3-Seminar-Enzyme - wilmnet.de
3-Seminar-Enzyme - wilmnet.de
3-Seminar-Enzyme - wilmnet.de
Erfolgreiche ePaper selbst erstellen
Machen Sie aus Ihren PDF Publikationen ein blätterbares Flipbook mit unserer einzigartigen Google optimierten e-Paper Software.
3. Biochemie <strong>Seminar</strong><br />
Einteilung <strong>de</strong>r <strong>Enzyme</strong> bzgl. Funktion unter Berücksichtigung <strong>de</strong>r Coenzyme:<br />
Allgemeine Definitionen:<br />
- <strong>Enzyme</strong>:<br />
o biologische Katalysatoren, d.h. können eine Reaktion unter z.B. mil<strong>de</strong>n<br />
Temperaturen und neutralem pH-Wert ermöglichen<br />
o haben im Vergleich mit chemischen Katalysatoren:<br />
höhere Reaktionsgeschwindigkeiten<br />
größere Spezifität<br />
o meistens Proteine, Ausnahme: Ribozyme (kleine RNA-Moleküle)<br />
o beeinflussen nicht das Reaktionsgleichgewicht<br />
o beschleunigen Reaktionen um 10 8 - 10 20<br />
o setzen Aktivierungsenergie herab<br />
o das aktive Zentrum:<br />
<strong>de</strong>r Bereich <strong>de</strong>s Enzyms an <strong>de</strong>m die Bindung <strong>de</strong>s zu katalysieren<strong>de</strong>n<br />
Substrates stattfin<strong>de</strong>t<br />
- Coenzyme und Cofaktoren:<br />
o nie<strong>de</strong>rmolekulare nichtproteinartige Substanzen<br />
o sie wer<strong>de</strong>n vorübergehend o<strong>de</strong>r dauerhaft an das aktive Zentrum <strong>de</strong>s Enzyms<br />
gebun<strong>de</strong>n<br />
o somit wird eine bessere Substratspezifität ermöglicht und somit die<br />
Umwandlung zum Reaktionsprodukt beschleunigt<br />
o Bsp.: Metallionen sind typische Cofaktoren<br />
o Beispiele für Coenzyme fin<strong>de</strong>n sich im Anhang bzw. in <strong>de</strong>n Vorlesungsfolien.<br />
- Apoenzym: <strong>Enzyme</strong> ohne entsprechen<strong>de</strong> Coenzyme<br />
- Holoenzyme: <strong>Enzyme</strong> und Coenzyme zusammen<br />
- Isoenzyme: katalysieren die gleiche Reaktion sind aber strukturell unterschiedlich<br />
- prosthetische Gruppe: Apoenzym und Coenzym sind covalent (=dauerhaft) gebun<strong>de</strong>n<br />
- Cosubstrate: Coenzyme, die bei <strong>de</strong>r Katalyse strukturell verän<strong>de</strong>rt wer<strong>de</strong>n und in<br />
modifizierter Form freigesetzt wer<strong>de</strong>n<br />
- Anmerkung:<br />
o Viele Coenzyme leiten sich von Vitaminen ab und können somit im Körper<br />
nicht synthetisiert wer<strong>de</strong>n<br />
o Coenzyme, die selbst hergestellt wer<strong>de</strong>n können, leiten sich meistens von<br />
Purin- o<strong>de</strong>r Pyrimidinnucleoti<strong>de</strong>n ab<br />
Substratspezifität:<br />
- <strong>Enzyme</strong> weisen Substratbindungsstellen auf („aktive Zentren“)<br />
o Geometrische Komplementarität Formen ergänzen sich<br />
o Elektronische Komplementarität Interaktion über nicht-kovalente<br />
Bindungen<br />
Van-<strong>de</strong>r-Waals-Kräfte<br />
Hydrophobe Wechselwirkungen<br />
Elektrostatische Kräfte<br />
Wasserstoffbrückenbindungen<br />
- Bindung erfolgt entwe<strong>de</strong>r nach <strong>de</strong>m Schlüssel-Schloß-Prinzip o<strong>de</strong>r die Bindungsstelle<br />
bil<strong>de</strong>t sich erst bei Anwesenheit <strong>de</strong>s <strong>Enzyme</strong>s aus („induced fit“)<br />
- Stereospezifität ist gegeben, d.h. das Enzym unterschei<strong>de</strong>t zwischen chiralen Proteinen<br />
- geometrische Spezifität:<br />
1 von 11
o Spaltung an bestimmten Amminosäuren<br />
o Spaltung bestimmter Bindungstypen<br />
o Katalyse an bestimmten Gruppen<br />
Enzymnomenklatur:<br />
- früher:<br />
o umgesetztes Substrat plus –ase Enzymname<br />
- heute:<br />
o häufig Verwendung <strong>de</strong>r Trivialnamen nach <strong>de</strong>m o.g. Muster<br />
o gemäß internationaler Nomenklatur (am Beispiel <strong>de</strong>r Hexokinase):<br />
1. Namensteil ist das Substrat (ATP)<br />
2. Namensteil spezifiziert <strong>de</strong>n Typ <strong>de</strong>r katalysierten Reaktion (D-<br />
Hexose-6-Phosphotransfer)<br />
3. Namensteil ist die Endung –ase<br />
somit ist <strong>de</strong>r systematische Name <strong>de</strong>r Hexokinase: ATP: D-6-Hexose-6-<br />
Phosphotransferase<br />
o je<strong>de</strong>s Enzym erhält eine <strong>Enzyme</strong>Commission-Nummer aus 4 Ziffern<br />
die erste Ziffer ist einer <strong>de</strong>r Hauptgruppe zuzuordnen<br />
die zweite und dritte beziehen sich auf chemische Einzelheiten<br />
die vierte Ziffer ist durchlaufend<br />
o Hauptgruppen:<br />
1. Hauptgruppe: Oxidoreduktasen<br />
• katalysieren Redoxreaktionen<br />
2. Hauptgruppe: Transferasen<br />
• katalysieren <strong>de</strong>n Transport einer funktionellen Gruppe zwischen<br />
zwei Substraten<br />
3. Hauptgruppe Hydrolasen<br />
• katalysieren die hydrolytische Spaltung covalenter Bindungen<br />
4. Hauptgruppe: Lyasen<br />
• katalysieren die nicht-hydrolytische (und nicht-oxidative)<br />
Spaltung bzw. Ausbildung von covalenten Bindungen<br />
5. Hauptgruppe: Isomerasen<br />
• katalysieren die Umwandlung isomerer Formen von Substraten<br />
ineinan<strong>de</strong>r<br />
6. Hauptgruppe: Ligasen<br />
• katalysieren die Knüpfung covalenter Bindungen<br />
Grafik siehe Anhang bzw. Vorlesungsfolien<br />
Mechanismen <strong>de</strong>r Enzymkatalyse:<br />
- <strong>Enzyme</strong> nutzen verschie<strong>de</strong>ne Katalysestrukturen.<br />
- es wer<strong>de</strong>n drei grundsätzliche Prinzipien unterschie<strong>de</strong>n<br />
o allgemeine Säure-Basen-Katalyse<br />
ein Proton wird im Übergangszustand <strong>de</strong>r Reaktion übertragen<br />
eine funktionelle Gruppe im aktiven Zentrum wirkt als Protonendonor<br />
o<strong>de</strong>r –akzeptor<br />
beson<strong>de</strong>re Be<strong>de</strong>utung hat Histidin<br />
• es kann bei physiologischem pH sowohl als Broensted-Säure<br />
(protonierte Form) als auch als Broensted-Base (<strong>de</strong>protonierte<br />
Form) vorliegen<br />
2 von 11
o covalente Katalyse<br />
Voraussetzung ist das Vorkommen von nucleophilen (negativ<br />
gela<strong>de</strong>nen) reaktiven Gruppen im aktiven Zentrum, die mit<br />
elektrophilen (positiv gela<strong>de</strong>nen) Gruppen <strong>de</strong>r Substrate<br />
vorrübergehend covalente Bindungen eingehen können<br />
es entsteht somit übergangsweise ein covalent gebun<strong>de</strong>nes Intermediat,<br />
welches beson<strong>de</strong>rs reaktionsfähig ist und schnell unter Bildung <strong>de</strong>s<br />
Produktes umgesetzt wird<br />
o Metallionen-vermittelte Katalyse<br />
Metallionen sind Cofaktoren vieler <strong>Enzyme</strong>, da sie<br />
• eine optimale Substratkonformation erzielen (durch die Bildung<br />
eines Metallion-Substrat-Komplexes)<br />
• durch reversible Än<strong>de</strong>rungen ihres Oxidationszustan<strong>de</strong>s an<br />
Redoxreaktionen teilnehmen können<br />
• Ladungen stabilisieren und die Reaktionsfähigkeit durch<br />
Polarisierung erhöhen können<br />
o man kann die Katalysemechanismen auch kombinieren<br />
• Bsp.: Serinproteasen (Hemmung durch α 1 -Antitrypsin)<br />
o Kombination von allgemeiner Säure-Basen-Katalyse und<br />
covalenter Katalyse<br />
Kinetik enzymatischer Reaktionen und Einfluss von Inhibitoren:<br />
Funktionsweise <strong>de</strong>r <strong>Enzyme</strong>:<br />
- eine enzymatische Reaktion erfolgt nach folgen<strong>de</strong>m Muster:<br />
o E + S ES EP E + P (Gleichung 1)<br />
o das Substrat bin<strong>de</strong>t an das Enzym und bil<strong>de</strong>t einen Enzym-Substrat-Komplex<br />
o im zweiten Schritt erfolgt die katalytische Reaktion, wie oben beschrieben<br />
o anschließend trennt sich <strong>de</strong>r entstan<strong>de</strong>ne Enzym-Produkt-Komplex in das<br />
unverän<strong>de</strong>rte Enzym und das Produkt auf<br />
Kinetik (allgemein):<br />
- Reaktionsgeschwindigkeit:<br />
o <strong>de</strong>finiert als Än<strong>de</strong>rung einer Konzentration pro Zeiteinheit<br />
mol / l*s = Stoffumsatz pro Sekun<strong>de</strong><br />
abhängig von Temperatur und Anfangskonzentration <strong>de</strong>s Eduktes / <strong>de</strong>r<br />
Edukte<br />
k ist die temperaturabhängige Geschwindigkeitskonstante<br />
- die Reaktionsordnung:<br />
o Reaktion 1. Ordnung<br />
Stoff A reagiert zu Stoff B<br />
d.h. die Geschwindigkeit ist proportional zur Konzentration eines<br />
Eduktes<br />
v = k * [A]<br />
o Reaktion 2. Ordnung<br />
Stoff A und Stoff B reagieren zu Stoff C<br />
d.h. die Geschwindigkeit ist proportional zur Konzentration von zwei<br />
Edukten<br />
v = k * [A] * [B]<br />
o Reaktion pseudo-erster Ordnung<br />
3 von 11
Stoff A und Stoff B reagieren zu Stoff C, aber Stoff A liegt immer in<br />
unverän<strong>de</strong>rter Konzentration vor<br />
d.h. die Geschwindigkeit ist zwar proportional von zwei Edukten,<br />
allerdings liegt eines immer in <strong>de</strong>rselben Konzentration vor ist somit zu<br />
vernachlässigen<br />
z.B. könnte Stoff A Wasser bei biochemischen Reaktionen sein (immer<br />
55 mol/l)<br />
Enzymkinetik:<br />
- wichtige Begriffe:<br />
o Maximalgeschwindigkeit einer Reaktion (V max )<br />
o Michaelis-Menten-Konstante (K M )<br />
- „Die Geschwindigkeit einer enzymkatalysierten Reaktion wird bestimmt durch die<br />
Substrat- und Enzymkonzentration!“<br />
- wenn man obige Gleichung 1 betrachtet, dann sind zwei Dinge wichtig:<br />
o Die Rückreaktion von E + P kann man vernachlässigen, da das Enzym eine<br />
sehr geringe Affinität zum Endprodukt hat.<br />
o Zwischen E + S und ES wird sich ein Gleichgewicht einstellen.<br />
o Unter <strong>de</strong>n o.g. Voraussetzungen ist <strong>de</strong>r geschwindigkeitsbestimmen<strong>de</strong> Schritt<br />
die Reaktion von ES nach E und P. Dieser Reaktion sei die<br />
Geschwindigkeitskonstante k 2 zugeordnet.<br />
o somit gilt: v = k 2 * [ES]<br />
wie oben erwähnt gibt k 2 <strong>de</strong>n Prozentsatz an ES an, <strong>de</strong>r innerhalb einer<br />
Sekun<strong>de</strong> in E und P zerfällt<br />
o zusammenfassend ergibt sich also, dass die Reaktionsgeschwindigkeit<br />
abhängig ist von <strong>de</strong>r Enzym-Substrat-Konzentration<br />
man kann die Geschwindigkeit durch Erhöhung von [S] solange<br />
steigert, bis [E] gesättigt ist, dann liegt die Maximalgeschwindigkeit<br />
vor<br />
somit hängt die Maximalgeschwindigkeit von <strong>de</strong>r Enzymkonzentration<br />
ab, die als limitieren<strong>de</strong>r Faktor<br />
gilt<br />
es ergibt sich eine Hyperbel<br />
- Michaelis-Menten-Konstante (K M )<br />
o das ist genau diejenige [S] bei <strong>de</strong>r genau<br />
die Hälfte von [E] bela<strong>de</strong>n ist<br />
o somit beträgt die<br />
Reaktionsgeschwindigkeit v max / 2 <br />
genau die Hälfte max. Geschwindigkeit<br />
o da es sich um eine bestimmte Substratkonzentration han<strong>de</strong>lt, hat sie die Einheit<br />
mol / l<br />
o K M ist somit ein Maß für die Affinität eines Enzyms zu einem Substrat<br />
je kleiner K M umso schneller ist die Hälfte <strong>de</strong>r <strong>Enzyme</strong> mit Substrat<br />
bela<strong>de</strong>n umso schneller ist die Reaktion<br />
je größer K M umso größere Mengen an Substrat sind erfor<strong>de</strong>rlich umso<br />
langsamer ist die Reaktion<br />
o Berechnung von K M (genaue Herleitung siehe Anhang):<br />
k -1 : Geschwindigkeitskonstante für die Reaktion [ES] nach [E] und [S]<br />
k 1 : Geschwindigkeitskonstante für die Reaktion [E] und [S] nach [ES]<br />
k 2 : Geschwindigkeitskonstante für die Reaktion von [ES] nach [E] und<br />
[P]<br />
4 von 11
geht man davon aus, dass folgen<strong>de</strong> Reaktion im Gleichgewicht ist:<br />
• [E] + [S] nach [ES] nach [E] + [P]<br />
dann ist die Affinität umso höher je mehr [ES] vorliegt<br />
somit kann die Affinität aus <strong>de</strong>m Verhältnis <strong>de</strong>r<br />
Geschwindigkeitskonstanten berechnet wer<strong>de</strong>n:<br />
• K M = (k -1 + k 2 ) / k 1<br />
Wichtig: Die Michaelis-Menten-Konstante ist von <strong>de</strong>n Enzymmengen<br />
völlig unabhängig, da sich durch eine Än<strong>de</strong>rung <strong>de</strong>r Menge keine<br />
Än<strong>de</strong>rung <strong>de</strong>r Geschwindigkeitskostanten ergibt!<br />
- Michaelis-Menten-Gleichung (genaue Herleitung siehe Anhang)<br />
o sind V max und K M -Wert bekannt, kann man für je<strong>de</strong> Substratkonzentration die<br />
Reaktionsgeschwindigkeit v berechnen<br />
Michaelis-Menten-Gleichung<br />
• v = (V max * [S]) / (K M + [S])<br />
bessere Schreibweise:<br />
• v = V max * ([S]) / (K M + [S])<br />
hieraus lässt sich folgen<strong>de</strong>s ableiten:<br />
• wenn [S] sehr groß ist, dann kann man K M vernachlässigen, d.h.<br />
das die Geschwindigkeit mit ansteigen<strong>de</strong>r Substratmenge<br />
zunimmt<br />
• wenn [S] gleich K M ist, dann gilt 1 / 1+1 ½ d.h. die<br />
Geschwindigkeit entspricht <strong>de</strong>r halben<br />
Maximalgeschwindigkeit<br />
• Wenn [S] sehr klein ist (0,01µM) und K M sei 1µM, dann kann<br />
man [S] im Nenner vernachlässigen, d.h. bei sehr niedrigen<br />
Substratkonzentrationen ist die Reaktionsgeschwindigkeit<br />
nahezu linear. Damit ist die Zunahme <strong>de</strong>r<br />
Reaktionsgeschwindigkeit proportional zur<br />
Substratkonzentration und es liegt eine Reaktion erster Ordnung<br />
vor.<br />
„Die Michaelis-Menten-Gleichung beschreibt näherungsweise das<br />
kinetische Verhalten vieler <strong>Enzyme</strong>!“<br />
- Lineweaver-Burk-Diagramm<br />
o es ist von beson<strong>de</strong>ren Interesse V max sehr genau zu bestimmen<br />
o zusätzlich wird V max benötigt, damit man K M bestimmen kann<br />
o eine Ablesung aus <strong>de</strong>m Michaelis-Menten-Diagramm<br />
ist schwierig, da sehr hohe Substratkonfigurationen<br />
erfor<strong>de</strong>rliche wären (was experimentell schwierig ist)<br />
o bei Lineweaver-Burk wird <strong>de</strong>r reziproke Wert <strong>de</strong>r<br />
Umsatzgeschwindigkeit (1/v) gegen <strong>de</strong>n reziproken<br />
Wert <strong>de</strong>r Substratkonzentration (1/[S]) aufgetragen<br />
o man erhält dadurch eine lineare Darstellung, wobei <strong>de</strong>r<br />
Schnittpunkt dieser Gera<strong>de</strong>n mit <strong>de</strong>r Abszisse bei -<br />
1/K M und <strong>de</strong>r Schnittpunkt mit <strong>de</strong>r Ordinate bei<br />
1/V max<br />
- katalytische Aktivität<br />
o offizielle Einheit Katal<br />
o 1 kat = 1 Mol Substratumsatz pro Sekun<strong>de</strong><br />
o in <strong>de</strong>r Praxis selten benutzt<br />
o zur Bestimmung braucht man V max und K M<br />
5 von 11
- Wechselzahl k kat<br />
o Definition: Anzahl <strong>de</strong>r pro Mol Enzym in einer Zeiteinheit umgesetzten Mole<br />
Substrat<br />
o entspricht bei einfachen Enzymreaktion k 2<br />
o bei komplexen Reaktionen ist damit <strong>de</strong>r Reaktionsschritt gemeint, <strong>de</strong>r am<br />
langsamsten abläuft und somit limitierend ist<br />
- Enzymhemmung<br />
o Verbindung, <strong>de</strong>ren Anwesenheit die katalytische Aktivität eines Enzyms<br />
verän<strong>de</strong>rt, sind <strong>Enzyme</strong>ffektoren.<br />
o wirken sie positiv, wer<strong>de</strong>n sie als Aktivatoren bezeichnet<br />
o wirken sie negativ, wer<strong>de</strong>n sie als Hemmstoffe o<strong>de</strong>r Enzyminhibitoren<br />
bezeichnet<br />
o es wer<strong>de</strong>n zwei Arten <strong>de</strong>n Enzymhemmung unterschie<strong>de</strong>n<br />
reversible Hemmung<br />
• diese Art <strong>de</strong>r Hemmung ist durch die Dissoziation <strong>de</strong>s Enzym-<br />
Hemm-Komplexes gekennzeichnet und kann somit durch<br />
Entfernung <strong>de</strong>s Inhibitors aufgehoben wer<strong>de</strong>n<br />
irreversible Hemmung<br />
• das Enzym und <strong>de</strong>r Inhibitor können nicht mehr getrennt wer<strong>de</strong>n<br />
und das Enzym ist dauerhaft gehemmt<br />
o reversible kompetitive Hemmung<br />
„Reversible kompetitive Inhibitoren haben keinen Einfluss auf die<br />
Maximalgeschwindigkeit!“<br />
wenn ein Inhibitor in seiner chemischen Struktur <strong>de</strong>m Substrat ähnelt<br />
und <strong>de</strong>r Hemmstoff reversibel mit <strong>de</strong>m Enzym bin<strong>de</strong>t, dann<br />
konkurrieren Inhibitor und Substrat um die Bindungsstelle am Enzym<br />
erhöht man die Konzentration <strong>de</strong>s Substrates bei gleichbleiben<strong>de</strong>r<br />
Konzentration <strong>de</strong>s Hemmstoffes, dann steigt die Wahrscheinlichkeit<br />
<strong>de</strong>r Bindung <strong>de</strong>s Substrates und somit <strong>de</strong>r Entstehung von [ES]<br />
d.h. wenn man [S] maximal erhöht, dann kann man die<br />
Maximalgeschwindigkeit immer erreichen<br />
K M nimmt jedoch zu<br />
Beispiel:<br />
• eine Methanolvergiftung kann durch Ethanol Zugabe therapiert<br />
wer<strong>de</strong>n<br />
• Produkthemmung<br />
• weitere Beispiele siehe Vorlesungsfolien<br />
o reversible nicht-kompetitive Hemmung<br />
„Durch reversible nichtkompetitive Hemmung wird die<br />
Maximalgeschwindigkeit beeinflusst!“<br />
Inhibitor und Substrat konkurrieren nicht um dieselbe Bindungsstelle<br />
<strong>de</strong>r Inhibitor bin<strong>de</strong>t an einer Stelle <strong>de</strong>s Enzyms und macht es somit<br />
unwirksam<br />
gleichwohl kann das Substrat weiterhin an das Enzym bin<strong>de</strong>t, es fin<strong>de</strong>t<br />
allerdings keine Umwandlung in das Produkt mehr statt<br />
<strong>de</strong>r K M -Wert wird nicht beeinflusst, sehr wohl aber die tatsächlich<br />
katalytisch aktive Enzymmenge<br />
durch eine Substraterhöhung kann man keine<br />
Geschwindigkeitserhöhung erreichen<br />
6 von 11
o reversible unkompetitive Hemmung<br />
„Reversible unkompetitive Hemmung erniedrigt V max und K M !“<br />
<strong>de</strong>r Inhibitor bin<strong>de</strong>t nur an Enzym-Substrat-Komplexe und reagiert<br />
nicht mit <strong>de</strong>m freien Enzym<br />
somit wird die Hemmung bei [S] ebenfalls erhöht<br />
o irreversible Hemmung mit Übergangszustandsanaloga<br />
beson<strong>de</strong>rs wirksame Gruppe von Enzyminhibitoren<br />
haben eine strukturelle Ähnlichkeit mit <strong>de</strong>n Übergangszustän<strong>de</strong>n <strong>de</strong>r<br />
Substrate von Enzymreaktionen<br />
bin<strong>de</strong>n <strong>de</strong>utlich fester an das aktive Zentrum<br />
o irreversible Hemmung über Suizidsubstrate<br />
die Suizidsubstrate bin<strong>de</strong>n am Enzym, infolge <strong>de</strong>r Umsetzung<br />
verän<strong>de</strong>rn sie sich so, dass sie dauerhaft am Enzym gebun<strong>de</strong>n bleiben,<br />
somit wird das Enzym inhibiert<br />
Physiologische Regulation von Enzymaktivitäten:<br />
Einfluss von Temperatur, pH-Wert und Oxidationsmitteln<br />
- Die Enzymaktivität ist anhängig von <strong>de</strong>r Temperatur.<br />
o je höher die Temperatur, umso aktiver ist ein Enzym.<br />
o Die Konstante Q 10 gibt an, wie sich ein Enzym bei einer Temperaturerhöhung<br />
um 10°C verhält, i.d.R. ist Q 10 = 2 (doppelt so schnelle Enzymaktivität)<br />
o Es gibt allerdings ein Temperaturoptimum, <strong>de</strong>nn bei zu starker Erhöhung<br />
fangen die Enzymproteine an zu Denaturieren.<br />
- Die Enzymaktivität ist anhängig vom pH-Wert.<br />
o Viele <strong>Enzyme</strong> zeigen ein pH-Optimum.<br />
o Erklärung hierfür ist<br />
die reversible Dissoziation bzw. Ionisierung funktioneller Gruppen<br />
reversible Dissoziation bzw. Ionisierung von Substraten und/o<strong>de</strong>r<br />
Coenzymen<br />
Denaturierung <strong>de</strong>s Enzymproteins<br />
- Die Enzymaktivität kann durch Oxidationsmittel beeinflusst wer<strong>de</strong>n.<br />
o bei vielen intrazellulären <strong>Enzyme</strong>n nehmen Sulfhydrylgruppen am<br />
Katalyseprozess teil, diese können zu Disulfidbrücken oxidiert wer<strong>de</strong>n, d.h. es<br />
kann dadurch zur Konformitätsän<strong>de</strong>rung und somit zum kompletten Verlust<br />
<strong>de</strong>r Enzymaktivität kommen<br />
Regulation <strong>de</strong>r Enzymaktivität<br />
- Langzeitregulation kann über Induktion und Repression erfolgen<br />
o Induktion meint die Transkription von bestimmten Gensequenzen, die das<br />
Enzym enthalten<br />
o Repression meint Einschränkung <strong>de</strong>r Transkription<br />
- Än<strong>de</strong>rung <strong>de</strong>r Substratkonzentration<br />
o wie bereits in <strong>de</strong>r Enzymkinetik erwähnt, hat die Än<strong>de</strong>rung von [S] einen<br />
massiven Einfluss, da [S] in vivo meist unter K M liegt<br />
- Einfluss von <strong>Enzyme</strong>ffektoren<br />
o „Die Aktivität vieler <strong>Enzyme</strong> wird wirksam und schnell durch allosterische<br />
Effektoren reguliert!“<br />
7 von 11
solche Regulationsmechanismen fin<strong>de</strong>n sich häufig am Anfang von<br />
Stoffwechselwegen bzw. an Verzweigungspunkten <strong>de</strong>s<br />
Zellstoffwechsels<br />
enzymatische Aktivität kann durch Inhibitoren und Aktivatoren in einer<br />
reversiblen Weise beeinflusst wer<strong>de</strong>n<br />
Kooperativität bezeichnet die strukturelle und funktionelle<br />
Kommunikation zwischen Substrat- und Effektorbindungsstelle eines<br />
allosterischen Enzyms.<br />
diese kann entwe<strong>de</strong>r positiv o<strong>de</strong>r negativ sein<br />
• positiv be<strong>de</strong>utet, dass die Bindung <strong>de</strong>s Substrates o<strong>de</strong>r <strong>de</strong>s<br />
Effektors die Aktivität steigern<br />
• negativ be<strong>de</strong>utet, dass die Bindung <strong>de</strong>s Substrates o<strong>de</strong>r <strong>de</strong>s<br />
Effektors die Aktivität hemmt<br />
homotrope Kooperativität be<strong>de</strong>utet, dass <strong>de</strong>r Effekt durch das Substrat<br />
selbst ausgelöst wird<br />
heterotrope Kooperativität be<strong>de</strong>utet, dass <strong>de</strong>r Effekt und das Substrat<br />
unterschiedliche Moleküle sind<br />
Beispiel<br />
• Phosphofructokinase-1 <strong>de</strong>r Glykolyse zeigt eine sigmoidale<br />
Abhängigkeit <strong>de</strong>r Enzymaktivität, somit liegt eine positive<br />
homotrope Kooperativität vor<br />
o man unterschei<strong>de</strong>t einen V-Typ (o<strong>de</strong>r System) und einen K-Typ (o<strong>de</strong>r System)<br />
V-Typ<br />
• nur die Maximalgeschwindigkeit wird beeinflusst<br />
• Bsp.: Pyruvatcarboxylase wird die aktivierte Essigsäure (Acetyl-<br />
CoA) aktiviert<br />
K-Typ<br />
• die Michaelis-Menten-Konstante wird verän<strong>de</strong>rt<br />
• Bsp.: Phosphofructokinase-1<br />
Beispielgrafiken für die Erklärung fin<strong>de</strong>n sich im Anhang bzw. in <strong>de</strong>n<br />
Vorlesungsfolien<br />
- Covalente Modifikation eines Enzymproteins<br />
o „Schlüsselenzyme <strong>de</strong>s Zellstoffwechsels wer<strong>de</strong>n häufig durch kovalente<br />
Modifikationen reguliert!“<br />
o Möglichkeit <strong>de</strong>r Regulation <strong>de</strong>r Enzymaktivität, die auf einer physiologisch<br />
reversiblen covalenten Anheftung bestimmter funktioneller Gruppen o<strong>de</strong>r <strong>de</strong>r<br />
irreversiblen proteolytischen Verän<strong>de</strong>rung eines Enzymproteins beruht.<br />
o <strong>Enzyme</strong>, die sich durch <strong>de</strong>n Besitz o<strong>de</strong>r Nichtbesitz einer funktionellen Gruppe<br />
voneinan<strong>de</strong>r unterschei<strong>de</strong>n, bezeichnet man als interkonvertierbare <strong>Enzyme</strong>.<br />
o am häufigsten wer<strong>de</strong>n <strong>Enzyme</strong> phosphoryliert o<strong>de</strong>r <strong>de</strong>phosphoryliert<br />
o folgen<strong>de</strong> Gruppen können noch angehängt o<strong>de</strong>r abgespalten wer<strong>de</strong>n<br />
AMP<br />
UMP<br />
A<strong>de</strong>nosindiphosphatribose<br />
Methyl<br />
Acetyl<br />
Sulfat<br />
Myristyl<br />
Farnesyl<br />
8 von 11
o zu <strong>de</strong>n wichtigsten <strong>Enzyme</strong>, die durch proteolytische Spaltung aktiviert<br />
wer<strong>de</strong>n, gehören Zymogene (Verdauungsenzyme)<br />
Bsp.: Trypsinogen wird mittels Enterokinase/Enteropeptidase in<br />
Trypsin umgewan<strong>de</strong>lt<br />
- für weitere Beispiele siehe Vorlesungsfolien<br />
Enzymaktivitätsbestimmungen und Enzymdiagnostik:<br />
Enzymaktivität<br />
- Enzymmengen wer<strong>de</strong>n über ihre Aktivität bestimmt<br />
- Einheit: katal = mol/s (wie viel Substrat wird pro Zeit umgesetzt)<br />
- Internationale Einheit: IU = µmol/min<br />
- Umrechnung:<br />
o 1 nanokatal = 0,06 IU<br />
o 1 IU = 16,67 nanokatal<br />
- Wechselzahl:<br />
o Menge eines Substrats (mol) die in einer bestimmten Zeiteinheit (s) von einer<br />
bestimmten Enzymmenge (mol) umgesetzt wird<br />
o Einheit 1/s<br />
- Volumenaktivität:<br />
o <strong>Enzyme</strong>inheiten bezogen auf Volumen<br />
o Einheit: nanokatal/l o<strong>de</strong>r IU/l<br />
- spezifische Ativität:<br />
o Enzymaktivität bezogen auf bestimmte Menge Protein<br />
o Einheit: nkat/mg o<strong>de</strong>r IU/mg<br />
Optischer Test, direkt, indirekt, gekoppelt<br />
- einfacher optisch-enzymatischer Test:<br />
o Bestimmung <strong>de</strong>r Enzymaktivität über Coenzyme (NAD + /NADP + )<br />
o NAD + /NADP + haben ihr optisches Absorbtionsmaxium bei 340nm<br />
o wer<strong>de</strong>n die Coenzyme oxidiert, nimmt die Absorbtionsfähigkeit ab<br />
o die Än<strong>de</strong>rung <strong>de</strong>r Absorption bei 340nm wird gemessen<br />
o Lambert-Beer’sches Gesetz:<br />
E = ε c d<br />
E = Extinktion<br />
ε = molarer Extinktionskoeffizient (gibt die Extinktion für einen<br />
bestimmten Stoff bei einer <strong>de</strong>finierten Wellenlänge durch eine 1molare<br />
Lösung bei einer Schichtdicke von 1cm an)<br />
c = Konzentration<br />
d = Schichtdicke<br />
zur Errechnung <strong>de</strong>r Menge <strong>de</strong>s umgesetzten Substrates<br />
- zusammengesetzter optisch-enzymatischer Test:<br />
o Bestimmung von Enzymaktivitäten, die kein NAD + /NADP + als Coenzym<br />
benutzen<br />
o es wird eine nachgeschaltete Indikatorreaktion genutzt um die Aktivität <strong>de</strong>r<br />
vorhergehen<strong>de</strong>n Reaktion zu bestimmen<br />
o Substrate <strong>de</strong>r ersten Reaktion sowie Cosubstrate und Enzym <strong>de</strong>r zweiten<br />
Reaktion müssen im Überschuss vorhan<strong>de</strong>n sein.<br />
9 von 11
o Die Geschwindigkeit <strong>de</strong>r Indikatorreaktion hängt also von <strong>de</strong>r Menge <strong>de</strong>r<br />
Produkte <strong>de</strong>r ersten Reaktion ab und somit von <strong>de</strong>r Enzymaktivität <strong>de</strong>r ersten<br />
Reaktion.<br />
o die Geschwindigkeit <strong>de</strong>r Indikatorreaktion kann dann nach <strong>de</strong>m<br />
vorhergehen<strong>de</strong>n Prinzip gemessen wer<strong>de</strong>n<br />
ELISA (enyzme-linked immunosorbend assay)<br />
<strong>Enzyme</strong> als Signlverstärker (Western Blot, Immunhistochemie)<br />
Krankhafte Verän<strong>de</strong>rung von <strong>Enzyme</strong>n<br />
- Enzymaktivität im Blut<br />
o es wer<strong>de</strong>n drei Gruppen unterschie<strong>de</strong>n<br />
a) plasmaspezifische <strong>Enzyme</strong><br />
- gemeint sind Exportproteine (z.B. Albumin)<br />
- bei einer Schädigung <strong>de</strong>s Erzeugerorgans kommt es zu einer<br />
Syntheseeinschränkung und somit zu einem Abfall <strong>de</strong>r<br />
Enzymkonzentration<br />
b) <strong>Enzyme</strong> exokriner Gewebe<br />
- z.B. Hydrolasen <strong>de</strong>s Pankreas (Verdauungsenzyme)<br />
- können unter Normalbedingungen nur in sehr geringem Masse<br />
durch die Gefäßwän<strong>de</strong> diffundieren<br />
- bei Schädigung <strong>de</strong>s Pankreas kommt es somit zu einem<br />
intravasalen Anstieg (z.B. α-Amylase)<br />
- bei chronischen Krankheiten kommt es zu starken<br />
Einschränkungen <strong>de</strong>r katalytischen Leistung<br />
c) Zell-<strong>Enzyme</strong><br />
- <strong>Enzyme</strong> <strong>de</strong>s Intermediärstoffwechsels in <strong>de</strong>n Zellen<br />
- kommt es zu einem Anstieg im intravasalen Raum, dann liegt<br />
eine Permeabilitätsstörung <strong>de</strong>r entsprechen<strong>de</strong>n Zelle zugrun<strong>de</strong>,<br />
welche durch eine Nekrose hervorgerufen wer<strong>de</strong>n kann<br />
- Enzymaktivität von <strong>Enzyme</strong>n im Serum erhöht bei bestimmten Organschädigungne<br />
o Herzmuskel: CK-MB (Creatinkinase), ASAT (Aspartat-Aminotransferase),<br />
LDH-1 (Lactat-Dehydrogenase), α-HBDH (α-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase)<br />
o Leber/Gallenwege: γGT (γ-Glutamyl-Transpeptidase), ASAT, ALAT (Alanin-<br />
Aminotransferase), GLDH (Glutamat-Dehydrogenase), AP (Alkalische<br />
Phosphatase), LDH 5<br />
o Pankreas: α-Amylase, Lipase<br />
o Skelettknochen: AP<br />
o Skelettmuskel: CK-MM<br />
- Aktivitätsän<strong>de</strong>rungen sind diagnostizierbar in einer Spanne von 4-12h (abhängig vom<br />
Enzym<br />
- und normalisieren sich in 3- 20 Tagen<br />
- ELISA (enzyme-linked immunosorbend assay) Abb. siehe Folien 117 bis 119<br />
o Testsystem zum qualitativen und quantitativen Proteinnachweis<br />
o Nachweis von bestehen<strong>de</strong>n o<strong>de</strong>r vorangegangen Infektionen anhand von<br />
Antikörpern<br />
o Nachweis von spezifischen Antikörpern im Rahmen von<br />
Autoimmunerkrankungen<br />
o Nachweis <strong>de</strong>s C-Peptids zur Bewertung <strong>de</strong>r Insulinsekretion bei Diabetes<br />
mellitus<br />
10 von 11
o Vorgehen beim indirekten Verfahren (Antikörper-Messung)<br />
a) man benötigt eine Antigen-bela<strong>de</strong>ne Nachweisplatte<br />
b) Zugabe <strong>de</strong>s Serums und Adsorption <strong>de</strong>r Antikörper am Antigen<br />
c) Zugabe eines enzymgebun<strong>de</strong>nen Antikörpers gegen <strong>de</strong>n ersten<br />
Antikörper<br />
d) Zugabe eines Substrates, welches durch das Enzym umgebaut wird in<br />
einen photometrisch messbaren Stoff<br />
e) Messung <strong>de</strong>s Stoffes und somit indirekter Nachweis <strong>de</strong>s ersten<br />
Antikörpers<br />
o Vorgehen bei <strong>de</strong>r Antigen-Messung<br />
a) man benötigt eine mit Antikörpern-bela<strong>de</strong>ne Platte<br />
b) Zugabe <strong>de</strong>r Testlösung mit Antigen<br />
c) Zugabe eines enzymgebun<strong>de</strong>nen spezifischen Antikörpers auf das<br />
Antigen<br />
d) Zugabe eines Substrates, welches durch das Enzym in einen<br />
photometrisch messbaren Stoff umgebaut wird<br />
e) Die Intensität <strong>de</strong>r Farbreaktion ist direkt proportional zur<br />
Antigenkonzentration.<br />
o Vorgehen bei <strong>de</strong>r Konkurrenzmetho<strong>de</strong><br />
a) man benötigt eine mit Antikörpern-bela<strong>de</strong>ne Platte<br />
b) Zugabe von enzymgebun<strong>de</strong>nen Antigen und einer bestimmten Menge<br />
an unbekannter Konzentration <strong>de</strong>s Antigens<br />
c) Zugabe <strong>de</strong>s Substrates<br />
d) Die Intensität <strong>de</strong>r Farbreaktion wird jetzt indirekt proportional zur<br />
Antigenmenge sein.<br />
ALAT & ASAT<br />
- Alanin-Aminotransferase = GPT (Glutamat-Pyruvat-Transaminase)<br />
- Aspartat-Aminotransferase = GOT (Glutamat-Oxalacetat-Transferase)<br />
- sind bei<strong>de</strong> spezifisch für Erkrankungen <strong>de</strong>r Leber<br />
- HWZ: ASAT ~17h / ALAT ~47h<br />
- Im Verlauf kann <strong>de</strong>r De-Ritis-Quotient (ASAT/ALAT) eine Aussage über die<br />
schwerer <strong>de</strong>r Erkrankung geben<br />
- Quotient > 1 = schwere o<strong>de</strong>r chronische Schädigung<br />
- Quotient < 1 = Abklingen <strong>de</strong>r Erkrankung<br />
Anhang:<br />
- Säure-Basen-Theorie von Broensted<br />
o Säuren sind Protonendonatoren Teilchen die Wasserstoffionen abgeben<br />
o Basen sind Protonenakzeptoren Teilchen die Wasserstoffionen aufnehmen<br />
o die durch die Abspaltung eines Protons entstehen<strong>de</strong> Base bezeichnet man als<br />
korrespondieren<strong>de</strong> o<strong>de</strong>r konjugierte Base<br />
- Säure-Basen-Theorie nach Lewis<br />
o Säuren verfügen über Elektronenlücken<br />
sie sind Elektronenpaarakzeptoren<br />
o Basen haben ein freies Elektronenpaar<br />
sie sind Elektronenpaardonatoren<br />
11 von 11