pdf, 813 KB - Institut für Klinische Chemie - UniversitätsSpital Zürich

Arnold von Eckardstein
Institut für Klinische Chemie
UniversitätsSpital Zürich
Trennverfahren
im klinischen Labor
Trennverfahren im diagnostischen Labor
Verfahren
•(Ultra-)Zentrifugation
•Fällung
•(Ultra-)Filtration
•Extraktion
•Chromatographie
•Elektrophorese
Anwendungsbeispiele
Zellen, Plasma/Serum, Urin-Sediment,
(Lipoproteine)
Nukleinsäuren, Proteine, Lipoproteine
Proteine im Urin
Katecholamine, Medikamente
Katecholamine, Aminosäuren, Lipide,
Medikamente, Proteine, Nukleinsäuren
Proteine, Nukleinsäuren, Medikamente
Zentrifugation
‣ Prinzip: Trennung nach Dichte
‣ Anwendungen:
• Zentrifugation
• Ultrazentrifuge
Trennung von Zellen und
Plasma/Serum
Trennung von Zellen,
Mikroorganismen, Zylindern,
Kristallen aus Urin (Urin-Sediment)
Lipoproteine
RZB =
(p * rpm) 2 * r
30 2 x 980
RZB =
1.119 * 10 -5 * rpm 2 * r
Zentrifugation
RZB: relative Zentrifugalbeschleunigung
r: Radius
rpm: rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
g: Vielfaches der Erdanziehungskraft
Dichte
(g/ml)
0,95 -
1,006 -
1,06 -
HDL
.
1,21 -
IDL
LDL
Lipoproteine
VLDL
Chylomikronen
Remnants
.
Chylomikron
< 12 18 25 25 80 80 1200
Durchmesser (nm)
Kernlipide:
Kernlipide:
TG C
90% 10%
75% 25%
20% 80%
20% 80%
Fällung
‣ Prinzip: Herstellung (wasser-)
unlöslicher Komplexe
‣ Anwendungen:
• Messung
• Probenvorbereitung
• Konzentrierung
Turbidimetrie, Nephelometrie
(TCA/Protein; Ag/AK-Komplexe)
Enteiweissung, DNA-Isolation,
Lipoproteine

Klinisch-chemische Lipoprotein-Analytik
Reagenz
+
Photometer
Filtration
‣ Prinzip: Fraktionierung nach Grösse
Serum
Fällungsmittel
+
Serum
Zentrifuge
Reagenz
+
Überstand
Photometer
Gesamtcholesterin
HDL-
Cholesterin
‣ Anwendungen:
• Konzentrierung
• Trennung freier und
proteingebundener
Metabolite
von Urin-Proteinen für
Elektrophorese (Ultrafiltration)
“Urmethode” für Bestimmung
freier Hormone (Dialyse)
Extraktion
Festphasenextraktion
‣ Prinzip:
Trennung nach Löslichkeit
‣ Anwendungen:
• Probenvorbereitung, häufig erforderlich vor der
chromatographischen Trennung von
Stoffwechselprodukten (z.B. Lipide, Katecholamine)
oder Medikamenten
Chromatographie
‣ Prinzip: Trennung nach Löslichkeit,
Ladung, Grösse oder Affinität
zwischen einer festen und
flüssigen Phase
‣ Anwendungen:
• Gaschromatogr. Ethanol, org. Säuren, Medikamente
• reversed phase Lipide, Vitamine, Medikamente
• Ionenaustausch Katecholamine, HbA1c
• Gelfiltration Makroenzyme, Immunkomplexe
• Affinität Isoenzyme
Injektor
Was ist Chromatographie?
Mobile Phase:
Gas (GC) oder Flüssigkeit (HPLC)
Stationäre Phase:
fest
Trennsäule
Zeit
Detektor &
Schreiber

HPLC (Flüssigkeitschromatographie):
Detektion mittels UV,
Fluoreszenz,
Massenspektrometrie
Reversed Phase HPLC
GC (Gaschromatographie):
Detektion mittels Flammenionisation,
Electron Capture,
Massenspektrometrie
Ionenaustausch-Chromatographie
Ionenaustausch-Chromatographie
Beispiel: glykiertes Hämoglobin (HbA1c)
(Kationen)
Chromatographie: Detektoren
Prinzip der Massenspektrometrie
Detektor
Anwendungsbeispiele
‣(Spektral-)Photometer Medikamente, Vitamine, Porphyrine
(UV, Dioden-Array)
‣elektrochemischer D. Katecholamine
‣Fluoreszenz-D. (erfordert Derivatisierung): Homocystein
‣Massenspektometer
Metaboliten (Lipide, Aminosäuren,
Alkohole), Medikamente, Gifte, etc.
Einlasssystem
Probe
Ionen-Quelle
VAKUUM SYSTEM
Massen
analysator
Detektor
Signal
prozessor

Prinzip der Massenspektrometrie
Massenspektrometrie
Molekül (M)
Ionisierung
M+/Fragmentierung
Massenanalysator
Massenspektrum
Massenspektrum
von Atropin
CH
N
3
H
H
OC
124
CH
Atropin#874 RT: 14.62 AV: 1 SB: 353 13.91-14.56, 15.44-16.64 NL: 1.42E6
T: {0,0} + c EI det=500.00 Full ms [ 80.00-400.00]
O CH 2 OH
80
60
Molekülion
40
82.2
124.2
100
20
289.3
125.2
96.2 140.2
207.2
272.3 290.4
191.2 267.2 304.4 328.3 349.4
218.3 385.2
0
100 150 200 250 300 350 400
m/z
Kopplung von Chromatographie und
Massenspektrometrie
• Massenspektrum:
spezifischer für bestimmte Substanzen als z.B. UVoder
Fluoreszenz - Spektrum (aber abhängig von der
Ionisations - Art und vom Massenspektrometer - Typ)
• Chromatogaphie + Massenspektrum:
dreidimensionale Information
Intensität
m/z
Zeit
Anforderungen an HPLC-UV und LC-MS
Kriterium LC-UV LC-MS
Darstellung von Sirolimus durch HPLC-UV
1 ml Vollblut
Methoden-
Spezifität
Methoden-
Selektivität
Quantifizierung
v.a. durch
analyt.
Trennung
v.a. durch
analyt.
Trennung
v.a. durch
Massenanalysator
Analyt.
Trennung und
Massenanalysator
Trennung nicht
notwendig
Basislinientrennung
der
Komponenten
Blut gespickt mit
2.5 (C), 5 (D) und
40 (E) µg/l SRL
Talspiegel (7.1
µg/l) eines
Nierentransplantierten
Patienten
Cattaneo D,
J. Chromatogr B 2002

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
MA: 258314
RT: 5.94
MA: 17116783
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Time (min)
R T: 5.38
MA: 8615572
100
90
Rela 80
tive
70
Abu
60
nda
50
nce
40
30
20
10
0
RT: 5.88
MA: 17005234
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Ti me (min)
MA: 583990
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
RT: 5.87
MA: 9960475
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Time (min)
Darstellung von Sirolimus durch LC-MS/MS
0.5 ml Vollblut
RT: 5.43
Sirolimus
R elativeAbundance
Desmethoxy-
Rapamycin (IS)
m/z
869.5
m/z
839.7
R elativeAbundance RT: 5.33
Standard 1 Standard 6 Patientenprobe
(0.5 µg/l) (50 µg/l) (4.7 µg/l)
Elektrophorese
‣ Prinzip: Trennung nach Ladung, Grösse
oder isolektrischem Punkt (IEF)
im elektrischen Feld
‣ Anwendungen:
• Elektrophorese Serum-/Urineiweisselektrophorese,
Immunelektrophorese, I.-fixations-e.
Lipoproteine, Isoenzyme
• (SDS-) PAGE Proteinurie-Diagnostik,
Gensequenzierung
• IEF
Oligoklonale IgG im Liquor
genetische Proteinvarianten
Serumeiweißelektrophorese
Typische Elektrophoresemuster
Gensequenzierung mit Kapillarelektrophorese
SDS-Polyacrylamidgelektrophorese
UV-Detektion
Fluoreszenz-Detekt.
Poly-A-Oligonucleotide
Gensequenz

SDS-
Polyacrylamidgel-
Elektrophorese
(SDS-PAGE,
Urin-Diagnostik)
Albumin
-
Isoelektrische Fokussierung (IEF)
+
Wanderungsrichtung
Isoelektrische Fokussierung
(Liquor-Diagnostik)
Proteomics:
2D-Elektrophorese + Tandem MS
Normalbefund
Liquor
Serum
2D-PAGE
Oligoklonale IgG
Liquor
Serum
SDS-PAGE
Tandem MS
IgG in Liquor
und Serum
Liquor
Serum
Immunglobuline
Albumin
IEF