Handbuch der Nanoanalytik Steiermark 2005 - lamp.tugraz.at

Methoden
M21: Negativkontrastierung
als Diagnostik
(a)
M21: Negativkontrastierung als Diagnostik
Die Wechselwirkung zwischen Elektronen und
biologischem Material ist zu gering, um einen hinreichenden
Kontrast in einer elektronenmikroskopischen
Abbildung zu erzeugen. Der Kontrast kann
jedoch durch eine Färbung mit Schwermetallen,
einer sogenannten Negativfärbung, wesentlich verbessert
werden. Im Elektronenmikroskop erscheint
ein mit Schwermetall umlagertes biologisches Objekt
überall dort hell, wo das biologische Material
sitzt, da dort kein Schwermetall abgelagert werden
kann. Die Umgebung, wo das Schwermetall abgelagert
ist, erscheint dunkel, da dort die Elektronen
stark gestreut werden. Weil nicht das biologische
Material selbst durch eine chemische Reaktion
gefärbt wurde, nennt man dies Negativfärbung.
Dadurch ist das biologische Objekt selbst ausgezeichnet
kontrastiert (s. Abb. 1a, b).
Zur Negativfärbung verwendet man 1–2%ige
Lösungen von Schwermetallsalzen, wie das Natriumsalz
der Phosphorwolframsäure oder Uranylacetat.
Beim Eintrocknen der Schwermetallsalzlösung
sammelt sich diese auf Grund der Kapillarwirkung
um ein biologisches Objekt herum an. In Vertiefungen
des Objekts selbst, auch in sehr kleinen,
bleibt ebenfalls mehr Flüssigkeit liegen. Es ist
deshalb möglich, dünne Objekte wie Viren, große
Proteinmoleküle, filamentöse Strukturen und
raue Membranoberflächen gut sichtbar zu machen
(s. Abb. 2).
Für größere biologische Objekte wie ganze Zellen
ist die Negativfärbung ungeeignet, da das Färbemittel
nur sehr beschränkt eindringen kann, und
diese Objekte bei der Durchstrahlung infolge ihrer
Dicke zu viele Informationen überlagert haben.
Ausführung der Negativfärbung
Das Objekt wird zuerst auf einem Trägerfilm adsorbiert.
Die am häufigsten verwendeten Kollodium-
Kohle-Filme verändern ihre Ladungseigenschaften
im Laufe der Zeit. Die Netzchen (mit Trägerfilm) werden
deshalb vor der Adsorption einer Glimmentladung
ausgesetzt. Dabei wird in einer Vakuumkammer
bei einem Partialdruck von 1 Pascal (0,01 mbar)
zwischen zwei Elektroden in einem Abstand von
(b)
Index Kontakte Institute Lösungen Methoden
Abbildung 1:
Adenoviren und Rotaviren, die häufigste Ursache für Magen-Darmerkrankungen (Gastroenteritis) im
Kindesalter. (a) Adenoviren (60 – 90 nm), (b) Rotaviren (65 –75 nm).
Handbuch der Nanoanalytik Steiermark 2005
55