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Zelluläre und molekulare biologische Strukturen und Prozesse Ziele der modernen Biologie sind, Mechanismen, die Lebensprozessen zugrunde liegen, auf molekularer oder zellulärer Ebene zu verstehen. Dabei sind die Kenntnis der dreidimensionalen molekularen Struktur und die Interaktion mit anderen Molekülen von entscheidender Bedeutung. So werden einige der großen Herausforderungen der nächsten Jahrzehnte die Aufklärung der molekularen Mechanismen von Infektionskrankheiten, der Krebsentstehung und der Funktion und Dysfunktion des Nervensystems sein. Ebenfalls wird das aus der Genomforschung hervorgegangene Arbeitsgebiet der Proteomics eine wesentliche Bedeutung erlangen. Neutronenstreuung kann hier wichtige Erkenntnisse beisteuern, indem enzymatische Prozesse durch Proteinkristallographie an isotopensubstituierten Proteinen oder die Wechselwirkung verschiedener Komponenten (Protein-Nukleinsäure oder Protein-Protein-Komplexe) studiert werden. Die besondere Stärke der Neutronenstreuung besteht darin, dass man durch Isotopensubstitution molekularen Komponenten sichtbar machen und Kontrast erzeugen kann (s. Abb. 2.12). Grenzflächen zwischen Molekülen Eine besondere Rolle kommt der Untersuchung von Vorgängen an Grenzfl ächen zwischen Makromolekülen zu, da dies in lebenden Systemen eine Vielzahl biologischer und chemischer Prozesse umfasst. Ein herausragendes Beispiel sind die biologischen Membranen, für die das strukturelle und funktionelle Verständnis der Membranproteine sowie deren Wechselwirkung mit Molekülen auf beiden Seiten der Zellmembranen auch auf absehbare Zeit eine der größten Herausforderungen der modernen Biologie darstellt (s. Abb. 2.13). Proteindynamik Eine ebenso wichtige Rolle spielt das Verständnis der Proteindynamik, bei der die interne Dynamik biologischer Makromoleküle auf einer Pikosekundenzeit- und Ångströmlängenskala untersucht werden. Im Bereich von Proteinbindungsreaktionen wird die Wechselwirkungskinetik biologischer Makromoleküle in Mikrosekunden und bis zur atomaren Aufl ösung beobachtet. Beispiel: biologischer Vorgang Neutronen können komplementäre Beiträge zu den in der Strukturbiologie weit verbreiteten Techniken wie NMR oder Röntgen-/Synchrotronstreuung leisten und liefern so Schlüsselinformationen zum Verständnis komplexer biologischer Vorgänge. Als ein Beispiel sei hier die Komplexbildung im Chaperon erläutert. Chaperone (frz. le chaperon = die Kappe) sind große makromolekulare Komplexe, die an der Faltung von Proteinen beteiligt sind. Sie bestehen im E.coli Bakterium aus den beiden Komplexen GroEL (14 Untereinheiten à 60 kDa; 1 Da = Masse eines Kohlenstoffatoms) und GroES (sieben Untereinheiten à 10 kDa), s. Abb. 2.14. Eine strukturell ähnliche Untereinheit wird auch in einem Virus, dem so genannten T4-Phagen, gefunden: das Molekül GP31. Dieses Makromolekül kann das GroES im bakteriellen Chaperon ersetzen und er- möglicht dann vermutlich präferentiell die Synthese und korrekte Faltung eines anderen Phagenproteins (GP23). Auf diese Art und Weise kann das Virus das bakterielle Chaperon ‚umprogrammieren‘, so dass in diesem speziellen Fall auch ohne Weitergabe von Erbinformation die Produktion von Virusmaterial unterstützt wird. Wie lässt sich der Prozess sichtbar machen Mittels Kontrastvariation (Austausch von 1 H gegen 2 H) kann in sogenannten ‚chasing experiments‘ die Kinetik der eben beschriebenen Komplexbildung verfolgt werden. Das bedeutet im Prinzip, dass vermessen wird, ob und wie schnell sich der virale GP31 Proteinkomplex an die Stelle des bakteriellen GroES ‚schummeln‘ kann. Dies geschieht folgendermaßen: An die größere bakterielle Untereinheit GroEL wird die Kappe aus viralem GP31 oder bakteriellem GroES gebunden. Diese Komplexe werden in einem Lösungsmittel aufgenommen, dessen Streulängendichte der von deuteriertem [ 2 H]GroES entspricht. Dann wird [ 2 H]GroES im Überschuss zusammen mit ADP (einem Energielieferanten) zugegeben und beobachtet, wie sich die Streuung zeitabhängig verändert. Wird GP31 gegen die deuterierte bakterielle Kappe [ 2 H]GroES ausgetauscht, erscheint das Chaperon GroEL–[ 2 H]GroES kleiner als der Komplex bestehend aus GroEL–GP31 oder Gro- EL–GroES, da in dem gewählten Lösungsmittel das [ 2 H]GroES ‚unsichtbar‘ ist (contrast matching). Aus solchen Messungen ergibt sich, dass die Kappe des T4- Phagen mit GroEL einen stabileren Komplex bildet als das ursprüngliche bakterielle System GroEL–GroES. Diese Langzeitstabilität der Verbindung aus bakteriellen und viralen Makromolekülen kann somit die korrekte Faltung des Phagenproteins GP23 unterstützen und erklären, wie trickreich sich ein Phage vermehren kann. D 2 O SO 4 Abb. 2.12. Beispiel für die 1,5 Å hochaufgelöste Kristallstruktur von Myoglobin. Die atomare Dichtekarte zeigt in blau (1,5 σ) und in rot (-2,0 σ) positive und negative Streulängenbeiträge. Der Wasserstoff 1 H (rot) und, in der Kontaktregion zwischen zwei Molekülen, das schwere Wasser D 2 O sind deutlich zu sehen. D 2 O 22 Komplexität: Biologie 23
Mögliche zukünftige Anwendungen: Kernspinkontrastvariation Im Gegensatz zu der oben erwähnten Möglichkeit, interessante Bereiche in einem Makromolekül durch Isotopensubstitution zu markieren, bietet die Neutronenstreuung zudem die Option, polarisierte Neutronen an polarisierten Kernspins (im wesentlichen 1 H) zu streuen (s. Abb. 2.15). Die zeitaufgelöste Neutronenstreuung an dynamisch polarisierten Protonenspins erlaubt die Untersuchung von sehr verdünnten paramagnetischen Strukturen. Hierzu gehört beispielsweise eine Reihe von Enzymen, deren aktive Zentren in einen radikalischen Zustand übergehen können oder ihn an anderer Stelle innerhalb des Proteins auslösen. Eine erste entsprechende Untersuchung wurde an dem katalasegebundenen Tyrosylradikal durchgeführt. Der erste zweifelsfreie Nachweis der Kernspindiffusion in einem protonenreichen Molekül gelang in einem Biradikalmolekül. Der Aufbau des intramolekularen Polarisationsgradienten ist rasch (< 1 Sekunde) und somit nur über zeitaufgelöste Neutronenstreuung, nicht aber mit NMR, nachweisbar, denn NMR-Messungen erfordern mehr Zeit. Auf diese elegante Weise kann im Inneren eines Proteins ein Streukontrast erzeugt werden, der zur Strukturuntersuchung herangezogen werden kann. Abb. 2.13. Ein Beispiel für Vorgänge an biologischen Membranen ist die Einlagerung von Squalene, einem Polyisopren. Die Phospholipide POPC und POPS bilden eine Membran mit und ohne Squalene. Polyisoprene sind Bestandteile von Biomembranen, die keine polare Gruppe besitzen; über ihre Funktion ist wenig bekannt. Auffällig ist, dass in allen Membranen, die Protonengradienten aufrechterhalten müssen, diese Kohlenwasserstoffe zu finden sind. Mit Neutronendiffraktion konnten diese Moleküle zum ersten Mal in der Membran lokalisiert werden. Ihre Position zwischen den Monoschichten des Lipidbilayers kann eine mögliche Erklärung liefern, warum diese Moleküle als Protonenbarriere dienen. Abb. 2.14. Kristallstruktur von GroEL(blau)/GroES(rot) [1AON.pdb, A Seitenansicht, B Draufsicht] im Vergleich zur Kristallstruktur von GP31 (grüne Schleifendarstellung, C) und GroES (blaue Schleifendarstellung, D). Obwohl GP31 und GroES nur eine geringe Sequenzhomologie aufweisen, sind beide Komplexe strukturell so ähnlich, dass es zu einer Verdrängung von GroES kommt, wenn GP31 präsent ist. A: GroEL/GroES B C: GP31 D: GroES R1 R2 R1 Abb. 2.15. Dieses Biradikalmolekül mit einem festen Abstand von 38 Å zwischen den an den Enden befindlichen radikalischen Nitroxydgruppen (NO durch grüne bzw. blaue Punkte gekennzeichnet) dient nicht nur der Eichung in der EPR-Spektroskopie. Es unterstützt auch in hervorragender Weise den Vorgang der Kernspinpolarisation durch Mikrowelleneinstrahlung in einem starken Magnetfeld bei tiefen Temperaturen. In einem ersten Schritt der dynamischen Kernspinpolarisation (DNP) werden die Protonen in dem durch R1 gekennzeichneten Gebieten polarisiert. Da das Lösungsmittel deuteriert ist, greift in einem zweiten Schritt die Polarisation vorzugsweise auf die benachbarten Kernspins in R2 über. 24 Komplexität: Biologie 25
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