -Spezifität.
Nickelallergie bestätigt/vermutet SI Geschlecht
q 31,0 F
q 24,4 F
q 21,9 F
q 19,3 F
q 18,2 F
q 18,2 F
q 17,3 F
q 15,4 F
q 13,5 F
q 12,9 F
q 12,9 F
q 9,5 F
q 8,4 F
q 8,2 F
q 8,0 F
y 6,4 M
y 6,3 M
y 5,8 M
y 4,3 M
y 1,9 M
y 1,9 M
y 1,4 F
y 1,2 M
y 1,0 F
y 0,8 F
Fünftel ‘‘schwach reaktive’’ und in der Hälfte der Fälle
‘‘stark reaktive’’ Ergebnisse.
Nickel-Sensitivität und -Spezifität
Fünfzehn Personen mit gesicherter (Epikutan-Test positiv)
oder vermuteter (Hautreaktion auf Schmuck oder
Jeansknöpfe) Nickelallergie und 10 Personen ohne Hinweise
auf eine Nickelallergie wurden im MELISA getestet
(Tabelle 7). Alle 15 Personen mit nachgewiesener
oder vermuteter Nickelallergie waren im MELISA positiv
(SI 8,0–31,0); alle untersuchten Personen waren Frauen.
Von den Personen ohne Hinweise auf eine Nickelallergie
waren 6 negativ (SIF1,9), 4 zeigten eine geringe Reaktivität
(SI 4,3–6,4).
Diskussion
Seit seiner Einführung vor 40 Jahren wurde der LTT für
die Labordiagnostik von T-Zell-Reaktivität sowohl gegen
Medikamente, Metabolite, Krankheitserreger und Metalle
als auch zum Nachweis von antigen-spezifischer zellulärer
Immunreaktivität bei stark immunkomprimierten
Patienten eingesetzt w9–17x. Seine allgemeine Anwendung
und Akzeptanz wurde allerdings durch die begrenzten
und manchmal widersprüchlichen Daten über seine
Zuverlässigkeit behindert w17, 28, 29x. In dieser Studie
evaluieren wir die Reproduzierbarkeit, Sensitivität, Spezifität
und Zuverlässigkeit eines solchen Proliferationstests,
des MELISA -Tests, der zuerst 1994 veröffentlicht
w23x und 1999 in unserem Labor eingeführt wurde. Diese
Evaluierung wurde in Verbindung mit der Akkreditierung
des Labors (ISO 17025) im Jahre 2001 durchgeführt.
Wie bei jedem komplexen biologischen Assay hängt
der MELISA von der systematischen Feinabstimmung
einer Reihe von Faktoren wie Zellkonzentration, Metallkonzentration,
Kulturbedingungen und Zusammensetzung
der Medien ab. Alle diese Faktoren bedingen
erhebliche technische Variationen. Aus diesem Grund ist
der Nachweis einer akzeptablen Intra- und Interassay-
Reproduzierbarkeit wichtig. Die hier veröffentlichten
Daten zeigen eine hohe qualitative Intra- und Interassay-
Übereinstimmung der Ergebnisse und eine Gesamt-
Reproduzierbarkeitsrate von 94% bei einem
Standard-Cut-off von G3,0. Die 6% diskordanten Messergebnisse
weisen mit einer Ausnahme nur schwach
positive Reaktivitäten (SIF4,6) auf. Ein geringer Anteil
von schwach positiven MELISA -Ergebnissen liegt offensichtlich
in einer ‘‘Grauzone’’, die für die meisten labordiagnostischen
Tests nicht ungewöhnlich ist. Falls solche
Ergebnisse klinisch relevant scheinen, sollten sie durch
eine Wiederholungsuntersuchung bestätigt werden.
Wenn ein Cut-off von G5,0 angewandt wird, wie in einigen
MELISA Studien berichtet w24x, liegt die Reproduzierbarkeit
bei 99%. Es ist bemerkenswert, dass es
keine Unterschiede in der Reproduzierbarkeit gibt, wenn
Doppelbestimmungen von ein und derselben oder zwei
verschiedenen technischen Assistenten durchgeführt
werden (eigene Beobachtung). Mroz et al. beobachteten
in 9 von 10 Proben, die aufgeteilt und in zwei verschiedenen
Laboratorien mit dem LTT untersucht worden
waren, eine Übereinstimmung der Reaktivität gegenüber
Beryllium w21x.
Unseres Wissens stellen die Daten unserer Studie im
Vergleich zu bisherigen Veröffentlichungen die umfangreichste
Evaluierung der Reproduzierbarkeit eines LTT
dar.
Die Verwendung einer höheren Zahl an Lymphozyten
im MELISA -Test (1=10 6 Zellen/Test) im Vergleich zu
konventionellen LTTs (100 000 bis 250 000 Zellen/Test)
soll seine Sensitivität erhöhen w23x. Die hier präsentierten
Ergebnisse von seriellen Verdünnungen der Lymphozyten
von quecksilber- und nickel-sensibilisierten Patienten
stützen diese Behauptung. Die antigenspezifische Reaktivität
wird durch die Proliferation eines kleinen Teils der
Gedächtniszellen hervorgerufen und ist daher zwangsläufig
direkt von der Anzahl der untersuchten Lymphozyten
abhängig. Im Gegensatz dazu ist die durch
Mitogene (z.B. PWM) erzeugte polyklonale Proliferation
viel weniger von der Zellzahl abhängig. Mroz et al. berichteten
über eine verbesserte Sensitivität gegen Beryllium
mit einem LTT, der 250 000 Lymphozyten/Test im Vergleich
zu 100 000 Lymphozyten/Test hatte w21x. Verglichen
mit dem MELISA werden LTTs mit -1=10 6 Zellen/
Test eine geringere Sensitivität und daher einen höheren
Anteil an falsch-negativen Ergebnissen zeigen.
Nicht nur die Lymphozytenkonzentration sondern auch

E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: Validierung des MELISA 531
die Metallkonzentration kann die Ergebnisse im Lymphozytentransformationstests
beeinflussen. Frühe LTTs für
Metalle, e.g. anorganisches Quecksilber, zeigten unspezifische
Stimulierungen bei nicht sensibilisierten Patienten
w28, 29x. Später zeigte sich, dass dieser Effekt auf
der Verwendung hoher mitogener Konzentrationen des
anorganischen Quecksilbers von )0,5 mg/ml beruhte
w14x. Die in dieser Studie an 10 Patienten mit einer seriellen
Verdünnung von anorganischem Quecksilber gewonnenen
Ergebnisse bestätigen diese Beobachtung. Nur
bei Konzentrationen von F0,5 mg/ml, wie sie in allen
anderen Tests dieser Studie Standard sind, können positive
Reaktionen als quecksilber-spezifische Sensibilisierungen
bewertet werden. Es wurde berichtet, dass hohe
Nickelkonzentrationen von G10 mg/ml ebenso nichtspezifische
Proliferation induzieren w18x. In unserer Studie
lagen die Nickelkonzentrationen bei F5 mg/ml.
Da alle 250 Patienten unserer Studie auf eine Metallsensibilisierung
verdächtige klinische Symptome aufwiesen,
war es nicht überraschend, dass die Mehrzahl (74%)
positiv gegen eines oder mehrere der bis zu 20 getesteten
Metalle war. In einer Untersuchung von 930 Patienten
in Södertälje (Schweden) waren 62% im MELISA positiv
gegen ein oder mehrere Metalle w24x. Die niedrigere Zahl
mag auf einem höheren Cut-off (SIG5) und weniger getesteten
Metallen (ns15) als in unserer Studie beruhen.
Eine noch niedrigere Zahl (58%) wurde in einer Studie
mit über 5 000 Patienten gefunden, die mit einem modifizierten
MELISA , dem so genannten LTT-CITA , untersucht
worden waren w30x. Diese verminderte Sensitivität
dürfte auf dem Einsatz der geringen Zahl an Lymphozyten
(250 000/Test) und der begrenzten Zahl an getesteten
Metallen (ns10) liegen. Die 26% der Patienten unserer
Studie mit klinischen Symptomen einer Metallallergie,
aber negativer Reaktion gegen alle getesteten Metalle
könnten gegen ein hier nicht untersuchtes Metall sensibilisiert
sein, unter toxischen Effekten einer Metallbelastung
leiden (nicht mit dem MELISA -Test nachweisbar)
oder eine Erkrankung anderer Ätiologie haben.
In allen bisherigen Studien war Nickel das Metall,
gegen das am häufigsten Sensibilisierungen gefunden
wurden, und zwar häufiger bei Frauen als bei Männern
und unabhängig davon, ob der Epikutan-Test oder ein
Lymphozytenproliferationstest verwendet wurde w18,
24–26x. Auch in unserer Studie wies Nickel die höchste
Reaktivitätsrate (73%) auf. Die von drei unabhängigen
Gruppen mitgeteilten Raten, die denselben MELISA -
Test einsetzten, aber einen Cut-off von G5 wählten, variierten,
lagen aber alle niedriger: ca. 22% für München,
ca. 36% für Södertälje und ca. 47% für Uppsala w24x.
Selbst wenn die 20,8% der Nickel-Reaktivitäten unserer
Studie mit einem SI von 3–5 als negativ bewertet wären,
läge die Nickel-Reaktivität mit 57% (statt 73%) immer
noch etwas höher als die für Uppsala berichtete. In dem
weniger empfindlichen LTT-CITA reagierten ungefähr
28% der Patienten positiv auf Nickel w30x.
Für die weitere Analyse der Sensitivität und Spezifität
der Reaktivität gegen Nickel in unserer Studie wurden
Patienten mit und ohne Verdacht auf eine Nickel-Allergie
im MELISA getestet. Während die Sensitivität 100%
betrug, schien die Spezifität niedriger zu sein: vier Personen
ohne Verdacht auf eine Nickel-Allergie zeigten niedrige
Nickel-Reaktivitäten (SI 4,3–6,4). Epikutan-
Test-Ergebnisse waren von diesen Patienten nicht erhältlich.
Eine Wiederholungsuntersuchung des MELISA war
nicht möglich. Der Patient mit dem höchsten SI von 6,4
in dieser Gruppe hatte Diabetes, Psoriasis und Nahrungsmittel-Allergien.
Einerseits könnten diese 4 Patienten
falsch positiv gegen Nickel reagieren, andererseits
könnten sie eine nur geringe asymptomatische Nickel-
Allergie haben. Alle vier waren Männer, die möglicherweise
kaum Schmuck tragen und daher keine
Haut-Sensibilisierung beobachten. Außerdem wurde
über nickel-reaktive T-Zellen bei Personen mit negativem
Epikutan-Test und ohne Kontaktdermatitis bereits berichtet
w31x.
Eine größere Differenz der Reaktivität gegen Titan wurde
in unserer Studie (42%) im Vergleich zu den MELISA
Studien in München (ca. 1,5%), Södertälje (ca. 6%) und
Uppsala (10%) gefunden w24x. Selbst wenn wegen der
besseren Vergleichbarkeit mit den oben erwähnten Studien,
die einen höheren Cut-off verwenden, die Reaktivitäten
im Bereich SI 3–5 (35,7%) eliminiert wurden, war
die Rate positiver Befunde mit 27% noch erheblich
höher. Eine mitogene Titankonzentration scheidet als
Erklärung aus, da erstens über solche Titanwirkungen
niemals berichtet wurde, zweitens in unserer Studie dieselben
Titankonzentrationen getestet wurden wie in den
drei erwähnten Untersuchungen und drittens die Mehrzahl
unserer Patienten (58%) nicht auf Titan reagierte. Die
höhere Rate in unserer Studie könnte auf einer stärkeren
Exposition unserer Patienten im Jahre 2001, z.B. gegen
Titan in Zahnimplantaten, im Vergleich zu denen aus den
Jahren 1996/1997 beruhen w24x. Eine Korrelation mit dem
Epikutan-Test ist nicht möglich, da der Epikutan-Test auf
Titan im Allgemeinen nicht durchgeführt wird. Während
der wahre Umfang der Titan-Sensibilisierung noch
geklärt werden muss, sind die hier mitgeteilten Titan-
Reaktivitäten reproduzierbar, korrelieren (soweit klinische
Daten verfügbar waren) mit einer Titan-Exposition (Kosmetika,
Zahnimplantate, orthopädische Prothesen) und
sind klinisch relevant, d.h. Reduktion der Titanexposition
bewirkt eine Abnahme der Reaktivität bei titan-positiven
Patienten und eine Verbesserung der klinischen Symptome
w27x.
In unserer Studie war die Reaktivität gegen anorganisches
Quecksilber etwas niedriger (8%) im Vergleich zu
München (ca. 14%), Södertälje (ca. 21%) und Uppsala
(ca. 33%) w24x, aber ähnlich wie in der mit dem LTT-CITA
getesteten Gruppe (8%) w30x. Die höhere Rate in den
schwedischen Gruppen könnte auf der bewussten Aufnahme
einer größeren Zahl von Patienten mit positivem
Epikutan-Test gegen Quecksilber und der höheren Rate
von Amalgamträgern (VDM Stejskal, persönliche Mittei-

532 E. Valentine-Thon and H.-W. Schiwara: Validierung des MELISA
lung) beruhen. Kürzlich durchgeführte MELISA -Tests
ergaben bei 29 italienischen Patienten bzw. 42 Schweizer
Patienten 14% bzw. 21% positive Reaktionen gegen
Quecksilber (Valentine-Thon, unveröffentlicht 2002).
Selbstverständlich variiert die Anzahl positiver Reaktionen
gegen Quecksilber in Abhängigkeit von der Exposition
gegen Quecksilber, für die in erster Linie
Amalgamfüllungen verantwortlich sind w32x.
Für die übrigen in unserer Studie getesteten Metalle
wurden vergleichbare Reaktivitäten in den Untersuchungen
von München, Södertälje und Uppsala mit dem
MELISA w24x und ebenso mit dem LTT-CITA gefunden
w30x.
Die Daten dieser Studie bestätigen also die hohe
Reproduzierbarkeit, Sensitvität, Spezifität und Zuverlässigkeit
des MELISA -Tests zum Nachweis von Metall-
Allergien. Der klinische Nutzen dieses LTT wurde in den
Publikationen anderer Autoren hervorgehoben w24–26x.
Weitere eigene Veröffentlichungen sind in Vorbereitung
w27x.
Danksagung
Die Autoren bedanken sich bei Frau Andrea Kleemeyer, Frau
Renate Nehrkorn, Frau Ute Neuelmann und insbesondere bei
Frau Carola Schreiber für ihre ausgezeichnete technische
Assistenz.
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