Tiho Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover
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<strong>Tierärztliche</strong> <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong><br />
Untersuchungen zum biologischen Effekt von Rolipram sowie in<br />
Lipidnanokapseln eingeschlossenem Rolipram auf<br />
Spiralganglienzellen und dendritische Zellen in vitro und<br />
Spiralganglienzellen in vivo<br />
INAUGURAL - DISSERTATION<br />
zur Erlangung des Grades eines<br />
Doktors der Veterinärmedizin<br />
- Doctor medicinae veterinariae -<br />
(Dr. med. vet.)<br />
vorgelegt von<br />
Hartwig Meyer<br />
Rotenburg/Wümme<br />
<strong>Hannover</strong> 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer<br />
1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer<br />
Prof. Dr. Timo Stöver<br />
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie<br />
der <strong>Tierärztliche</strong>n <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong><br />
Prof. Dr. Timo Stöver<br />
Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde<br />
der Johann Wolfgang Goethe-Universität,<br />
Frankfurt am Main<br />
Prof. Prof. h. c. Dr. Thomas Lenarz<br />
Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde<br />
der Medizinischen <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong><br />
Dr. med. vet. Verena Scheper<br />
2. Gutachter: Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein<br />
Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2011<br />
Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde<br />
der Medizinischen <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong><br />
Gefördert durch die Europäische Union im Rahmen des „3g-Nanotechnology-based targeted<br />
drugdelivery using the inner ear as a model target organ“ - Projektes „NanoEar“<br />
(Projektnummer NMP4-CT-2006-026556).
Meinen lieben Eltern<br />
in<br />
tiefer Dankbarkeit<br />
für ihre bedingungslose<br />
Unterstützung gewidmet<br />
Stufen<br />
Wie jede Blüte welkt<br />
und jede Jugend dem Alter weicht,<br />
blüht jede Lebensstufe,<br />
blüht jede Weisheit auch und jede Tugend<br />
zu ihrer Zeit und darf nicht ewig dauern.<br />
Es muss das Herz bei jedem Lebensrufe<br />
bereit zum Abschied sein und Neubeginne,<br />
um sich in Tapferkeit und ohne Trauern<br />
in and're, neue Bindungen zu geben.<br />
Und jedem Anfang wohnt ein Zauber inne,<br />
der uns beschützt und der uns hilft zu leben.<br />
Wir sollen heiter Raum um Raum durchschreiten,<br />
an keinem wie an einer Heimat hängen,<br />
der Weltgeist will nicht fesseln uns und engen,<br />
er will uns Stuf' um Stufe heben, weiten!<br />
Kaum sind wir heimisch einem Lebenskreise<br />
und traulich eingewohnt,<br />
so droht Erschlaffen!<br />
Nur wer bereit zu Aufbruch ist und Reise,<br />
mag lähmender Gewöhnung sich entraffen.<br />
Es wird vielleicht auch noch die Todesstunde<br />
uns neuen Räumen jung entgegen senden:<br />
des Lebens Ruf an uns wird niemals enden.<br />
Wohlan denn, Herz, nimm Abschied und<br />
gesunde!<br />
(Hermann Hesse)
Inhaltsverzeichnis<br />
V<br />
VERZEICH�IS VO� EIGE�E� VORTRÄGE� U�D POSTER�................................. X<br />
ABKÜRZU�GSVERZEICH�IS........................................................................................ XII<br />
1 EI�LEITU�G ....................................................................................................................... 1<br />
2 LITERATURÜBERSICHT.................................................................................................. 6<br />
2.1 Das Hörorgan der Säugetiere.......................................................................................... 6<br />
2.1.1 Anatomie des Hörorganes.......................................................................................... 7<br />
2.1.2 Das Spiralganglion................................................................................................... 10<br />
2.1.3 Physiologisches Prinzip des Hörvorgangs ............................................................... 11<br />
2.2 Hörminderung und Ertaubung ...................................................................................... 13<br />
2.2.1 Formen der Hörschädigungen.................................................................................. 13<br />
2.2.2 Sensorineuraler Hörverlust ...................................................................................... 14<br />
2.2.3 Kompensation des sensorischen Hörverlusts durch Cochlea-Implantate ................ 17<br />
2.2.4 Ansätze zur Verbesserung der Nerv-Elektroden-Interaktion................................... 18<br />
2.2.5 Applikationswege zur medikamentösen Therapie des Innenohres.......................... 22<br />
2.3 Nanotechnologien ......................................................................................................... 25<br />
2.3.1 Definition, Eigenschaften von Nanostrukturen und deren Anwendung .................. 25<br />
2.3.2 Nanotechnologie in der Medizin.............................................................................. 26<br />
2.3.3 Anwendung von Nanomedizin in der Otologie ....................................................... 28<br />
2.3.4 Nanomedizin in der Veterinärmedizin..................................................................... 29<br />
2.3.5 Lipidnanokapseln..................................................................................................... 30<br />
2.4 Phosphodiesterase-Hemmer ......................................................................................... 34<br />
2.4.1 Wirkungsweise der Phosphodiesterase-Hemmer..................................................... 34<br />
2.4.2 Einteilung der Phosphodiesterase-Hemmer............................................................. 35<br />
2.4.3 Rolipram .................................................................................................................. 36<br />
3 ZIELSETZU�G .................................................................................................................. 40<br />
4 MATERIAL U�D METHODE� ...................................................................................... 42<br />
4.1 Material......................................................................................................................... 42<br />
4.1.1 Reagenzien, Laborbedarf, Verbrauchsmaterialien, Pharmaka und Geräte .............. 42<br />
4.1.2 Herstellung der Lipidnanokapseln ........................................................................... 42<br />
4.1.3 Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit Spiralganglienzellen...... 44
VI<br />
4.1.4. Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit dendritischen Zellen ..... 45<br />
4.1.5 Versuchstiere und Tierhaltung für die In-vivo-Experimente ................................... 46<br />
4.1.6 Versuchsgruppen...................................................................................................... 46<br />
4.2 Methoden ...................................................................................................................... 48<br />
4.2.1 Methoden für die In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen................................ 48<br />
4.2.1.1 Übersicht der In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen ...................... 48<br />
4.2.1.2 Versuch zur Bewertung des Einflusses der Nanopartikel-Komponenten<br />
auf das Überleben von vereinzelt angezüchteten Spiralganglienzellen .. 49<br />
4.2.1.3 Beschichtung der 96-Multiwellplatten zur Kultivierung von<br />
Spiralganglienzellen ................................................................................ 50<br />
4.2.1.4 Gewinnung der Spiralganglienzellen ....................................................... 51<br />
4.2.1.5 Die Vereinzelung der Spiralganglienzellen ............................................. 53<br />
4.2.1.6 Einsaat der Spiralganglienzellen.............................................................. 54<br />
4.2.1.7 Fixation der Spiralganglienzellen ............................................................ 55<br />
4.2.1.8 Markierung der vereinzelten Spiralganglienzellen über die<br />
immunozytochemische ABC-Methode ................................................... 56<br />
4.2.1.9 Vermessung der Spiralganglienzellen und statistische Auswertung der<br />
Spiralganglienzellversuche...................................................................... 58<br />
4.2.2 Methoden für die In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen ................................ 59<br />
4.2.2.1 Die Generierung und Kultivierung dendritischer Zellen ......................... 59<br />
4.2.2.2 Übersicht der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen ...................... 61<br />
4.2.2.3 Messung der TNF-α-Konzentration......................................................... 63<br />
4.2.2.4 Vitalitätsbestimmung ............................................................................... 64<br />
4.2.3 Methoden für die In-vivo-Versuche ......................................................................... 65<br />
4.2.3.1 Übersicht der In-vivo-Versuche ............................................................... 65<br />
4.2.3.2 Anästhetische Versorgung; prä- und postoperative Versorgung der<br />
Versuchstiere........................................................................................... 65<br />
4.2.3.3 Akustisch-evozierten Hirnstammpotentiale (aABR) ............................... 66<br />
4.2.3.4 Systemische Ertaubung von Meerschweinchen....................................... 68<br />
4.2.3.5 Applikation von Flüssigkeiten ins Innenohr via Cochleostomie ............. 69<br />
4.2.3.6 Transkardiale Perfusion ........................................................................... 72
VII<br />
4.2.3.7 Gewinnung der Cochleae ......................................................................... 73<br />
4.2.3.8 Entkalkung, Entwässerung und Einbetten der Cochleae.......................... 74<br />
4.2.3.9 Herstellung und Anfärbung der Paraffinschnitte ..................................... 75<br />
4.2.3.10 Auswertung der Paraffinschnitte............................................................ 76<br />
4.2.3.11 Statistische Auswertung der In-vivo-Versuche ...................................... 79<br />
5 ERGEB�ISSE ..................................................................................................................... 81<br />
5.1 Ergebnisse der In-vitro-Versuche mit vereinzelten Spiralganglienzellen .................... 81<br />
5.1.1 Einfluss von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BDNF auf<br />
die Überlebensrate vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen.............................. 81<br />
5.1.2 Einfluss von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BDNF auf<br />
das Neuritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen ......... 83<br />
5.1.3 Einfluss von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BDNF auf<br />
den Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen .............................. 87<br />
5.1.4 Einfluss von LNC FITC, LNC BLANK und BDNF auf die Überlebensrate<br />
vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen............................................................. 88<br />
5.1.5 Einfluss von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf das<br />
Neuritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen................ 90<br />
5.1.6 Einfluss von LNC, LNC BLANK sowie BDNF auf den Somadiameter vereinzelt<br />
kultivierter Spiralganglienzellen.............................................................................. 92<br />
5.2 Ergebnisse der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen......................................... 92<br />
5.2.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die TNF-α-Sekretion ............................................ 93<br />
5.2.2 Einfluss der Testsubstanzen in der Konzentration von 1 µM auf die TNF-α-<br />
Sekretion .................................................................................................................. 97<br />
5.2.3 Ergebnisse der Vitalitätstestsbestimmung der dendritischen Zellen ....................... 99<br />
5.3 Ergebnisse der In-vivo-Versuche................................................................................ 100<br />
5.3.1 Ergebnisse der aABR-Messungen ......................................................................... 100<br />
5.3.2 Vergleich der Spiralganglienzelldichten zwischen rechten und linken ertaubten<br />
Cochleae der Tiere einer Versuchsgruppe sowie der linken bzw. rechten<br />
Cochleae aller Gruppen untereinander .................................................................. 102
VIII<br />
5.3.3 Vergleich der Spiralganglienzelldichten des unteren, mittleren und oberen<br />
Abschnitts der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie) innerhalb einer<br />
Versuchsgruppe sowie zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen ............... 104<br />
5.3.4 Vergleich der Spiralganglienzelldichten des unteren, mittleren und oberen<br />
Abschnitts der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie) innerhalb einer<br />
Versuchsgruppe sowie zwischen den Versuchsgruppen ....................................... 107<br />
5.3.5 Vergleich der Somadiameter der Spiralganglienzellen zwischen rechter und<br />
linker ertaubter Cochleae der Tiere einer Versuchsgruppe sowie der linken<br />
bzw. rechten Cochleae aller Gruppen untereinander............................................. 109<br />
5.3.6 Vergleich der ermittelten Somadiameter des unteren, mittleren und oberen<br />
Abschnitts der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie) innerhalb einer<br />
Versuchsgruppe sowie zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen ............... 112<br />
5.3.7 Vergleich der ermittelten Somadiameter des unteren, mittleren und oberen<br />
Abschnitts der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie) innerhalb einer<br />
Versuchsgruppe sowie zwischen den Versuchsgruppen ....................................... 114<br />
6 DISKUSSIO� .................................................................................................................... 119<br />
6.1 Bewertung der In-vitro-Ergebnisse............................................................................. 120<br />
6.1.1 Auswirkungen von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und<br />
BDNF auf das Überleben von vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen.......... 120<br />
6.1.2 Wirkungen von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BDNF<br />
auf die Neuritenlängen der vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen............... 124<br />
6.1.3 Effekte von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BDNF auf die<br />
Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen................................... 126<br />
6.1.4. Bewertung der Auswirkungen der Nanopartikel-Komponenten auf das<br />
Überleben von vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen durch die<br />
vergleichende Behandlung der Spiralganglienzellen mit LNC FITC,<br />
LNC BLANK sowie BDNF................................................................................... 127<br />
6.1.5 Auswirkungen von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf das<br />
Neuritenauswachsverhalten sowie den Somadiameter von kultivierten<br />
Spiralganglienzellen .............................................................................................. 128
6.1.6 Wirkung von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM, LNC BLANK und<br />
IX<br />
LNC FITC auf die LPS-induzierte TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen........... 129<br />
6.2 Bewertung der In-vivo-Ergebnisse ............................................................................. 134<br />
6.2.1 Bewertung der Auswirkungen der unterschiedlichen Testsubstanzen auf das<br />
Überleben von Spiralganglienzellen in ertaubten Cochleae.................................. 134<br />
6.2.2 Bewertung der Auswirkungen der unterschiedlichen Testsubstanzen auf das<br />
Überleben von Spiralganglienzellen hinsichtlich der apikalen, mittleren und<br />
basalen Abschnitte der ertaubten Cochleae ........................................................... 138<br />
6.2.3 Bewertung der Auswirkung der Testsubstanzen auf den ermittelten<br />
Somadiameter ........................................................................................................ 140<br />
6.3 Zusammenfassende Bewertung der durchgeführten In-vitro- und In-vivo-Versuche 142<br />
7 ZUSAMME�FASSU�G .................................................................................................. 145<br />
8 SUMMARY........................................................................................................................ 148<br />
9 LITERATURVERZEICH�IS ......................................................................................... 151<br />
10 A�HA�G ......................................................................................................................... 173<br />
10.1 Herstellung von Lösungen und Medien.................................................................... 173<br />
10.2 Lösungen und Reagenzien........................................................................................ 174<br />
10.3 Verwendete Arzneimittel.......................................................................................... 177<br />
10.4 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien .................................................................. 179<br />
10.5 Operationsbesteck..................................................................................................... 182<br />
10.6 Geräte........................................................................................................................ 183<br />
10.7 Einfluss der Testsubstanzen auf die Vitalität dendritischer Zellen .......................... 187<br />
ERKLÄRU�G...................................................................................................................... 188<br />
DA�KSAGU�G................................................................................................................... 189
Verzeichnis von eigenen Vorträgen, und Postern<br />
X<br />
Ein Teil der im Rahmen der Dissertation ermittelten Ergebnisse wurden bereits auf folgenden<br />
Fachtagungen präsentiert:<br />
• SCHEPER, V., HÜTTEN, M., MEYER, H., FOUCHET, F., BASTIAT, G.,<br />
SAULNIER, P., LENARZ, T., STÖVER, T.<br />
Nanoparticles as carriers for Rolipram to increase the neuroprotective effect on Spiral<br />
Ganglion Cells<br />
In: 33 rd MidWinter Meeting of Association for Research in Otolaryngology, Anaheim,<br />
California, USA, 2010 (Poster)<br />
• MEYER, H., STÖVER, T., FOUCHET F., BASTIAT, G., SAULNIER, P.,<br />
BÄUMER, W., LENARZ, T., SCHEPER, V.<br />
Increase of the Neuroprotective Effect of Rolipram on Spiral Ganglion Cells via<br />
Nanoparticle Carriage<br />
In: 47 th Inner Ear Biology Workshop, Prague, Czech Republic, 2010 (Poster)<br />
• MEYER, H., STÖVER, T., FOUCHET F., BASTIAT, G., SAULNIER, P.,<br />
BÄUMER, W., LENARZ, T., SCHEPER, V.<br />
In-vitro- and in-vivo-Effects of Rolipram on Spiral Ganglion Cells and Dendritic Cells<br />
via Nanoparticle Carriage<br />
In: 15 th Conference on Implantable Auditory Prostheses, Pacific Groove, USA, 2011<br />
(Poster)
XI<br />
• SCHEPER, V., MEYER, H., STÖVER, T., BASTIAT, G., SAULNIER, P., VOIGT,<br />
H., LENARZ, T.<br />
Untersuchungen zum neuroprotektiven Effekt von Rolipram und nanopartikel-<br />
vermittelter Rolipram Applikation<br />
In: 82. Jahresversammlung 2011 der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-<br />
Ohrenheilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie e.V., Bonn<br />
Für die vorliegende Arbeit wurden die in den Vorträgen und Postern präsentierten Ergebnisse<br />
in einen Kontext gesetzt, ausführlicher beschrieben sowie durch weitere Ergebnisse ergänzt.
Abkürzungsverzeichnis<br />
XII<br />
aABR acoustically evoked auditory brainstem response (akustisch evozierte<br />
Abb. Abbildung<br />
auditorische Hirnstamm-Potenziale)<br />
ABC Avidin-Biotin-Complex<br />
Ak Antikörper<br />
AP artifizielle Perilymphe<br />
BDNF brain-derived neurotrophic factor<br />
bzw. beziehungsweise<br />
ca. zirka<br />
cAMP cyclic adenosin monophosphate (zyklisches Adenosin-Monophosphat)<br />
cGMP cyclic gunanosin monophosphate (zyklisches Guanosin-Monophosphat)<br />
d day (Tag)<br />
DAB Diaminobenzidin<br />
dB Dezibel<br />
DC Dendritic cell<br />
DMSO Dimethylsulfoxid<br />
DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)<br />
DNase I Deoxyribonuclease I<br />
EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat<br />
ELISA enzyme linked immunoabsorbent assay<br />
EPR-Effekt enhanced permeability and retention-Effekt<br />
et al. et alii (und andere)<br />
etc. et cetera (und so weiter)<br />
EU Europäische Union<br />
FBS Fetal bovine serum<br />
FITC Fluoreszein-5-isothiocyanat<br />
°C Grad Celsius<br />
g Erdschwerebeschleunigung<br />
g Gramm<br />
GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
XIII<br />
GM-CSF granulocyte macrophage-colony stimulating factor<br />
h hora (Stunde)<br />
HBSS Hank’s balanced salt solution<br />
Hz Hertz<br />
IgG Immunglobulin G<br />
IL Interleukin<br />
i.m. intramuskulär<br />
kg Kilogramm<br />
KGW Körpergewicht<br />
kHz Kilohertz<br />
l Liter<br />
LNC Lipidnanokapsel<br />
LPS Lipopolysaccharide<br />
µ mikro (1 x 10 -6 )<br />
MAP mitogen activated protein<br />
mg Milligramm<br />
ml Milliliter<br />
MW Mittelwert (arithmetischer Mittelwert)<br />
n Stichprobenumfang<br />
NaCl Natriumchlorid<br />
NAD Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid<br />
NADP Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat<br />
NF-κB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells<br />
nm Nanometer (1 x 10 -9 m)<br />
NO Stickstoffmonoxid<br />
ns nicht signifikant<br />
NS Normalserum<br />
OD Optische Dichte<br />
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)<br />
PEG Polyethylenglykol<br />
PFA Paraformaldehyd
XIV<br />
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration<br />
PIT-Methode phase inversion temperature-Methode<br />
RhoA ras homolog gene family, member A<br />
RNS reactve nitrogen species (reaktive Stickstoff Spezies)<br />
ROS reactive oxygen species (reaktive Sauerstoff Spezies)<br />
rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute)<br />
s Sekunde<br />
s.c. subcutan<br />
SGZ Spiralganglienzelle<br />
SPION superparamagnetic iron oxide nanoparticles<br />
SPL sound pressure level (Schalldruckpegel)<br />
Std. Stunden<br />
Tab. Tabelle<br />
TNF Tumornekrosefaktor<br />
Trk Tyrosin Kinase<br />
z. B. zum Beispiel<br />
ZNS Zentrales Nervensystem
1 Einleitung<br />
1<br />
Die Beeinträchtigung des Hörvermögens im Sinne einer Hörminderung oder Ertaubung stellt<br />
eine der in Deutschland am häufigsten verbreiteten Erkrankungen dar. Nach einer im Jahr<br />
2000 durchgeführten Studie wurde die Zahl der Betroffenen in Deutschland auf über<br />
10 Millionen geschätzt (SOHN 2001).<br />
Die Ursachen der Hörminderungen sind meist durch einen Verlust der sensorineuralen<br />
Strukturen begründet. Neben erblichen Faktoren spielen auch erworbene Ursachen, wie<br />
beispielsweise eine erhöhte Lärmexposition (MINAMI et al. 2007) oder die Applikation von<br />
ototoxischen Arzneimitteln (YAMANE et al. 1988; SELIMOGLU 2007) eine entscheidende<br />
Rolle. Bei dem durch Lärm verursachten Hörverlust (noise induced hearing loss) kommt es<br />
zu einer reflektorischen Abnahme der Durchblutung im Innenohr, wodurch eine negative<br />
Energiebilanz in den Zellen ausgelöst wird. In der Folge führt die Bildung von freien<br />
Radikalen sowie ein vermehrter Kalzium-Einstrom zur Degeneration der Haarzellen<br />
(MINAMI et al. 2007). Der arzneimittelinduzierte Haarzellverlust wird ebenfalls über die<br />
Bildung von freien Radikalen ausgelöst. Dabei wird die Degeneration der Haarzellen auch<br />
hier über die dem Lärm induzierten Hörverlust entsprechenden Mechanismen eingeleitet.<br />
(SELIMOGLU 2007).<br />
Eine Therapie der geschädigten Haarzellen im Sinne einer Protektion vor schädigenden<br />
Einflüssen oder gar die Regeneration von bereits degenerierten Sinneszellen des Innenohres<br />
ist beim Menschen bisher nicht möglich. Vielmehr wird versucht, das geschädigte Organ<br />
durch apparative Therapieformen zu ersetzen, bzw. zu unterstützen. So werden bei gering- bis<br />
mittelgradig schwerhörigen Patienten Hörgeräte eingesetzt. Bei hochgradig schwerhörigen<br />
sowie ertaubten Patienten ist die Implantation von elektronischen Innenohrprothesen, den<br />
Cochlea-Implantaten, die Therapieform der ersten Wahl. So gehört die Behandlung von<br />
taubgeborenen Kindern mittels eines Cochlea-Implantats mittlerweile zur Routine. Der über<br />
das Cochlea-Implantat vermittelte Höreindruck ermöglicht den Betroffenen das Erlernen von<br />
Sprache (LENARZ 1997), was einen entscheidenden Beitrag zur Verbesserung der<br />
Integrationsfähigkeit in die Gesellschaft leistet und darüber hinaus eine wesentlich gesteigerte<br />
Lebensqualität bietet.
2<br />
Das Cochlea-Implantat übernimmt bei fehlenden Haarzellen durch die in die Scala tympani<br />
eingeführte Mehrkanalelektrode die elektrische Anregung der Spiralganglienzellen. Durch die<br />
Bildung und Weiterleitung von Aktionspotentialen durch die Spiralganglienzellen kann somit<br />
auch nach einer Haarzelldegeneration ein künstlich erzeugter Höreindruck erzielt werden.<br />
Jedoch kommt es durch den Verlust der Haarzellen zu einer progressiven Abnahme der<br />
Spiralganglienzelldichte (SPOENDLIN 1984), was durch das Fehlen von elektrischer und<br />
neurotropher Stimulation bedingt ist (INCESULU u. NADOL 1998; ALTSCHULER et al.<br />
1999). Um die Funktion eines Cochlea-Implantats möglichst lange auf hohem Niveau<br />
gewährleisten zu können, stellt eine Verzögerung oder gar ein Verhindern der<br />
Spiralganglienzelldegeneration einen wesentlichen Aspekt bei der Optimierung von Cochlea-<br />
Implantaten dar (INCESULU u. NADOL 1998).<br />
Bis heute wurden eine Vielzahl von unterschiedlichen Substanzen ermittelt, welche sich als<br />
neuroprotektiv erwiesen haben. Durch die lokale Applikation dieser neurotrophen Faktoren<br />
konnte die fortschreitende Degeneration der Spiralganglienzellen signifikant verlangsamt<br />
werden. Wichtige Vertreter dieser Stoffgruppe stellen brain derived neurotrophic factor<br />
(BDNF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), Neurotrophin-3 (NT-3) sowie<br />
fibroblast growth factor (FGF) dar (STAECKER et. al. 1996; GILLESPIE u. SHEPHERD<br />
2005). MILLER et al. (1997) konnten anhand einer Studie mit ertaubten Meerschweinchen<br />
belegen, dass sich eine Behandlung mit BDNF als besonders effektiv auf das Überleben der<br />
Spiralganglienzellen erwiesen hat. Des Weiteren zeigte sich, dass eine elektrische Stimulation<br />
der Spiralganglienzellen ebenfalls zu einer Verzögerung der Degeneration führt<br />
(HARTSHORN et. al. 1991). Letztlich ist hierbei aber in jedem Fall eine dauerhafte,<br />
begleitende Therapie nötig, da nach Behandlungsabbruch eine fortschreitende Verminderung<br />
der Spiralganglienzelldichte nachgewiesen wurde (GILLESPIE et. al. 2003). Erste Ansätze zu<br />
dauerhaften Drug-Delivery-Systemen stellen mit Mikrokathetern versehene osmotische<br />
Pumpen dar, die es ermöglichen, über einen längeren Zeitraum Arzneimittel ins Innenohr zu<br />
applizieren. Dennoch ist die Dauer der Applikation auf wenige Wochen begrenzt. Eine<br />
weitere Option bildet die Gentherapie. Durch das Einschleusen von Gensequenzen<br />
neurotropher Faktoren könnten die Zellen nun selbst für eine dauerhafte Produktion dieser<br />
neuroprotektiven Substanzen sorgen (YAGI et. al. 2000; REJALI et. al. 2007).
3<br />
Über virale Vektoren konnte bereits ein Gentransfer im Innenohr realisiert werden. Obwohl<br />
eine Expression der eingeschleusten Sequenzen in den Zellen des Innenohres nachgewiesen<br />
wurde, zeigten die Ergebnisse jedoch keinen zellspezifischen Gentransfer (HAN et. al. 1999,<br />
SUZUKI et. al. 2003). Des Weiteren wird meist nur eine zeitlich begrenzte Expression von<br />
etwa 3 Wochen erzielt, was im Hinblick auf eine langfristige Therapie nicht wünschenswert<br />
ist (HUSSEMAN u. RAPHAEL 2009). Zusätzlich ergeben sich durch die Verwendung von<br />
viralen Vektoren nicht unerhebliche Nachteile, wie beispielsweise die potenzielle Infektiosität<br />
und die Möglichkeit entzündliche oder immunologische Prozesse auszulösen (KHO et. al.<br />
2000).<br />
Neben den viralen Vektoren bieten künstlich hergestellte Nanopartikel eine vielversprechende<br />
Möglichkeit zum Transport von Arzneimitteln und Gensequenzen. Hierbei handelt es sich um<br />
Partikel, deren Größe im nanoskaligen Bereich angesiedelt ist, für die die amerikanische<br />
�ational �anotechnology Initiative Größenordnungen von 1 bis 100 nm angibt. Heute werden<br />
eine Vielzahl unterschiedlicher Nanopartikel hergestellt, welche aus organischen sowie<br />
anorganischen Grundbausteinen zusammengesetzt sein können. Neben dem Einsatz in der<br />
Industrie findet sich ein breites Anwendungsgebiet im Gesundheitswesen und in der Medizin.<br />
So werden Nanopartikel bereits in einigen Sonnenschutzmitteln verwendet, aber auch zur<br />
Bekämpfung von Brustkrebs können im Rahmen der Therapie Nanopartikel eingesetzt<br />
werden (PAUTLER u. BRENNER 2010). Der Vorteil von Nanopartikeln liegt in der nicht<br />
vorhandenen Infektiosität und der Produktion von biodegradablen Grundgerüsten, welche<br />
eine geringe Reaktion des Körpers erwarten lassen. Weiterhin lassen sich Nanopartikel<br />
kostengünstig herstellen. Durch die Eigenschaft der Herstellung nach biologischen<br />
Bauprinzipien sind Nanopartikel prädestiniert für den Transport von medizinischen<br />
Wirkstoffen oder Genen.<br />
Neben der Transportfunktion besteht die Möglichkeit, die Oberfläche von Nanopartikeln mit<br />
spezifischen Rezeptoren zu funktionalisieren. Über diese Rezeptoren sollen die Nanopartikel<br />
nur an ausgesuchte Zellpopulationen binden, in welche sie daraufhin aufgenommen werden<br />
und ihr Transportgut freisetzen können. Gerade in der Behandlung von Krebs werden durch<br />
traditionelle Verfahren wie der Chemo- oder Strahlentherapie nicht nur die Tumorzellen,<br />
sondern auch die gesunden Körperzellen geschädigt. Durch den Einsatz von Nanopartikeln ist<br />
eine gezielte Behandlung des veränderten Gewebes denkbar, welche entscheidende Vorteile
4<br />
gegenüber den herkömmlichen Therapieformen hinsichtlich der Minderung von<br />
Nebenwirkungen erreichen kann (PAUTLER u. BRENNER 2010).<br />
Auch im Innenohr kann ein gezielter Wirkstofftransport über Nanopartikel eine erhebliche<br />
Dosisminderung und damit ein geringeres Risiko von Nebenwirkungen im Vergleich zu einer<br />
systemischen Behandlung erreichen. Zusätzlich wird durch die geringere Dosis auch ein<br />
beträchtlicher ökonomischer Nutzen erreicht, da weniger Wirkstoff eingesetzt werden muss.<br />
Neueste Forschungsergebnisse belegen, dass durch die lokale Applikation von<br />
fluoreszenzmarkierten Lipidnanokapseln in die Scala tympani eine breite Verteilung der<br />
Nanopartikel in den einzelnen Zellpopulationen erreicht werden kann (SCHEPER et al.<br />
2009b). Die Ergebnisse zeigten die Fähigkeit wirkstoffunbeladener Nanopartikel, die Zellen<br />
zu infiltrieren ohne dabei toxische Effekte auszulösen.<br />
Neben dem Erhalt der Spiralganglienzellen wird die optimale Funktionsweise der Cochlea-<br />
Implantate noch durch einen weiteren wichtigen Faktor beeinflusst. Durch postoperativ<br />
einsetzende Fremdkörperreaktionen versucht der Körper durch Bindegewebszubildung das<br />
Implantat abzukapseln. Hierdurch kommt es zu einer zunehmend verminderten Nerv-<br />
Elektroden-Interaktion, was zu einer verringerten Frequenzselektivität und einer Erhöhung<br />
der Impedanzen sowie des Stromeintrags führt (NEWBOLD et al. 2004). PAASCHE et. al.<br />
(2003) konnten nach der Insertion von Cochlea-Implantaten durch die lokale Applikation von<br />
Glukokortikoiden eine Verringerung der Impedanzen im Vergleich zu unbehandelten<br />
Patienten feststellen.<br />
Die Beurteilung eines biologischen Effekts, welcher durch die Freisetzung eines<br />
Transportgutes im Sinne von Arzneimitteln hervorgerufen werden kann, soll in der<br />
vorliegenden Arbeit evaluiert werden. In dieser Studie werden wirkstoffbeladene<br />
Lipidnanokapseln verwendet. Hierbei ist der Phosphodiesterase-Hemmer Rolipram im<br />
Inneren des Nanopartikels eingekapselt, wodurch das Arzneimittel bis zur Freisetzung im<br />
Zellinneren geschützt wird. Für dieses Arzneimittel konnten WHITAKER et. al. (2008) im<br />
Tierversuch neuroprotektive Eigenschaften nachweisen. In der vorliegenden Arbeit wird<br />
zunächst der Effekt des Roliprams und einer Nanopartikel-Rolipram-Kombination auf das<br />
Überleben von isoliert angezüchteten Spiralganglienzellen untersucht. Des Weiteren werden<br />
Versuche zur Evaluierung des Einflusses von Rolipram und der Nanopartikel-Rolipram-<br />
Kombination auf die TNF-α-Sekretion von dendritischen Zellen durchgeführt. Der Vergleich
5<br />
zwischen dem direkt applizierten Rolipram und der Applikation mittels Nanopartikel lässt<br />
eine Aussage über die Effektivität dieses Drug-Delivery-Systems zu. Nachfolgend wird der<br />
Effekt des Roliprams auf die Dichte der Spiralganglienzellen von zuvor ertaubten<br />
Meerschweinchen in direkter sowie Nanopartikel-vermittelter Applikation untersucht. So<br />
werden mit dieser Arbeit die Fragestellungen des biologischen Effekts von Rolipram, sowie<br />
die Auswirkungen des mittels eines Drug-Delivery-Systems applizierten Arzneimittels auf die<br />
Neurone des Hörsystems in-vitro und im Tiermodell bearbeitet.
2 Literaturübersicht<br />
2.1 Das Hörorgan der Säugetiere<br />
6<br />
Das Ohr der Säugetiere (Auris, Organum vestibulocochleare) dient neben der Aufnahme und<br />
Weiterverarbeitung von akustischen Umweltreizen auch der Wahrnehmung der Lage des<br />
Körpers im Raum und stellt somit ein Doppelsinnesorgan dar (NICKEL et. al. 2004).<br />
Morphologisch-anatomisch wird das Ohr in einen äußeren Anteil, das äußere Ohr (Auris<br />
externa), einen mittleren Anteil, das Mittelohr (Auris media) und in einen inneren Anteil, das<br />
Innenohr (Auris interna) eingeteilt. Das Innenohr verkörpert das eigentliche statoakustische<br />
Sinnesorgan. Es besteht aus dem für den Gleichgewichtssinn verantwortlichen<br />
Vestibularapparat und aus der Hörschnecke (Cochlea), welche das eigentliche innere<br />
Hörorgan darstellt (Abb. 1).<br />
Abb. 1: Aufbau des menschlichen Hör- und Gleichgewichtsorganes (modifiziert nach BOENNINGHAUS<br />
u. LENARZ 2007)
2.1.1 Anatomie des Hörorganes<br />
7<br />
Das äußere Ohr ist durch die aus Knorpel bestehende Ohrmuschel (Auricula) gekennzeichnet.<br />
Sie dient als Schallauffangtrichter und leitet akustische Reize über den äußeren Gehörgang<br />
(Meatus acusticus externus) in Richtung Mittelohr. Der äußere Gehörgang findet sein Ende<br />
im Paukenring (Anulus tympanicus), in dem das Trommelfell (Membrana tympanica)<br />
eingespannt ist, welches das äußere Ohr zur Paukenhöhle (Cavum tympani) des Mittelohres<br />
abgrenzt (NICKEL et al. 2004).<br />
Das im Felsenbein liegende Mittelohr beinhaltet die Paukenhöhle (Cavum tympani) als<br />
luftgefüllten Raum, in welcher sich die Gehörknöchelchen (Ossicula auditus) Hammer<br />
(Malleus), Amboß (Incus) und Steigbügel (Stapes) befinden. Sie dienen der Weiterleitung und<br />
Verstärkung des eintreffenden Schallsignals, in dem die Schwingungen des Trommelfells<br />
über die bewegliche Gehörknöchelchenkette zum Innenohr weitergeleitet werden. Hierbei ist<br />
der Hammerstiel (Manubrium mallei) im Trommelfell verankert. Die Schwingungen werden<br />
über den Amboß, welcher gelenkig mit dem Hammer verbunden ist, auf den Steigbügel<br />
übertragen, wobei die Fußplatte des Steigbügels (Basis stapedis) an das ovale Fenster des<br />
Innenohres grenzt. Des Weiteren steht die Paukenhöhle über die Ohrtrompete (Tuba auditiva,<br />
EUSTACHIsche Röhre) mit dem Nasenrachen in Verbindung, um den Luftdruck zu<br />
regulieren und den Abfluss von Sekreten gewährleisten zu können (NICKEL et. al. 2004).<br />
Das Innenohr bildet ein nach außen geschlossenes System. Es vereint die funktionellen<br />
Eigenschaften des Gleichgewichtssinnes, über den Anteil des Gleichgewichtsorganes<br />
(Vestibularapparat) sowie des Gehörsinnes, durch die nach rostroventral angeordnete<br />
Hörschnecke (Cochlea). Während die Cochlea des Menschen im knöchernen Felsenbein<br />
angesiedelt ist (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007), ragt die konusförmige Hörschnecke<br />
des Meerschweinchens frei ins Mittelohr hervor (COOPER u. SCHILLER 1975). Nach außen<br />
wird sie von einer dünnen knöchernen Ummantelung von der Paukenhöhle abgegrenzt. Im<br />
Inneren bildet die Schneckenspindel (Modiolus) die Achse um die sich der knöcherne<br />
Schneckengang (Canalis spiralis cochleae) beim Menschen in 2,75, beim Meerschweinchen<br />
in 3,5 bis 4 Windungen verjüngt (NADOL 1988). Eine von der Schneckenspindel in den<br />
Schneckengang ragende, spiralig verlaufende Knochenlamelle, (Lamina spiralis ossea) teilt<br />
den Schneckengang mithilfe von zwei an ihm entspringenden Membranen in drei
8<br />
Flüssigkeitsräume. Die oben gelegene Vorhoftreppe (Scala vestibuli) beginnt am ovalen<br />
Fenster (Fenestra vestibuli) und wird zum darunter liegenden Ductus cochlearis (Scala<br />
media) durch die REISSNERsche Membran (Membrana vestibularis) abgegrenzt. An der<br />
Modiolusspitze kommuniziert die Vorhoftreppe über einen Hohlraum (Helicotrema) mit der<br />
Paukentreppe (Scala tympani), welche am runden Fenster (Fenestra cochleae) endet und zur<br />
darüberliegenden Scala media durch die Basilarmembran (Lamina basilaris) abgegrenzt ist<br />
(NICKEL et. al. 2004). Das Flüssigkeitsvolumen der in der Paukentreppe und der<br />
Vorhoftreppe enthaltenen Perilymphe, welche aus dem kaliumarmen Liquor cerebrospinalis<br />
entstammt, wird von SHINOMORI et al. (2001) für Meerschweinchen mit 8,87 µl angegeben.<br />
Zwischen der Vorhof- und der Paukentreppe befindet sich der im Querschnitt dreieckige<br />
Ductus cochlearis, auch Scala media genannt. Dieser wird dorsal zur Scala vestibuli durch die<br />
Membrana vestibularis abgegrenzt. Im ventralen Bereich trennt die Basilarmembran (Lamina<br />
basilaris) die Innenräume von Ductus cochlearis und Paukentreppe. An der lateralen Seite<br />
begrenzt die Stria vascularis den Innenraum. Hierbei handelt es sich um ein gut<br />
vaskularisiertes Epithel, welches für die Produktion von kaliumreicher Endolymphe<br />
verantwortlich ist, wobei für den Ductus cochlearis des Meerschweinchens ein Volumen von<br />
1,5 µl beschrieben wird (SHINOMORI et al. 2001).<br />
Als wesentlicher struktureller Bestandteil zur Generierung der Hörwahrnehmung befindet<br />
sich das Cortische Organ (Organum spirale) im ventralen Bereich des Ductus cochlearis<br />
(Abb 2). Seine Haarsinneszellen und die stabilisierenden Stützzellen sind auf der<br />
Basilarmembran (Lamina basilaris) lokalisiert, welche von der modiolusseitigen Lamina<br />
ossea spiralis bis zum lateral begrenzenden Ligamentum spirale reicht. Beim Menschen<br />
beträgt die durchschnittliche Länge dieser Membran in etwa 35 mm, wobei sie beim<br />
Meerschweinchen mit einer Länge von 16,4 ± 1,4 mm (LINSS et al. 2007) angegeben wird.<br />
Eine besondere Art von Stützzellen, die Pfeilerzellen, bilden den Cortischen Tunnel, zu<br />
dessen abaxialer Seite 3 bis 5 Reihen von äußeren Haarzellen (insgesamt etwa 12-19000 beim<br />
Menschen) und zur axialen Seite eine Reihe von inneren Haarzellen (etwa 3500 beim<br />
Menschen) angeordnet sind (LEONHARDT et al. 1990). Der Limbus spiralis ossea begrenzt<br />
das Cortische Organ modiolusseitig. Sein Labium limbi vestibulare dient als Ansatzstelle für<br />
die Tektorialmembran (Membrana tectoria), welche mit den apikalen Sinneshärchen<br />
(Stereovilli) der äußeren Haarzellen in festem Kontakt steht, während die Stereovilli der
9<br />
inneren Haarzellen keinen festen Kontakt zur Tektorialmembran haben (HOTH u. LENARZ<br />
1997).<br />
Abb. 2: Darstellung der Lage des Cortischen Organs im Querschnitt eines Schneckengangs der<br />
Cochlea (modifiziert nach Nickel et al. 2004)
2.1.2 Das Spiralganglion<br />
10<br />
In der Schneckenspindel der Cochlea verläuft nahe der Basis der Lamina spiralis ossea ein<br />
feiner Knochenkanal (Canalis spiralis modioli, ROSENTHALscher Kanal) in welchem sich<br />
neben Blutgefäßen das Spiralganglion (Ganglion spirale cochleae) befindet (NICKEL et al.<br />
2004).<br />
Hierbei handelt es sich um größtenteils bipolare Nervenzellen, deren periphere Fortsätze die<br />
dendritischen Fasern des Hörnervs bilden. Unter Verlust der Markscheide passieren diese von<br />
ventral die Lamina basilaris und treten in Kontakt mit den inneren Haarzellen oder, nachdem<br />
sie den Cortischen Tunnel durchzogen haben, in Kontakt mit den äußeren Haarzellen. Die<br />
zentralen Axone der Ganglienzellen vereinigen sich schließlich im Inneren der<br />
Schneckenspindel zum �ervus cochlearis, dem eigentlichen Gehörnerv.<br />
Die Neurone des Spiralganglions werden auf Grund morphologischer und funktioneller<br />
Unterschiede in zwei Typen unterteilt. Zum einen wird durch Typ-I-Ganglienzellen die<br />
afferente Versorgung der inneren Haarzellen gewährleistet, während Typ-II-Ganglienzellen<br />
die afferente Versorgung der äußeren Haarzellen übernehmen (RUBEL u. FRITZSCH 2002).<br />
Während Typ-I-Ganglienzellen etwa 95 % der Zellpopulation ausmachen, stellen Typ-II-<br />
Ganglienzellen nur etwa 5 % der Spiralganglienzellpopulation, wobei Typ-I-Ganglienzellen<br />
nur jeweils mit einer inneren Haarzelle in Kontakt treten, Typ-II-Ganglienzellen aber in<br />
Verbindung mit bis 30-60 äußeren Haarzellen stehen können (ROMAND u. ROMAND 1987;<br />
RUBEL u. FRITZSCH 2002). Weiterhin zeigen sich histomorphologische Unterschiede<br />
zwischen den beiden Ganglienzelltypen. Die Perikarien der bipolaren Typ-I-Ganglienzellen<br />
sind von einer Myelinscheide umgeben, während diese bei den pseudounipolaren Typ-II-<br />
Ganglienzellen nicht nachzuweisen ist. Zudem weisen die Zellen des Ganglion-II-Typs einen<br />
hellen runden Kern mit einem ausgeprägten Nucleolus auf. (LEONHARDT et al. 1990). Des<br />
Weiteren zeigen die Durchmesser der Perikarien der Typ-I-Ganglienzellen mit 12-25µm ein<br />
im Mittel etwas größeres Ausmaß als Typ-II-Ganglienzellen (BICHLER 1984).
11<br />
2.1.3 Physiologisches Prinzip des Hörvorgangs<br />
Die Sinnesempfindung des Hörens wird durch die Aufnahme von akustischen Reizen und<br />
deren Weiterleitung durch Nervenfasern zum Gehirn charakterisiert, wo diese letztlich im<br />
Bereich der Hörrinde als solche gedeutet werden.<br />
Der Entstehung eines akustischen Reizes liegt ein schwingender Körper zugrunde, welcher als<br />
Schallquelle durch Druck- und Dichteschwankungen in elastischen Medien wie Gasen,<br />
Flüssigkeiten oder Festkörpern, Schallwellen erzeugt. Die Frequenz dieser Schwingungen<br />
definiert die Höhe des Tones und wird in Hertz (Hz) angegeben wobei die Amplitude der<br />
Auslenkung den Schalldruck, also die Lautstärke, bestimmt. Der Schalldruckpegel (sound<br />
pressure level = SPL) wird in Dezibel (dB) gemessen und umfasst für die Leistung des<br />
menschlichen Ohres einen so großen Rahmen, dass er in einem logarithmischen Maß<br />
angegeben wird (ENGELHARDT u. BREVES 2004). Weiterhin werden akustische Reize in<br />
zwei unterschiedliche Qualitäten unterteilt. Töne werden durch eine Sinusschwingung einer<br />
einzigen Frequenz charakterisiert, während Geräusche aus vielen, übereinandergelagerten<br />
Frequenzen bestehen (ZENNER 1994).<br />
Die Leistungsfähigkeit des Gehörs weist, gerade in der Fähigkeit ein bestimmtes<br />
Frequenzspektrum zu verarbeiten, eine hohe artspezifische Variabilität auf. So können<br />
Elefanten Infraschall bis zu einer Wellenlänge von 14 Hz wahrnehmen. Die langwelligen<br />
Frequenzen werden über viele Kilometer transportiert, was den Tieren eine Kommunikation<br />
über große Distanzen ermöglicht. Ein anderes Extrem findet sich bei nachtaktiven<br />
Fledermäusen, welche sich mit Hilfe von sehr hochfrequenten Schallimpulsen auch in<br />
absoluter Dunkelheit orientieren können. Sie sind in der Lage Frequenzen im<br />
Ultraschallbereich bis zu 200 kHz wahrzunehmen. Die Wahrnehmung des menschlichen<br />
Gehörs weist ein Frequenzspektrum von 20 Hz bis 20 kHz auf, wohingegen die in dieser<br />
Studie als Tiermodell verwendeten Meerschweinchen ein Frequenzspektrum von 50 Hz bis<br />
50 kHz aufweisen (FAY 1988; PENZLIN 1991; SCHMIDT-NIELSEN 1999). Aber nicht nur<br />
in der Wahrnehmung der Tonhöhe, auch in der Verarbeitung von akustischen Reizen<br />
unterschiedlicher Schallintensitäten sind speziesspezifische Unterschiede evident. Besonders<br />
nachtaktive Carnivoren zeigen gegenüber dem Menschen ein leistungsfähigeres Gehör. So<br />
liegt die Hörschwelle von Hauskatzen im Bereich von 1 bis 10 kHz etwa 20 dB unter der des
12<br />
Menschen. Der gesamte Bereich der wahrnehmbaren Schallintensitäten wird als dynamische<br />
Breite bezeichnet und liegt beim Menschen in einem Rahmen von 0-120 dB SPL<br />
(ENGELHARDT u. BREVES 2004).<br />
Die physiologischen Vorgänge des Hörens lassen sich in drei wesentliche Abschnitte<br />
unterteilen. Zunächst wird der Schall über Gase oder Flüssigkeiten transportiert, was als<br />
Konduktion bezeichnet wird. Im Anschluss werden die Schallwellen im Ohr über die<br />
Sinneszellen in neuronale Aktivitäten umgewandelt. Bei diesem Vorgang spricht man von<br />
Transduktion. Die Transmission oder auch Reizfortleitung steht am Ende des Prozesses der<br />
Sinneswahrnehmung und evoziert durch die Verarbeitung im Gehirn die Wahrnehmung und<br />
die Interpretation der Qualität des akustischen Reizes (WEHNER u. GEHRING 2003).<br />
Am Beginn des eigentlichen Hörvorganges treffen die Schallwellen, welche durch die<br />
Ohrmuschel zum Gehörgang geleitet werden, auf das Trommelfell. Dieses wird dadurch in<br />
Schwingung versetzt und gibt diese mechanische Bewegung an den mit ihm verbundenen<br />
Hammer der Gehörknöchelchen weiter. Amboss und Steigbügel leiten diese Bewegung<br />
weiter, wodurch letztlich über die Steigbügelplatte ein Druck auf die Membran des ovalen<br />
Fensters ausgelöst wird. Dieser Druckimpuls wird auf die dahinterliegende Perilymphe<br />
übertragen. Durch die Inkompressibilität der Perilymphe bildet sich eine Wanderwelle. Diese<br />
beginnt am ovalen Fenster und verläuft über die Scala tympani bis zur Schneckenspitze und<br />
über das Helicotrema in die Scala vestibuli, worüber sie letztlich zum runden Fenster gelangt.<br />
Hierdurch wird die Basilarmembran in Schwingungen versetzt, wodurch es zu Scherkräften<br />
zwischen den Stereovilli der Haarzellen und der darüberliegenden Tektorialmembran kommt<br />
(LEONHARDT 1990). Durch die Auslenkung der Stereovilli werden am apikalen Zellende<br />
Ionenkanäle geöffnet. So strömen aus der kaliumreichen Endolymphe des Ductus cochlearis<br />
Kalium-Ionen in die Zelle, wodurch es zur Depolarisation und zum Einstrom von Kalzium-<br />
Ionen kommt. Durch die Depolarisation werden am basalen Zellpol in der Folge<br />
exzitatorische Neurotransmitter freigesetzt, wobei es sich hier vermutlich um Glutamat<br />
handelt (JANSSEN et al. 1991). Somit werden an den Afferenzen der Spiralganglienzellen<br />
Aktionspotentiale ausgelöst, was den Transduktionsprozess, also die Umwandlung eines<br />
äußeren Reizes in ein neuronales Körpersignal, abschließt.<br />
Die Wahrnehmung von unterschiedlichen Tonhöhen wird durch das Prinzip der<br />
Frequenzdispersion ermöglicht. Hierbei kommt es zu einer ortstonotopen Auslenkung der
13<br />
Basilarmembran durch die Wanderwelle. Dies bedeutet, dass unterschiedliche<br />
Schallfrequenzen zu einer maximalen Amplitude der Wanderwelle an unterschiedlichen Orten<br />
der Basilarmembran führen. So zeigt der Durchmesser des Schneckenganges im basalen<br />
Bereich eine wesentlich weitere Ausdehnung als apikal. Zudem besitzt die Basilarmembran in<br />
Apexnähe eine 1000-fach höhere Steifigkeit als im basalen Bereich. Dadurch kommt es zum<br />
Amplitudenmaximum der Wanderwelle hoher Frequenzen im basalen Bereich, während tiefe<br />
Frequenzen Wanderwellen mit einem Maximum in Apexnähe bilden (ALLEN 1980;<br />
ZENNER 1994). Zu dieser passiv durch die Wanderwelle ausgelösten Frequenzselektivität<br />
wird zusätzlich eine aktive Verstärkung der Wanderwelle durch die äußeren Haarzellen<br />
erreicht. Diese besitzen, neben der Fähigkeit zur Umwandlung von Schallenergie in<br />
elektrische Energie, motorische Eigenschaften durch ihr Aktinfilamentskelett und antworten<br />
auf Beschallung mit einer Kontraktion. Durch diesen aktiven Prozess verstärken sie die<br />
Amplitude der Wanderwelle und dämpfen benachbarte Basilarmembranabschnitte. Die<br />
Frequenzselektivität beruht damit auf der passiven Wanderwelle sowie auf einer durch die<br />
äußeren Haarzellen hervorgerufenen aktiven Verstärkung der Wanderwelle, wobei dieser<br />
Anteil den passiven Vorgang wesentlich übersteigt (REISS 2009).<br />
2.2 Hörminderung und Ertaubung<br />
2.2.1 Formen der Hörschädigungen<br />
Ätiologisch können Beeinträchtigungen des Hörempfindens in angeborene und erworbene<br />
Schädigungen eingeteilt werden. Während eine Fehlfunktion des Genoms ursächlich für<br />
hereditär bedingte Defekte ist, entstehen erworbene Schädigungen des Hörempfindens im<br />
Wesentlichen durch exogen zugeführte Noxen. Hierbei sind die Applikation von ototoxisch<br />
wirksamen Arzneimitteln (YAMANE et al. 1988; SELIMOGLU 2007) oder eine verstärkte<br />
Lärmexposition (MINAMI 2007) als Hauptursachen zu sehen.<br />
Weiterhin werden Hörschädigungen topographisch in schallleitungsbedingte, konduktive<br />
Beeinträchtigungen sowie in schallempfindungsbedingte, sensorineurale Beeinträchtigungen<br />
unterteilt (HOTH u. LENARZ 1994).
14<br />
Die konduktiven Fehlfunktionen betreffen das äußere und das Mittelohr. Hierbei kann es<br />
durch eine Vielzahl von möglichen Veränderungen zu einer gestörten Weiterleitung der<br />
Schallwellen kommen. Dadurch kann das Hörempfinden auch bei einem völlig intakten<br />
Innenohr gedämpft erscheinen oder völlig fehlen. Beispiele hierfür können eine vermehrte<br />
Ansammlung von Cerumen, Otosklerose, Neoplasien oder auch entzündliche Schwellungen<br />
sein.<br />
Ursachen von Schallempfindungsschwerhörigkeiten finden sich zum einen im Innenohr und<br />
werden als sensorische Fehlfunktionen (cochleär) bezeichnet. Weiterhin werden Störungen<br />
des Hörnervs als neurale und Fehlfunktionen im Bereich der zentralen Hörbahn als zentrale<br />
Störungen (retrocochleär) benannt (HOTH u. LENARZ 1994). Erkrankungen und<br />
Schädigungen der cochleären, sowie der retrocochleär gelegenen Strukturen werden als<br />
sensorineuraler Hörverlust zusammengefasst.<br />
Im Folgenden wird auf den sensorineuralen Hörverlust genauer eingegangen, da sich die<br />
vorliegende Studie mit der Verwendung von Nanopartikeln als Medikamentenapplikations-<br />
System (Drug-Delivery-System) zur potentiellen intracochleären Therapie bei Patienten mit<br />
sensorineuralem Hörverlust befasst.<br />
2.2.2 Sensorineuraler Hörverlust<br />
Der sensorineurale Hörverlust fasst Erkrankungen und Schädigungen der cochleären, sowie<br />
der retrocochleär gelegenen Strukturen zusammen.<br />
Der retrocochleäre, bzw. neurale Hörverlust ist ätiologisch durch Veränderungen des<br />
Hörnerves oder durch die Beeinträchtigung der weiterführenden Anteile der zentralen<br />
Hörbahn charakterisiert. Hierbei handelt es sich häufig um neoplastische Veränderungen,<br />
wobei aber auch entzündliche Prozesse oder Traumata nicht selten als Ursache in Frage<br />
kommen (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007).<br />
In der Humanmedizin stellt aber der cochleäre oder auch sensorische Hörverlust die weitaus<br />
häufigste Form der Schwerhörigkeit dar. Durch eine initiale Schädigung der Haarzellen ist die<br />
Transduktion von akustischen Reizen nicht mehr gegeben, wodurch ein Hörempfinden nicht
15<br />
mehr ermöglicht werden kann. Ursachen für diese Form der Hörschädigung können<br />
angeboren sowie erworbenen sein.<br />
Bei den angeborenen Formen unterscheidet man syndromale von nichtsyndromalen<br />
Ausprägungen. Beispiele für syndromale Ausprägungen sind mit Nieren- (z.B. Alport-<br />
Syndrom) oder Augenerkrankungen (z.B. Cogan-Syndrom, Wardenburg-Syndrom)<br />
assoziierte Hörschädigungen. Nichtsyndromale Ausprägungen werden beim Menschen<br />
hauptsächlich durch eine Mutation der gap-junction-Proteine Connexin 26 und 31<br />
hervorgerufen (LEFEBVRE u. VAN DE WATER 2000; LIU et al. 2008).<br />
Weiterhin kann der Verlust von Haarzellen aber auch durch Erkrankungen der Mutter<br />
während der Schwangerschaft ausgelöst werden, welche metabolische (bspw. Diabetes<br />
mellitus) oder infektiöse (bspw. Röteln) Ursachen haben können. Auch bei einem erschwerten<br />
Geburtsverlauf kann durch das Auftreten von Hypoxie eine Schädigung des Gehörs eintreten<br />
(BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007).<br />
In der Veterinärmedizin sind angeborene Hörminderungen in der Regel mit einer<br />
Pigmentierungsstörung assoziiert. So ist die Fellfarben-assoziierte sensorineurale Taubheit bei<br />
Katzen, Hunden, Pferden und Neuweltkameliden beschrieben (WEBB u. CULLEN 2010).<br />
Als Ursache werden zum einen Defekte in der Differenzierung und Reifung von Melanozyten<br />
diskutiert, zum anderen aber auch ein frühzeitiges Absterben sowie eine Fehlfunktion dieser<br />
auch in der Stria vascularis angesiedelten Zellen. So kann eine physiologische Funktion<br />
dieses in der Cochlea befindlichen Epithels nicht erreicht werden. In der Folge kommt es zum<br />
Absterben der Sinneszellen, wodurch das Tier letztlich ertaubt (STEEL u. BARKWAY 1989;<br />
OHLEMILLER 2009). So ist bei Katzen mit weißer Fellfärbung und blaugefärbter Iris eine<br />
polygenetische Ursache für den Hörverlust beschrieben (GEIGY et al. 2007). Bei Pferden,<br />
insbesondere Paint-Horses, wurde eine Assoziation zu dem endothelian receptor type B<br />
(EDNRB)-Gen nachgewiesen, welches auch für die Ausprägung des letalen, weißen,<br />
Fohlensyndroms verantwortlich ist (MAGDESIAN et al. 2009). Bei Hunden hingegen<br />
erwiesen sich Assoziationen zum Merle-Gen (z.B. Bobtail, Blue-Merle-Collie,<br />
harlekinfarbige-Dogge) sowie zum Piebald-Gen (z.B. Dalmatiner, Greyhound) als ursächlich<br />
(STRAIN et al. 2004; PLATT et al. 2006).<br />
Ursachen für einen erworbenen Verlust von Haarzellen können ebenfalls sehr vielfältig sein.<br />
So stellt neben altersbedingtem Hörverlust der Einfluss von ototoxischen Substanzen einen
16<br />
wesentlichen Anteil der erworbenen Hörminderungen dar. Aber auch Schädigungen durch<br />
eine erhöhte Lärmexposition führen zu einem Verlust von Haarzellen.<br />
Durch die Applikation von ototoxisch wirksamen Arzneimitteln, wie Aminoglykosid-<br />
Antibiotika oder Schleifendiuretika, kommt es nach systemischer Anwendung zu einer<br />
Schädigung der Haarzellen. So ist bereits nach wenigen Stunden post applicationem ein von<br />
der Basis der Cochlea ausgehender Haarzellverlust zu verzeichnen (WU et al. 2002). Hierbei<br />
wird die arzneimittelinduzierte Apoptose der Haarzellen im Wesentlichen durch zwei<br />
Mechanismen initiiert. Einerseits kommt es zur vermehrten Bildung von reactive oxygen<br />
species (ROS), welche über die Bildung freier Radikale die Apoptose der Zellen hervorrufen.<br />
Andererseits wird über eine Aktivierung der Stickstoffmonoxid-(NO)-Synthase die NO-<br />
Konzentration in den Zellen erhöht, was letztlich wieder zur Bildung von freien Radikalen<br />
und somit zur Apoptose führt (PRIUSKA u. SCHACHT 1995; TAKUMIDA et al. 1999).<br />
WEST et al. (1973) wiesen in Tierversuchen den Effekt des Haarzellverlustes durch die<br />
kombinierte Injektion des Aminoglykosids Kanamycin und des Schleifendiuretikums<br />
Ethacrynsäure nach. Aus diesen Ergebnissen etablierte sich ein häufig angewendetes Modell<br />
für die Erforschung der Taubheit nach initialem Haarzellverlust, wobei gleiche Erfolge durch<br />
die Verwendung des Schleifendiuretikums Furosemid erzielt werden konnten (VERSNEL et<br />
al. 2007). Eine weitere anerkannte Methode zur Ertaubung von Versuchstieren stellt ein durch<br />
erhöhte Lärmexposition hervorgerufener Hörverlust (noise induced hearing loss, NIHL) dar.<br />
Auch hier werden die apoptotischen Vorgänge über die Bildung von ROS und reactive<br />
nitrogen species (RNS) eingeleitet, indem sie zur Bildung von freien Radikalen führen<br />
(MINAMI 2007). Die schädigenden Effekte der durch Aminoglykoside sowie durch Lärm<br />
erzeugten Ertaubung führen demnach durch denselben Startmechanismus zur Apoptose der<br />
Haarzellen (KOPKE et al. 1999).<br />
Durch den primären Verlust von Haarzellen kommt es im weiteren Verlauf zu einer<br />
sekundären Degeneration der Spiralganglienzellen (OTTE et al. 1978; WEBSTER u.<br />
WEBSTER 1981; SPOENDLIN 1984), welche die erste Station der Reizweiterleitung in<br />
Bezug auf das Hörempfinden bilden. So hat die Anzahl der Spiralganglienzellen einen<br />
entscheidenden Einfluss auf die Funktionalität und den damit verbundenen therapeutischen<br />
Erfolg von Cochlea-Implantaten (GANTZ et al. 1993). Als Hauptursachen für die Apoptose<br />
der Spiralganglienzellen nach initialem Haarzellverlust werden zum einen die fehlende
17<br />
elektrische Stimulierung durch die von den Haarzellen gebildeten Neurotransmitter<br />
beziehungsweise Aktionspotentiale gesehen, zum anderen produzieren die Haarzellen eine<br />
Reihe von neurotrophen Faktoren. Von diesen üben unter anderem Neurotrophin-3, brain-<br />
derived neurotrophic factor (BDNF) und glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)<br />
einen essentiellen Einfluss auf die Vitalität der Spiralganglienzellen aus. Ohne die<br />
Anwesenheit der neurotrophen Faktoren ist langfristig das Überleben der Spiralganglienzellen<br />
nicht möglich (DODSON 1997; KANZAKI et al. 2002).<br />
2.2.3 Kompensation des sensorischen Hörverlusts durch Cochlea-Implantate<br />
Nach Verlust der Haarzellen ist es heute mittels eines Cochlea- Implantats möglich, ertaubten<br />
Patienten die Wiedererlangung eines Höreindrucks zu vermitteln. Hierdurch kann betroffenen<br />
Personen ein erneutes Sprachverständnis ermöglicht werden, was in einer erheblichen<br />
Steigerung der Lebensqualität resultiert (MATSCHKE u. PLATH 1988). Um jedoch eine<br />
Therapie mit Cochlea-Implantaten gewährleisten zu können, muss nach der Schädigung der<br />
sensorischen Strukturen die vollständige Funktionalität der den reizweiterleitenden Anteile<br />
der Hörbahn gegeben sein (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007).<br />
Cochlea-Implantate bestehen aus mehreren externen sowie internen, implantierten Anteilen.<br />
Zu den äußeren Anteilen zählt der im Außenohrbereich getragene Sprachprozessor, welcher<br />
über ein Mikrophon empfangene Schallschwingungen nach Filterung, Entrauschung und<br />
Komprimierung in elektrische Signale umwandelt. Das erzeugte Signalmuster wird an die<br />
ebenfalls externe, an der Kopfhaut getragene Sendespule weitergeleitet. Durch<br />
elektromagnetische Induktion wird die Information transkutan an die im Bereich des Mastoids<br />
implantierte Sendespule übermittelt. Letztlich gelangen die Signale über die mit der<br />
Sendespule verbundene Elektrode zum Hörnerv (LEHNHARDT et al. 1986). Die über eine<br />
Cochleostomie oder über die Rundfenstermembran in die Scala tympani eingeführte und<br />
möglichst modiolus- und damit spiralganglienzellnah positionierte Mehrkanalelektrode,<br />
ermöglicht durch die bis zu 22 Elektrodenkontakte eine frequenzabhängige elektrische<br />
Reizung der Spiralganglienzellen. Diese generieren daraufhin Aktionspotentiale, welche über
18<br />
die zentrale Hörbahn zum auditorischen Cortex weitergeleitet werden, wo sie einen<br />
Höreindruck evozieren (LENARZ 1997).<br />
In den letzten Jahren konnte unter anderem durch die Weiterentwicklungen der Elektroden ein<br />
immer besseres Hörempfinden und damit auch ein erheblich gesteigertes Sprachverständnis<br />
erzielt werden (HELMS u. MÜLLER 1999; BRADLEY et al. 2010). Dennoch ist der durch<br />
das Implantat erreichte Höreindruck nicht mit den physiologischen Leistungen zu<br />
vergleichen. Des Weiteren treten zuweilen beträchtliche Unterschiede zwischen behandelten<br />
Personen auf, welche in den individuellen Voraussetzungen begründet liegen (GANTZ et al.<br />
1993). Zusätzlich wird die Funktionalität des Cochlea-Implantats durch zwei wesentliche<br />
Faktoren beeinträchtigt. Zum einen muss die Anzahl der durch die Hörprothese angeregten<br />
Spiralganglienzellen auf einem möglichst hohen Niveau erhalten werden (INCESULU u.<br />
NADOL 1998), zum anderen kommt es durch postoperative Gewebsreaktionen zu<br />
Bindegewebsproliferationen und somit zu einer verschlechterten Nerv-Elektroden Interaktion,<br />
welche eine suboptimale Signalübertragung zwischen Elektrode und Spiralganglienzellen<br />
bedingt (NEWBOLD et al. 2004; PAASCHE et al. 2009).<br />
2.2.4 Ansätze zur Verbesserung der �erv-Elektroden-Interaktion<br />
Durch den Verlust der Haarzellen im Zuge der sensorischen Hörminderung kommt es<br />
aufgrund fehlender Haarzell-vermittelter elektrischer Stimulation, sowie der ausbleibenden<br />
Produktion von neurotrophen Faktoren zu einer progressiven Degeneration der<br />
Spiralganglienzellen (DODSON 1997; KANZAKI et al. 2002). Diesen sekundär eintretenden<br />
Zellverlust gilt es aufzuhalten, da eine Therapie mittels Cochlea-Implantat ohne eine<br />
ausreichende Dichte dieser Nervenzellen nicht optimal genutzt werden kann.<br />
Durch intensive Forschung konnten eine Vielzahl von neuroprotektiven Substanzen ermittelt<br />
werden, welche einen positiven Einfluss auf das Spiralganglienzellüberleben in vitro, sowie<br />
auch im Tierversuch nach erfolgter Ertaubung, zeigten (GILLESPIE u. SHEPHERD 2005).<br />
In Zellkulturexperimenten wurde ein protektiver Effekt auf das Spiralganglienzellüberleben<br />
unter anderem für brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3) sowie<br />
neurotrophin-4/5 (NT-4/5) nachgewiesen. Diese zu den Neurotrophinen gehörenden
19<br />
Substanzen stellen körpereigene Signalstoffe dar, welche über die Bindung an<br />
membranständige Rezeptoren die Interaktionen zwischen Neuronen modulieren und einen<br />
Einfluss auf das Überleben (HEMPSTEAD et al. 2006) und die Funktion der Neurone haben<br />
(REICHHARDT et al. 2006). Es werden zwei Arten von Rezeptoren unterschieden. Zum<br />
einen können Neurotrophine über den p75NT-Rezeptor binden, welcher zu den Rezeptoren<br />
der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Familie gehört und alle Neurotrophine binden kann und<br />
dadurch einen programmierten Zelltod auslöst. Im Vergleich zu den Rezeptoren der<br />
Tyrosinkinase-Rezeptor-Familie (TrkA, TrkB, TrkC) ist seine Affinität zu Neurotrophinen<br />
aber vergleichsweise gering. Diese hingegen binden nur spezifische Neurotrophine, wobei<br />
nach erfolgreicher Bindung eine Kaskade antiapoptotischer Vorgänge ausgelöst wird. Der für<br />
BDNF spezifische Rezeptor wird als TrkB bezeichnet (HUANG u. REICHARDT 2001). So<br />
erwiesen sich BDNF und NT-4/5 als sehr potente Substanzen, um das Überleben von<br />
kultivierten Spiralganglienzellen neonataler Ratten im Vergleich zu unbehandelten<br />
Kontrollgruppen zu sichern, während der Effekt von NT-3 zwar schwächer ist, aber dennoch<br />
eine signifikante Protektion zeigte (ZHENG et al. 1995; MALGRANGE et al. 1996;<br />
MARZELLA et al. 1999). Durch BDNF konnte des Weiteren eine Stimulation des<br />
Neuritenwachstums bei neonatal gewonnenen Spiralganglienzellen beobachtet werden<br />
(HARTNICK et al. 1996; MALGRANGE et al. 1996; GILLESPIE et al. 2001). Aber nicht<br />
nur Versuche mit neonatal gewonnenen, auch Studien mit Spiralganglienzellen adulter Ratten<br />
zeigten einen positiven Einfluss von BDNF auf die Überlebensrate (LEFEBVRE et al. 1994).<br />
So scheint der trophische Support der Spiralganglienzellen durch neurotrophe Faktoren auch<br />
im ausgewachsenen Organismus eine entscheidende Rolle zu spielen (GILLESPIE u.<br />
SHEPHERD 2005), dennoch konnte bei Studien mit Spiralganglienzellen adulter Ratten kein<br />
vermehrtes Neuritenauswachsverhalten gezeigt werden (LEFEBVRE et al. 1994).<br />
Auch im Tierversuch konnten die in den Zellkulturexperimenten gewonnen Erkenntnisse<br />
reproduziert werden. So wurden in zahlreichen Studien die Effekte unterschiedlicher<br />
neurotropher Faktoren an experimentell ertaubten Versuchstieren evaluiert. Besonders BDNF<br />
stellte sich in Versuchen mit mittels Kanamycin und Furosemid ertaubten Meerschweinchen<br />
als stark protektiv heraus. So wurde die Applikation von 0,25 µl/h BDNF in einer<br />
Konzentration von 62,5 µg/ml über einen Zeitraum von 28 Tagen ab dem fünften Tag nach<br />
der Ertaubung über eine osmotische Pumpe reguliert und bewirkte eine signifikant erhöhte
20<br />
Spiralganglienzellüberlebensrate (SHEPHERD et al. 2005). GILLESPIE et al. (2004) konnten<br />
des Weiteren auch protektive Effekte für NT-3, NT-4/5 in einer Konzentration von 62,5 µl/ml<br />
bei einer Verabreichung von 0,25 µl/h nachweisen. Hierbei wurden die Tiere erst nach 14<br />
Tagen mittels osmotischer Pumpen für 4 Wochen versorgt.<br />
Aber auch ein nicht zu den Neurotrophinen gehörender neurotropher Faktor stellte sich im<br />
Tiermodell als vielversprechend heraus. Der zur Transforming Growth Factor-β-(TGF-β)-<br />
Superfamilie gehörende glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF) bewirkte bei<br />
durch Lärmexposition ertaubten Meerschweinchen ein signifikant gesteigertes<br />
Spiralganglienzellüberleben. Die Applikation des GDNF erfolgte dabei über einen Zeitraum<br />
von 3 Wochen mittels osmotischer Pumpe. Die Behandlung wurde 4 Tage nach der Ertaubung<br />
begonnen wobei zunächst eine Applikation von 72 ng/h GDNF über einen Zeitraum von<br />
7 Tagen erfolgte. Die darauf folgenden 14 Tage wurde die Menge jedoch auf 50 ng/h GDNF<br />
reduziert (YLIKOSKI et al. 1998).<br />
Neben der Applikation von neuroprotektiv wirkenden Substanzen wurden auch Studien zur<br />
Ermittlung eines spiralganglienzellprotektiven Effekts durch elektrische Stimulierung<br />
durchgeführt. Die Ergebnisse der Studien durch HEGARTY et al. (1997) zeigten einen<br />
positiven Effekt auf die Vitalität von isoliert angezüchteten Spiralganglienzellen durch<br />
Wechselstrom. WEFSTAEDT (2006) konnte dahingegen in einem ähnlichen Versuchsaufbau<br />
keine signifikant gesteigerten Überlebensraten im Vergleich zu unstimulierten Zellgruppen<br />
feststellen. Die Anwendung von elektrischer Stimulation zeigte im Tiermodell in<br />
Kombination mit Neurotrophen Faktoren vielversprechende Ergebnisse (KANZAKI et al.<br />
2002; GILLESPIE u. SHEPHERD 2005; SHEPHERD et al. 2005). Aber auch der alleinige<br />
Einfluss der elektrischen Stimulation auf die Spiralganglienzelldichte ertaubter<br />
Meerschweinchen wurde von LOUSTEAU (1987) als signifikant erhöht beschrieben.<br />
Weiterhin zeigte SCHEPER (2007) im Versuch mit Kanamycin/Ethacrynsäure ertaubten<br />
Meerschweinchen, dass durch die Kombination von GDNF und elektrischer Stimulation eine<br />
noch höhere Spiralganglienzelldichte erreicht werden kann als durch die einzeln verabreichten<br />
Faktoren. Hierbei wurde mit der Behandlung über die elektrischen Stimuli, sowie auch die<br />
Applikation der entsprechenden neurotrophen Faktoren, drei Wochen nach der Ertaubung<br />
begonnen.
21<br />
Neben dem Erhalt der noch verbleibenden Spiralganglienzellen ist für die Therapie mittels<br />
eines Cochlea-Implantats eine möglichst optimale Nerv-Elektroden-Interaktion anzustreben.<br />
Daher ist während der Insertion der Elektrode auf eine modiolusnahe Positionierung zu achten<br />
(SHEPHERD et al. 1993). So wurden mittlerweile Cochlea-Implantate entwickelt, deren<br />
spiralförmig hergestellte Elektrode zunächst über ein Stilett in gerader Position gehalten wird.<br />
Während der Insertion der Elektrode wird das Stilett entfernt und die Elektrode kehrt in ihre<br />
Ausgangsformation zurück und kann sich so in Modiolusnähe positionieren (RAU et al.<br />
2010). Durch die spiralganglienzellnähere Position wird so ein wesentlicher Einfluss auf die<br />
Hörschwelle genommen (SHEPHERD et al. 1993).<br />
Ein weiterer wichtiger Einflussfaktor bezüglich der Nerv-Elektroden-Interaktion ist die<br />
Gewebsmanipulation im Rahmen der Operation. So kommt es durch die Insertion des<br />
Implantats zu einer Fremdkörperreaktion, in deren Verlauf der Organismus die Elektrode<br />
durch Bildung von Bindegewebe vom Körper abkapselt (TYKOCINSKI et al. 2001;<br />
PAASCHE et al. 2006). Dadurch kommt es zu einer Erhöhung der Impedanzen zwischen<br />
Nerv und Elektrode, was zum einen zu einer Erhöhung der Hörschwelle, zum anderen aber<br />
auch zu einem erhöhten Energieverbrauch des Implantats führt. So richtet sich ein<br />
Schwerpunkt der Forschungen auf eine Verminderung der postoperativen<br />
Bindegewebsbildung.<br />
Als möglichen Ansatz für die Hemmung des Bindegewebswachstums eignen sich<br />
antiinflammatorisch wirkende Substanzen, wie zum Beispiel Glukokortikoide. Vertreter<br />
dieser Arzneimittelgruppe zeichnen sich durch ihre hohe antiinflammatorische und<br />
immunsuppressive Wirkung aus. In einer humanen Versuchsreihe konnte durch die einmalige<br />
intraoperative Applikation des Glukokortikoids Triamcinolon eine signifikante Verringerung<br />
der Impedanz von Patienten mit Cochlea-Implantaten im Vergleich zur Kontrollgruppe<br />
erreicht werden. Hierbei wurde das Glukokortikoid in Form einer Kristall-Suspension<br />
verabreicht, was die Freisetzung des Arzneimittels über einen verlängerten Zeitraum von<br />
mehreren Wochen sicherstellte (PAASCHE et al. 2006). Auch HUANG und Kollegen (2000)<br />
konnten zeigen, dass durch Glukokortikoidtherapie posttraumatische Gewebsreaktionen und<br />
die darauffolgende Fibrosierung verringert werden kann. Weiterhin konnte WEFSTAEDT<br />
(2006) belegen, dass eine Applikation des Glukokortikoids Dexamethason in einer<br />
Konzentration von 100 ng/ml keinen Einfluss auf das Überleben von in Zellkultur
22<br />
angezüchteten Spiralganglienzellen hat. In einer weiteren Studie am Meerschweinchenmodell<br />
zeigte sich jedoch durch die Applikation von 0,5 µl Dexamethason in einer Konzentration von<br />
100 ng/ml über einen Zeitraum von 4 Wochen nach Insertion eines Elektrodenträgers, keine<br />
signifikante Verringerung des postoperativen Bindegewebswachstums (SCHEPER 2007).<br />
Ein weiterer Ansatz zur verbesserten Nerv-Elektroden-Interaktion besteht in der<br />
Modifizierung der Implantatoberflächen. Hierdurch soll die Adhärenz von entstehendem<br />
Bindegewebe verhindert werden, was in einer verringerten Impedanz resultieren würde.<br />
In-vitro-Studien zeigten, dass auf mittels Lasertechnik mikrostrukturierten Modelloberflächen<br />
aus Silikon bzw. Platin das Fibroblastenwachstum signifikant gehemmt werden kann (REICH<br />
et al. 2008). Somit ist anzunehmen, dass durch die speziell strukturierte Elektrodenoberfläche<br />
eine weitere Optimierung der Leistung von Cochlea-Implantaten ermöglicht werden könnte.<br />
2.2.5 Applikationswege zur medikamentösen Therapie des Innenohres<br />
Die systemische Behandlung von Erkrankungen des Innenohres wird durch das<br />
Vorhandensein der Blut-Cochlea-Schranke erschwert. Nur durch die Applikation von<br />
Arzneimitteln in sehr hohen Dosierungen kann ein ausreichender Wirkstoffspiegel im<br />
Innenohr erreicht werden, was zu einem hohen Risiko von Nebenwirkungen führt (SWAN et<br />
al. 2008). Somit stellen lokale Therapien meist die einzige Möglichkeit dar, eine gezielte<br />
Behandlung von Innenohrerkrankungen durchzuführen.<br />
Hierzu eignet sich zunächst die Applikation von Wirkstoffen über die Rundfenstermembran.<br />
Im Gegensatz zur direkten intracochleären Verabreichung von Arzneimitteln wird eine<br />
genaue Dosierung durch erhebliche individuelle Unterschiede in der Dicke der Membran und<br />
der daraus variablen Diffusionsgeschwindigkeit erschwert (BANERJEE u. PARNES 2004).<br />
Vorteile hinsichtlich der intracochleären Applikation ergeben sich aber durch ein geringeres<br />
Infektionsrisiko sowie einem geringeren Operationstrauma. Neben der Applikation von<br />
lipophilen Arzneimitteln, wie Glukokortikoiden, zeigten Studien auch den Übertritt von<br />
adenoviralen Vektoren durch die Rundfenstermembran in das Innere der Cochlea. So konnte<br />
mit Hilfe von Gensequenzen, welche in diesem viralen Drug-Carrier transportiert wurden, die<br />
erfolgreiche Transfektion von Zellen der Cochlea nachgewiesen werden, obgleich sie
23<br />
wesentlich geringer war, als es in Studien mit intracochleärer Applikation gezeigt werden<br />
konnte (STÖVER et al. 1999). Aber auch die Applikation von Nanopartikeln, als mögliches<br />
Drug-Carrier-System, zeigte gute Penetrationseigenschaften durch die Rundfenstermembran<br />
(ZHANG et al. 2011).<br />
Trotz des höheren Infektionsrisikos haben intracochleäre Applikationswege aufgrund der<br />
genaueren Dosierungsmöglichkeiten und der besseren intracochleären Verteilung erhebliche<br />
Vorteile gegenüber der Behandlung über die Rundfenstermembran. So können Arzneimittel<br />
durch die einmalige Applikation per Mikroliterspritze und angeschlossenem<br />
Injektionskatheter in die Scala tympani gebracht werden (LEGOUIX u. PIERSON 1977;<br />
PAASCHE et al. 2006; SCHEPER et al. 2009b). Eine weitere Möglichkeit bieten osmotische<br />
Pumpen, welche über einen Mikrokatheter die entsprechenden Wirkstoffe kontinuierlich über<br />
einen längeren Zeitraum in die Cochlea bringen können, wobei sich aber das Risiko einer<br />
Fibrosierung durch den im Innenohr positionierten Katheter ergibt (BROWN et al. 1993).<br />
Das Einschleusen von Gensequenzen stellt eine weitere Möglichkeit dar, erhebliche Erfolge<br />
in der Behandlung von Innenohrerkrankungen zu erzielen. Durch die Verwendung von<br />
Gensequenzen neurotropher Faktoren könnten die intracochleär transfizierten Zellen die<br />
Produktion dieser Substanzen selbst übernehmen (YAGI et. al. 2000; REJALI et. al. 2007).<br />
Aber auch Gensequenzen zur Transdifferenzierung von Stützzellen des Cortischen Organs<br />
könnten eine hoffnungsvolle Therapiemöglichkeit ergeben. So konnten Stützzellen durch die<br />
Transfektion mit dem Math1 bzw. Atoh1-Gen in funktionelle Haarzellen umgewandelt<br />
werden (KAWAMOTO et al. 2003; IZUMIKAWA et al. 2005).<br />
Der Transport dieser Gensequenzen ist über Drug-Delivery-Systeme, wie zum Beispiel virale<br />
Vektoren, durchführbar. Trotz vielversprechender Ergebnisse hinsichtlich der Expression und<br />
daraus erzielten protektiven Wirkungen auf die Zellen des Innenohres (DUAN et al. 2004;<br />
YAGI et. al. 2000), weisen virale Vektoren erhebliche Nachteile auf. So zeigen sie meist sehr<br />
niedrige Transfektionsraten von geringer Dauer und sind gegenüber den unterschiedlichen<br />
Zelltypen sehr unspezifisch. Darüber hinaus zeigte sich ein hohes Potential für entzündliche<br />
und immunologische Reaktionen. Zudem weisen die Vektoren die Fähigkeit zur Migration in<br />
das kontralaterale Innenohr auf (KHO et al. 2000; STÖVER et al. 2000). Letztlich stellt die<br />
potentielle Infektiosität ein weiteres Risiko bei der Behandlung von Menschen dar, welches<br />
zudem ethische Bedenken begründet.
24<br />
Eine weitere Behandlungsmöglichkeit besteht darin, über die zellbasierte Therapie<br />
neurotrophe Faktoren in der Cochlea freizusetzen. So können genmodifizierte Fibroblasten<br />
das Neurotrophin brain derived neurotrophic factor (BDNF) produzieren und über eine<br />
modifizierte Elektrode in die Cochlea gebracht werden (REJALI et al. 2007). Jedoch sind<br />
noch keine Daten über die Dauer der BDNF-Produktion sowie andere etwaige Einflüsse auf<br />
die Cochlea durch Abwanderung und einer dadurch möglichen Fibrosierung durch die<br />
eingebrachten Zellen bekannt.<br />
Begründet durch die noch nicht absehbaren Gefahren der zellbasierten Therapie, sowie den<br />
Nachteilen der viralen Vektoren, besteht die Notwendigkeit, neue Therapiemöglichkeiten zu<br />
entwickeln, wobei ein viel versprechender Ansatz in der Entwicklung nonviraler Vektoren<br />
liegt. So bieten synthetisch hergestellte Nanopartikel eine aussichtsreiche Möglichkeit zum<br />
Transport von Arzneimitteln oder Gensequenzen und zeigen dabei nicht die erheblichen<br />
Nachteile viraler Vektoren auf. Die Vorteile der nanopartikelbasierten Therapie liegen in der<br />
nicht vorhandenen Infektiosität sowie in der Produktion von biodegradablen Grundgerüsten,<br />
welche eine möglichst geringe Reaktion des Körpers erwarten lassen. Weiterhin ist eine<br />
kostengünstige Herstellung realisierbar, wobei durch die Möglichkeit der<br />
Oberflächenmodifikation des Partikels mit spezifischen Rezeptoren eine Zellselektivität<br />
erreicht werden soll, sodass ganz bestimmte Gewebe oder Zellpopulationen angesteuert<br />
werden können. Durch den Einsatz von Nanopartikeln ist demnach eine gezielte Behandlung<br />
von verändertem Gewebe denkbar, was entscheidende Vorteile gegenüber den<br />
herkömmlichen Therapieformen hinsichtlich der Minderung von Nebenwirkungen bewirken<br />
kann (PAUTLER u. BRENNER 2010).
2.3 �anotechnologien<br />
2.3.1 Definition, Eigenschaften von �anostrukturen und deren Anwendung<br />
25<br />
Eine präzise Definition des Terminus “Nanotechnologie” stellt sich als Herausforderung dar.<br />
So ist in der Literatur keine einheitliche Beschreibung über die Größe der hergestellten<br />
Strukturen zu finden. Die Angaben geben dennoch einen Rahmen von 0,1 bis 500 nm an<br />
(WOLF 2009; PHILPOTT 2011 et al.), wobei sich der Großteil der Quellen auf einen<br />
Größenbereich von 1 bis 100 nm beschränkt (NARDUCCI 2007; RIVIERE 2007; SCOTT<br />
2007; KIM et al. 2010). In diesem Maßstab zeigen sich aufgrund der physikalischen,<br />
chemischen und biologischen Eigenschaften von Materialen häufig abweichende<br />
Eigenschaften im Vergleich zum makroskopischen Level (RIVIERE 2007; SCOTT 2007). So<br />
wird die chemische Reaktivität durch die extrem große Oberfläche im Verhältnis zum<br />
Volumen immens gesteigert, wodurch Nanostrukturen eine katalytische Wirkung<br />
zugeschrieben werden kann (SCOTT 2007; LIU u. GU 2009; KIM et al. 2010)<br />
Die Grundgerüste der Nanostrukturen sind vielgestaltig, so ist es möglich, je nach<br />
gewünschtem Einsatzgebiet organische wie auch anorganische Strukturen zu synthetisieren,<br />
welche die unterschiedlichsten Formen aufweisen können. Neben den aus Kohlenstoffatomen<br />
bestehenden sphärischen Fullerenen sind auch sogenannte �anotubes herstellbar, bei denen<br />
die Kohlenstoffatome in Form einer Röhre angeordnet sind. Die beachtliche mechanische<br />
Belastbarkeit dieser Nanostrukturen (ZHANG et al. 2005) macht den Einsatz zur<br />
Stabilisierung der unterschiedlichsten Materialien denkbar. So reichen die Visionen über die<br />
Verbesserung der Belastbarkeit von Alltagsgegenständen bis hin zur Optimierung von<br />
schusssicherer Kleidung (COLLINS 2000). Des Weiteren werden im Bereich der<br />
Medizinforschung liposomale Partikel als Arzneimitteltransporter eingesetzt. Aber auch<br />
sogenannte Dendrimere, welche sich durch eine verzweigte Grundstruktur auszeichnen, sind<br />
für die Ankopplung von Arzneimitteln geeignet und werden in diesem Gebiet eingesetzt.<br />
(KIM et al. 2010).<br />
Aufgrund der besonderen Eigenschaften findet Nanotechnologie heute in den<br />
unterschiedlichsten Bereichen Anwendung, wobei Nanostrukturen allein oder im Hinblick auf<br />
die Modifikation von Oberflächen anderer Materialen genutzt werden. Diese vielfältige
26<br />
Anwendbarkeit fördert Weiterentwicklungen insbesondere in den Bereichen der Medizin<br />
(Diagnose, Monitoring, Behandlung) und Elektronik (z.B. Mikrochips). Aber auch in den<br />
Materialwissenschaften werden vermehrt Nanostrukturen angewendet, wobei beispielsweise<br />
mit „Manufactured Nanomaterials“ beschichtetes Glas einen Lotuseffekt aufweist, was in der<br />
Solarzellindustrie einen entscheidenden Beitrag zu einer langfristig hohen Energiegewinnung<br />
führt (LEE et al. 2010). Zudem konnten in den letzten Jahren Erfolge zur Verlängerung der<br />
Haltbarkeit von Lebensmitteln durch speziell mit Nanotechnolgie optimierten<br />
Verpackungsstoffen erreicht werden. Durch antibakteriell wirksame Nanobeschichtungen<br />
kann so ein frühzeitiges Verderben der Nahrung verhindert werden (IMRAN et al. 2010).<br />
2.3.2 �anotechnologie in der Medizin<br />
Nanotechnologien finden bereits heute ein breites Anwendungsspektrum in der Medizin. So<br />
werden nanoskalige Strukturen in Diagnose und Therapie von Krankheiten eingesetzt, wobei<br />
der Wirkstofftransport via Nanopartikel zur Entwicklung wirkungsvoller Drug-Delivery-<br />
Systeme das größte Anwendungsfeld darstellt (VENUGOPAL et al. 2008).<br />
Besonders in der Diagnose und Behandlung von Tumoren werden Nanomaterialien vermehrt<br />
verwendet (KIM et al. 2010). Mit speziell designten Nanopartikeln ist es bereits möglich,<br />
Tumorgewebe aufzuspüren, wobei die Partikel zum einen als Arzneimittel-Carrier wirken<br />
können aber auch als Kontrastmittel für diagnostische Zwecke dienen. So reichern sich<br />
Nanostrukturen, bedingt durch eine größere Permeabilität der Gefäße und einem gleichzeitig<br />
gestörtem Lymphsystem (MORILLE et al. 2010), im tumorös veränderten Gewebe an<br />
(HOBBS et al. 1998). Dadurch können an Nanopartikel gekoppelte antineoplastische<br />
Arzneimittel im Vergleich zu herkömmlich applizierten Medikamenten eine höhere<br />
Wirkstoffkonzentration im Zielgewebe erreichen. Weiterhin kann durch Modifikation der<br />
Polymerzusammensetzung des Carriersystems eine kontrollierte Abgabe der Arzneimittel<br />
erzielt werden. Dadurch wird die Dauer der Degradation des Partikels und damit die<br />
Freisetzungsgeschwindigkeit des Ladungsgutes verändert. Durch die Beschichtung der<br />
Partikeloberfläche mit Polyethylenglycol (PEG) kann zudem die Halbwertszeit im Blutstrom<br />
verlängert werden, da auf diese Weise eine wirkungsvolle Opsonisierung dieser
27<br />
körperfremden Stoffe verhindert wird und somit dem Immunsystem gegenüber maskiert<br />
werden (PRENCIPE et al. 2009). Weiterhin zeigt sich ein entscheidender Vorteil der<br />
Nanomedizin in verringerten Nebenwirkungen, da eine unspezifische Aufnahme von<br />
Arzneimitteln in gesundes Gewebe verhindert werden soll (ALEXIS et al. 2008; PRENCIPE<br />
et al. 2009). So zeigten VISARIA et al. (2006) eine Anreicherung von mit TNF-α-<br />
beschichteten Goldnanopartikeln in Tumorgewebe von betroffenen Personen, welche auf eine<br />
herkömmliche Therapie nicht mehr responsiv waren. Über dieses Drug-Delivery-Systgem war<br />
es möglich, den Patienten ohne Nebenwirkungen eine 20-mal höhere Dosis von TNF-α zu<br />
applizieren. Weitere Therapiemöglichkeiten bieten sich durch die Injektion von speziellen<br />
Nanopartikeln, sogenannten Nanoshells. Hierbei handelt es sich um einen Nanopartikel mit<br />
einem dielektrischen Kern (bspw. Silicium) welcher mit einer ultradünnen Metalloberfläche<br />
beschichtet ist (bspw. Gold) (SCOTT 2007). Durch die Anregung mit Licht im Nah-<br />
Infrarotbereich (700-800 nm), werden die Elektronen des Metalls angeregt und zerstören<br />
durch eine lokalisierte Erwärmung das sie umgebene Tumorgewebe (HIRSCH et al. 2003).<br />
Aber nicht nur in der Therapie, auch in der Diagnose von Neoplasien werden<br />
Nanotechnologien eingesetzt. So werden „superparamagnetic iron oxide nanoparticles“<br />
(SPION) verwendet, welche in der Bildgebung der Magnetresonanztomographie einen hohen<br />
Kontrast zu nanopartikelfreiem Gewebe aufzeigt (HARISINGHANI et al. 2003). Durch die<br />
Beschichtung mit krankheitsspezifischen Liganden, welche durch spezifische Antikörper<br />
gestellt werden könnten, wäre es möglich bestimmte Krankheiten vor einer klinischen<br />
Symptomatik zu erkennen oder aber den Erfolg einer Therapie zu evaluieren (MULDOON et<br />
al. 2006; SUMER u. GAO 2008).<br />
Weiterhin findet die Nanotechnologie auch im Bereich der Implantatforschung Anwendung.<br />
Durch den Einsatz von Diamantbeschichtungen kann eine Erhöhung der Stabilität von<br />
Implantaten erreicht werden. Des Weiteren finden Oberflächenmodifikationen mit<br />
Silbernanopartikeln als antibakterielle Beschichtungen erfolgreich Verwendung<br />
(SCHIERHOLZ et al. 1998).<br />
Neben den Anwendungen im lebenden Organismus bieten Nanopartikel zudem auch Vorteile<br />
im Bereich der In-vitro-Diagnostik. Hier liegt der Fokus auf der Früherkennung von<br />
diagnostisch relevanten Proteinen, Nukleinsäuren oder Genen. Als besonders geeignet haben<br />
sich Goldnanopartikel herausgestellt, welche durch eine Beschichtung mit speziellen DNA-
28<br />
Sequenzen als hochspezifisches Suchinstrument für unterschiedlichste Krankheiten verwendet<br />
werden kann (NAM et al. 2003).<br />
2.3.3 Anwendung von �anomedizin in der Otologie<br />
Systemische Behandlungen von Erkrankungen des Innenohres sind aufgrund der<br />
anatomischen Gegebenheiten in ihrer Effizienz limitiert. So ist die Blut-Cochlea-Schranke,<br />
welche im physiologischen Sinne die Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke aufweist, dafür<br />
verantwortlich, dass systemisch applizierte Arzneimittel nur unter hohen Dosierungen den<br />
erforderlichen Wirkstoffspiegel im Innenohr erreichen (SWAN et al. 2008). Aufgrund der<br />
dadurch entstehenden Belastung des gesunden Gewebes durch die vom hochdosierten<br />
Arzneimittel hervorgerufenen Nebenwirkungen, ist ein gezielter Transport des Arzneimittels<br />
zu den veränderten Geweben anzustreben.<br />
Nun bietet die Nanomedizin zwei wesentliche Ansätze zur Therapie von<br />
Innenohrerkrankungen. Eine Möglichkeit bietet die Modifikation der Oberfläche von<br />
Cochlea-Implantaten, durch die ein gezielter Transport von Wirkstoffen (Gene, Arzneimittel-<br />
insbesondere neurotrophe Faktoren) zu den Zielzellen erreicht werden soll. Dadurch kann die<br />
Funktionalität des Implantats bei hochgradig hörgeschädigten Patienten optimiert werden. Ein<br />
weiterer Ansatz wäre die Möglichkeit einer Applikation auf die Rundfenstermembran, wobei<br />
die Nanopartikel durch Permeation die gewünschten Zielzellen der Cochlea erreichen können.<br />
Im Vergleich zu einer direkten Applikation über die Eröffnung des Innenohres, stellt diese<br />
Methode einen weitaus weniger invasiven Vorgang dar.<br />
Ein weiterer Vorteil der Nanopartikel-basierten Medizin eröffnet sich über die<br />
Zusammensetzung des Carriersystems, durch welche sich eine zeitlich gesteuerte Freisetzung<br />
der Arzneimittel ermöglichen ließe, sodass auch eine längerfristige Freisetzung von<br />
Wirkstoffen möglich ist (KIM et al. 2010).<br />
In ersten Studien mit Chinchillas konnten GE et al. (2007) nachweisen, dass auf die<br />
Rundfenstermembran applizierte Polylactoglykolsäurenanopartikel diese durchdringen und<br />
sich intracochleär verteilen. Eine andere Studie zeigte ein ähnliches Verhalten von Rhodamin<br />
markierten Polylactoglykolsäurenanopartikel, wobei die Nanopartikel auch in geringer
29<br />
Konzentration nach systemischer Applikation in der Cochlea nachgewiesen werden konnten<br />
(TAMURA 2005). Die Verteilung der Nanopartikel in den unterschiedlichen<br />
Zellpopulationen der Cochlea wies aber in beiden Fällen keine Spezifität auf. Auch<br />
SCHEPER et al. (2009b) konnten durch die intracochleäre Applikation von Fluoreszein-5-<br />
isothiocyanat (FITC) markierten hyperverzweigten Polylysin-Nanopartikeln sowie<br />
Lipidnanokapseln keine Selektivität nachweisen. Dennoch zeigten diese Partikel eine gute<br />
zelluläre Aufnahme, wobei keine zytotoxischen Effekte evident waren.<br />
Weitere Studien belegten sogar einen protektiven Effekt auf die Spiralganglienzellen von<br />
Meerschweinchen, welche eine Woche zuvor medikamentös ertaubt wurden. An Tag sieben<br />
der Studie wurde den Tieren ein Hydroxyapatit-Nanopartikel mit einem rekombinanten green<br />
fluorescent protein (GFP) + Neurotrophin-3 (NT-3)-Plasmid intrachochleär injiziert. Der<br />
Nachweis der GFP-NT-3 Expression gelang bereits an Tag 14 der Studie durch<br />
immunohistochemische Auswertung, wobei sich der protektive Effekt auf die<br />
Spiralganglienzellen durch die Histologie sowie durch die Durchführungen von aABR-<br />
Messungen zeigte (ZHU et al. 2005; JIANG et al. 2007).<br />
Die Ergebnisse der oben genannten Studien zeigen vielversprechende Ansätze zur<br />
zukünftigen Therapie von Innenohrerkrankungen mittels Nanotechnologien, sei es durch die<br />
Modifikation von Cochlea-Implantaten oder durch die lokale bzw. systemische Applikation<br />
von biologisch aktiven, d.h. mit Arzneimitteln oder Genen gekoppelten Nanopartikeln.<br />
2.3.4 �anomedizin in der Veterinärmedizin<br />
Auch in der Veterinärmedizin wird die Nanomedizin in Zukunft einen erheblichen Einfluss<br />
ausüben. Gerade in den Bereichen der Diagnostik und Therapie werden analog zur<br />
Humanmedizin dramatische Veränderungen vorausgesagt (SCOTT 2007). Durch immer<br />
höhere Sicherheitsstandards in der Nahrungsmittelindustrie aber auch durch immer älter<br />
werdende und in einem zunehmenden Maße an „Zivilisationskrankheiten“ leidenden<br />
Haustieren kommt es zu rapide steigenden Kosten. Deshalb muss nach neuen<br />
Lösungsansätzen gesucht werden, welche die Nanomedizin bieten könnte (NARDUCCI 2007;<br />
RIVIERE 2007).
30<br />
So ist es denkbar, dass insbesondere in der Diagnostik und Behandlung von Tumoren große<br />
Fortschritte erzielt werden. Schon heute ist es möglich, mittels Anreicherung von Nanoshell-<br />
Nanopartikeln in neoplastischen Zellverbänden von Mäusen Tumorgewebe gezielt zu<br />
zerstören, indem die Partikel durch äußere Anregung über langwelliges Licht im Nah-<br />
Infrarotbereich das sie umgebene Tumorgewebe auf bis zu 55 °C erwärmen und damit<br />
zerstören (HIRSCH et al. 2003).<br />
Weitere, in naher Zukunft nutzbare Errungenschaften der Nanomedizin stellen sogenannte<br />
Drug-Carrier-Systeme dar. Diese sollen nach dem „Smart Drug-Delivery-Prinzip“ wirken. So<br />
wird dieses Prinzip von SCOTT (2007) im makroskaligen Bereich mit den Diensten der<br />
Postzustellung verglichen. Verschlossene und adressierte Sendungen werden erst nach<br />
Zustellung beim Empfänger geöffnet. Auf den nanoskaligen Bereich übertragen bedeutet das,<br />
dass die in Nanostrukturen eingeschlossenen oder angekoppelten bioaktiven Substanzen<br />
(Arzneimittel, Gene) erst im Zielgewebe freigesetzt werden. Somit können Krankheiten mit<br />
einer wesentlich geringeren Arzneimitteldosis behandelt werden, was gerade im Hinblick auf<br />
die Therapie mit antimikrobiellen Wirkstoffen im Bereich der Nahrungsmittelindustrie<br />
erhebliche Vorteile aufzeigt. So werden nicht nur Wartezeiten für Nahrungsmittel von<br />
lebensmittelliefernden Tieren verringert, sondern auch potentielle Restrisiken für den<br />
Endverbraucher minimiert (SCOTT 2007).<br />
Zusätzlich werden Veränderungen im Bereich der Tierzucht erwartet. Durch die subkutane<br />
Injektion von Nanotubes sollen über Fluoreszenz im Nah-Infrarotbereich feinste<br />
Schwankungen des Estradiolspiegels im Bereich der Nutztiergynäkologie bei Schweinen und<br />
Rindern festgestellt werden können, wodurch eine stark vereinfachte und genauere,<br />
sensorgesteuerte Östrusbestimmung ermöglicht werden soll (SCOTT 2007).<br />
2.3.5 Lipidnanokapseln<br />
Bei den in dieser Arbeit verwendeten Lipidnanokapseln (LNC) handelt es sich um<br />
Nanopartikel mit einem flüssigen Kern auf der Basis von Triglyceriden (Labrafac ® ), welcher<br />
von einer Phasengrenzschicht aus oberflächenaktiven Tensiden (Lipoïd ® und Solutol ® )<br />
umgeben ist. Um den Partikel gegenüber metabolischen Einflüssen im Körper zu schützen,
31<br />
wurde die Partikeloberfläche zusätzlich mit Polyethylenglycol (PEG) modifiziert, wodurch<br />
die Opsonisierung über das Komplementsystem des Körpers erschwert wird. Hierüber kann<br />
eine wirkungsvolle Maskierung des Partikels gegenüber dem Immunsystem erwirkt werden<br />
(KIM et al. 2010; VONARBOURG et al. 2009), was zu einer längeren Halbwertszeit im Blut<br />
und damit zu einer längeren Zirkulation im Körper führt (ABDEL-MOTTALEB et al. 2010;<br />
PERRIER et al. 2010). Des Weiteren wurde der Nanopartikel über eine Bindung zum PEG<br />
mit dem Fluoreszenzmarker Fluoreszein-5-isothiocyanat (FITC) markiert, um eine<br />
Lokalisation der Partikel in vitro und in vivo zu ermöglichen.<br />
In den vorliegenden Versuchen wurde der Einfluss des Phosphodiesterase-Hemmers<br />
Rolipram auf den Erhalt von Spiralganglienzellen untersucht. So konnten WHITAKER et al.<br />
(2008) bereits einen neuroprotektiven Effekt für Rolipram nachweisen. Da Rolipram im<br />
Intrazellularraum wirkt, wurde neben einer direkten Behandlung der Effekt über eine<br />
Applikation mittels LNC als Drug-Delivery-System untersucht. So wäre eine verlängerte<br />
Freisetzung des Arzneimittels aus dem Nanopartikel denkbar, worüber ein gesteigerter Effekt<br />
erzielt werden kann.<br />
So konnten im Hinblick auf die Therapie von Tumoren bereits eine große Vielzahl von<br />
unterschiedlichen Medikamenten in das Innere der Lipidnanokapseln eingefügt werden,<br />
wobei Doxorubicin, Paclitaxel, Docetaxel und Hydroxytamoxifen als Beispiele genannt seien<br />
sollen (HUYNH et al. 2009). Allen Arzneimitteln ist eine hohe Lipophilität gemeinsam, die es<br />
vergleichsweise einfach macht, sie in den lipophilen Kern des Nanopartikels einzuschließen.<br />
Aber auch hydrophile DNA Abschnitte konnten über eine besondere Methode in<br />
Lipidnanokapseln eingeschlossen werden. So bediente man sich eines Lipoplexnanopartikels<br />
in welchem die DNA eingeschlossen wurde und somit in die LNC eingeschleust werden<br />
konnte. Im Tierversuch zeigte sich nach der intravenösen Applikation der Partikel in die<br />
Schwanzvene von Mäusen, dass eine wesentlich längere Verweildauer der LNCs im<br />
Organismus erreicht werden konnte, was auf eine signifikant verbesserte Stabilität der LNC<br />
im Vergleich zu solitär injizierten Lipoplexen hinweist. So wurden nach 60 Minuten noch<br />
etwa 40 % der fluoreszenzmarkierten LNCs im Blut der Mäuse nachgewiesen<br />
(VONARBOURG et al. 2009), während die Konzentration der Lipoplexe nach fünf Minuten<br />
bereits einen Wert von unter 1 % erreicht hatte (BARRON et al. 1998). Diese Stabilität zeigt<br />
entscheidende Vorteile der Lipidnanokapseln im Hinblick auf eine verlängerte Abgabe von
32<br />
Arzneimitteln. So konnten LAMPRECHT et al. (2002) in früheren Studien mittels High-<br />
performance liquid chromatography (HPLC) nachweisen, dass die LNCs bei einem<br />
physiologischen pH-Wert von 7,4 und 37 °C die Hälfte ihres Ladungsgutes erst nach etwa<br />
einer Woche freigegeben haben. Ein initialer Burst-Effekt, d. h. die Freisetzung des<br />
vollständigen Ladungsgutes nach etwa einer Minute, wie er sich bei solid lipid nanocapsules<br />
gezeigt hatte (ZUR MÜHLEN et al. 1998), konnte nicht beobachtet werden. So können die<br />
hergestellten Nanopartikellösungen bei einer Temperatur von 4 °C über Monate gelagert<br />
werden, ohne dass sie ihr Ladungsgut freisetzen (HUYNH et al. 2009). Eine weitere<br />
interessante Studie zeigte, dass mit PEGylierten DNA-Lipidnanokapseln eine erheblich<br />
erhöhte Transfektionsrate in neoplastischem Gewebe erzielt werden konnte (MORILLE et al.<br />
2010). Hierbei wurde die Genexpression der in den Partikeln inkorporierten Luciferase nach<br />
intravenöser Injektion in Tumorgewebe, Lungen, Nieren, Leber und Milz der Versuchstiere<br />
evaluiert. Durch die Synergie von der erhöhten Zirkulationsdauer der mit PEG<br />
oberflächenmodifizierten Nanopartikel und dem EPR-Effekt (enhanced permeability and<br />
retention) konnte eine 84-fach höhere Luciferaseexpression im Tumorgewebe im Vergleich<br />
zu den anderen Organen erzielt werden. Hierbei kommt es durch den EPR-Effekt zu einer<br />
Anreicherung der Nanopartikel im Gewebe des Tumors, was im Wesentlichen durch die<br />
höhere Vaskularisation des tumorösen Gewebes, insbesondere aber auch durch die erhöhte<br />
Permeabilität dieser Gefäße bedingt ist und zum Übertritt der Partikel in das Gewebe führt.<br />
Durch die erheblichen Mängel des lymphatischen Systems im neoplastischen Gewebe werden<br />
Fremdstoffe über die Lymphe nur unzureichend abgeführt. Folglich kommt es zur Retention<br />
der Nanopartikel im Tumorgewebe (MATSUMURA und MAEDA 1986).<br />
Neben der Tumormedizin bieten sich Lipidnanokapseln aber auch in vielen anderen Gebieten<br />
der Medizin als vielversprechendes Drug-Carrier-System an. Als Beispiel sei die Möglichkeit<br />
einer effektiveren Vakzination genannt. Über die Oberflächenmodifikation mit<br />
Mannosederivaten wird eine Aufnahme der Partikel über Mannoserezeptoren von<br />
antigenpräsentierenden Zellen erleichtert (HEURTAULT et al. 2010). Weiterhin konnten<br />
erfolgreiche Studien mit antikörperbeschichteten LNCs hinsichtlich der Überwindung der<br />
Blut-Hirn-Schranke durchgeführt werden. So zeigten mit monoklonalen OX-26 Antikörpern<br />
beschichtete Nanopartikel eine nach intravenöser Injektion um 100 % erhöhte Konzentration<br />
im Gehirn im Vergleich zu nichtkonjugierten Nanokapseln. Über den OX-26 Antikörper wird
33<br />
eine zielgerichtete Verbindung zum Transferrinrezeptor des zerebralen Endotheliums<br />
ermöglicht, wodurch eine verbesserte Überwindung der Blut-Hirn-Schranke erzielt wird<br />
(BEDUNEAU et al. 2008).<br />
Die Überwindung von Barrieren spielt auch in der Behandlung von Innenohrerkrankungen<br />
eine große Rolle. So sind die Strukturen der Cochlea durch die Blut-Cochlea-Schranke vor<br />
Fremdstoffen aus dem Blut weitgehend geschützt, was eine systemische Behandlung von<br />
Innenohrerkrankungen sehr schwierig macht (SWAN et al. 2008). Erste Studien zielten darauf<br />
ab, die Verteilung von Lipidnanokapseln im Inneren der Cochlea zu untersuchen, nachdem sie<br />
über eine Eröffnung des Mittelohres auf die Rundfenstermembran von Ratten appliziert<br />
wurden. ZOU et al. (2008) zeigten, dass die fluoreszenzmarkierten Lipidnanokapseln bereits<br />
30 Minuten post applicationem die Rundfenstermembran auf parazellulärem Weg<br />
durchdrungen hatten und in den zellulären Strukturen der Cochlea aufgenommen wurden. Die<br />
Verteilung zeigte sogar eine intranukleare Aufnahme der Partikel in Spiralganglienzellen,<br />
deren Behandlung bei Patienten mit sensorineuralem Hörverlust von besonderem Interesse ist.<br />
Weitere Studien mit Meerschweinchen wiesen eine homogene Verteilung in den Zellen des<br />
Innenohres nach intracochleärer Applikation via Cochleostomie auf. Hierbei wurde die<br />
Fragestellung nach einer etwaigen spezifischen Verteilung sowie nach toxischen Effekten<br />
bearbeitet. Die Ergebnisse zeigten eine hervorragende Aufnahme der ebenfalls<br />
fluoreszenzmarkierten Partikel in die unterschiedlichen Zellpopulationen, wobei die<br />
Auswertung von Zytocochleogrammen keine toxischen Effekte an den Haarzellen erkennen<br />
ließ. SCHEPER et al. (2009b) konnten mit dieser Studie grundlegende Resultate hinsichtlich<br />
dieses auch für die Otologie sehr vielversprechenden Drug-Carrier-Systems erzielen.
2.4 Phosphodiesterase-Hemmer<br />
34<br />
2.4.1 Wirkungsweise der Phosphodiesterase-Hemmer<br />
Phosphodiesterase-Hemmer sind Arzneimittel, welche die im Zytoplasma vorhandenen<br />
Phosphodiesterasen hemmen. Erstmals konnten sie 1972 aus Rattengehirnen isoliert werden<br />
(UZUNOV u. WEISS 1972). Kurze Zeit später stellte man eine Hemmung dieser auch in<br />
anderen Geweben vorhandenen Esterasen durch eine Vielzahl von Arzneimitteln fest (WEISS<br />
1975; FERTEL 1976). Die Phosphodiesterase ist ein Enzym, welches bei Wirbeltieren in 11<br />
verschiedenen Isoenzymen bekannt ist (BOSWELL-SMITH et al. 2006). Durch Hydrolyse ist<br />
es diesen Enzymen möglich, die Second-Messenger cyclic adenosin monophosphate (cAMP)<br />
und cyclic guanosine monophosphate (cGMP) zu Adenosinmonophosphat (AMP) und<br />
Guanosinmonophosphat (GMP) abzubauen, wobei es cAMP- und cGMP-spezifische aber<br />
auch unspezifische Phosphodiesterasen gibt, welche beide Messenger-Moleküle spalten<br />
können. Bei diesen Messenger-Molekülen handelt es sich um Nukleotide, d.h. sie sind aus<br />
Nukleosiden [Nukleinbase Adenin bzw. Guanin sowie einer Pentose (Ribose)] und einem<br />
Phosphatrest aufgebaut. Da sie durch den Abbau der Phosphodiesterasen an der Position 3’<br />
bzw. 5’ hydrolytisch gespalten werden, bezeichnet man diese Enzymgruppe auch genauer als<br />
3’, 5’-Zyklonukleotid-Phosphodiesterasen. Hierdurch findet eine nomenklatorische<br />
Abgrenzung zu einer Vielzahl von weiteren Enzymen im Organismus statt, welche<br />
nichtzyklische Phosphodiesterbindungen spalten können und somit auch als<br />
Phosphodiesterasen bezeichnet werden. Als Beispiele seien hierfür DNAsen und RNAsen<br />
genannt. Da die Second-Messenger eine Vielzahl von unterschiedlichen Reaktionen über die<br />
Phosphorylierung von Proteinkinasen einleiten (bspw. Lipolyse und Glykogenabbau) werden<br />
diese Vorgänge durch den Abbau über die Phosphodiesterase gehemmt. So wird durch den<br />
Einsatz von Phosphodiesterase-Hemmern eine erhöhte Second-Messenger Konzentration<br />
erzielt, wodurch eine große Anzahl von zellmetabolischen Aktivitäten initiiert werden, auf die<br />
im Weiteren genauer eingegangen wird.
35<br />
2.4.2 Einteilung der Phosphodiesterase-Hemmer<br />
Phosphodiesterase-Hemmer werden in zwei Gruppen unterteilt. Zum einen gibt es die<br />
nichtselektiven Phosphodiesterase-Hemmer, welche unspezifisch alle Enzyme dieser Gruppe<br />
inhibieren, zum anderen gibt es die spezifisch wirkenden Phosphodiesterase-Hemmer, welche<br />
nur einen bestimmten Typ von Phosphodiesterasen hemmen. Zu den nichtselektiven<br />
Phosphodiesterase-Hemmern gehören beispielsweise Methylxanthine wie Koffein,<br />
Theobromin und Theophyllin. Theophyllin wird in der Behandlung der chronisch<br />
obstruktiven Lungenerkrankung (chronic obstructive pulmonary disease, COPD) eingesetzt,<br />
ist aber selektiven Phophodiesterasehemmern aufgrund der Stärke seiner Nebenwirkungen,<br />
wie Übelkeit und Tachykardie, unterlegen (RABE et al. 2007). Die Einteilung der selektiven<br />
Phosphodiesterase-Hemmer richtet sich nach der Spezifität für einen bestimmten Typ der 11<br />
Isoformen der Phosphodiesterase, wobei für die Hemmung der Phosphodiesterase 10 und 11<br />
keine Inhibitoren bekannt sind. So kommen die jeweiligen Phosphodiesterasen in bestimmten<br />
Geweben gehäuft vor, während sie in anderen fehlen können (SIEGEL et al. 1999).<br />
Dementsprechend werden Phosphodiesterase-3-Inhibitoren wie beispielsweise Milrinon bei<br />
akuter Herzinsuffizienz eingesetzt (FORTH et al. 2002). Durch die Hemmung der<br />
Phosphodiesterase-3 erhöht sich die Konzentration des intrazellulären Second-Messenger<br />
Moleküls cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Hierüber werden Proteinkinasen<br />
aktiviert, wodurch es zur Öffnung von Kalzium-Kanälen kommt, was die Kontraktionskraft<br />
des Myokards erhöht und somit eine inotrope Wirkung erzielt. Im Bereich der<br />
Veterinärmedizin findet Pimobendan (Vetmedin ® ) Anwendung bei der Behandlung der<br />
dilatativen Kardiomyopathie. Als sogenannter Kalzium-Sensitizer erhöht es die<br />
Empfindlichkeit der Herzmuskelfasern auf Kalzium-Ionen, wodurch die Kontraktiliät des<br />
Myokards verstärkt wird. Parallel kommt es durch die Hemmung der Phosphodiesterase-3 zu<br />
einem gefäßerweiternden Effekt, was den Einsatz bei Herzklappenerkrankungen ebenso<br />
sinnvoll macht (LOMBARD et al. 2006). Aufgrund dieser beiden Eigenschaften wird<br />
Pimobendan auch als Inodilatator bezeichnet. Großen Bekanntheitsgrad erlangte der<br />
Phosphodiesterase-5-Inhibitor Sildenafil (VIAGRA ® ), welcher durch die selektive Hemmung<br />
der cGMP-sensitiven Phosphodiesterase-5 zu einer erhöhten Konzentration von cGMP in den<br />
Muskelzellen der Gefäße des Corpus Cavernosum führt (SOLDINI 1999). Über die
36<br />
Aktivierung der Proteinkinase G kommt es zu einem intrazellulärem Kalzium-Abfall, welcher<br />
die Entspannung der Gefäßmuskulatur bedingt und durch einen erhöhten Bluteinstrom zur<br />
Erektion führt.<br />
Die Phosphodiesterase-4 kommt hauptsächlich in den Zellen der Organe Hoden, Niere,<br />
Gehirn, Leber, Lunge, sowie in Leukozyten vor (SIEGEL et al. 1999). Dementsprechend<br />
bestehen hinsichtlich der Pathologien dieser bestimmten Organe prädestinierte Einsatzgebiete<br />
für Inhibitoren dieser Enzymsubklasse. So zeigt sich die Effektivität von Phosphodiesterase-<br />
4-Inhibitoren besonders in der Behandlung von entzündlich bedingten Lungenerkrankungen<br />
(WESTON et al. 1997; FUHRMANN et al. 1999; GAMBLE et al. 2003). Aber auch bei<br />
neurodegenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems zeigt sich ein großes<br />
Potential. In diversen Studien konnten antipsychotische Effekte nachgewiesen werden<br />
(MAXWELL et al. 2004; KANES 2007). Des Weiteren wurden positive Effekte auf das<br />
Langzeitgedächtnis festgestellt (BARAD et al. 1998). Darüber hinaus konnten in anderen<br />
Arbeiten vielversprechende Ergebnisse hinsichtlich der Therapie von Alzheimer und<br />
Parkinson (SMITH et al. 2009) erzielt werden. Durch diese Studien können neuroprotektive<br />
und antiinflammatorische Wirkungen von Phosphodiesterase-4-Inhibitoren erwartet werden.<br />
Somit könnten die Spiralganglienzellen vor der Degeneration nach primärem Haarzellverlust<br />
geschützt werden, wobei Phosphodiesterase-4-Inhibitoren aber auch in der Hemmung von<br />
postoperativen Gewebsreaktionen von Nutzen sein könnten.<br />
Ein interessanter Vertreter und als Archetyp geltender Phosphodiesterase-4-Inhibitor ist<br />
Rolipram. Da Rolipram in dieser Arbeit verwendet wurde, soll im Folgenden eingehender auf<br />
diesen Phosphodiesterase-4-Inhibitor eingegangen werden.<br />
2.4.3 Rolipram<br />
Bei dem Phosphodiesterase-4-Hemmer Rolipram handelt es sich um einen experimentellen<br />
Arzneistoff, welcher das erste Mal Ende der siebziger Jahre in der Literatur genannt wird.<br />
KARPANEN et al. (1979) führten Studien an männlichen Sprague-Dawley-Ratten<br />
hinsichtlich der antihypertensiven Wirkung von Rolipram durch und konnten einen<br />
dosisabhängigen Effekt nachweisen. So wurde durch eine intracerebroventriculär injizierte
37<br />
Dosis von 64 µg Rolipram pro Ratte ein Blutdruckabfall von 30 % erreicht. Des Weiteren<br />
wurden im Tierversuch antipsychotische Wirkungen nachgewiesen (MAXWELL 2004). So<br />
führte eine geringe intrazelluläre Konzentration von cyclic adenosin monophosphate (cAMP)<br />
im Krankheitsbild der Schizophrenie zu Signaltransduktionsabnormalitäten. Frühere Studien<br />
versuchten diesen Effekt durch die Blockade von Dopaminrezeptoren zu unterbinden,<br />
wodurch ein Anstieg des intrazellulären cAMP erreicht wurde. Mit Rolipram konnte somit die<br />
Wirksamkeit eines nichtrezeptorvermittelten Therapieansatzes zur Behandlung von<br />
Schizophrenie belegt werden (KANES 2007). Grundlagenforschungen zur Huntington´s<br />
disease, einer autosomal dominant vererbten neurodegenerativen Erkrankung, zeigten<br />
vielversprechende Ergebnisse. So kommt es im Verlauf der Krankheit zu einer verminderten<br />
Aktivität des cAMP responsive element binding protein (CREB). Dieses Protein ist für die<br />
Transkription von unterschiedlichen Genen verantwortlich, unter anderem für das Gen des<br />
neuroprotektiv wirkenden BDNF (PURVES 2007). Wird durch Rolipram die<br />
Phosphodiesterase-4 gehemmt, so kommt es zu einem Anstieg der Konzentration von cAMP.<br />
Dieses aktiviert die Proteinkinase-A, welche über einen Phosphorylierungsschritt im Nukleus<br />
der Zelle CREB aktiviert und so zur Bildung von BDNF beitragen kann, wodurch ein<br />
neuroprotekiver Effekt erzielt wird. Im Tiermodell wurde ein neurodegenerativer Effekt durch<br />
Applikation von Quinolonsäure (DE MARCH et al. 2007), einer exzitotoxisch wirkenden<br />
Substanz, ins Corpus Striatum von Mäusen, erzielt. Hierbei kommt es zur Überreizung des<br />
exzitatorisch wirkenden N-methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptors, was eine verringerte<br />
CREB-Aktivität (HARDINGHAM et al. 2002), sowie einen erhöhten Kalzium-Einstrom zur<br />
Folge hat und somit zum Tod der neuronalen Zelle führt (STAVROVSKAYA u. KRISTAL<br />
2005; GUZMAN-LENIS et al. 2009). Durch die tägliche, intraperitoneale Applikation von<br />
1,5 mg/kg Rolipram über einen Zeitraum von 2 Wochen, konnten die durch Quinolonsäure<br />
hervorgerufenen Läsionen um 62 % gegenüber der Kontrollgruppe verringert werden (DE<br />
MARCH et al. 2007). In anderen Versuchen am Quinolonsäuremodell zeigten BLOCK et al.<br />
(2001), dass die neuroprotektive Wirkung des Phosphodiesterase-Hemmers Rolipram auch<br />
über die Hemmung von TNF-α erzielt wird. So zeigten WHITAKER et al. (2008) im Spinal<br />
Cord Injury-Tiermodell einen großen Einfluss des Zytokins TNF-α auf den sekundär<br />
induzierten Zelltod. Durch die Applikation von Rolipram konnte eine verminderte Expression<br />
von TNF-α nachgewiesen werden, wobei die entstehenden Läsionen um 40 % verringert
38<br />
werden konnten. Eine weitere Studie von VALERA et al. (2008) zeigte die Rolipram-<br />
vermittelte Protektion primärer neuronaler Zellen, welche aus Rattengehirnen gewonnen<br />
wurden. Durch die Zugabe von exzitotoxisch wirkendem NMDA konnte die Degeneration der<br />
Zellen durch die Applikation von Rolipram verringert werden, was durch einen intrazellulären<br />
Anstieg von aktiviertem CREB erklärt wurde. Des Weiteren werden positive Effekte von<br />
Phosphodiesterase-4-Inhibitoren auf die axonale Regeneration im Spinal Cord Injury-Modell<br />
beschrieben. Hierbei reguliert über cAMP aktiviertes CREB die Expression der Gene für IL-6<br />
und Arginase I, welche einen direkten Einfluss auf eine gesteigerte Axonregeneration haben<br />
sollen (HANNILA u. FILBIN 2007).<br />
Neben der Wirkung auf die Zellen des Zentralen Nervensystems zeigten viele Studien die<br />
potente antiinflammatorische Wirkung von Rolipram. So werden nahezu alle Zellen, die im<br />
Prozess des Entzündungsgeschehens eine Rolle spielen, von Rolipram beeinflusst. Ursächlich<br />
soll hierfür die präferierte Hemmung der Phosphodiesterase-4A/B sein, welche hauptsächlich<br />
in Monozyten, Makrophagen, Granulozyten und T-Zellen expremiert wird (MACKENZIE u.<br />
HOUSLAY 2000, ZHU et al. 2001). Ein entscheidender Wirkmechanismus dieses<br />
antiinflammatorischen Effekts wird durch die Hemmung der Bildung des Zytokins TNF-α<br />
erzielt (WACHTEL 1982).<br />
Neben Makrophagen und Monozyten, welche als Hauptproduzenten des Zytokins TNF-α<br />
gelten, können auch andere Zellen, wie beispielsweise dendritische Zellen, neutrophile<br />
Granulozyten oder Endothelzellen TNF-α freisetzen (HIGUCHI et al. 1990). TNF-α spielt im<br />
Rahmen von lokalen und systemischen Entzündungsreaktionen eine zentrale Rolle. Als<br />
pleiotropes, proinflammatorisches Zytokin ist TNF-α neben weiteren Zytokinen wie IL-1α,<br />
IL-1ß und Interferon-γ ein wichtiger Mediator der nicht-adaptiven Immunantwort.<br />
Dementsprechend ist TNF-α im Abwehrgeschehen von viralen sowie bakteriellen Infektionen<br />
entscheidend beteiligt (ABBAS et al. 2005). So dient TNF-α als Signalmolekül, um die<br />
Aktivität unterschiedlichster Immunzellen zu modulieren. Weiterhin zeigt sich auch ein<br />
proliferationsverstärkender Effekt auf Fibroblasten (POSTLETHWAITE u. KANG 1983).<br />
Ansätze zur Erklärung des zugrunde liegenden Wirkmechanismus der Phosphodiesterase-4-<br />
Inhibitoren finden sich in der Initiierung von Signalkaskaden. So findet durch den<br />
verminderten Abbau von cAMP eine verstärkte Phosphorylierung der Proteinkinase A statt.<br />
Diese aktiviert den Transkriptionsfaktor CREB, der unter anderem die Transkription von
39<br />
proinflammatorischen Zytokinen steuert (DEREE et al. 2008). Des Weiteren wird eine<br />
Beeinflussung des Transkriptionsfaktors nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of<br />
activated B-cells (NF-κB) diskutiert, wobei die Transkription des Zytokins TNF-α von diesem<br />
Faktor abhängig ist. Durch den Phosphodiesterase-Inhibitor vermittelten Anstieg von<br />
phosphoryliertem CREB wird eine Konkurrenz um den Koaktivator CREB binding protein<br />
(CBP) angenommen, wodurch die Wirkung des NF-κB inhibiert wird (DEREE et al. 2008).<br />
Aber auch eine Hemmung der Phosphorylierung und des nachfolgenden Abbaus des nuclear<br />
factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor alpha (IκBα) wird als<br />
ursächlich für den antiinflammatorischen Effekt von Phosphodiesterase-4-Inhibitoren<br />
angesehen. So liegt der Transkriptionsfaktor NF-κB im Zytosol in einer inaktiven Form vor<br />
indem es an den Inhibitorkomplex IκBα gebunden ist. Um die aktive Form des NF-κB<br />
freizusetzen wird IκBα unter anderem über Lipopolysaccharid induzierte Signalwege<br />
phosphoryliert, worüber der Abbau dieses Inhibitorkomplexes eingeleitet wird (DEREE et al.<br />
2008). Durch cAMP-abhängige Proteinkinasen wird eine Inhibierung der Phosphorylierung<br />
und Degradation von IκBα vermutet (KWAK et al. 2005)<br />
Neuere Studien zeigten zudem einen Einfluss von Phosphodiesterase-Hemmern auf das<br />
entzündungsmodulierende mitogen activated protein (MAP)-Kinasesystem. So zeigte<br />
Rolipram eine Hemmung der INF-γ induzierten Phosphorylierung der p38-MAP-Kinase<br />
(KWAK et al. 2005).<br />
Diese Studien belegen somit die antiinflammatorische und neuroprotektive Wirkung von<br />
Rolipram. Die vorliegende Arbeit soll zum einen den Effekt des Roliprams auf<br />
degenerierende Spiralganglienzellen untersuchen und zum anderen das Potential zur<br />
Fibrosehemmung nach erfolgter Cochlea-Implantat-Insertion beurteilen.
3 Zielsetzung<br />
40<br />
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu prüfen, ob der Phosphodiesterase-4-Hemmer Rolipram<br />
geeignet ist, das Ergebnis, welches mit Cochlea-Implantaten im Patienten erzielt werden<br />
kann, zu optimieren.<br />
Es wird der neuroprotektive Effekt des Roliprams auf die im Innenohr lokalisierten<br />
neuronalen Zellen, die Spiralganglienzellen, in vitro und in vivo untersucht. Zudem wird in-<br />
vitro die Wirkung des Roliprams auf die proinflammatorische TNF-α-Produktion bestimmt,<br />
um zu prüfen, ob mittels Rolipramapplikation das postoperative Bindegewebswachstum um<br />
den Elektrodenträger des Cochlea-Implantats vermindert werden kann.<br />
Zur Hemmung der Phosphodiesterase-4 muss Rolipram durch die Zellmembran in das<br />
Zytoplasma der Zelle gelangen. Im Rahmen dieser Studie wird zusätzlich untersucht, ob die<br />
Rolipramaufnahme in die Zelle, und somit der biologische Effekt des Arzneimittels, durch<br />
Lipidnanokapseln als Transportsystem gesteigert werden kann.<br />
Zunächst werden hierzu In-vitro-Studien durchgeführt:<br />
• Untersuchung des neuroprotektiven Effektes von Rolipram, sowie auch von in<br />
Lipidnanokapseln eingeschlossenem Rolipram auf die Überlebensrate von isoliert<br />
angezüchteten Spiralganglienzellen neonataler Sprague-Dawley-Ratten. Des Weiteren<br />
werden das Neuritenauswachsverhalten sowie der Somadiameter der überlebenden<br />
Spiralganglienzellen beurteilt. Der Versuchsansatz wird in vier unterschiedlichen<br />
Konzentrationen durchgeführt, um eine möglichst optimale Konzentration für die<br />
potentiell nachfolgenden In-vivo-Experimente zu ermitteln.<br />
• Ferner werden Untersuchungen mit murinen dendritischen Zellen durchgeführt, anhand<br />
derer die Freisetzung des Roliprams aus dem Nanopartikel verifiziert werden kann.<br />
Zunächst werden die Zellen mit Rolipram und in Nanopartikeln inkorporiertem Rolipram<br />
behandelt. Eine anschließende Stimulation mit Lipopolysacchariden führt zur Reifung und<br />
Aktivierung der Zellen, wodurch eine Sekretion des Zytokins TNF-α erwirkt wird. Je nach<br />
Ausprägung lassen sich Aussagen über einen entzündungshemmenden Effekt treffen. Für
41<br />
die Kombination mit Cochlea-Implantaten könnten so positive Effekte hinsichtlich einer<br />
postoperativ auftretenden, fremdkörperbedingten Bindegewebsbildung erzielt werden.<br />
Folgende In-vivo-Studien werden, basierend auf den Erkenntnissen der In-vitro-Studien,<br />
durchgeführt:<br />
• Untersuchung des Einflusses von Rolipram und mittels Lipidnanokapseln appliziertem<br />
Rolipram auf das Überleben der Spiralganglienzellen ertaubter Meerschweinchen.<br />
Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen Rückschlüsse darauf zulassen, ob Rolipram die<br />
Spiralganglienzellen nach Ertaubung vor Degeneration schützen kann, beziehungsweise das<br />
Fortschreiten der Degeneration verlangsamen kann.<br />
Eine zusätzliche Erkenntnis soll sein, ob Rolipram die Fremdkörperreaktion nach<br />
Implantation von Cochlea-Implantaten potentiell verringern kann.<br />
Weiterhin soll geklärt werden, ob Lipidnanokapseln die Wirkung des Roliprams steigern<br />
können.
4 Material und Methoden<br />
4.1 Material<br />
4.1.1 Reagenzien, Laborbedarf, Verbrauchsmaterialien, Pharmaka und Geräte<br />
42<br />
Die verwendeten Lösungen, Reagenzien (10.2), Pharmaka (10.3), Geräte (10.6) und eine<br />
Auflistung des verwendeten Laborbedarfs, sowie der benötigten Verbrauchsmaterialien<br />
(10.4), finden sich im Anhang in Tabellenform wieder. In diesem Kapitel wird ebenfalls die<br />
Herstellung von einzelnen Lösungen und Medien besprochen (10.1).<br />
4.1.2 Herstellung der Lipidnanokapseln<br />
Alle in dieser Arbeit verwendeten Nanopartikel (Lipidnanokapseln, LNC) wurden in den<br />
„Laboratoires d’Ingénierie de la Vectorisation Particulaire“ der Universität Angers in<br />
Frankreich hergestellt.<br />
Die Herstellung der Lipidnanokapseln basiert auf der neuartigen Methode der<br />
Phaseninversion (phase inversion temperature method, PIT-Methode) bei welcher eine Öl-in-<br />
Wasser Emulsion durch wiederholte Erwärmung und Abkühlung in eine Wasser-in-Öl<br />
Emulsion umgekehrt wird (HEURTAULT et al. 2002; BEDUNEAU et al. 2006).<br />
Bei den Lipidnanokapseln handelt es sich um Nanopartikel bestehend aus einem flüssigen<br />
Kern, welcher von einer Schicht aus oberflächenaktiven Substanzen umgeben ist (Abb 3. A).<br />
Die zur Herstellung benötigte ölige Phase bestand aus dem Caprin- und Caprylsäure-<br />
Triglyzerid Labrafac ® WL 1349 (Gattefossé S.A., Saint-Priest, Frankreich), während die<br />
wässrige Phase aus mit Natriumchlorid angereichertem, steril gefilterten Wasser bestand. Des<br />
Weiteren war das Hinzufügen von zwei Tensiden nötig, dem Lipoïd ® S75-3 (Lipoïd GmbH,<br />
Ludwigshafen, Deutschland), einem aus Sojabohnen gewonnenem Lecithin und dem Solutol ®<br />
HS 15 (BASF, Ludwigshafen, Deutschland), einem aus Polyethylenglycol bestehenden,<br />
künstlich hergestellten Tensid. Um Lipidnanokapseln mit dem gewünschten Durchmesser von<br />
etwa 50 nm herzustellen, wurden die Komponenten in den folgenden Mengen verarbeitet:
43<br />
1,028 g Labrafac ® , 0,075 g Lipoïd ® , 0,846 g Solutol ® , 0,089 g NaCl und 2,962 g steril<br />
gefiltertes Wasser.<br />
Um zunächst eine Öl-in-Wasser Emulsion zu erhalten, wurden alle Komponenten vermengt<br />
und auf einem Magnetrührer bei Raumtemperatur und 200 rounds per minute (rpm)<br />
vermischt. Unter kontinuierlicher Erwärmung bei einer steigenden Temperatur von 4 °C pro<br />
Minute, wurde bei etwa 70 °C ein kurzes Intervall der Transparenz beobachtet, wonach die<br />
vollständige Phasenumkehr bei einer Temperatur von etwa 85 °C erreicht wurde.<br />
Anschließend wurden drei Temperaturzyklen nahe der Phasenumkehr, alternierend von 60 bis<br />
85 °C, wiederholt, um eine stabile Wasser-in-Öl Emulsion zu erhalten. Die vorliegende<br />
Mischung wurde daraufhin mit 12,5 ml Wasser im Verhältnis 1:2,5 verdünnt, wobei das<br />
Wasser zudem auf 2 °C herabgekühlt war um die Reaktionsprozesse zu stoppen und somit die<br />
Herstellung der LNC zu vollenden.<br />
Eine anschließende Modifikation der Oberfläche wurde im Vorfeld der<br />
Fluoreszenzmarkierung der Nanopartikel vorgenommen. 1,75 ml LNC (10 17 Nanopartikel/ml)<br />
wurden für 90 Minuten bei einer Temperatur von 60 °C mit 1,25 ml wässriger Lösung<br />
(15 mg/ml) von 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Amino(Polyethylene-<br />
Glycol)2000] (DSPE-PEG2000-amino) (Alabaster, USA) inkubiert. Die Suspension wurde<br />
alle 15 Minuten aufgeschüttelt und am Ende in einem Eisbad für 1 Minute abgeschreckt.<br />
Danach wurden die Nanopartikel mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszein-5-isothiocyanate<br />
(FITC, Sigma-Aldrich Frankreich) markiert, um die Lokalisation der Partikel in Zellen und<br />
Geweben nachvollziehen zu können (Abb. 3. B.). Hierfür wurden 1 ml FITC mit einer<br />
Konzentration von 2 mg/ml auf 2,95 ml LNC Suspension gegeben, wobei der pH-Wert<br />
langsam durch tropfenweise Zugabe von Na3PO4 auf 9 erhöht wurde. Unter Lichtabschluss<br />
wurde die Mischung in einem Wasserbad für 45 Minuten bei 37 °C inkubiert um abschließend<br />
die Reaktion, durch Überführung in ein Eisbad für 3 Minuten, zu beenden. Bei den in den<br />
Zellversuchen verwendeten Nanopartikeln ohne Fluoreszenzmarkierung entfiel dieser Schritt<br />
der Herstellung.<br />
Um das Arzneimittel Rolipram in die Partikel aufzunehmen, wurde der Phosphodiesterase-<br />
Hemmer vor den drei Temperaturzyklen in einer Konzentration von 1 mg/ml Labrafac ®<br />
hinzugefügt (Abb. 3. B.), wobei dieser Schritt bei den Nanopartikeln ohne Rolipram entfiel.
4.1.3 Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit Spiralganglienzellen<br />
44<br />
A B C<br />
Für die zu Beginn der vorliegenden Arbeit durchgeführten Zellkulturexperimente wurden<br />
neonatale Sprague-Dawley-Ratten (eigene Zucht) beiderlei Geschlechts verwendet. Insgesamt<br />
fanden in dieser Studie 138 Tiere im Alter von 3-5 Tagen Verwendung.<br />
Durch die den In-vivo-Experimenten vorangegangenen Zellkulturexperimente wurde der<br />
Einfluss des biologischen Effekts von Rolipram sowie der Nanopartikel auf das Überleben der<br />
Spiralganglienzellen untersucht, um die Studien am Tier auf ein Minimum zu reduzieren. So<br />
konnte durch die Zellversuche im Rahmen dieser Arbeit diejenige Konzentration der<br />
Nanopartikellösung ermittelt werden, welche ein optimales Überleben der<br />
Spiralganglienzellen in vitro zeigte. Die daraus ermittelte Konzentration wurde anschließend<br />
im Tiermodell untersucht.<br />
Labrafac ®<br />
Mixture of Lipoïd ® and Solutol ®<br />
DSPE-PEG2000-amino<br />
FITC<br />
Rolipram<br />
Abb. 3: (A) Lipidnanokapsel; (B) Lipidnanokapsel mit FITC markiert; (C) Lipidnanokapsel mit FITC<br />
markiert und inkorporiertem Rolipram.<br />
Die Verwendung der Tiere zu wissenschaftlichen Zwecken (Tierschutzgesetz, §4) wurde dem<br />
zuständigen Amt gemeldet (Veterinäramt <strong>Hannover</strong>). Die Tierhaltung und Zucht wurde unter
45<br />
spezifisch pathogen-freien Bedingungen in den Räumlichkeiten des Zentralen Tierlabors der<br />
Medizinischen <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> unter identischen Bedingungen für alle Tiere<br />
durchgeführt.<br />
Die Haltung der Muttertiere erfolgte in Zweiergruppen in Typ 3 Makrolon ® -Käfigen (Uno<br />
Roestvaststaal B.V., Zevenaar, Holland). Bei einer Raumtemperatur von 20-24 °C und 50-<br />
60 % relativer Luftfeuchtigkeit wurde der Tagesrhythmus der Tiere durch einen täglichen<br />
Hell/Dunkel-Zyklus von 12 Stunden reguliert. Die Versorgung der Tiere erfolgte durch ein<br />
Trockenpelletfutter (Altromin-1324 ® , Altromin GmbH, Lage) und Trinkwasser ad libitum,<br />
wobei die Tiere auf einer Standardeinstreu gehalten wurden.<br />
Zur Gewinnung der Spiralganglienzellen wurden die Jungtiere 1-2 h vor der Verwendung von<br />
den Muttertieren separiert.<br />
4.1.4. Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit dendritischen Zellen<br />
Zur Generierung der dendritischen Zellen wurden Stammzellen aus dem femoralen<br />
Knochenmark von BALB/c Mäusen gewonnen. Die Versuche sollten neben der<br />
zytokinproduktionshemmenden Wirkung des Roliprams auch einen Aufschluss über die<br />
Freisetzung des Arzneimittels aus der Nanopartikel-Rolipram-Kombination geben.<br />
Für die Gewinnung von Stammzellen aus dem femoralen Knochenmark der BALB/c Mäuse<br />
erfolgte eine Anzeige zur Organentnahme für das Anlegen von Zellkulturen beim<br />
Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES<br />
Oldenburg). Insgesamt wurden drei Tiere für die Durchführung der Experimente verwendet.<br />
Hierbei handelte es sich um weibliche BALB/c Mäuse mit einem Gewicht von ca. 20 g. Die<br />
Tiere wurden in der Tierhaltung des Instituts der Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie<br />
der Stiftung <strong>Tierärztliche</strong> <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> in Kleingruppen von 5-6 Tieren auf einer<br />
Standardeinstreu gehalten, wobei der Tagesrhythmus durch einen Hell/Dunkel-Zyklus von<br />
12 Stunden reguliert wurde. Zur Versorgung wurde den Tieren eine Altromin-Standarddiät<br />
(Altromin-1324 ® , Altromin GmbH, Lage) sowie Wasser zur freien Verfügung gestellt.
4.1.5 Versuchstiere und Tierhaltung für die In-vivo-Experimente<br />
46<br />
Für die den Zellkulturversuchen nachfolgenden In-vivo-Experimente wurden weibliche,<br />
Dunkin-Hartley-Meerschweinchen vom Züchter Charles-River verwendet. Das<br />
Ausgangsgewicht betrug 330-460 g. Für die Durchführung der Studie wurden 32 Tiere<br />
verwendet. Das Tierversuchsvorhaben wurde beim Niedersächsischen Landesamt für<br />
Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) unter der Nummer 33.9-42502-04-<br />
07/1266 angemeldet und genehmigt.<br />
Die Haltung, sowie alle Eingriffe am Tier, erfolgten in den Räumlichkeiten des CrossBIT-<br />
Gebäudes, Feodor-Lynen-Straße 31 in 30625 <strong>Hannover</strong>. Zu Versuchsbeginn wurde die<br />
Hörschwelle der Versuchstiere mittels akustisch evozierter Hirnstammpotentiale ermittelt. In<br />
die Studie wurden nur Tiere aufgenommen, deren Hörstatus der physiologischen Norm<br />
entsprach (KANO u. STARR 1987; MITCHELL et al. 1997).<br />
Nachfolgend wurden die Tiere systemisch ertaubt und sieben Tage später einer erneuten<br />
Messung der Hirnstammpotentiale zur Verifizierung des Ertaubungserfolges unterzogen.<br />
Anschließend wurden die zu untersuchenden Substanzen intracochleär appliziert.<br />
Die Tierhaltung wurde entsprechend der EU-Richtlinie 86/609/EWG unter identischen<br />
Bedingungen durchgeführt. Die Tiere wurden in Gruppen zu je 4 Individuen in Typ 3<br />
Makrolon ® -Käfigen (Uno Roestvaststaal B.V., Zevenaar, Holland) auf einer Standard-<br />
Einstreu (Weichholzfaser) gehalten. Ihr Tagesrhythmus wurde durch einen Hell/Dunkel-<br />
Zyklus von 12 Stunden reguliert. Die Raumtemperatur wurde konstant in einem Bereich von<br />
20-24 °C gehalten wobei die Luftfeuchtigkeit einen Wert von 50-60 % aufwies. Zur<br />
Versorgung erhielten die Tiere Trinkwasser und Heu ad libitum, wobei ihnen zusätzlich ein<br />
Trockenpelletfutter (ssniff MS-2, ssniff Spezialdiäten GmBH, Soest) angeboten wurde.<br />
4.1.6 Versuchsgruppen<br />
Die folgende Tabelle (Tab.1) gibt einen Überblick über die Einteilung der<br />
Versuchstiergruppen. Es wurde eine Gruppengröße von je acht Tieren gewählt. Alle<br />
Versuchstiere wurden am ersten Tag der Studie systemisch ertaubt, wobei zuvor die
47<br />
Hörschwelle mittels acoustically evoked auditory brainstem response (aABR)-Messung<br />
bestimmt wurde. In die Studie wurden nur normalhörende Tiere einbezogen. Am siebten Tag<br />
der Studie wurde die Ertaubung mittels wiederholter aABR-Messung bestätigt. Die Studie<br />
umfasst den Vergleich von vier Gruppen, wobei den Tieren der ersten Gruppe eine Woche<br />
nach der Ertaubung per Cochleostomie 5 µl Lipidnanokapsellösung mit inkorporiertem<br />
Rolipram in einer Verdünnung mit phospate buffered saline (PBS) von 1:100 in die Scala<br />
tympani der linken Cochlea injiziert wurde (Konzentration der Stammlösung:<br />
Lipidnanokapseln 45 mg/ml; 19 µg/ml Rolipram). Die Tiere der zweiten Gruppe wurden in<br />
gleicher Weise auf der linken Seite mit einer Injektion von 5 µl Lipidnanokapsellösung in<br />
einer Verdünnung von 1:100 behandelt (Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln<br />
45 mg/ml). Bei der dritten Versuchsgruppe wurden 5 µl Rolipramlösung in der zu Gruppe 1<br />
entsprechenden Konzentration injiziert wobei die letzte Gruppe eine Injektion von 5 µl PBS<br />
in die Scala tympani beider Cochleae erhielt. Bei den Gruppen 1-3 wurden in die Scala<br />
tympani der rechten Cochlea je 5 µl PBS als Kontrolle injiziert. Die Perfusion wurde bei allen<br />
Gruppen nach wiederholter aABR-Messung am Tag 21 vorgenommen.<br />
Tab. 1: Darstellung des zeitlichen Verlaufs sowie der vorgenommenen Eingriffe während der in-vivo-<br />
Versuche. PBS = phosphate buffered saline, aABR = acoustically evoked auditory brainstem response<br />
Tiergruppe Tag 0 Tag 7 Tag 21<br />
Gruppe 1<br />
aABR<br />
aABR<br />
aABR<br />
�anopartikel/Rolipram Ertaubung Cochleostomie Tötung<br />
Gruppe 2<br />
aABR<br />
aABR<br />
aABR<br />
�anopartikel<br />
Ertaubung Cochleostomie Tötung<br />
Gruppe 3<br />
aABR<br />
aABR<br />
aABR<br />
Rolipram<br />
Ertaubung Cochleostomie Tötung<br />
Gruppe 4<br />
aABR<br />
aABR<br />
aABR<br />
PBS<br />
Ertaubung Cochleostomie Tötung
4.2 Methoden<br />
4.2.1 Methoden für die In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen<br />
48<br />
4.2.1.1 Übersicht der In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen<br />
Im Vorfeld der In-vivo-Versuche wurden die benutzten Nanopartikel zunächst in vitro<br />
getestet, um die optimale Konzentration der verwendeten Nanopartikel zu ermitteln und<br />
mögliche toxische Effekte auf die im Tiermodell relevanten Zelltypen auszuschließen. Hierzu<br />
wurden Spiralganglienzellen von neonatalen Sprague-Dawley-Ratten kultiviert und mit<br />
unterschiedlichen Konzentrationen der Nanopartikel inkubiert. Insgesamt wurden vier<br />
unterschiedliche Gruppen getestet. Bei diesen Gruppen handelte es sich um:<br />
- mit FITC fluoreszenzmarkierte Lipidnanokapseln (LNC FITC)<br />
- mit FITC markierte Lipidnanokapseln in welchen Rolipram (LNC FITC ROLIRPAM)<br />
inkorporiert war<br />
- verdünntes Rolipram, welches in den zu den arzneimittelkombinierten Nanokapseln<br />
entsprechenden Konzentrationen verwendet wurde<br />
- brain derived neurotrophic factor (BDNF) in der Konzentration von 50 ng/ml als<br />
Positivkontrolle<br />
Diese Gruppen wurden jeweils in vier verschiedenen Konzentrationen im Sinne einer<br />
Verdünnungsreihe der Stammlösungen (Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln<br />
45 mg/ml; 19 µg/ml Rolipram) mit Panserin (10.2), von 1:50, 1:100, 1:200 und 1:300<br />
verwendet. Eine Ausnahme bildet die mit BDNF behandelte Gruppe. Hier wurden die Zellen<br />
nur mit der Konzentration von 50 ng/ml behandelt, da sich diese Konzentration als besonders<br />
protektiv auf das Überleben von Spiralganglienzellen in vitro erwiesen hat (LEFEBVRE et al.<br />
1994; HEGARTY et al. 1997) und in diesem Versuch als Positivkontrolle diente. Insgesamt<br />
erfolgten fünf Wiederholungen der Versuche, wobei die Auszählungen der Zellanzahlen,<br />
sowie die Ausmessungen der Neuritenlängen und Somadurchmesser gemittelt und<br />
miteinander verglichen wurden (Tab. 2).
Tab. 2: Übersicht über die in-vitro-Versuche mit kultivierte Spiralganglienzellen. Es werden die ver-<br />
wendeten Konzentrationen und die Anzahl der behandelten Kavitäten der Versuchsgruppen LNC<br />
49<br />
FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BDNF dargestellt.<br />
Versuchsgruppe Konzentration<br />
�anopartikel<br />
[mg/ml]<br />
LNC FITC 1:300= 0,15<br />
1:200= 0,225<br />
1:100= 0,45<br />
LNC FITC<br />
ROLIPRAM<br />
1:50 = 0,9<br />
1:300= 0,15<br />
1:200= 0,225<br />
1:100= 0,45<br />
1:50 = 0,9<br />
Konzentration<br />
Rolipram<br />
[µg/ml]<br />
1:300= 0,063<br />
1:200= 0,095<br />
1:100= 0,19<br />
1:50 = 0,38<br />
ROLIPRAM 1:300= 0,063<br />
1:200= 0,095<br />
1:100= 0,19<br />
1:50 = 0,38<br />
Anzahl der Wells<br />
pro Versuchstag<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
Anzahl der<br />
Wells<br />
insgesamt<br />
BDNF 50 ng/ml 4-8 30<br />
4.2.1.2 Versuch zur Bewertung des Einflusses der Nanopartikel-Komponenten auf das<br />
Überleben von vereinzelt angezüchteten Spiralganglienzellen<br />
Da im ersten Zellkulturversuch ein positiver Effekt der Nanopartikel ohne Rolipram<br />
(LNC FITC) auf das Überleben der kultivierten Spiralganglienzellen zu erkennen war, wurde<br />
ein zusätzlicher Versuch durchgeführt, um einen etwaigen Einfluss des Fluoreszenzmarkers<br />
FITC auf die Vitalität der Spiralganglienzellen zu evaluieren. Die Fragestellung war hierbei,<br />
ob der Nanopartikel alleine oder das an ihm gebundene FITC den protektiven Einfluss ausübt.<br />
Auch für diesen Versuch wurden Spiralganglienzellen aus neonatalen Sprague-Dawley-Ratten<br />
gewonnen und kultiviert. Folglich wurden drei Gruppen gebildet:<br />
- mit FITC fluoreszenzmarkierte Lipidnanokapseln (LNC FITC)<br />
- Lipidnanokapseln ohne Fluoreszenzmarker (LNC BLANK)<br />
- brain derived neurotrophic factor (BDNF) in der Konzentration von 50 ng/ml als<br />
Positivkontrolle<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
20<br />
20<br />
20<br />
20<br />
20<br />
20<br />
20<br />
20<br />
20<br />
20<br />
20<br />
20
50<br />
Die Versuche wurden dreimal wiederholt. Je Gruppe wurden drei unterschiedliche<br />
Konzentrationen getestet. Es wurde eine Verdünnung der Stammlösungen mit Panserin (10.2)<br />
von 1:100, 1:200 und 1:300 durchgeführt (Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln<br />
45 mg/ml). BDNF wurde wiederum nur in der Konzentration von 50 ng/ml als<br />
Positivkontrolle mitgeführt. Eine Übersicht der Gruppen wird in Tabelle 3 gegeben.<br />
Tab. 3: Übersicht über die in-vitro-Versuche mit kultivierten Spiralganglienzellen. Es werden die<br />
verwendeten Konzentrationen und die Anzahl der behandelten Kavitäten der Versuchsgruppen LNC<br />
FITC, LNC BLANK und BDNF dargestellt.<br />
Versuchsgruppe Konzentration<br />
�anopartikel [mg/ml]<br />
LNC FITC 1:300= 0,15<br />
1:200= 0,225<br />
1:100= 0,45<br />
LNC BLANK 1:300= 0,15<br />
1:200= 0,225<br />
1:100= 0,45<br />
Anzahl der Wells pro<br />
Versuchstag<br />
3<br />
3<br />
3<br />
Anzahl der<br />
Wells<br />
insgesamt<br />
BDNF 50 ng/ml 3 9<br />
4.2.1.3 Beschichtung der 96-Multiwellplatten zur Kultivierung von Spiralganglienzellen<br />
Zur Kultivierung von Spiralganglienzellen wurden die in 96-Multiwell-Kulturplatten (10.4)<br />
vorhandenen Kavitäten mit Poly-D/L-Ornithin (10.2) und Laminin (10.2) beschichtet. Diese<br />
Behandlung gewährleistete eine bessere Adhäsion der Spiralganglienzellen am Boden des<br />
Wells und verhinderte somit eine Ablösung der Zellen durch spätere Spül- und<br />
Färbevorgänge.<br />
Zunächst wurde aus zuvor angelegten und bei -20°C gelagerten Aliquots die benötigte Menge<br />
Poly-D/L-Ornithin entnommen und eine Lösung mit der Konzentration von 0,1 mg/ml Poly-<br />
D/L-Ornithin in phosphate buffered saline (PBS, 10.2) hergestellt. Von dieser Lösung wurden<br />
im ersten Schritt des Beschichtens 100 µl in die einzelnen Vertiefungen pipettiert. Im<br />
Anschluss erfolgte eine Inkubationszeit von einer Stunde bei Raumtemperatur.<br />
3<br />
3<br />
3<br />
9<br />
9<br />
9<br />
9<br />
9<br />
9
51<br />
Vor Ablauf dieser Stunde wurde die Lamininlösung vorbereitet, wobei hier entsprechend der<br />
Lösung des Poly-D/L-Ornithins verfahren wird. Die Konzentration beträgt im Falle des<br />
Laminins 0,01 mg/ml in PBS. Die Poly-D/L-Ornithin Lösung wird nun vorsichtig vom Rand<br />
des Wells beginnend abgesaugt, wobei auch in den folgenden Schritten darauf geachtet wird,<br />
dass der Boden der jeweiligen Vertiefung nicht austrocknet. Hiernach schließt sich ein<br />
Waschvorgang mit 100 µl PBS pro Well an, wobei anschließend je Vertiefung 100 µl<br />
Lamininlösung eingebracht wurde.<br />
Die folgende Inkubationszeit beträgt wiederum 60 Minuten, wobei die Wellplatte im<br />
Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit gelagert wurde.<br />
Abschließend wurde die Lamininlösung vorsichtig entfernt und ein letzter Spülschritt mit<br />
100 µl PBS pro Well schloss sich an. Bis zur Verwendung konnte die beschichtete Platte 5<br />
Tage bei 4 °C gelagert werden.<br />
4.2.1.4 Gewinnung der Spiralganglienzellen<br />
Zur Gewinnung der Spiralganglienzellen wurden 3-5 Tage alte Sprague-Dawley-Ratten<br />
zunächst durch einen Scherenschlag dekapitiert. Anschließend wurden die Unterkieferäste mit<br />
einer geraden chirurgischen Schere (10.5) von rostral nach caudal entfernt. Vom Schädel<br />
wurde im nächsten Schritt die Haut entfernt wonach, beginnend vom Hinterhauptsloch, die<br />
Schädeldecke und die Schädelbasis durch zwei Scherenschnitte eröffnet wurde. Auf Höhe der<br />
Verbindungslinie der caudalen Augenwinkel erfolgte anschließend ein Transversalschnitt,<br />
wodurch die zwei caudalen Anteile des Schädels vom rostralen Anteil separiert wurden. Die<br />
zügige Überführung der beiden Schädelhälften in eiskalte phosphate buffered saline (PBS,<br />
10.2) erfolgte nach der Entnahme der Gehirnanteile.<br />
Die weiteren Dissektionsschritte wurden unter einem Auflichtstereomikroskop (10.6) mithilfe<br />
von Uhrmacherpinzetten (10.5) durchgeführt. Hierbei erfolgte zunächst eine präparatorische<br />
Darstellung des Felsenbeines, wonach die Cochleakapsel eröffnet wurde. Anschließend<br />
konnten die Anteile der häutigen Schnecke entnommen und in eine neue Petrischale mit<br />
eiskaltem PBS überführt werden. Vom Modiolus wurden nun das Cortische Organ und die<br />
Stria vascularis entwunden. Letztlich erfolgte die Trennung des Spiralganglions vom
52<br />
Modiolus, welches sofort in eisgekühltes Hank´s balanced salt solution (HBSS, 10.2)<br />
überführt wurde. In Abbildung 4 werden einzelne Präparationsschritte bildlich dargestellt.<br />
Für einen Versuchsansatz von 15 x 10 4 Zellen pro Vertiefung auf einer 96-Multikulturplatte<br />
(10.4), wurden etwa 18-20 Tiere benötigt, was der Präparation von 36-40<br />
Spiralgangliensträngen entspricht. Mit den gewonnenen Zellen konnten 60 Vertiefungen<br />
belegt werden.<br />
Abb. 4: Darstellung einzelner Präparationsschritte zur Gewinnung des Spiralganglions. Bild 1 zeigt die<br />
eröffnete Schädelkapsel einer 4 Tage alten Sprague-Dawley-Ratte. Bild 2 veranschaulicht die<br />
Präparation und Entnahme der Cochlea. In Bild 3 ist die häutige Schnecke dargestellt. Nach der<br />
Entfernung von Stria vascularis und Cortischem Organ zeigt Bild 4 das aus dem Modiolus<br />
herausgetrennte Spiralganglion.
53<br />
4.2.1.5 Die Vereinzelung der Spiralganglienzellen<br />
Zunächst wurde für die Kultivierung und Vereinzelung der Spiralganglienzellen<br />
supplementiertes, serumfreies Zellkulturmedium hergestellt. Die Herstellung wurde nach dem<br />
im Anhang (10.1) aufgeführtem Schema vollzogen und entsprach in ihrer Zusammensetzung<br />
den Protokollen von LEFEBVRE et al. (1991) und ALETSEE et al. (2000). Die so gefertigte<br />
Lösung konnte bis zur Verwendung sieben Tage im Kühlschrank bei 4 °C gelagert werden.<br />
Bevor mit der eigentlichen Vereinzelung begonnen werden konnte, wurden die Überstände<br />
aus den zuvor beschichteten 96-well Platten (10.4) verworfen und pro Vertiefung mit 100 µl<br />
serumfreiem Spiralganglienzellkulturmedium gewaschen. Die Multiwell-Kulturplatte wurde<br />
im Anschluss unter dem Laborabzug (10.6) gelagert, sodass das die Platte vor der Einsaat der<br />
Spiralganglienzellen Raumtemperatur erreichen konnte, um ein möglichst schonendes<br />
Einsäen der Zellen zu gewährleisten.<br />
Die Separierung der Spiralganglienzellen erfolgte in einen enzymatischen sowie<br />
mechanischen Schritt der Vereinzelung. Bei der Vorgehensweise wurde nach in der Literatur<br />
anerkannten Protokollen verfahren (LEFEBVRE et al. 1991; HEGARTY et al. 1997).<br />
Bevor mit der enzymatischen Vereinzelung der nach obigem Schema (4.2.1.4) präparierten<br />
Spiralganglienzellstränge begonnen werden konnte, wurden die hierfür benötigten 2 ml<br />
Verdaulösung [Hank’s balanced salt solution (HBSS) inklusive 0,1 % Trypsin, 0,1 % DNase<br />
I und 0,01 % Kollagenase, 10.2] sowie das anschließend verwendete FBS (200 µl) bei 37 °C<br />
und 5 % CO2 für mindestens 30 Minuten im Brutschrank (10.6) inkubiert. Die in<br />
eisgekühltem HBSS vorliegenden Spiralganglienzellstränge wurden zunächst mittels<br />
Pipettierhilfe (10.6) vom Überstand befreit. Sofern sich noch einige Stränge frei in der<br />
Lösung befanden und sich noch kein vollständiger Bodensatz gebildet hatte, wurden die<br />
Zellstränge für etwa 20 Sekunden bei 6000-7000 rounds per minute (rpm) zentrifugiert (10.6).<br />
Anschließend erfolgte die Zugabe von 2 ml erwärmter Verdaulösung mit einer nachfolgenden<br />
Inkubationszeit von 20 min bei 37 °C und 5 % CO2. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde<br />
die Verdaulösung so vollständig wie möglich entfernt und durch sofortige Zugabe von 200 µl<br />
erwärmten FBS konnte die enzymatische Vereinzelung der Zellen gestoppt werden. Im<br />
nächsten Schritt wurden die Zellen noch dreimalig mit je einem Milliliter serumfreien<br />
Spiralganglienzellmedium gespült, wonach sich die mechanische Verdauung angeschlossen
54<br />
hat. Hierfür wurden die Zellen mittels einer 1000 µl Pipettierhilfe (10.6) und einem<br />
entsprechenden Pipettenaufsatz (10.4) etwa 100 Mal auf- und abpipettiert, wobei sehr<br />
vorsichtig verfahren werden musste um durch die entstehende Schaumbildung keine Zellen zu<br />
verlieren. Anschließend wurde mit einer 200 µl Pipettierhilfe (10.6) und entsprechendem<br />
Aufsatz (10.4) in gleicher Weise verfahren wodurch eine Suspension mit einzelnen Zellen<br />
entstand um die für die Einsaat der Spiralganglienzellen benötigte Zellzahl bestimmen zu<br />
können.<br />
4.2.1.6 Einsaat der Spiralganglienzellen<br />
Um die für den Versuch benötigte Zellanzahl von 1,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung bestimmen<br />
zu können, wurde zunächst die Gesamtzellzahl der zuvor verdauten Zellen bestimmt. Hierfür<br />
entnahm man dem vorliegenden Milliliter Zellsuspension 10 µl und überführte diese in ein<br />
0,5 ml Eppendorffgefäß (10.4). Aus Gründen der optimierten Visualisierung sowie zur<br />
Identifizierung von bereits letalen Zellen wurden noch 10 µl Trypanblau (10.2) hinzugefügt.<br />
Das Trypanblau-Zellgemisch wurde zur besseren Homogenisierung noch einige Male auf-<br />
und abpipettiert um anschließend je 7 µl auf beide Seiten einer Neubauer-Zählkammer (10.6)<br />
einzubringen. Die acht Felder der Zählkammer wurden unter einem Aufsichtmikroskop (10.6)<br />
einzeln ausgezählt und gemittelt, wobei der Mittelwert mit 2 x 10 4 multipliziert (Faktor 2<br />
ergibt sich durch das Hinzufügen des Trypanblaus) die Gesamtzellzahl in dem hergestellten<br />
Milliliter Zellsuspension ergab. Fielen während der Zählung größere Zellcluster auf, so wurde<br />
die Zellsuspension erneut mechanisch vereinzelt, da neben der nicht durchzuführenden<br />
Zählung auch die spätere Auswertung der Spiralganglienzellanzahl zu nicht tolerablen<br />
Abweichungen geführt hätte.<br />
Anhand der Gesamtzellzahl wurde die Zellsuspension mit der entsprechenden Menge<br />
serumfreien Spiralganglienzellmedium verdünnt, um eine Konzentration von 1,5 x 10 4 Zellen<br />
pro 50 µl zu erreichen. Diese wurden nach Verwerfen des serumfreien<br />
Spiralganglienzellkulturmediums in die Vertiefungen der Multikulturwellplatte eingebracht.<br />
Weitere 50 µl wurden in je nach Versuchsansatz entsprechenden Anteilen Medium und<br />
Nanopartikel- oder Arzneimittellösungen aufgefüllt um ein Gesamtvolumen von 100 µl pro
55<br />
Well zu erreichen. In jedem Versuch wurden neben den unterschiedlich konzentrierten<br />
Nanopartikel- und Arzneimittelgruppen auch mindestens zwei Kontroll- und zwei<br />
Einsaatansätze mitgeführt. Die Einsaatkontrolle wurde bereits nach vier Stunden fixiert,<br />
wodurch sich in der späteren Auswertung die relative Überlebensrate der Spiralganglienzellen<br />
aller Gruppen ermitteln ließ. Hierfür wurden die immunozytochemisch angefärbten<br />
Spiralganglienzellen der Einsaatkontrolle ausgezählt. Der Mittelwert der pro Versuchsansatz<br />
mitgeführten Einsaatkontrollansätze galt als Bezugsgröße (100 %) und wurde mit den<br />
Anzahlen der als vital geltenden Spiralganglienzellen der mit den Testsubstanzen behandelten<br />
Versuchsansätze sowie der Negativkontrolle ins Verhältnis gesetzt (5.1.1). Die<br />
Kontrollgruppe wurde nur mit serumfreiem Spiralganglienzellkulturmedium angesetzt, wobei<br />
keine weiteren Zusätze hinzugegeben wurden um den Effekt auf die Überlebensrate der<br />
Spiralganglienzellen der Nanopartikel und des Arzneimittels zu verifizieren. Versuchs- und<br />
Kontrollgruppen wurden nach 48 Stunden Inkubationszeit im Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2<br />
und 95 % Humidität fixiert.<br />
4.2.1.7 Fixation der Spiralganglienzellen<br />
Zur Fixierung der Spiralganglienzellen wurde zunächst das serumfreie<br />
Spiralganglienzellmedium entfernt wobei die Flüssigkeit vorsichtig vom Rand her abgesaugt<br />
wurde, um die am Boden adhärenten Zellen nicht zu beschädigen oder gar zu entfernen.<br />
Hierbei wurde auch darauf geachtet, dass der Boden nicht vollständig austrocknen durfte,<br />
bevor der nächste Schritt erfolgte. Anschließend wurde die Fixierlösung, welche zu gleichen<br />
Teilen aus Methanol und Aceton (10.2) besteht, hinzugefügt. Pro Well wurden 100 µl<br />
verwendet, welche für 10 Minuten bei Raumtemperatur einwirken mussten. Nach dreimaligen<br />
Spülvorgängen mit je 150 µl PBS (10.2) wird im letzten Durchgang die Lösung in der Kavität<br />
belassen und die Versuchsplatte von außen mit Parafilm abgedicht. So konnte die<br />
abgedichtete Platte bei 4 °C bis zur immunozytochemischen Anfärbung gelagert werden. Die<br />
Weiterverarbeitung sollte innerhalb der darauffolgenden 2 Monate abgeschlossen sein.
56<br />
4.2.1.8 Markierung der vereinzelten Spiralganglienzellen über die immunozytochemische<br />
ABC-Methode<br />
Da man durch die Präparation und Vereinzelung des Spiralganglionzellstrangs eine<br />
Mischkultur aus Spiralganglienzellen, Bindegewebszellen sowie Gliazellen erhält, ist es<br />
notwendig, die kultivierten Spiralganglienzellen nach der Fixierung zu markieren. Dadurch<br />
war es möglich, die Zielzellen sicher zu identifizieren, weiterhin wurde eine genaue<br />
Vermessung der Dendriten und Somadurchmesser ermöglicht.<br />
In der vorliegenden Arbeit erfolgte die spezifische Anfärbung der Spiralganglienzellen durch<br />
die Avidin-Biotin-Complex-(ABC-)Methode. Hierbei handelt es sich um eine<br />
Immunperoxidase-Methode, bei der ein biotinylierter Sekundärantikörper an einem gegenüber<br />
dem Zielantigen sensitiven Primärantikörper bindet (HSU et al. 1981). Der Mechanismus<br />
dieser Methode beruht auf dem Vorhandensein von vier Bindungsstellen für das<br />
wasserlösliche Vitamin Biotin am Molekül des Glykoproteins Avidin, wobei drei<br />
Bindungsstellen durch ein biotinyliertes Markerenzym besetzt werden. Bei diesem<br />
Markerenzym handelt es sich um eine Peroxidase. Die verbleibende Bindungsstelle wird zur<br />
Bindung eines biotinylierten Sekundärantikörpers verwendet, wobei dieser an einen gegen<br />
Spiralganglienzellantigene gerichteten Primärantikörper bindet. Anschließend wird durch die<br />
Zugabe des Chromogens Diaminobenzidin (DAB) eine Enzym-Substrat-Reaktion<br />
herbeigeführt, welche letztlich zu einer farbigen Markierung der Spiralganglienzellen führt.<br />
Für die selektive Anfärbung der Spiralganglienzellen wurde neben den einzelnen<br />
Bestandteilen des „Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit, Mouse IgG“ (10.2) und „Peroxidase<br />
Substrate Kit DAB“ (10.2), sterilisierte PBS (10.2) sowie der als Primärantikörper dienende<br />
„ANF-AK (Neurofilament 200 kD, NCL-NF200)“-Antikörper (10.2) verwendet. Die<br />
Arbeitsabfolge entsprach hierbei dem Schema von in der Literatur publizierten Protokollen<br />
(DAZERT et al. 1998; ALETSEE et al. 2000).<br />
Vor dem Beginn der einzelnen Färbeschritte stellt man eine 1,5%ige Pferdenormalserum-<br />
lösung her, wobei für einen Versuchsumfang von 50 Wells einer 96-Multiwellplatte zu 13 ml<br />
PBS 3 Tropfen Pferdeserum aus dem Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit hinzugegeben<br />
wurden. Anschließend wurden für die Herstellung der Antikörperlösung 1 in 6 ml<br />
Pferdenormalserumlösung 13 µl ANF-Antikörper hinzugegeben, was einer Konzentration von
57<br />
1:500 entspricht. Die Antikörperlösung 2 wurde durch die Zugabe von 30 µl Biotin-Ak aus<br />
dem Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit in 6 ml Pferdenormalserumlösung hergestellt. Die<br />
Endkonzentration entspricht in diesem Fall einer Verdünnung von 1:200.<br />
Nach Fertigstellung dieser Lösungen wurden die Zellen aus dem Brutschrank entnommen.<br />
Das überstehende PBS wurde vorsichtig vom Rand her entfernt, woraufhin 100 µl der<br />
Antikörperlösung 1 in jede Vertiefung gebracht wurden und eine Inkubationszeit von einer<br />
Stunde bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank erfolgte. Nach Ablauf der Inkubationszeit<br />
wurde der Überstand verworfen und es folgte ein Spülvorgang mit 150 µl PBS pro<br />
Vertiefung. Anschließend wurde eine Inkubationszeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur<br />
mit 100 µl Antikörperlösung 2 pro Kavität durchgeführt. Während dieser Zeit wurde die<br />
ABC-Lösung hergestellt, wozu 7,5 ml PBS mit jeweils drei Tropfen der Reagenzien A und B<br />
aus dem Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit versetzt wurden. Die Lösung sollte dabei etwa<br />
30 Minuten vor der Verwendung hergestellt werden.<br />
Nach einem weiteren Spülschritt mit jeweils 150 µl PBS wurden anschließend pro Vertiefung<br />
100 µl ABC Lösung hinzugegeben und für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.<br />
In der Zwischenzeit erfolgte die Herstellung des DAB-Substrats aus den Reagenzien des<br />
Peroxidase Substrate Kits DAB. Hierzu wurden 7,5 ml Aqua bidest (10.2) mit 3 Tropfen<br />
Puffer-Stammlösung, 6 Tropfen DAB-Stammlösung sowie 3 Tropfen Wasserstoffperoxid<br />
vermischt. Das DAB-Substrat wurde letztlich nach einem wie oben beschriebenen Spülschritt<br />
in einer Menge von 100 µl pro Well hinzugegeben, wobei dieser Färbevorgang nach einer<br />
Dauer von 12 Minuten durch die Hinzugabe von 300 µl PBS pro Kavität gestoppt wurde.<br />
Nach Verwerfen des Überstandes erfolgte ein weiterer Spülvorgang mit jeweils 150 µl PBS,<br />
wobei zur abschließenden Lagerung bei 4 °C 150 µl PBS pro Well hinzugegeben wurden, was<br />
ein Austrocknen der fixierten und gefärbten Zellen verhindert. Bis zur Auswertung war eine<br />
Lagerung der Zellen durch Abdichten mit Parafilm bei 4 °C bis zu zwei Monate möglich.
58<br />
4.2.1.9 Vermessung der Spiralganglienzellen und statistische Auswertung der<br />
Spiralganglienzellversuche<br />
Zur Auswertung der Versuche wurden mittels eines inversen binokularen Mikroskops (10.6)<br />
und einer charged-coupled-device-(CCD)-Kamera (10.6) sowie dem angeschlossenem<br />
rechnergestützten Bildbearbeitungssystem cellP (Olympus Soft Imaging Solutions, Münster;<br />
10.6) drei Parameter der überlebenden und zuvor immunozytochemisch angefärbten<br />
Spiralganglienzellen ermittelt. Zunächst erfolgte die Bestimmung der Zellanzahl von vitalen<br />
Spiralganglienzellen. Als vital wurden Zellen definiert, deren Neuritenaussprossungen<br />
mindestens die dreifache Länge des Somadurchmessers aufgewiesen haben (MARZELLA et<br />
al. 1999). Als zweiter Parameter wurde mittels softwaregestützter Vermessung die Länge der<br />
Neuriten bestimmt. Hierbei wurden pro Kavität 5 Gesichtsfelder bestimmt und je Gesichtsfeld<br />
diejenige Spiralganglienzelle mit der längsten Neuritenaussprossung vermessen (GILLESPIE<br />
et al. 2001). War in dem entsprechenden Gesichtsfeld keine vitale Spiralganglienzelle<br />
visualisierbar, so wurde eine Zelle aus einem benachbartem Bereich hinzugezogen. Letztlich<br />
erfolgte in entsprechender Weise die Vermessung des Somadurchmessers, wobei die Messung<br />
vertikal zur Richtung der Neuritenaussprossung vorgenommen wurde. Weiterhin wurde bei<br />
der Erhebung der Parameter auch auf morphologische Abweichungen der Zellen geachtet,<br />
welche Aufschluss auf eine Beeinträchtigung durch die Testsubstanzen geben könnten.<br />
Abbildung 5 gibt eine beispielhafte Darstellung der angezüchteten Spiralganglienzellen<br />
wieder.<br />
Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Softwareprogramm GraphPad Prism ® 4 (10.6).<br />
Zunächst wurden die Daten mittels Kolmogorow-Smirnow-Test auf Normalverteilung<br />
geprüft, anschließend wurde eine Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) mit<br />
Student-Newman-Keuls-Test durchgeführt.<br />
Die ermittelten Signifikanzniveaus wurden dabei wie folgt definiert:<br />
- p > 0,05 = nicht signifikant unterschiedlich (ns)<br />
- p < 0,05 = signifikant unterschiedlich (*)<br />
- p < 0,01 = hoch signifikant unterschiedlich (**)<br />
- p < 0,001 = höchst signifikant unterschiedlich (***)
59<br />
Abb. 5: Beispielhafte Darstellung in Zellkultur angezüchteter und immunozytochemisch angefärbter<br />
(DAB-Färbung) Spiralganglienzellen. Als vital wurden Zellen bewertet, deren Neuritenausläufer<br />
mindestens die dreifache Länge des Somadurchmessers aufweisen konnten. Immunozytochemisch<br />
angefärbte Spiralganglienzellen ohne Ausläufer wurden als nicht lebensfähig bewertet (Pfeile).<br />
4.2.2 Methoden für die in-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen<br />
4.2.2.1 Die Generierung und Kultivierung dendritischer Zellen<br />
Die Generierung dendritischer Zellen erfolgte durch die Gewinnung von Stammzellen aus<br />
dem Knochenmark des Femurs von BALB/c Mäusen. Hierbei wurde nach dem in der<br />
Literatur beschrieben Protokoll von LUTZ et al. (1999) verfahren.
60<br />
Zunächst wurden die verwendeten Tiere durch zervikale Dislokation getötet. Danach erfolgte<br />
die Entnahme des Femurs, welcher im Anschluss für 5 Minuten in 70%igem Ethanol<br />
desinfiziert und anschließend in sterile PBS-Lösung (10.2) überführt wurde.<br />
Mittels eines Skalpells wurden die Epiphysen des Femurs abgesetzt, um die Stammzellen<br />
mithilfe einer Spritze und 5 ml PBS aus dem Knochen zu spülen. Durch vorsichtiges hin und<br />
herschaben mit der Kanüle in der Markhöhle wurde die Gewinnung von möglichst vielen<br />
Zellen sichergestellt, welche in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen (10.4) aufgefangen wurden.<br />
Um die Zellen zu vereinzeln, wurde die gewonnene Suspension mit einer Pipette einige Male<br />
auf und ab pipettiert, um anschließend bei 300 g für 10 Minuten und 4 °C zentrifugiert zu<br />
werden. Der entstehende Überstand wurde verworfen und das Zellpellet im Anschluss mit<br />
5 ml Roswell Park Memorial Institute-Medium (RPMI, 10.2) Medium resuspendiert. Um die<br />
Anzahl der gewonnen Zellen zu bestimmen, wurden 100 µl der Zellsuspension in ein<br />
Eppendorffgefäß überführt und mit 100 µl Schwintzer-Lyse (10.2) für 5 Minuten bei<br />
Raumtemperatur inkubiert. Hierdurch kommt es zur Lyse der in der Suspension ebenfalls<br />
vorhandenen Erythrozyten. Zur Auszählung der vitalen Zellen wurden aus dieser Lösung<br />
wiederum 50 µl entnommen um in 100 µl Trypanblau (10.2) überführt zu werden. Durch das<br />
Trypanblau können tote Zellen visualisiert werden, indem der Farbstoff aufgrund einer<br />
verstärkten Permeabilität der Zellmembran abgestorbener Zellen ins Zytoplasma<br />
aufgenommen wird und die Zelle folglich blau anfärbt. Positiv angefärbte Zellen wurden<br />
nicht ausgezählt. Im Anschluss wurden 10 µl des Trypanblau-Zellgemischs auf eine<br />
Neubauerkammer aufgetragen und die vorhandenen Zellen in vier Feldern der Kammer unter<br />
einem Mikroskop (10.6) ausgezählt. Die daraus resultierende Gesamtzellzahl wurde mit der<br />
Formel: Anzahl der ausgezählten Zellen x 2 x 3 x 10.000/4, errechnet. Die Faktoren 2 und 3<br />
ergeben sich durch die Verdünnung mit Schwintzer-Lyse und dem Trypanblau wobei das<br />
Ergebnis durch die Anzahl der vier ausgezählten Felder geteilt wird.<br />
Zu Beginn des Zellansatzes zur Reifung der dendritischen Zellen, wurde eine Zellzahl von<br />
3 x 10 6 Zellen in eine Petrischale mit 10 ml sterilem DC-Medium (10.1) eingesät. Die Zellen<br />
wurden insgesamt 10 Tage im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. An Tag 3<br />
erfolgte eine Zugabe von 10 ml frischem, sterilem DC-Medium mit 20 ng/ml granulocyte<br />
macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Am 6. sowie 8. Tag erfolgte ein teilweiser<br />
Mediumwechsel, wobei 10 ml aus der Kultur entnommen wurden und die darin enthaltenen
61<br />
Zellen bei 300 g und 4 °C für 10 Minuten herunterzentrifugiert wurden. Der Überstand des<br />
alten Mediums wurde verworfen, wobei die Zellen mit 10 ml frischem Medium resuspendiert<br />
wurden. Im Anschluss wurden die Zellen wieder in die Petrischale überführt. Des Weiteren<br />
wurde auch an diesen Tagen 20 ng/ml GM-CSF hinzugefügt.<br />
Die optimale Kultivierungsdauer wird für aus dem Knochenmark gewonnene dendritische<br />
Zellen mit etwa 8 Tagen angegeben (INABA et al. 1992). Bei einer längeren Kultivierung von<br />
über 10 Tagen nehmen die Reinheit und die Ausbeute der Zellen wieder ab.<br />
4.2.2.2 Übersicht der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen<br />
In diesem Versuchsaufbau sollte der Einfluss von Rolipram, sowie von in Lipidnanokapseln<br />
inkorporiertem Rolipram auf die TNF-α-Produktion dendritischer Zellen untersucht werden.<br />
So wurden die kultivierten Zellen am Tag neun des Versuchs mit den jeweiligen<br />
Testsubstanzen behandelt. Eine Stunde später erfolgte die Zugabe von 0,5 µg/ml LPS<br />
(Lipopolysacchariden; 10.2), was zur Reifung und Aktivierung der dendritischen Zellen führt.<br />
Durch die Anregung der Zellen mit LPS kommt es zur Produktion des Zytokins TNF-α. Die<br />
Stärke der Hemmung der Zytokinproduktion durch die verwendeten Versuchssubstanzen<br />
wurde durch die Bestimmung der TNF-α-Konzentration ermittelt (4.2.2.3). Je geringer die<br />
TNF-α-Produktion, desto höher die Effizienz der hemmenden Wirkung der Substanz. Um ein<br />
Ausbleiben der TNF-α-Produktion durch eine verminderte Vitalität der Zellen durch eine<br />
mögliche Toxizität der eingesetzten Substanzen auszuschließen wurde ein CellTiter 96 ®<br />
Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay am Ende des Versuchs (Tag 10) durchgeführt<br />
(4.2.2.4). Hierfür wurde die gesamte Mikrotiter-Wellplatte zunächst für 10 min bei 1000 g<br />
(g = Erdschwerebeschleunigung) und 4 °C zentrifugiert, um die Abnahme eines zellfreien<br />
Überstandes zu gewährleisten. Bis zur Auswertung wurden die Überstände bei -80 °C<br />
eingefroren.<br />
Dieser Versuch sollte neben der Wirkung des Roliprams auch eine Aussage über die Effizienz<br />
der Nanopartikel-Rolipram-Kombination liefern. Des Weiteren können auch Rückschlüsse<br />
auf den Einfluss des Roliprams auf entzündungsbedingte Prozesse gezogen werden, da TNF-α
62<br />
hierbei eine Schlüsselrolle spielt und die Hemmung dieses Zytokins zu einer Abschwächung<br />
der Symptome führt.<br />
Sechs Gruppen wurden gebildet und in drei Versuchsansätzen wiederholt, wobei die<br />
Ergebnisse zusammengefasst und statistisch ausgewertet wurden. Die verwendeten<br />
Konzentrationen wurden in Anlehnung an HEYSTEK et al. (2003) gewählt.<br />
- Zu dem ersten Zellkulturansatz (Versuchsgruppe ROLIRPAM) wurden vier<br />
unterschiedliche Verdünnungen von Rolipram hinzugegeben (10 µmol, 1 µmol,<br />
0,1 µmol, 0,01 µmol).<br />
- Der zweiten Gruppe wurde die Nanopartikel-Rolipram Kombination (LNC FITC<br />
ROLIPRAM) hinzugegeben, wobei die Konzentrationen des Roliprams analog zur<br />
ersten Gruppe gewählt wurden (10 µmol, 1 µmol, 0,1 µmol, 0,01 µmol).<br />
- Die dritte Gruppe (LNC FITC) wurde mit unbeladenen Nanopartikeln behandelt,<br />
wobei diese den Fluoreszenzmarker FITC an ihrer Oberfläche gekoppelt hatten.<br />
Die Partikelanzahlen entsprechen in den unterschiedlichen Konzentrationen den<br />
Werten der zweiten Gruppe.<br />
- Als Kontrollgruppe wurde ein unbeladener, sowie unmarkierter Partikel gewählt<br />
(LNC BLANK), um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Die<br />
Konzentrationen entsprechen ebenfalls den Werten der Gruppe 1.<br />
- Als Negativkontrolle wurde in einer fünften Gruppe der Effekt des Vehikels, also<br />
des Lösungsmittels (DMSO > 0,01 Vol. %) auf die TNF-α-Produktion der<br />
dendritischen Zellen untersucht. Die dendritischen Zellen dieser Gruppe (Gruppe<br />
VEHIKEL) wurden nicht mit LPS behandelt.<br />
- Die sechste Gruppe diente als Positivkontrolle, wobei die dendritischen Zellen mit<br />
keiner weiteren Substanz behandelt, aber mit LPS angeregt wurden (Gruppe LPS).<br />
Als Übersicht zur Gruppenaufteilung sowie zu den verwendeten Konzentrationen soll die<br />
untenstehende Tabelle 4 dienen.
63<br />
Tab. 4: Übersicht der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen zur Beurteilung der TNF-α Produktion<br />
nach LPS-induzierter Stimulation und Zugabe von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM, LNC FITC und<br />
LNC BLANK<br />
Versuchsgruppe Konzentration<br />
Nanopartikel<br />
Gruppe1:<br />
ROLIPRAM<br />
Gruppe 2:<br />
LNC FITC<br />
ROLIRPAM<br />
Gruppe 3<br />
LNC FITC<br />
Gruppe 4:<br />
LNC BLANK<br />
Gruppe 5:<br />
VEHIKEL<br />
(DMSO > 0,01<br />
Vol.-%)<br />
Gruppe 6:<br />
LPS<br />
1,06 x 10 11<br />
1,06 x 10 12<br />
1,06 x 10 13<br />
1,06 x 10 14<br />
1,06 x 10 11<br />
1,06 x 10 12<br />
1,06 x 10 13<br />
1,06 x 10 14<br />
1,06 x 10 11<br />
1,06 x 10 12<br />
1,06 x 10 13<br />
1,06 x 10 14<br />
4.2.2.3 Messung der TNF-α-Konzentration<br />
Konzentration<br />
Rolipram<br />
0,01 µmol<br />
0,1 µmol<br />
1 µmol<br />
10 µmol<br />
0,01 µmol<br />
0,1 µmol<br />
1 µmol<br />
10 µmol<br />
Anzahl der Wells<br />
pro Konzentration<br />
und Versuchstag<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
4<br />
Anzahl der<br />
Wells insgesamt<br />
Die Messung des von den dendritischen Zellen produzierten Zytokins TNF-α wurde mittels<br />
eines TNF-α-Maus ELISA (10.2, R&D Systems, Minneapolis, USA) nach Herstellerprotokoll<br />
durchgeführt. Das Prinzip dieses Tests beruht auf der Bindung von TNF-α an polyklonale<br />
Antikörper, welche fest in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte (10.4) gebunden sind. Wird<br />
4<br />
4<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12<br />
12
64<br />
der Überstand der unterschiedlichen Versuchsansätze nun auf die Platte gegeben, so bindet<br />
darin vorhandenes TNF-α an diesen Antikörper. Durch das Hinzufügen eines<br />
enzymgekoppelten Antikörpers wurde TNF-α erneut gebunden, woraufhin die Zugabe eines<br />
Farbstoffes einen enzyminduzierten Farbumschlag bewirkt. Je mehr TNF-α vorhanden war,<br />
desto stärker ist der Farbumschlag, was durch photometrische Auswertung mittels MRX-<br />
Reader (10.6) bei 450 nm zwischen den unterschiedlichen Gruppen verglichen werden sollte.<br />
Anhand der ermittelten Werte der Standardreihe wurde eine Kalibrationskurve zur<br />
Bestimmung der TNF-α-Konzentration in den mit den Testsubstanzen behandelten Wells<br />
errechnet. Die statistische Auswertung wurde über den Vergleich der jeweiligen<br />
Konzentrationen der Gruppen untereinander durchgeführt und mittels Varianzanalyse<br />
(analysis of variance, ANOVA) und Student-Newman-Keuls-Test ausgewertet. Hierfür wurde<br />
das Softwareprogramm GraphPad Prism ® 4 (10.6) verwendet.<br />
Die ermittelten Signifikanzniveaus wurden dabei wie folgt definiert:<br />
- p > 0,05 = nicht signifikant unterschiedlich (ns)<br />
- p < 0,05 = signifikant unterschiedlich (*)<br />
- p < 0,01 = hoch signifikant unterschiedlich (**)<br />
- p < 0,001 = höchst signifikant unterschiedlich (***)<br />
4.2.2.4 Vitalitätsbestimmung<br />
Zur Bestimmung der Vitalität der dendritschen Zellen wurde am Ende des Versuchs (Tag 10)<br />
ein CellTiter 96 ® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay durchgeführt. Zudem<br />
wurden die Zellen einer mikroskopischen Kontrolle hinsichtlich morphologischer<br />
Abweichungen unterzogen, welche eine tendenzielle Aussage über eine mögliche<br />
Beeinflussung durch die Testsubstanzen zulassen könnte. Die Ergebnisse des Vitalitätstests<br />
lassen eine Aussage über die Beeinträchtigung der Zellen durch die verwendeten<br />
Testsubstanzen zu. So kann eine geringere TNF-α-Produktion nicht nur durch eine Hemmung<br />
der Zytokinbildung sondern auch durch ein vermehrtes Degenerieren der in der Zellkultur<br />
vorhandenen Zellen bedingt sein.
65<br />
Die Funktionsweise dieses Assays basiert auf der Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-<br />
Phosphat (NADPH) oder Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) katalysierten<br />
Umsetzung von dem gelblichen Methyltetrazolium zu einem violetten Formazanfarbstoff.<br />
NADPH/NADH befindet sich nur in lebenden Zellen, sodass der Farbumschlag durch<br />
photometrische Auswertung bei 490 nm einen Aufschluss auf die Vitalität der Zellen gibt. Die<br />
erhaltene Menge des Formazonfarbstoffs ist hierbei direkt proportional zu der Anzahl vitaler<br />
Zellen.<br />
4.2.3 Methoden für die In-vivo-Versuche<br />
4.2.3.1 Übersicht der In-vivo-Versuche<br />
In den vorangegangenen In-vitro-Versuchen zeigte sich das beste Spiralganglienzellüberleben<br />
bei einer Nanopartikel-Rolipram-Konzentration von 1:100 (Konzentration der Stammlösung:<br />
Lipidnanokapseln 45 mg /ml; 19 µg/ml Rolipram). Basierend auf diesem Ergebnis wurde<br />
dieselbe Konzentration in den In-vivo-Versuchen angewendet. Die entsprechenden Lösungen<br />
wurden per Cochleostomie in die Scala tympani der Versuchstiere injiziert. Die Durchführung<br />
der Versuche erfolgte, wie zuvor beschrieben, mit vier Versuchsgruppen (4.1.6).<br />
Nach der histologischen Aufarbeitung wurden die Anzahlen der überlebenden<br />
Spiralganglienzellen sowie deren Somadurchmesser ermittelt. Zunächst erfolgte ein Vergleich<br />
der erhobenen Daten der Gruppen untereinander. Dabei wurden die Daten der mit der<br />
Testsubstanz behandelten Seiten statistisch verglichen. Des Weiteren erfolgte ein statistischer<br />
Vergleich der Ergebnisse innerhalb der einzelnen Gruppen. Hierbei wurden die Daten der mit<br />
der Testsubstanz behandelten Seite mit den Daten der Kontrollseite verglichen.<br />
4.2.3.2 Anästhetische Versorgung; prä- und postoperative Versorgung der Versuchstiere<br />
Sämtliche an den Versuchstieren vorgenommenen Manipulationen, wie elektrophysiologische<br />
Messungen, chirurgische Eingriffe, sowie die transkardiale Perfusion, erfolgten unter
66<br />
Allgemeinanästhesie. Dazu wurde den Tieren nach Ermittlung des aktuellen Körpergewichts<br />
eine Kombination von 40 mg Ketamin/kg Körpergewicht (KGW) und 0,3 mg/kg KGW<br />
Medetomidin (10.3) intramuskulär verabreicht. Bei Bedarf wurde mit einer Zweidritteldosis<br />
der ursprünglichen Konzentration nachdosiert. Davon ausgenommen wurde am Tag 21 der<br />
Studie nach den aABR Messungen mit der vollen Ursprungsdosis nachdosiert, um die<br />
Schmerzfreiheit im Verlauf der Perfusion insbesondere während der Thorakotomie zu<br />
gewährleisten. Während der gesamten Narkosedauer wurden die Meerschweinchen auf einer<br />
Wärmematte (10.3) gelagert, um die Körpertemperatur auf 37-38 °C zu halten.<br />
Des Weiteren erhielten die Tiere 0,05 mg/kg KGW Atropin (10.3), um die Salivation zu<br />
vermindern, sowie 5 mg/kg KGW Carprofen (10.3) zur Analgesie. Die Operationsfelder der<br />
Ertaubung sowie die der Cochleostomie wurden im Anschluss an die elektrophysiologischen<br />
Messungen mittels einer Haarschneidemaschine (10.3) rasiert, sowie mit Cutasept ® (10.3)<br />
desinfiziert, um das Risiko einer Infektion zu minimieren. An den entsprechenden<br />
Schnittstellen wurde zusätzlich eine Lokalanästhesie mittels Prilocain (10.3) vorgenommen.<br />
Die Mengen variierten hierbei je nach Eingriff zwischen 1 ml bei den Hautschnitten der<br />
Ertaubung sowie der Cochleostomie und 6 ml im Vorfeld der Thorakotomie. Die antibiotische<br />
Versorgung der Tiere wurde am Tag der Operation mit einer intramuskulären Injektion von<br />
10 mg/kg Enrofloxacin (10.3) gewährleistet. Zum Schutz der Hornhaut wurden die Tiere lokal<br />
mit dexpanthenolhaltiger Augensalbe (10.3) versorgt, um ein Austrocknen der Cornea<br />
aufgrund des fehlenden Lidreflexes während der Narkose zu verhindern. Die Nachsorge<br />
erfolgte durch eine 5-tägige orale Applikation von Enrofloxacin (10 mg/kg KGW). Am ersten<br />
Tag nach der Operation, sowie einen Tag vor der Operation wurde zusätzlich 0,5 ml Bene<br />
Bac® (10.3) oral verabreicht, um die Darmflora zu stabilisieren.<br />
4.2.3.3 Akustisch-evozierten Hirnstammpotentiale (aABR)<br />
Unmittelbar vor der systemischen Ertaubung am Versuchstag 0 wurde über eine acoustically<br />
evoked auditory brainstem response (aABR)-Messung die physiologische Hörschwelle der<br />
Versuchstiere bestimmt. Bei Meerschweinchen wird die physiologische Hörschwelle in einem<br />
Bereich von unter 50 dB SPL angegeben (KANO u. STARR 1987; MITCHELL et al. 1997).
67<br />
Tiere, die nicht dieser Norm entsprochen hätten, wären aus der Studie genommen worden,<br />
was im Verlauf der Tierversuchsstudien nicht erforderlich war.<br />
Am siebten Versuchstag wurde im Vorfeld der Cochleostomie mittels einer erneuten aABR-<br />
Messung der Erfolg der systemischen Ertaubung kontrolliert. Zeigten die Tiere einen<br />
Hörschwellenanstieg um ≥ 50 dB, so wird der Verlust des Hörempfindens angenommen<br />
(AGTERBERG et al. 2009). War ein geringerer Anstieg der Hörschwelle zu erkennen, so ist<br />
die Annahme eines Resthörvermögens gegeben. Versuchstiere mit Resthörvermögen schieden<br />
aus der Studie aus.<br />
Kurz vor der Perfusion wurde am 21. Versuchstag die letzte aABR-Messung vorgenommen,<br />
um den Erfolg der Ertaubung nochmals zu bestätigen und um eventuelle Veränderungen<br />
hinsichtlich der Hörschwelle festzustellen. Die Ableitung der akustisch evozierten<br />
Hirnstammpotentiale erfolgte durch ein System der Firma Tucker-Davis Technologies (TDT,<br />
Alachua, Florida, USA). Dieses System besteht aus zwei RX6-Multifunktionsprozessoren<br />
(10.6), einer Lautsprechertreibereinheit (ED 1) sowie einem Mikrophonverstärker zur<br />
Kalibrierung der Übertragungsstrecke (10.6). Die anästhesierten und auf einer Wärmematte<br />
(10.6) platzierten Meerschweinchen erhielten die akustischen Stimuli über elektrostatische<br />
Lautsprecher (EC 1) (10.6). Als Ohrsonden dienten umfunktionierte 200 µl Pipettenspitzen,<br />
die auf den Lautsprechern aufgesetzt in den äußeren Gehörgang der Meerschweinchen<br />
platziert wurden.<br />
Zur Ableitung der akustisch evozierten Potentiale wurden vier Nadelelektroden (10.6)<br />
subdermal am Kopf des Tieres angebracht. Die Referenzelektrode wurde am Nasenrücken<br />
befestigt. Relativ dazu wurden vom linken sowie rechten Mastoid die akustisch evozierten<br />
Potentiale über zwei weitere Elektroden abgeleitet. Die Platzierung der Erdungselektrode<br />
erfolgte im Nackenbereich des Tieres zur Unterdrückung von Störsignalen, die z.B. durch<br />
Herzschlag oder Muskelspannung hervorgerufen wurden. Die Ableitelektroden übertrugen die<br />
Potentiale über den Niedrig-Impedanz-Wandler (RA4LI) an einen Vorverstärker (Medusa 4<br />
channel Preamps, RA4PA 4-channel preamp). Dieser setzte die Signale digital um und<br />
überführte sie über ein Glasfaserkabel an den Multifunktionsprozessor.<br />
Ein mit den Hardware-Komponenten der Messeinheit verbundener Computer steuerte über<br />
die TDT-Software (BioSigRP) die einzelnen Messungen. So wurde der Dynamikbereich der<br />
Stimuli (10 ms Sinuspulse; 1ms kosinus Ein- und Ausblendfunktion) in 10 dB Schritten von
68<br />
20-90 dB SPL festgelegt, wobei dem Tier folgende Frequenzen präsentiert wurden: 1 kHz,<br />
4 kHz, 8 kHz, 16 kHz, 32 kHz und 40 kHz. Zur Rauschunterdrückung innerhalb der<br />
abgeleiteten Potentiale wurde ein Bandpassfilter erster Ordnung mit einem Durchlassbereich<br />
von 300 Hz bis 3 kHz bei 3 dB Dämpfung an den Grenzen verwendet. Um weitere Artefakte<br />
zu unterdrücken, wurde eine Schwelle von 70 µV gewählt. Ableitungen, die diese Schwelle<br />
überschritten, wurden verworfen. Für die graphische Darstellung wurden die Ableitungen für<br />
jeden wiederholten Stimulus über 270 Durchläufe gemittelt. Die Hörschwelle wurde<br />
anschließend durch visuelle Auswertung bestimmt und galt als erreicht, sobald ein deutliches<br />
lokales Maximum im Verlauf der gemittelten Wellenform zu erkennen war (YAGI et al.<br />
2000; VIVERO et al. 2007).<br />
4.2.3.4 Systemische Ertaubung von Meerschweinchen<br />
Für die In-vivo-Versuche der vorliegenden Arbeit erfolgte ein induzierter Haarzellverlust<br />
durch die Applikation ototoxisch wirkender Arzneimittel. So ist durch die Verabreichung von<br />
Kanamycin und dem Schleifendiuretikum Furosemid einwirkungsvoller Haarzellverlust<br />
bereits nach zwei Stunden zu erwarten. Die auf diese Weise ertaubten Tiere dienen als Modell<br />
für Patienten mit sensorineuralem Hörverlust (VERSNEL et al. 2007).<br />
Zu Beginn der medikamentellen Ertaubung wurden die Tiere einer Allgemeinanästhesie<br />
unterzogen (4.2.3.2). Die Narkose ist zum einen für die Bestimmung der Hörschwellen der<br />
Tiere notwendig (4.2.3.3), zum anderen wird die Applikation des Furosemids in die externe<br />
Vena jugularis vorgenommen, deren Zugang nur über eine operative Eröffnung der ventralen<br />
Halsmuskulatur möglich ist.<br />
Nachdem die Tiere narkotisiert waren, erfolgte vor der Bestimmung der Hörschwelle eine<br />
subkutane Injektion von 400 mg Kanamycin/kg KGW (10.3). War die Messung beendet,<br />
wurden die Tiere für die Operation vorbereitet indem eine Rasur des Haarkleides am<br />
ventralen Halsbereich vorgenommen wurde und im Bereich der Schnittlinie ein Milliliter<br />
Xylonest ® Lokalanästhetikum (10.3) subkutan injiziert wurde. Zu Beginn der Operation<br />
wurden die Tiere auf einer Wärmematte (10.3) auf dem Rücken liegend gelagert, um einen<br />
optimalen Zugriff auf das Operationsfeld zu erhalten. Nach der lokalen Desinfektion durch
69<br />
Cutasept ® erfolgte ein medianer Hautschnitt am ventralen Hals um nachfolgend die<br />
Halsmuskulatur mit Hilfe einer chirurgischen Schere (10.5) stumpf zu durchtrennen. Die in<br />
der Tiefe liegende Vena jugularis wurde vorgelagert und auf den geöffneten Schenkeln einer<br />
chirurgischen Pinzette positioniert, wo sie von eventuell anheftendem Bindegewebe befreit<br />
werden konnte. So vorbereitet wurden drei Schlaufen aus resorbierbarem Nahtmaterial (10.4)<br />
um das Gefäß gelegt. Die kopf- und herzwärts gelegenen Schlaufen wurden jeweils an die<br />
Außenseite der Pinzettenschenkel gebracht, um den für die Eröffnung des Gefäßes nötigen<br />
Handlungsraum zu vergrößern. Die mittlere Schlaufe wurde zunächst in Richtung Kopf um<br />
das Gefäß gelegt. Die Eröffnung des Gefäßes wurde mittels einer 1G-Kanüle (10.4)<br />
vollzogen. Mit einer feinen Uhrmacherpinzette (10.5) war es nun möglich, in die perforierte<br />
Stelle vorzudringen und durch Aufziehen der Öffnung einen mit NaCl gefüllten<br />
Silikonschlauch in das Gefäß vorzuschieben. Ließ sich der Schlauch ohne Probleme<br />
vorschieben, so erfolgte das Aufsetzen einer mit Natriumchlorid (NaCl) gefüllten Spritze und<br />
es wurde durch Aspiration von Blut die korrekte Positionierung des Schlauches überprüft.<br />
Danach wurde die mittlere Schlaufe um den im Gefäß positionierten Schlauch leicht<br />
angezogen um einen Austritt des im Anschluss zu applizierenden Furosemids (10.3) zu<br />
verhindern. Die mit NaCl gefüllte Spritze wurde nun durch eine mit Furosemid gefüllte<br />
Spritze ersetzt, wobei pro Kilogramm Körpergewicht 100 mg Furosemid langsam über einen<br />
Zeitraum von 10 Minuten appliziert wurden. Zwischenzeitlich wurde immer wieder Blut<br />
aspiriert, um den richtigen Sitz des Schlauches zu kontrollieren. Nach der Applikation wurde<br />
die mittlere Schlaufe entfernt, und die beiden äußeren Schlaufen wurden ligiert. Abschließend<br />
erfolgte der Verschluss der Muskulatur mittels Einzelheften aus resorbierbarem Nahtmaterial<br />
(10.4), während die äußere Haut mit nichtresorbierbarem Faden verschlossen wurde (10.4).<br />
4.2.3.5 Applikation von Flüssigkeiten ins Innenohr via Cochleostomie<br />
Bevor die eigentliche Applikation von Flüssigkeiten in die Scala tympani des Innenohres via<br />
Cochleostomie durchgeführt werden konnte, musste ein geeignetes Applikationssystem<br />
hergestellt werden (Abb. 6). Hierzu wurde ein etwa 20 cm langer Silikonschlauch<br />
(Innendurchmesser 0,3 mm, Außendurchmesser 0,7 mm) (10.4) auf den Konus einer
70<br />
27 G Kanüle (10.4) geschoben. In das freie Vorderende wurde ein 2,5 cm langer<br />
Polyimidschlauch (Innendurchmesser 0,12 mm, Außendurchmesser 0,28 mm; 10.4)<br />
eingebracht, sodass die eine Hälfte im Silikonschlauch befindlich war. Zur Abdichtung und<br />
Fixierung des Silikonschlauches an der Kanüle, sowie des Polyimidschlauches in dem<br />
Silikonschlauch wurde Gewebekleber (10.4) sowie auch Karboxylatzement (10.2) verwendet.<br />
Etwa 1 mm entfernt von der Spitze des Polyimidschlauches wurde mit Karboxylatzement<br />
(10.2) eine kleine Kugel gebildet, welche die Öffnung der Scala tympani während des<br />
Einbringens von Flüssigkeiten bei der Cochleostomie abdichten soll. Gleichzeitig wird ein zu<br />
weites Vordringen ins Innere der Hörschnecke verhindert, was ungewollten Verletzungen<br />
vorbeugt. Nach dieser Präparation trocknete und härtete der verwendete Kleber und<br />
Knochenzement 2 Tage aus, bevor er durch eine Sterilisation im Autoklaven (10.6) für die<br />
Benuztung bereitgestellt werden konnte.<br />
1 2<br />
3<br />
Abb. 6: Die Abbildung veranschaulicht das Injektionssystem zur Einbringung von Flüssigkeiten in das<br />
Innenohr. Teilbild 1 zeigt eine stumpfe 27 G Kanüle auf welche der Silikonschlauch aufgeschoben und<br />
anschließend mit Gewebekleber fixiert wurde. In Teilbild 2 ist eine Großaufnahme des<br />
Polyimidschlauches zu sehen, welcher in die Spitze des Silikonschlauches eingeschoben und mit<br />
Gewebekleber sowie Karboxylatzement fixiert wurde. Der Pfeil weist auf eine mit Karboxylatzement<br />
geformte Verdickung an der Spitze des Polyimidschlauches, welche ein zu tiefes Eindringen in die<br />
cochleären Strukturen verhindert. Teilbild 3 zeigt die Hamiltonspritze und das Schlauchsystem im<br />
Überblick.
71<br />
Die in den Versuchen benutzten Lösungen wurden am Tag der Operation mit steriler<br />
phosphate buffered saline (PBS)-Lösung (10.2) verdünnt, sodass die Konzentration der<br />
verwendeten Nanopartikellösungen einer Verdünnung von 1:100 der Stammlösung<br />
entsprachen (Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln 45 mg/ml; 19 µg/ml<br />
Rolipram). So enthielt die verdünnte Rolipram-Nanopartikellösung pro Milliliter 0,19 µg<br />
Rolipram. Die Lösung des Arzneimittels Rolipram wurde in der entsprechenden Gruppe mit<br />
PBS ebenfalls auf die Konzentration 0,19 µg pro Milliliter verdünnt.<br />
Am 7. Versuchstag wurden die Tiere zunächst unter Allgemeinanästhesie (4.2.3.2) einer<br />
Hörschwellenbestimmung (4.2.3.3) unterzogen. Diese erneute Messung diente als<br />
Kontrollmessung der am Tag null durchgeführten Ertaubung.<br />
Zu Beginn der Operation wurden die Tiere in Bauchlage auf einer Wärmematte (10.6)<br />
gelagert, nachdem der postaurikuläre Operationsbereich durch Rasur vom Haarkleid befreit<br />
und zusätzlich mit je einem Milliliter Xylonest ® (10.3) lokal anästhesiert wurde. Durch einen<br />
postaurikulären Schnitt erfolgte die Durchtrennung der Haut. Anschließend wurde mit einer<br />
chirurgischen Schere (10.5) stumpf durch die Muskulatur in die Tiefe bis auf den mastoidalen<br />
Anteil des Musculus sternocleidomastoideus präpariert. Die darüber liegenden, bereits<br />
durchtrennten Muskelanteile wurden mittels eines Wundspreizers (10.5) aus dem<br />
Operationsfeld gehalten. Der Ansatz des Muskels wurde in der Folge losgelöst, woraufhin die<br />
Bulla tympanica sichtbar wurde. Nach der Entfernung des dem Knochen aufliegenden<br />
Periosts erfolgte die Eröffnung der Bulla mittels einer spitzen Skalpellklinge (10.4) wodurch<br />
der Zugang zum Mittelohr gegeben war. Unter mikroskopischer Sichtkontrolle (10.6) konnte<br />
die Cochlea nahe des runden Fensters in ihrer basalen Windung eröffnet werden. Dies erfolgte<br />
durch das Bohren eines kleinen Loches mit einer spitzen Sonde (10.5). Durch die<br />
anschließende Cochleostomie wurde der perilymphatische Raum der Scala tympani<br />
zugänglich gemacht. Das freie Ende des Polyimidschlauches wurde nun vorsichtig mittels<br />
einer Uhrmacherpinzette (10.5) durch die Öffnung in die Scala tympani inseriert (Abb. 7).<br />
Zuvor wurde der Schlauch, sowie eine auf den Schlauch aufgesetzte Hamiltonspritze (10.4)<br />
mit der entsprechenden Lösung gefüllt und auf Durchgängigkeit geprüft. In Position gehalten<br />
schloss sich die Injektion von 5 µl Flüssigkeit über eine Dauer von 5 bis 10 Minuten an. Nach<br />
Abschluss der Injektion erfolgte der Verschluss der Cochlea, sowie auch der Bulla durch<br />
Karboxylatzement (10.2). Das Weichteiltrauma wurde mittels Einzelhälften in zwei Schichten
72<br />
adaptiert. Die Muskelnaht erfolgte mit resorbierbarem Nahtmaterial (10.4) während die<br />
Hautnaht mit nichtresorbierbarem Faden verschlossen wurde (10.4).<br />
Bei allen Tieren wurden linksseitig die entsprechenden Versuchslösungen, rechtsseitig<br />
hingegen PBS-Lösung zur Kontrolle injiziert.<br />
Tympanotomie<br />
Abb. 7: Operationssitus der Cochleostomie. Linksseitig wird das eröffnete Mittelohr mit der darin zu<br />
erkennenden Basalwindung der Cochlea gezeigt, wobei ein Teil des runden Fensters zu erkennen ist.<br />
Unter dem runden Fenster wurde die knöcherne Wand der Cochlea mittels einer Lanzette eröffnet<br />
(Cochleostomie), um den mit einer Mikroliterspritze verbundenen Injektionskatheter einführen zu<br />
können (rechts dargestellt).<br />
4.2.3.6 Transkardiale Perfusion<br />
rundes Fenster<br />
Cochleostomie<br />
Polyimidschlauch<br />
Am 21. Studientag wurden die Tiere aller Gruppen einer abschließenden aABR-Messung<br />
(4.2.3.3) unterzogen. Nach Beendigung dieser Messung unter Allgemeinanästhesie (4.2.3.2)<br />
wurde eine weitere volle Narkosedosis appliziert. Eine nachfolgende Lokalänasthesie entlang<br />
der Schnittlinie mit 6 ml Xylonest ® (10.3), welches subkutan sowie intramuskulär verabreicht
73<br />
wurde, diente als zusätzliche Schmerzausschaltung in Vorbereitung auf die anschließende<br />
Thorakotomie. Hierzu wurde der Brustkorb unterhalb des Xyphoids mittels einer<br />
Metzenbaumschere (10.5) eröffnet. Die Schnittlinie folgte durch die Mitte des linken<br />
Rippenbogens bis zur Apertura thoracis um dann in einem Bogen, durch die Mitte des<br />
rechten Rippenbogens, wieder den Ausgangspunkt zu erreichen. Das umschriebene Teilstück<br />
konnte nun abgehoben werden um eine freie Sicht auf das Herz zu erhalten. Vom Apex des<br />
Herzens ausgehend wurde der Herzbeutel mit einer spitzen chirurgischen Schere (10.5)<br />
eröffnet um nachfolgend einen Schnitt ins rechte Herzohr zu vollziehen, was den Abfluss des<br />
Blutes und der Perfusionslösung gewährleisten sollte. Durch das Eröffnen des Herzbeutels<br />
wurde zusätzlich das Entstehen einer Herztamponade durch das aus dem Herzohr<br />
austretenden Blutes verhindert. Dadurch wurde die volle Kraftentfaltung des noch<br />
schlagenden Herzens gesichert, um eine vollständige Perfusion des Blutgefäßsystems und<br />
damit ein blutfreies Präparat zu erhalten.<br />
Anschließend wurde in die linke Herzkammer eine an ein Infusionsbesteck (10.4)<br />
angeschlossene Kanüle (10.4) eingeführt über die eine Infusion von 200 ml phosphate<br />
buffered saline (PBS,10.2) erfolgte, um das Blut aus dem Kreislauf zu spülen. Die Fixierung<br />
des Tierkörpers erfolgte in der gleichen Weise unter Verwendung von 200 ml 4%igem<br />
Paraformaldehyd (10.1).<br />
4.2.3.7 Gewinnung der Cochleae<br />
Nach erfolgter Fixierung wurde das Tier mittels einer Metzenbaumschere (10.5) dekapitiert.<br />
Die ersten Halswirbel wurden entfernt um durch das Foramen magnum in die Schädelhöhle<br />
eindringen zu können und das Schädeldach durch zwei Scherenschläge zu eröffnen. Das nun<br />
freiliegende Gehirn wurde weitestgehend entfernt um die Sicht auf die Felsenbeine<br />
freizugeben. Diese wurden manuell aus der knöchernen Verbindung zum Schädel<br />
herausgebrochen und anschließend mit Zellstoff von anhaftendem Muskelgewebe gesäubert.<br />
Mittels einer chirurgischen Pinzette (10.5) konnte nun die Bulla eröffnet werden, um die freie<br />
Sicht in das Mittelohr und auf die Cochlea zu gewährleisten. Unter einem Aufsichtmikroskop<br />
(10.6) erfolgte die Eröffnung des runden sowie ovalen Fensters der Cochlea mittels einer
74<br />
feinen Uhrmacherpinzette (10.5). Um ein Eindringen von Luft in die unteren Windungen zu<br />
vermeiden, wurden diese Schritte in einer mit 4%igem Paraformaldehyd (10.1) gefüllten<br />
Petrischale (10.4) durchgeführt Zusätzlich wurde die Cochlea im Bereich der obersten<br />
Windung eröffnet um einen optimalen Durchfluss während der nachfolgenden Spülung mit<br />
4%igem Paraformaldehyd zu gewährleisten. Diese wurde vorsichtig, vom runden Fenster<br />
ausgehend durchgeführt. Im Anschluss wurde die Cochlea in 4%iges Paraformaldehyd<br />
überführt und bis zur Weiterverarbeitung 2 Stunden nachfixiert.<br />
4.2.3.8 Entkalkung, Entwässerung und Einbetten der Cochleae<br />
Die nachfixierten Cochleae wurden zunächst drei Waschvorgängen mit phosphate buffered<br />
saline (PBS, 10.2) unterzogen. Hierzu erfolgte das Ausspülen der 4%igen<br />
Paraformaldehydlösung (10.1) auf einem Schwingtisch (10.6) wobei jeder Spülvorgang über<br />
einen Zeitraum von mindestens 5 Minuten vollzogen wurde. Im Anschluss daran wurden die<br />
Cochleae bis zur vollständigen Entkalkung in einer 20%igen EDTA-Lösung (10.1) bei einer<br />
Temperatur von 37 °C für mindestens vier Wochen gelagert. Je nach Verknöcherungsgrad<br />
wurden auch Zeiträume von 5 Wochen durchgeführt. Der richtige Entkalkungsgrad konnte<br />
mittels einer spitzen Sonde (10.5) festgestellt werden, indem man die Konsistenz der Probe<br />
durch vorsichtiges Einstechen in einen Knochenbereich neben der Cochlea prüfte. Das<br />
Einstechen durfte kein deutliches Widerstandsgefühl hervorrufen. Die Probe wies eine<br />
knorpelige Konsistenz auf, Krepitationen durften nicht wahrzunehmen sein.<br />
Zu Beginn der Entwässerung wurden die Proben abermals drei Waschvorgängen mit PBS<br />
unterzogen, hierbei wird nach oben genanntem Schema verfahren, um Reste der EDTA-<br />
Lösung zu entfernen. Im Anschluss erfolgte die Entwässerung mittels einer ansteigenden<br />
Alkoholreihe. Die Proben wurden zunächst in eine 50%ige Ethanollösung (10.2) eingelegt<br />
und für 2 Stunden in dieser belassen. Danach wurden sie in 70%iges Ethanol überführt. Die<br />
Verweildauer der Proben in dieser Lösung beträgt ebenfalls mindestens zwei Stunden,<br />
konnten aber auch über Nacht darin belassen werden. Weiterhin folgten zwei Schritte in<br />
90%igem und 100%igem Ethanol, wobei jeweils 2 Stunden Entwässerungszeit eingehalten<br />
wurden. Daraufhin wurden die Proben in Methylbenzoat überführt und für ebenfalls
75<br />
2 Stunden in diesem belassen um sie anschließend mit flüssigem Paraffin (10.2) zu<br />
durchtränken. Die Proben wurden nun über Nacht bei 70 °C im Wärmeschrank (10.6) in<br />
flüssigem Paraffin belassen um sie am darauf folgenden Tag in die Tags zuvor mit flüssigem<br />
Paraffin gefüllte Einbettform (10.4) zu überführen. Das erneute Umbetten in frisches Paraffin<br />
verhindert einen zu hohen Methylbenzoatrückstand in dem Probenparaffinblock, wodurch die<br />
Schnitteigenschaften des Präparates verbessert werden. Tagsüber wurden die Proben im<br />
Wärmeschrank belassen, damit beim Umbetten eingebrachte Luftbläschen aufsteigen konnten<br />
und keine Hohlräume in den Paraffinblöcken entstanden. Gegen Ende des Tages oder aber<br />
mindestens drei Stunden nach dem Umbetten wurden die Proben in der Einbettform zum<br />
Aushärten aus dem Wärmeschrank entnommen. Zuletzt wurden die Cochleae mit dem runden<br />
Fenster zum Grund der Einbettform ausgerichtet, was eine waagerechte Positionierung des<br />
Modiolus gewährleistete. Die langsam vom Grund und den Rändern her erstarrende<br />
Paraffinflüssigkeit bot die Grundlage zur korrekten Ausrichtung. Über Nacht erstarrten die<br />
eingebetteten Proben nun vollständig bei Raumtemperatur und wurden am nächsten Tag aus<br />
der Form entnommen. Bis zur Weiterverarbeitung war eine Lagerung bei Raumtemperatur<br />
möglich.<br />
4.2.3.9 Herstellung und Anfärbung der Paraffinschnitte<br />
Die zuvor hergestellten Paraffinproben-Blöcke wurden entsprechend zurechtgeschnitten und<br />
auf kleine Holzblöcke aufgeschmolzen und zur optimalen Fixierung an diesen erst am<br />
nächsten Tag weiterbearbeitet. Die Holzblöcke konnten nun in die Halterung des Mikrotoms<br />
(10.6) eingespannt werden ohne die Probe dabei zu beeinflussen. Mittels des Mikrotoms<br />
erfolgte die Herstellung von 5 µm dicken Serienschnitten. Durch die vorherige Ausrichtung<br />
der Cochleae konnten Schnitte parallel zur Modiolusachse angefertigt werden. Die<br />
zusammenhängenden und durch den Schneidevorgang leicht gestauchten Schnitte wurden<br />
zunächst vom Schneidetisch in ein auf 37 °C erwärmtes Streckbad (10.6) überführt und dort<br />
bis zur vollständigen Entfaltung belassen. Anschließend wurden die Schnitte auf Objektträger<br />
(10.4) aufgezogen und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet.
76<br />
Zur Anfärbung der Schnitte wurde die Hämalaun-Eosin-Färbung (10.2) verwendet. Hierzu<br />
wurden die Objektträger zunächst für zweimal fünf Minuten in ein Xylolbad (10.2) gebracht,<br />
wonach sich eine absteigende Alkoholreihe angeschlossen hat. Hierbei wurden die<br />
Objektträger für jeweils fünf Minuten in 100%-, 90%- sowie 70%igem Ethanol belassen um<br />
anschließend für fünf Minuten in Leitungswasser gespült zu werden. Danach erfolgte die<br />
Anfärbung mit Hämalaun für eine Minute. Ein weiterer Spülschritt unter fließendem,<br />
lauwarmem Leitungswasser schloss sich an, um danach die Proben für 45 Sekunden mit Eosin<br />
zu färben. Der darauffolgende, fünfminütige Waschvorgang mit Leitungswasser leitete die<br />
Entwässerung mit 70%-, 90%- und 100%igem Ethanol ein, wobei die Proben für jeweils fünf<br />
Minuten in den Lösungen belassen wurden. Den Abschluss bildeten wiederum zwei mal fünf<br />
Minuten Einwirkzeit in Xylol. Danach wurden die Proben in feuchtem Zustand unter dem<br />
Abzug (10.6) mit Eukitt ® Schnelleinschlussmittel (10.2) unter Deckgläsern (10.4)<br />
eingedeckelt und für mindestens 24 Stunden unter dem Abzug getrocknet.<br />
4.2.3.10 Auswertung der Paraffinschnitte<br />
Zur Auswertung der Proben wurde zunächst ein mitmodiolarer Schnitt ausgewählt.<br />
Ausgehend von diesem Schnitt wurde zusätzlich jeder fünfte nachfolgende Schnitt ausgezählt<br />
sowie ausgemessen. Zur Auswertung wurden pro Cochlea fünf Schnitte herangezogen. Pro<br />
Schnitt erfolgte eine Beurteilung der Anschnitte des ROSENTHALschen Kanals. Hierbei<br />
handelt es sich um die 6-7 Anschnitte des Kanals der unteren und oberen basalen Windung,<br />
der ersten, zweiten, dritten und vierten mittleren Windung sowie der apikalen Windung. Die<br />
vierte mittlere sowie die apikale Windung waren im Schnittbild in den meisten Fällen nicht<br />
getrennt darstellbar. In den Fällen der einzelnen Darstellung wurden die Daten dieser beiden<br />
Anschnitte zusammengefasst (Abb. 8). Weiterhin wurden zur Beurteilung eines lokalen<br />
Effekts der Testsubstanzen die Ergebnisse des unteren und oberen basalen Anschnitts<br />
zusammengefasst und als unterer Abschnitt bezeichnet. Ebenso wurde mit dem ersten und<br />
zweiten mittleren Anschnitt verfahren, wobei diese als mittlerer Abschnitt bezeichnet wurden.<br />
Die oberen Anschnitte wurden entsprechend als oberer Abschnitt bezeichnet.
77<br />
Zur Auswertung wurde ein inverses binokularisches Mikroskop (10.6) mit angeschlossener<br />
charged-coupled-device-(CCD)-Kamera (10.6) verwendet. Rechnergestützt konnte mittels des<br />
Programms cellP (Olympus Soft Imaging Solutions, Münster; 10.6) die Fläche des<br />
ROSENTHALschen Kanals bestimmt werden. Die Spiralganglienzellen wurden markiert und<br />
ausgezählt. In die Zählung wurden nur Zellen mit einem Somadurchmesser von mindestens<br />
10 µm eingeschlossen, weiterhin mussten sie einen sichtbaren Nukleus zeigen. Abbildung 9<br />
zeigt eine beispielhafte Darstellung von Spiralganglienzellen, welche in die Zählung<br />
miteinbezogen wurden. Der Quotient aus Fläche und Spiralganglienzahl ergab die Dichte der<br />
Spiralganglienzellen (SGZ), welche in SGZ pro 10.000 µm 2 angegeben wurde. Zur<br />
Ermittlung der durchschnittlichen Somadurchmesser wurden pro Anschnitt des<br />
ROSENTHALschen Kanals acht Spiralganglienzellen vermessen und deren<br />
Somadurchmesser gemittelt. Je Quadrant wurden zwei Zellen ausgewählt. Bei weniger als<br />
acht vorhandenen Zellen wurden alle Zellen, unabhängig von der Verteilung innerhalb des<br />
Kanalanschnitts, ausgezählt.
Abb. 8: Mittmodiolarer Paraffinschnitt der Cochlea eines Meerschweinchens (Hämalaun-Eosin-<br />
Färbung). Die jeweiligen Anschnitte des ROSENTHALschen Kanals sind rot markiert (u.b. = untere<br />
78<br />
basale Windung, o.b. = obere basale Windung, 1.-4 m. = erste bis vierte mittlere Windung, a. = apikale<br />
Windung)<br />
u. b.<br />
1. m.<br />
3. m.<br />
a.<br />
4. m.<br />
2. m.<br />
o. b.
79<br />
Abb. 9: Darstellung der 3. mittleren Windung des ROSENTHALschen Kanals eines ertaubten<br />
Meerschweinchens. Die verbleibenden Spiralganglienzellen mit erkennbarem Nukleus sind durch<br />
Pfeile gekennzeichnet (Hämalaun-Eosin-Färbung).<br />
4.2.3.11 Statistische Auswertung der In-vivo-Versuche<br />
Die statistische Auswertung der Ergebnisse der Tierversuchsstudien erfolgte computergestützt<br />
mittels des Programms GraphPad Prism ® 4 (10.6). Zu Beginn wurden die jeweiligen<br />
Datensätze auf eine Normalverteilung der Werte geprüft. Hierzu wurde der Kolmogorow-<br />
Smirnow-Test angewendet. Für den Vergleich der Parameter Spiralganglienzelldichte sowie<br />
Somadiameter zwischen rechter und linker Seite einer Versuchsgruppe wurde der t-Test für<br />
abhängige Stichproben durchgeführt. Wurden diese Parameter zwischen den Gruppen
80<br />
verglichen, so fand eine Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) mit Student-<br />
Newman-Keuls-Test Anwendung.<br />
Die ermittelten Signifikanzniveaus wurden dabei wie folgt definiert:<br />
- p > 0,05 = nicht signifikant unterschiedlich (ns)<br />
- p < 0,05 = signifikant unterschiedlich (*)<br />
- p < 0,01 = hoch signifikant unterschiedlich (**)<br />
- p < 0,001 = höchst signifikant unterschiedlich (***)
5 Ergebnisse<br />
81<br />
5.1 Ergebnisse der In-vitro-Versuche mit vereinzelten Spiralganglienzellen<br />
5.1.1 Einfluss von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BD�F auf die<br />
Überlebensrate vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen<br />
Zur Untersuchung eines spiralganglienzellprotektiven Effekts wurden zunächst aus<br />
neonatalen Sprague-Dawley-Ratten gewonnene Spiralganglienzellen vereinzelt und kultiviert.<br />
Dem Kulturmedium wurden die zu untersuchenden Testsubstanzen zugefügt. Hierbei handelte<br />
es sich um LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM und Rolipram, welche in vier<br />
unterschiedlichen Verdünnungen (1:50, 1:100, 1:200, 1:300) der Stammlösung (45 mg/ml<br />
Lipidnanokapseln; 19 µg/ml Rolipram) getestet wurden. BDNF hingegen diente als<br />
Positivkontrolle und wurde in einer Konzentration von 50 ng/ml verwendet, welche als<br />
besonders protektiv gilt (LEFEBVRE et al. 1994; HEGARTY et al. 1997). Das Medium der<br />
jeweiligen Einsaatkontrollansätze sowie der Negativkontrolle blieb unbehandelt.<br />
Pro Well wurden 15 x 10 4 Zellen eingesät. Der nach einer Kulturdauer von 4 Stunden fixierte<br />
Einsaatkontrollansatz wies im Mittel einen Wert von 229,6 ± 18,1 (Mittelwert ±<br />
Standardabweichung; n=12) eingesäten Spiralganglienzellen auf und lieferte den Bezugswert<br />
(100 %) für die nach 48 Stunden fixierten Zellen der Negativkontrollgruppe sowie der mit den<br />
Testsubstanzen behandelten Gruppen (4.2.1.6).<br />
Nach 48 Stunden Kulturdauer zeigten in der Negativkontrollgruppe (n=12) 10,7 ± 4,2 % der<br />
ursprünglich eingesäten Spiralganglienzellen eine Neuritenaussprossung, welche den<br />
Somadurchmesser der Zelle um das dreifache oder mehr übertraf. Diese Zellen galten als vital<br />
und dienten als Bezugsgröße zur Beurteilung der Effekte der Testsubstanzen (Abb. 10).<br />
Die Verwendung der LNC FITC-Nanopartikel wies in der Verdünnung 1:50 kein erhöhtes<br />
Spiralganglienzellüberleben im Vergleich zur Kontrolle auf (10,3 ± 8,2 %; n=20),<br />
wohingegen die 1:100 Verdünnung mit einem Wert von 24,4 ± 8,8 % (n=20) ein höchst<br />
signifikant (p < 0,001) erhöhtes Überleben bewirkte. Auch in der Verdünnung von 1:200 zur<br />
Stammlösung zeigten die unbeladenen Nanopartikel noch einen hoch signifikant erhöhten
82<br />
Wert (p < 0,01; 20,7 ± 7,6 %; n=20), welcher in der 1:300 Verdünnung nicht mehr zu<br />
erkennen war (17,9 ± 6,8 %; n=20).<br />
Tendenziell konnte für die mit Rolipram beladenen LNCs ein ähnliches Bild gezeigt werden.<br />
In der Verdünnung von 1:50 (16,2 ± 10,2 %; n=20) erbrachte der Zusatz der Nanopartikel-<br />
Arzneimittel-Kombination keine veränderte Überlebensrate der Spiralganglienzellen<br />
verglichen mit der Negativkontrolle, wobei die 1:100 Verdünnung mit dem Maximalwert<br />
dieser Gruppe von 32,6 ± 9,7 % (n=20) einen statistisch höchstsignifikanten Unterschied zur<br />
Negativkontrollgruppe erreichte (p < 0,001). Aber auch die 1:200 und die 1:300 Verdünnung<br />
bewirkten in dieser Gruppe ein erhöhtes Spiralganglienzellüberleben (23,4 ± 7,2 %; n=20;<br />
p < 0,01 respektive 20,0 ± 6,4 %; n=20; p < 0,05). Innerhalb dieser Versuchsgruppe zeigte die<br />
1:100 Verdünnung gegenüber der 1:200 Verdünnung ein hoch signifikant gesteigertes Spiral-<br />
ganglienzellüberleben (p < 0,01).<br />
Ein ebenfalls hoch signifikanter Unterschied bestand zwischen den Werten der 1:100<br />
Konzentrationen der LNCs und der mit Rolipram beladenen LNCs, wobei sich bei der<br />
Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination ein hoch signifikant höheres Überleben zeigte<br />
(p < 0,01).<br />
Rolipram hingegen bewirkte in den verwendeten Konzentrationen ein sehr homogenes Bild<br />
und erbrachte mit durchschnittlichen Werten von 15,7 ± 4,5 % (n=20 pro Konzentration) ein<br />
tendenzielles aber kein signifikant erhöhtes Überleben gegenüber den Zellen der<br />
Negativkontrolle.<br />
Die Zugabe von BDNF in der Konzentration 50 ng/ml (n=30) diente als Positivkontrolle und<br />
zeigte im Vergleich zur Negativkontrollgruppe ein deutlich signifikant erhöhtes<br />
Spiralganglienzellüberleben von 45,7 ± 12,6 % (p < 0,001). Auch im Vergleich zu allen<br />
anderen Gruppen zeigte BDNF den signifikant höchsten Wert (p < 0,001).
SGZ-Überleben [ % von Einsaat]<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
***<br />
**<br />
**<br />
LNC FITC 1:50<br />
LNC FITC 1:100<br />
LNC FITC1:200<br />
LNC FITC 1:300<br />
***<br />
**<br />
**<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:50<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:100<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:200<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:300<br />
83<br />
*<br />
ROLIPRAM 1:50<br />
ROLIPRAM 1:100<br />
ROLIPRAM 1:200<br />
ROLIPRAM 1:300<br />
Versuchsgruppe<br />
***<br />
BDNF 50 ng/ml<br />
Negativkontrolle<br />
Abb. 10: Effekte der unterschiedlichen Verdünnungen von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM,<br />
Rolipram sowie BDNF auf das SGZ-Überleben nach 48 Stunden Kulturdauer in Prozent der<br />
ursprünglich eingesäten SGZ [229,6 ± 18,1 Zellen (Mittelwert ± Standardabweichung; n=12)]. Die<br />
dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 5 unabhängigen Experimenten<br />
(n=20 pro Konzentration je Gruppe, Kontrolle: n=12, BDNF: n=30). Die Signifikanzen sind im Vergleich<br />
zur Kontrollgruppe über den Säulen dargestellt, während Vergleiche unter den Gruppen mittels<br />
Klammern dargestellt sind (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,01 = ***; ns = nicht signifikant).<br />
5.1.2 Einfluss von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BD�F auf das<br />
�euritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen<br />
Nach 48 Stunden Kultivierungsdauer wurde neben der prozentualen Überlebensrate der<br />
Spiralganglienzellen auch das Neuritenauswachsverhalten der Zellen analysiert. In der<br />
Negativkontrolle zeigten die Zellen ein mittleres Auswachsverhalten von 420,1 ± 181,5 µm<br />
(Mittelwert ± Standardabweichung; n=60). Dieser Wert galt als Bezugsgröße um die Effekte<br />
der Versuchskonditionen in ein gesteigertes sowie verringertes Auswachsverhalten<br />
einzuteilen.
84<br />
Das Auswachsverhalten der Neuriten unter Einwirkung der LNC FITC Nanopartikel in einer<br />
Verdünnung von 1:50 zur Stammlösung (45 mg/ml Lipidnanokapseln) zeigte mit einem Wert<br />
von 265,6 ± 159,4 µm (n=100) eine höchst signifikante Verringerung der Neuritenlängen im<br />
Vergleich zur Negativkontrollgruppe (p < 0,001). In den Verdünnungen von 1:100 und 1:200<br />
wurde hingegen kein signifikanter Unterschied zur Negativkontrollgruppe deutlich<br />
(474,2 ± 185,4; n=100 respektive 500,1 ± 193,6 µm; n=100). So zeigten die mit der 1:300<br />
Verdünnung behandelten Zellen aber ein signifikant verlängertes Neuritenwachstum<br />
verglichen zur Negativkontrollgruppe (p < 0,05; 519,1 ± 205,4 µm).<br />
Die LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe wies analog zu den unbeladenen Nanopartikeln ein<br />
signifikant verringertes Neuritenauswachsverhalten in der Verdünnung von 1:50 auf<br />
(349,3 ± 178,3 µm; p < 0,05, n=100). Mit der 1:100 sowie die 1:200 Verdünnung dieser<br />
Gruppe konnten bei den behandelten Zellen signifikant verlängerte Neuriten im Vergleich zu<br />
den Zellen der Negativkontrolle erreicht werden (547,6 ± 164,1 µm bzw. 536,8 ± 201,1 µm;<br />
p < 0,01 und n=100 je Gruppe). Diese Konzentration 1:100 zeigte im Vergleich zu allen<br />
Konzentrationen der mit Rolipram behandelten Zellen eine signifikant erhöhte Neuritenlänge<br />
(p < 0,05). Die 1:300 Verdünnung hingegen wies keinen signifikanten Unterschied zur<br />
Kontrolle auf (512 ± 197,9 µm; n=100). Der Vergleich zwischen den mit Rolipram beladenen<br />
Partikeln sowie den unbeladenen Partikeln in der Verdünnung 1:50, konnte für die<br />
Arzneimittel-Nanopartikel-Kombination hoch signifikant längere Neuritenlängen zeigen<br />
(p < 0,01). Die Gegenüberstellung der restlichen Verdünnungen ergab untereinander keine<br />
signifikanten Unterschiede.<br />
Rolipram zeigte in allen Verdünnungen ein sehr homogenes Bild und wies lediglich eine<br />
tendenziell verlängerte Neuritenlänge auf, welche aber in keinem Fall eine Signifikanz zur<br />
Kontrollgruppe bot (1:50 = 462,7 ± 196,4 µm; 1:100 = 455,9 ± 177,4 µm; 1:200 =<br />
464,9 ± 185,9 µm; 1:300 = 460,6 ± 190,4; n=100 je Gruppe).<br />
Auch die mit BDNF 50 ng/ml behandelten Zellen zeigten diese Tendenz, wiesen aber<br />
ebenfalls keinen statistisch signifikanten Unterschied auf. (475 ± 151,2 µm; n=130).<br />
In Abbildung 11 ist das Neuritenauswachsverhalten aller Versuchsgruppen graphisch<br />
dargestellt. In Abbildung 12 wird in einer lichtmikroskopischen Aufnahme beispielhaft das<br />
Neuritenauswachsverhalten aller Versuchsgruppen in der Verdünnung von 1:100 gezeigt.
85<br />
BDNF wurde in einer Konzentration von 50 ng/ml verwendet, während die Negativkontrolle<br />
keine weiteren Zusätze erhielt.<br />
SGZ-Neuritenlänge [µm]<br />
800<br />
700<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
***<br />
**<br />
*<br />
LNC FITC 1:50<br />
LNC FITC 1:100<br />
LNC FITC1:200<br />
LNC FITC 1:300<br />
*<br />
** **<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:50<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:100<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:200<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:300<br />
ROLIPRAM 1:50<br />
ROLIPRAM 1:100<br />
ROLIPRAM 1:200<br />
ROLIPRAM 1:300<br />
Versuchsgruppe<br />
*<br />
BDNF 50 ng/ml<br />
Negativkontrolle<br />
Abb. 11: Effekte der unterschiedlichen Verdünnungen von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM,<br />
Rolipram sowie BDNF auf das Neuritenauswachsverhalten von SGZ nach 48 Stunden Kulturdauer.<br />
Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 5 unabhängigen<br />
Experimenten (n=100 vermessene Neuritenlängen pro Konzentration je Gruppe, Kontrolle: n=60,<br />
BDNF: n=130). Die Signifikanzen im Vergleich zur Kontrollgruppe sind über den Säulen dargestellt,<br />
während Vergleiche unter den Gruppen mittels Klammern dargestellt sind (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **;<br />
p < 0,01 = ***; ns = nicht signifikant).
86<br />
1 2<br />
3 4<br />
5 6<br />
Abb. 12: Mikroskopische Darstellung des Neuritenauswachsverhaltens (Pfeile) vereinzelt kultivierter<br />
Spiralganglienzellen nach 48 Stunden unter Einfluss von folgenden Faktoren: Bild 1: LNC FITC 1:100;<br />
Bild 2: LNC FITC ROLIPRAM 1:100; Bild 3: LNC BLANK 1:100; Bild 4: ROLIPRAM 1:100; Bild 5:<br />
unbehandelte Negativkontrolle; Bild 6: BDNF 50 ng/ml. Stammlösung der Nanopartikel: 45 mg/ml<br />
LNC, 19 µg/ml Rolipram.
87<br />
5.1.3 Einfluss von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BD�F auf den<br />
Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen<br />
Neben der Evaluierung der prozentualen Überlebensrate der Spiralganglienzellen sowie ihrem<br />
Neuritenauswachsverhalten wurde auch der Durchmesser der Zellkörper unter Zugabe der<br />
Testsubstanzen ermittelt und miteinander verglichen. Der mittlere Somadurchmesser der<br />
Negativkontrolle betrug 14,5 ± 2,6 µm (Mittelwert ± Standardabweichung, n=60). Nur die mit<br />
den LNC FITC-Nanopartikeln in einer Konzentration von 1:50 zur Stammlösung (45 mg/ml<br />
Lipidnanokapseln) behandelten Zellen zeigten einen hoch signifikant geringeren<br />
Somadurchmesser von 12,8 ± 1,9 µm (p < 0,01). Alle anderen Werte lieferten keine statistisch<br />
signifikanten Differenzen verglichen mit dem mittleren Zelldurchmesser der Negativ-<br />
kontrolle. Zur Vollständigkeit seien die ermittelten Werte tabellarisch dargestellt (Tab. 5)<br />
Tab. 5: Ergebnisse der ermittelten Spiralganglienzelldurchmesser (Mittelwert ± Standardabweichung)<br />
nach 48-stündiger Kultivierung unter LNC FITC-, LNC FITC ROLIPRAM-, Rolipram- sowie BDNF-<br />
Einfluss in unterschiedlichen Verdünnungen.<br />
Gruppe Mittelwert des<br />
Somadurchmessers<br />
[µm]<br />
Standardabweichung Anzahl der<br />
vermessenen Somae<br />
Negativkontrollgruppe 14,5 2,6 60<br />
LNC FITC 1:50 12,8 1,9 100<br />
LNC FITC 1:100 13,2 2,2 100<br />
LNC FITC 1:200 13,3 2,2 100<br />
LNC FITC 1:300 14,0 3,2 100<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:50 13,3 2,1 100<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:100 14,0 2,6 100<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:200 13,7 2,8 100<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1:300 14,1 3,0 100<br />
Rolipram 1:50 14,4 2,6 100<br />
Rolipram 1:100 14,7 2,9 100<br />
Rolipram 1:200 14,6 3,0 100<br />
Rolipram 1:300 14,6 3,0 100<br />
BDNF 50 ng/ml 14,8 2,7 130
88<br />
5.1.4 Einfluss von L�C FITC, L�C BLA�K und BD�F auf die Überlebensrate<br />
vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen<br />
Da die Ergebnisse des ersten Zellversuches einen positiven Effekt der Nanopartikel ohne<br />
Rolipram auf das Überleben der Spiralganglienzellen zeigten, wurde ein zweiter Zellversuch<br />
durchgeführt, um die Effekte des Fluoreszenzmarkers FITC und der Lipidnanokapseln (LNC)<br />
als solches auf das Überleben der Spiralganglienzellen zu evaluieren. Hierbei wurde der<br />
Einfluss von mit FITC markierten Lipidnanokapseln (LNC FITC) und unmarkierten LNCs<br />
(LNC BLANK) auf das Überleben von kultivierten Spiralganglienzellen untersucht. Hierfür<br />
erfolgte der Zusatz von LNC FITC Nanopartikeln, welche in drei verschiedenen<br />
Verdünnungen der Stammlösung (1:100, 1:200, 1:300 Verdünnung der Stammlösung von<br />
45 mg/ml Lipidnanokapseln) auf die Zellen gegeben wurden. Mit der LNC BLANK-Gruppe<br />
wurde analog verfahren. Des Weiteren wurden die Zellen mit BDNF 50 ng/ml behandelt,<br />
welche als Positivkontrolle dienten. Das Medium der Einsaatkontrollansätze und der<br />
Negativkontrolle blieb unbehandelt.<br />
Bei einer Einsaat von 15 x 10 4 Zellen pro Kavität konnte bei der Einsaatkontrolle nach einer<br />
Kulturdauer von 4 h eine mittlere Spiralganglienzellanzahl von 247,3 ± 59,8 (Mittelwert ±<br />
Standardabweichung; n=6) ermittelt werden. Dieser Wert galt als Bezugsgröße (100 %) für<br />
die Berechnung der prozentualen Überlebensrate der nach 48 Stunden fixierten<br />
Spiralganglienzellen der Negativkontrolle (6,8 ± 4,9 %; n=9) sowie der mit den<br />
Testsubstanzen behandelten Gruppen (4.2.1.6).<br />
Im Vergleich zur Negativkontrolle konnten die mit LNC FITC behandelten Spiralganglien-<br />
zellen in der Verdünnung von 1:100 eine signifikant erhöhte Zellanzahl aufweisen<br />
(22,0 ± 13,8 %; n=9; p < 0,05). Die Werte der 1:200 sowie 1:300 Verdünnung erwiesen sich<br />
nicht als signifikant erhöht, zeigten aber die Tendenz zu einer erhöhten Überlebenszahl<br />
hinsichtlich der Negativkontrolle (17,4 ± 9,6 %; respektive 12,4 ± 6,8 %; n=9 je Gruppe).<br />
Im Gegensatz dazu bewirkten alle Verdünnungsstufen der LNC BLANK-Versuchsgruppe<br />
einen signifikant erhöhten Anstieg von vitalen Spiralganglienzellen. In der 1:100 Verdünnung<br />
zeigte sich der höchste Wert mit einem hoch signifikanten Unterschied von p < 0,01<br />
(28,4 ± 8,4 %; MW und STABW; n=9). Bei der 1:200 und der 1:300 Verdünnung war ein
89<br />
geringerer aber dennoch signifikanter Anstieg des Spiralganglienzellüberlebens zu erkennen<br />
(p < 0,05; 23,9 ± 10,9 %; respektive 20,6 ± 9,6 %; n=9 je Gruppe).<br />
Die mit BDNF 50 ng/ml behandelten Zellen zeigten den höchsten Signifikanzwert (p < 0,001;<br />
40,8 ± 16,2 %; n=9), wobei diese Gruppe als Positivkontrolle diente und gegenüber LNC<br />
BLANK-Gruppe und der 1:100 Verdünnung der LNC FITC-Gruppe ein signifikant erhöhtes<br />
Zellüberleben bewirkte (p < 0,01). Gegenüber den 1:200 und 1:300 Verdünnungen der LNC<br />
FITC-Gruppe zeigte BDNF sogar ein höchstsignifikant gesteigertes Überleben der<br />
Spiralganglienzellen (p < 0,001). Die im Text erläuterten Ergebnisse sind in Abbildung 13<br />
graphisch dargestellt.<br />
SGZ-Überleben [ % von Einsaat]<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
*<br />
LNC FITC 1:100<br />
LNC FITC 1:200<br />
LNC FITC 1:300<br />
**<br />
LNC BLANK 1:100<br />
LNC BLANK 1:200<br />
LNC BLANK 1:300<br />
Versuchsgruppe<br />
*<br />
*<br />
***<br />
BDNF 50 ng/ml<br />
Negativkontrolle<br />
Abb. 13: Effekte der unterschiedlichen Verdünnungen von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf<br />
das SGZ-Überleben nach 48 h Kulturdauer in Prozent der ursprünglich eingesäten SGZ<br />
[247,3 ± 59,8 SGZ (Mittelwert ± Standardabweichung; n=6 ausgezählte Wells)]. Die dargestellten<br />
Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 3 unabhängigen Experimenten (n=9<br />
ausgezählte Wells pro Verdünnung je Gruppe). Die Signifikanzen im Vergleich zur Kontrollgruppe sind<br />
über den Säulen dargestellt, während die Vergleiche unter den jeweils entsprechenden Verdünnungen<br />
keine signifikanten Unterschiede ergaben (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,01 = ***; ns = nicht<br />
signifikant).
90<br />
5.1.5 Einfluss von L�C FITC, L�C BLA�K sowie BD�F auf das<br />
�euritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen<br />
Neben dem prozentualen Überleben wurde auch in diesem Versuch das Auswachsverhalten<br />
der Neuriten bestimmt. So zeigten die Zellen in der unbehandelten Negativkontrollgruppe<br />
nach 48 Stunden Kulturdauer eine mittlere Neuritenlänge von 401,8 ± 166,1 µm (Mittelwert ±<br />
Standardabweichung; n=45) welche als Bezug für die Evaluierung der Neuritenlängen der mit<br />
den Testsubstanzen behandelten Spiralganglienzellen diente.<br />
Die Neuritenlängen aller mit LNC FITC behandelten Gruppen zeigten einen signifikanten<br />
Anstieg im Vergleich zur Negativkontrollgruppe. Die Verdünnung 1:100, 1:200 sowie 1:300<br />
(515,8 ± 131,6 µm; 526,0 ± 166,5 µm, respektive 491,4 ± 184,8 µm; n=45 je Gruppe) der<br />
Stammlösung (45 mg/ml Lipidnanokapseln), zeigten ein moderat signifikant verlängertes<br />
Auswachsverhalten (p < 0,05).<br />
Die mit LNC BLANK behandelten Zellen zeigten ebenfalls alle eine signifikante Erhöhung<br />
des Auswachswertes, wobei der höchste Wert in der Verdünnung 1:200 erreicht wurde<br />
(595,5 ± 187,4 µm; n=45; p < 0,01). Die Verdünnungen 1:100 und 1:300 wiesen im Vergleich<br />
zur Negativkontrolle ein leicht signifikant erhöhtes Neuritenauswachsverhalten auf (p < 0,05;<br />
487,5 ± 143,3 µm, respektive 523,3 ± 188,6 µm, n=45 je Gruppe). Innerhalb dieser Gruppe<br />
ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen der 1:100 und 1:200 Verdünnung, wobei<br />
die mittleren Neuritenlängen der 1:200 Verdünnung den höheren Wert erreichten (p < 0,05).<br />
Jedoch zeigte der Vergleich der sich entsprechenden Verdünnungen der LNC FITC und LNC<br />
BLANK Partikel untereinander keinen statistischen Unterschied.<br />
Auch BDNF konnte in einer Konzentration von 50 ng/ml in diesem Versuch ein signifikant<br />
erhöhtes Neuritenwachstum im Vergleich zur Negativkontrolle erzielen (p < 0,01;<br />
541,8 ± 144,9 µm; n=45).<br />
Die Abbildung 14 stellt die ermittelten Ergebnisse der Neuritenlängen graphisch dar.
SGZ-Neuritenlänge [µm]<br />
600<br />
500<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
LNC FITC 1:100<br />
LNC FITC 1:200<br />
LNC FITC 1:300<br />
LNC BLANK 1:100<br />
91<br />
800 ***<br />
700<br />
*<br />
* *<br />
*<br />
*<br />
LNC BLANK 1:200<br />
*<br />
LNC BLANK 1:300<br />
Versuchsgruppe<br />
**<br />
BDNF 50 ng/ml<br />
Negativkontrolle<br />
Abb. 14: Effekte der unterschiedlichen Konzentrationen von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf<br />
das Neuritenauswachsverhalten von SGZ nach 48 Stunden Kulturdauer. Die dargestellten Werte<br />
zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 3 unabhängigen Experimenten (n=45 vermessene<br />
Neuritenlängen pro Konzentration je Gruppe). Die Signifikanzen sind im Vergleich zur Kontrollgruppe<br />
über den Säulen dargestellt, während Vergleiche unter den Gruppen mit Klammern dargestellt sind<br />
(p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,01 = ***; ns = nicht signifikant).
92<br />
5.1.6 Einfluss von L�C, L�C BLA�K sowie BD�F auf den Somadiameter vereinzelt<br />
kultivierter Spiralganglienzellen<br />
Der Vergleich der Somadiameter unter den mit den verschiedenen Testsubstanzen<br />
behandelten Gruppen ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede. Die tabellarische<br />
Darstellung gibt eine Übersicht über die ermittelten Daten (Tab. 6).<br />
Tab. 6: Ergebnisse der ermittelten Spiralganglienzelldurchmesser (Mittelwert ± Standardabweichung)<br />
nach 48-stündiger Kultivierung unter LNC FITC-, LNC BLANK- sowie BDNF-Einfluss in<br />
unterschiedlichen Verdünnungen.<br />
Gruppe Mittelwert des<br />
Somadurchmessers<br />
[µm]<br />
Standardabweichung Anzahl der<br />
vermessenen Soma<br />
Negativkontrolle 14,7 3,2 45<br />
LNC FITC 1:100 14,1 2,2 45<br />
LNC FITC 1:200 13,7 2,2 45<br />
LNC FITC 1:300 13,5 2,8 45<br />
LNC BLANK 1:100 13,5 2,1 45<br />
LNC BLANK 1:200 13,5 2,1 45<br />
LNC BLANK 1:300 13,3 2,0 45<br />
BDNF 50 ng/ml 14,5 2,3 45<br />
5.2 Ergebnisse der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen<br />
In diesem Versuch wurde der Einfluss der jeweiligen Testsubstanzen auf die TNF-α-Sekretion<br />
der dendritischen Zellen evaluiert. Hierbei wurden die dendritischen Zellen mit Rolipram<br />
(ROLIPRAM), in fluoreszenzmarkierten Lipidnanokapseln inkorporiertem Rolipram (LNC<br />
FITC ROLIPRAM), fluoreszenzmarkierten Lipidnanokapseln (LNC FITC) sowie nicht<br />
markierten Lipidnanokapseln (LNC BLANK) behandelt. Pro Gruppe wurden vier<br />
Konzentrationen angewendet (0,01 µM; 0,1 µM; 1 µM; 10 µM). Eine Stunde nach der
93<br />
Inkubation mit den Testsubstanzen erfolgte die Anregung und Reifung der Zellen zur TNF-α-<br />
Produktion durch die Zugabe von Lipopolysacchariden (LPS).<br />
5.2.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die T�F-α-Sekretion<br />
Die Inkubation mit Dimethylsulfoxid (DMSO; > 0,01 Vol %; Vehikelkontrolle) führte zu<br />
keiner TNF-α-Sekretion. Die Gegenüberstellung zu der in der Positivkontrolle (Zellen<br />
ausschließlich mit Lipopolysacchariden behandelt) ermittelten TNF-α-Konzentration von<br />
338,18 ± 41,82 pg/ml TNF-α (Mittelwert und Standardabweichung; n=12) zeigte besonders in<br />
den mit Rolipram inkubierten Zellen eine signifikante Inhibition dieses Zytokins. Alle<br />
gemessenen Werte erwiesen sich gegenüber der Positivkontrolle als signifikant erniedrigt<br />
(p < 0,001; Abb.15). Hierbei zeigte der Vergleich innerhalb der Gruppe einen deutlichen<br />
Abwärtstrend je stärker die eingesetzte Konzentration des Arzneimittels war. So bewirkte die<br />
Zugabe von 0,1 µM Rolipram bereits eine signifikant verringerte TNF-α-Produktion im<br />
Vergleich zu den mit 0,01 µM behandelten Zellen (211,23 ± 56,78 pg/ml TNF-α, n=12 gegen<br />
244,23 ± 47,42 pg/ml TNF-α, n=12; p < 0,05; Abb. 16). Des Weiteren zeigten die mit 1 µM<br />
(123,74 ± 30,27 pg/ml TNF-α; n=12) und 10 µM (100,71 ± 46,24 pg/ml TNF-α; n=12)<br />
Rolipram behandelten Zellen im Vergleich zu den beiden niedrigeren<br />
Rolipramkonzentrationen eine weitere, in diesem Fall höchst signifikant (p < 0,001)<br />
verminderte TNF-α-Produktion.<br />
Die Lipidnanokapsel-Rolipram-Kombination hingegen (LNC FITC ROLIPRAM) hatte in den<br />
Konzentrationen 0,01 µM und 0,1 µM keinen Effekt auf die TNF-α-Sekretion<br />
(326,09 ± 72,52 pg/ml TNF-α; n=12 bzw. 290,20 ± 45,74 pg/ml TNF-α; n=12). Jedoch zeig-<br />
ten sich in der Konzentration von 1 µM sowie 10 µM signifikant verringerte TNF-α-Werte.<br />
(p < 0,01; 245,07 ± 42,22 pg/ml TNF-α; n=12 bzw. p < 0,001; 105,20 ± 90,51 pg/ml TNF-α;<br />
n=12 ). Innerhalb der verschiedenen Konzentrationen wurde zwischen den mit 0,01 µM und<br />
0,1 µM LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen kein signifikanter Unterschied in der<br />
TNF-α-Produktion festgestellt, wobei sich aber zwischen 0,01 µM respektive 0,1 µM und<br />
1 µM ein hoch signifikant (p < 0,01) erniedrigter TNF-α-Wert für die mit 1 µM LNC FITC<br />
ROLIPRAM behandelten Zellen ergab. Die für die 10 µM Konzentration ermittelten Werte
94<br />
wiesen gegenüber allen anderen LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen einen höchst<br />
signifikant verringerten TNF-α-Wert auf (p < 0,001). Im mikroskopischen Bild zeigten die<br />
Zellen jedoch zellmorphologische Abweichungen im Gegensatz zu den Zellen der anderen<br />
Konzentrationen, wobei deutliche Granulationen im Zellinneren zu erkennen waren.<br />
Weiterhin zeigten sich Kristallbildungen.<br />
Bei den mit unbeladenen und unmarkierten Nanopartikeln (LNC BLANK) behandelten Zellen<br />
konnte in den Konzentrationen 0,01 µM (305,56 ± 40,74 pg/ml TNF-α; n=12) und 0,1 µM<br />
(308,59 ± 45,67 pg/ml TNF-α; n=12) keine zur Positivkontrolle verringerte TNF-α-Sekretion<br />
detektiert werden. Nur die mit 1 µM (283,11 ± 23,01 pg/ml TNF-α; n=12) Nanopartikel-<br />
lösung behandelten Zellen zeigten einen signifikant inhibierten Wert (p < 0,05). Auch in<br />
dieser Nanopartikelgruppe zeigte sich das für die LNC FITC ROLIRPAM beschriebene Bild<br />
in der Konzentration von 10 µM (98,11 ± 81,29 pg/ml TNF-α; n=12, p< 0,001). Innerhalb der<br />
Gruppe fanden sich höchst signifikante Unterschiede (p < 0,001) nur zu der TNF-α-<br />
Konzentration der mit 10 µM LNC BLANK-Lösung behandelten Zellen (Abb.16).<br />
Die LNC FITC-Gruppe zeigte ein ähnliches Bild, wobei in den Konzentrationen von 0,01 µM<br />
(303,84 ± 32,76 pg/ml TNF-α; n=12), 0,1 µM (293,52 ± 28,25 pg/ml TNF-α; n=12) und 1 µM<br />
LNC FITC (311,48 ± 33,57 pg/ml TNF-α; n=12) kein Unterschied zur Positivkontrolle<br />
evident wurde (Abb. 15). Die höchst signifikante Verringerung der TNF-α-Konzentration in<br />
der mit LNC FITC in der Konzentration von 10 µM behandelten Zellgruppe wiederholte die<br />
in den anderen Nanopartikelgruppen ermittelte Charakteristik der zellmorphologischen<br />
Veränderungen und der Kristallbildungen (p < 0,001, 146,90 ± 7,64 pg/ml TNF-α; n=12).<br />
Innerhalb der Gruppe waren wiederum höchst signifikante Unterschiede (p < 0,001) nur zur<br />
10 µM Konzentration zu verzeichnen (Abb.17).
Konzentration TNF - αα [pg/ml]<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
*** ***<br />
ROLIPRAM 0,01 µM<br />
ROLIPRAM 0,1 µM<br />
*** ***<br />
ROLIPRAM 1 µM<br />
ROLIPRAM 10 µM<br />
LNC FITC ROLIPRAM 0,01 µM<br />
LNC FITC ROLIPRAM 0,1 µM<br />
**<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1 µM<br />
LNC FITC ROLIPRAM 10 µM<br />
95<br />
LNC BLANK 0,01 µM<br />
LNC BLANK 0,1 µM<br />
*<br />
*** ***<br />
LNC BLANK 1 µM<br />
LNC BLANK 10 µM<br />
Versuchsgruppe<br />
Abb. 15: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM,<br />
LNC BLANK und LNC FITC in verschiedenen Konzentrationen und anschließender Stimulation mit<br />
LPS. Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten<br />
(n=12 Wells pro Konzentration je Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen sind im Vergleich zur<br />
Kontrollgruppe über den Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,001 = ***).<br />
LNC FITC 0,01 µM<br />
LNC FITC 0,1 µM<br />
LNC FITC 1 µM<br />
***<br />
LNC FITC 10 µM<br />
***<br />
Vehikel (DMSO)<br />
LPS
Konzentration TNF - α [pg/ml]<br />
400<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
ROLIPRAM 0,01 µM<br />
*<br />
ROLIPRAM 0,1 µM<br />
***<br />
ROLIPRAM 1 µM<br />
ROLIPRAM 10 µM<br />
96<br />
LNC FITC ROLIPRAM 0,1 µM<br />
LNC FITC ROLIPRAM 0,01 µM<br />
*** *** ***<br />
**<br />
Versuchsgruppe<br />
**<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1 µM<br />
LNC FITC ROLIPRAM 10 µM<br />
Abb. 16: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von ROLIPRAM und LNC FITC<br />
ROLIPRAM in verschiedenen Konzentrationen und anschließender Stimulation mit LPS. Die<br />
dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten (n=12 Wells<br />
pro Konzentration je Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen innerhalb einer Versuchsgruppe sind über<br />
den Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,001 = ***).
Konzentration TNF - α [pg/ml]<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
LNC BLANK 0,01 µM<br />
LNC BLANK 0,1 µM<br />
LNC BLANK 1 µM<br />
LNC BLANK 10 µM<br />
97<br />
400 *** *** *** *** *** ***<br />
LNC FITC 0,01 µM<br />
LNC FITC 0,1 µM<br />
Versuchsgruppe<br />
LNC FITC 1 µM<br />
LNC FITC 10 µM<br />
Abb. 17: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von LNC BLANK und LNC FITC in<br />
verschiedenen Konzentrationen und anschließender Stimulation mit LPS. Die dargestellten Werte<br />
zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten (n=12 Wells pro Konzentration je<br />
Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen innerhalb einer Versuchsgruppe sind über den Säulen<br />
dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,001 = ***).<br />
5.2.2 Einfluss der Testsubstanzen in der Konzentration von 1 µM auf die T�F-α-<br />
Sekretion<br />
In der zu den dendritischen Zellen gegebenen Konzentration von 1 µM zeigte sich die<br />
geringste TNF-α-Sekretion in der mit Rolipram behandelten Zellgruppe. Die über Rolipram<br />
ausgeübte Hemmung der Zytokinsekretion war gegenüber allen anderen Gruppen höchst<br />
signifikant erhöht (p < 0,001). Weiterhin zeigt die Nanopartikel-Rolipram-Kombination (LNC<br />
FITC ROLIPRAM) eine hoch signifikant stärkere TNF-α-Hemmung gegenüber der LNC
98<br />
BLANK-Gruppe (p < 0,01), wobei gegenüber der LNC FITC-Gruppe sogar ein höchst<br />
signifikanter Unterschied zu erkennen war (p < 0,001). Ein weiterer signifikanter Unterschied<br />
war zwischen den ermittelten Werten der LNC BLANK- und LNC FITC-Gruppe vorhanden,<br />
wobei die TNF-α-Konzentration der mit LNC BLANK behandelten Zellen geringer war<br />
(p < 0,05; Abb.18).<br />
Konzentration TNF - α<br />
α [pg/ml]<br />
400 ** ***<br />
*<br />
300<br />
200<br />
100<br />
0<br />
ROLIPRAM 1µM<br />
***<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1µM<br />
***<br />
LNC BLANK 1µM<br />
Versuchsgruppe<br />
***<br />
LNC FITC 1µM<br />
Abb. 18: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM,<br />
LNC BLANK und LNC FITC in der Konzentration von 1 µM und anschließender Stimulation mit LPS.<br />
Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten (n=12<br />
Wells pro Konzentration je Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen zwischen den Versuchsgruppen<br />
sind über den Säulen mit Klammern dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0.01 = **; p < 0.001 = ***).
5.2.3 Ergebnisse der Vitalitätstestsbestimmung der dendritischen Zellen<br />
99<br />
Die mit 10 µM Nanopartikel-Lösung (LNC FITC Rolipram, LNC BLANK und LNC FITC)<br />
behandelten Zellen zeigten zellmorphologische Veränderungen mit Granulierung des<br />
Zytoplasmas im mikroskopischen Bild, weiterhin waren Kristallbildungen zu erkennen.<br />
Trotz hoher Werte der photometrischen Auswertung bei LNC FITC ROLIPRAM 10 µM und<br />
LNC FITC 10 µM (10.7) wurde in der visuellen Betrachtung keine Umfärbung des gelblichen<br />
Methyltetrazoliums zu dem violetten Formazonfarbstoff festgestellt.<br />
Die Ergebnisse der anderen Gruppen zeigten eine Umfärbung von gelb zu violett, was sich in<br />
den hohen Werten der ermittelten optischen Dichten widerspiegelte (10.7).
5.3 Ergebnisse der In-vivo-Versuche<br />
100<br />
In der Tierversuchsstudie erfolgte die Untersuchung der spiralganglienzellprotektiven<br />
Wirkung des Phosphodiesterase-Hemmers Rolipram sowie des in Lipidnanokapseln<br />
inkorporierten Roliprams (LNC FITC ROLIPRAM). Des Weiteren wurde auch der Einfluss<br />
von unbeladenen Lipidnanokapseln (LNC FITC) auf das Spiralganglienzellüberleben<br />
untersucht. Eine letzte Tiergruppe wurde nur mit phosphate buffered saline (PBS) behandelt.<br />
Für die Durchführung dieser Untersuchungen wurden die Tiere zunächst systemisch ertaubt<br />
(Versuchstag 0), wonach die Injektion der jeweiligen Testsubstanzen in die Scala tympani der<br />
linken Cochleae erfolgte (Versuchstag 7). Rechtsseitig wurden alle Tiere in entsprechender<br />
Weise zur Kontrolle mit PBS behandelt. Am Tag 21 wurden die Cochleae gewonnen und zur<br />
histologischen Aufarbeitung vorbereitet, um durch Auszählung der überlebenden<br />
Spiralganglienzellen sowie der Ausmessung ihrer Somadiameter die Effekte der<br />
Testsubstanzen zu evaluieren.<br />
Für diese Studie wurden insgesamt 32 Tiere zu je acht Tieren pro Gruppe verwendet. In der<br />
PBS-Gruppe kam es in zwei Fällen zu unzureichenden Ertaubungen, indem nicht genügend<br />
Furosemid injiziert werden konnte. In den Gruppen LNC FITC und LNC FITC ROLIPRAM<br />
kam es zu jeweils einem Todesfall, wobei in der ROLIPRAM-Gruppe zwei Tiere<br />
intraoperativ verstorben sind. Somit wurden in die Auswertung der Ergebnisse in der LNC<br />
FITC-Gruppe n=7 Tiere, in der LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe n=6 Tiere, in der<br />
ROLIPRAM-Gruppe n=7 Tiere und in der PBS-Gruppe n=6 Tiere mit einbezogen. Alle Tiere<br />
zeigten in der postoperativen Versuchszeit ein ungestörtes Allgemeinbefinden mit ungestörter<br />
Futter- und Wasseraufnahme.<br />
5.3.1 Ergebnisse der aABR-Messungen<br />
Zur Bestimmung der Hörschwelle wurden die Tiere am Versuchstag 0, 7 und 21 der Studie<br />
einer akustisch evozierten Hirnstammpotential (aABR)-Messung unterzogen (4.2.3.3).<br />
Die Messung der Hörschwelle kurz vor der systemischen Ertaubung am Tag 0 diente zur<br />
Bestimmung der Ausgangshörschwelle. Bei einer Frequenz von 8 kHz lag die niedrigste
101<br />
Hörschwelle bei 20 dB SPL, während die höchste bei 40 dB SPL lag. Auch in den anderen<br />
getesteten Frequenzen zeigte sich bei allen Tieren ein der Tierart entsprechendes<br />
Hörvermögen (Abb. 19). Damit galten alle in der Studie verwendeten Tiere als normal hörend<br />
und konnten in die Auswertung mit einbezogen werden (KANO u. STARR 1987,<br />
MITCHELL et al. 1997).<br />
Am Tag 7 und am Tag 21 wurde eine erneute aABR-Messung durchgeführt um den Erfolg<br />
der systemischen Ertaubung zu überprüfen. Bei allen Tieren konnte nach der Ertaubung in<br />
allen getesteten Frequenzen kein positives aABR-Signal bis zur Messgrenze von 90 dB SPL<br />
ermittelt werden, was bei den Versuchstieren einem Hörschwellenanstieg von mindestens<br />
50 dB SPL entsprach, womit die Tiere als ertaubt galten (AGTERBERG et al. 2009).<br />
Hörschwelle [dB SPL]<br />
100<br />
90<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
Abb. 19: Darstellung der physiologischen Hörschwellen der rechten und linken Ohren am<br />
Versuchstag 0 (n=26; Mittelwert ± Standardabweichung). Die unterbrochene rote Linie stellt die<br />
ermittelten Daten des Versuchstages 7 und 21 dar. Hierbei konnte in keiner der gemessenen<br />
Frequenzen weder links- noch rechtsseitig ein positives aABR-Signal bis zur Messgrenze von 90 dB<br />
SPL beobachtet werden. Eine Messung höherer dB SPL-Werte war aufgrund der Systemkonfiguration<br />
nicht durchführbar.<br />
1 4 8 16 32 40<br />
Frequenz [kHz]<br />
links<br />
rechts
102<br />
5.3.2 Vergleich der Spiralganglienzelldichten zwischen rechten und linken ertaubten<br />
Cochleae der Tiere einer Versuchsgruppe sowie der linken bzw. rechten Cochleae aller<br />
Gruppen untereinander<br />
Zur Evaluierung der Effekte der unterschiedlichen Interventionen wurden die ermittelten<br />
Spiralganglienzelldichten der behandelten linken Cochleae mit denen der jeweiligen rechten<br />
Kontrollgruppe verglichen. Hierüber ließ sich die Wirksamkeit der jeweiligen Intervention<br />
erkennen, da der Spiralganglienzelldichtewert der rechten Kontrollseiten den Dichtewert nach<br />
21 Tagen Ertaubung widerspiegelt. Der Unterschied zur linken Seite gibt dabei die Effizienz<br />
der Testsubstanz hinsichtlich der Spiralganglienzelldichte an. Die statistische Auswertung<br />
erfolgte in diesem Fall über den t-Test für abhängige Stichproben. Des Weiteren fand ein<br />
Vergleich der linken behandelten Cochleae aller Gruppen untereinander statt, wobei mit den<br />
rechten Seiten genauso verfahren wurde. Hierbei wurde die statistische Auswertung mittels<br />
Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) und Student-Newman-Keuls-Test<br />
durchgeführt.<br />
Tendenziell wiesen alle Gruppen auf der rechten Kontrollseite eine höhere<br />
Spiralganglienzelldichte auf, wobei nur in der PBS-Gruppe zwischen linker und rechter Seite<br />
ein signifikanter Unterschied festgestellt wurde (4,14 SGZ ± 1,40/ 10.000 µm 2 ;<br />
Mittelwert ± Standardabweichung versus 5,23 SGZ ± 1,67/ 10.000 µm 2 ; p < 0,05; Abb. 20).<br />
Die Abweichungen der Spiralganglienzelldichten zwischen rechter und linker Seite zeigten<br />
bei den übrigen Gruppen keine signifikanten Unterschiede. Die ermittelten Werte ergaben für<br />
die LNC FITC-Gruppe auf der linken Seite eine mittlere Dichte von<br />
3,13 ± 0,49 SGZ/ 10.000 µm 2 während die rechte Seite mit 3,25 ± 0,38 SGZ/ 10.000 µm 2<br />
einen leicht erhöhten Dichtewert zeigte. Bei der LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe wurden<br />
Werte von 3,28 ± 1,48 SGZ/ 10.000 µm 2 für die linke Seite sowie<br />
3,36 ± 1,15 SGZ/ 10.000 µm 2 für die rechte Seite ermittelt. Ein ähnliches Bild zeigte sich in<br />
der ROLIPRAM-Gruppe wobei auf der linken Seite ein Dichtewert von<br />
3,31 ± 0,89 SGZ/ 10.000 µm 2 erreicht wurde, sich auf der Kontrollseite aber zur linken Seite<br />
ein wiederum leicht erhöhter Wert von 3,74 ± 0,89 SGZ/ 10.000 µm 2 darstellte.
Durchschnittliche SGZ-Dichte<br />
linker und rechter Cochleae<br />
(SGZ-Zahl/10.000 µm 2 )<br />
LNC FITC li<br />
Kontrolle PBS re<br />
LNC FITC ROLIPRAM li<br />
Kontrolle PBS re<br />
103<br />
8 *<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
ROLIPRAM li<br />
Kontrolle PBS re<br />
Versuchsgruppe<br />
PBS li<br />
Kontrolle PBS re<br />
Abb. 20: Durchschnittliche SGZ-Dichten (SGZ/ 10.000 µm 2 ; Mittelwert ± Standardabweichung) der<br />
Cochleae ertaubter Meerschweinchen nach linksseitiger Behandlung mit LNC FITC, LNC FITC<br />
ROLIPRAM, ROLIPRAM und PBS im Vergleich mit den jeweils rechtsseitigen, nur mit PBS<br />
behandelten Cochleae. Nur in der PBS-Gruppe war ein signifikanter Unterschied zu erkennen<br />
(p < 0,05 = *).<br />
Der Vergleich der Spiralganglienzelldichten der linken Ohren untereinander ergab keine<br />
signifikanten Unterschiede. So wurde das Dichtemaximum mit 4,14 ± 1,40 SGZ / 10.000 µm 2<br />
in der PBS-Gruppe, das Minimum in der LNC FITC-Gruppe mit einem Wert von<br />
3,13 ± 0,54 SGZ/ 10.000 µm 2 erreicht. Der Vergleich der Daten der rechten Cochleae<br />
hingegen zeigte einen signifikant erhöhten Wert der Spiralganglienzelldichte für die PBS-<br />
Gruppe mit 5,23 ± 1,67 SGZ/ 10.000 µm 2 (p < 0,05). Der niedrigste Wert zeigte sich auch auf<br />
dieser Seite ebenfalls in der LNC FITC-Gruppe mit 3,25 ± 0,41 SGZ/ 10.000 µm 2 .
104<br />
5.3.3 Vergleich der Spiralganglienzelldichten des unteren, mittleren und oberen<br />
Abschnitts der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie) innerhalb einer<br />
Versuchsgruppe sowie zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen<br />
Für die Beurteilung der jeweiligen Interventionseffekte in den unterschiedlichen Abschnitten<br />
der Cochlea wurden die ermittelten Spiralganglienzelldichten der einzelnen Anschnitte des<br />
ROSENTHALschen Kanals in drei Gruppen unterteilt (4.2.3.10). So zeigte der Vergleich der<br />
gewählten Abschnitte innerhalb einer Gruppe ob es abhängig von der Topographie in der<br />
Cochlea zu verschieden stark ausgeprägten Effekten kommt. Die Unterschiede in den<br />
Zelldichten der einzelnen Abschnitte können Rückschlüsse auf eine eventuelle Beeinflussung<br />
der rechten Ohren durch die linksseitig behandelten Ohren zulassen. Zum Vergleich der<br />
verschiedenen Abschnitte innerhalb einer Versuchsgruppe wurde der t-Test für abhängige<br />
Stichproben angewendet. Der Vergleich der einzelnen Abschnitte zwischen den<br />
verschiedenen Gruppen erfolgte mittels Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) und<br />
nachfolgendem Student-Newman-Keuls-Test (Abb. 21).<br />
Ein recht homogenes Bild war in der LNC FITC-Gruppe zu sehen, wobei zwischen den<br />
verschiedenen Abschnitten der Cochlea kein signifikanter Unterschied evident wurde. So<br />
konnten für den unteren Abschnitt ein mittlerer Wert von 3,14 ± 0,13 SGZ/ 10.000 µm 2<br />
(Mittelwert ± Standardabweichung), für den mittleren Abschnitt<br />
3,34 ± 0,80 SGZ/ 10.000 µm 2 ermittelt werden, während der obere Abschnitt einen mittleren<br />
Spiralganglienzelldichtewert von 3,26 ± 0,52 SGZ/ 10.000 µm 2 erzielte. Auch in der LNC<br />
FITC ROLIPRAM-Gruppe zeigte sich eine ähnlich homogene Verteilung der<br />
Spiralganglienzelldichten zwischen den drei Abschnitten, wobei der mittlere Abschnitt einen<br />
tendenziell höheren Wert zu dem unteren sowie oberen Abschnitt aufwies<br />
(3,55 ± 1,76 SGZ/ 10.000 µm 2 versus 3,24 ± 0,92 SGZ/ 10.000 versus 3,28 ± 0,94 SGZ/<br />
10.000 µm 2 )<br />
Als einzige Gruppe zeigten die Kontrollcochleae der mit Rolipram behandelten Tiere einen<br />
signifikanten Unterschied in der Spiralganglienzelldichte zwischen den einzelnen<br />
Abschnitten. So wurde im oberen Abschnitt (4,91 ± 1,20 SGZ/ 10.000 µm 2 ) ein hoch<br />
signifikant erhöhter (p < 0,01) Wert im Vergleich zum unteren Abschnitt<br />
(2,95 ± 0,88 SGZ/ 10.000 µm 2 ) erreicht. Aber auch gegenüber des mittleren Abschnitts
105<br />
(3,36 ± 1,08 SGZ/ 10.000 µm 2 ) zeigte sich ein zwar geringerer aber dennoch signifikanter<br />
(p < 0,05) Unterschied zur Spiralganglienzelldichte des oberen Abschnitts.<br />
In der PBS-Gruppe zeigte sich lediglich eine tendenzielle Zunahme der Zelldichten vom<br />
unteren über den mittleren bis zum oberen Abschnitt. Signifikante Unterschiede konnten<br />
hierbei jedoch auf Grund der höheren Streuung nicht beobachtet werden<br />
(4,39 ± 1,70 SGZ/ 10.000 µm 2 versus 5,44 ± 2,13 SGZ/ 10.000 µm 2 versus<br />
5,85 SGZ ± 1,84/ 10.000 µm 2 ).<br />
Durchschnittliche SGZ-Dichte<br />
rechter Cochleae (ohne Therapie)<br />
(SGZ-Zahl/10.000 µm 2 )<br />
8 **<br />
7<br />
*<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
LNC FITC 1<br />
LNC FITC 2<br />
LNC FITC 3<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1<br />
LNC FITC ROLIPRAM 2<br />
LNC FITC ROLIPRAM 3<br />
ROLIPRAM 1<br />
ROLIPRAM 2<br />
ROLIPRAM 3<br />
Versuchsgruppe (Kontrollseite)<br />
PBS 1<br />
PBS 2<br />
PBS 3<br />
Abb. 21: Darstellung der mittleren Spiralganglienzelldichten und der Standardabweichung des<br />
unteren (1), mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie).<br />
Das Diagramm zeigt den Vergleich der unterschiedlichen Abschnitte innerhalb der einzelnen Gruppen.<br />
Die hier dargestellten Kontrollseiten wurden alle mit PBS behandelt. Signifikanzniveaus sind mittels<br />
Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **).<br />
Der Vergleich der einzelnen Abschnitte zwischen den Gruppen erbrachte für die unteren und<br />
mittleren Abschnitte keinen signifikanten Unterschied. Nur der Vergleich der oberen<br />
Abschnitte wies im Vergleich zwischen den einzelnen Gruppen signifikante Unterschiede auf.
106<br />
So zeigte sich die Spiralganglienzelldichte des oberen Abschnittes der ROLIPRAM-Gruppe<br />
(4,91 ± 1,20 SGZ/ 10.000 µm 2 ) einen signifikant (p < 0,05) höheren Wert als die<br />
entsprechenden Windungen der Gruppen LNC FITC sowie LNC FITC ROLIPRAM<br />
(3,26 ± 0,52 SGZ/ 10.000 µm 2 ; respektive 3,28 ± 0,94 SGZ/ 10.000 µm 2 ), während der<br />
Spiralganglienzellwert des oberen Abschnitts der PBS-Gruppe<br />
(5,85 ± 1,84 SGZ/ 10.000 µm 2 ) die Werte der beiden letztgenannten Gruppen sogar hoch<br />
signifikant (p < 0,01) übertraf (Abb. 22).<br />
Durchschnittliche SGZ-Dichte<br />
rechter Cochleae (ohne Therapie)<br />
(SGZ-Zahl/10.000 µm 2 )<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
LNC FITC 1<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1<br />
ROLIPRAM 1<br />
PBS 1<br />
LNC FITC 2<br />
LNC FITC ROLIPRAM 2<br />
ROLIPRAM 2<br />
PBS 2<br />
Versuchsgruppe (Kontrollseite)<br />
LNC FITC 3<br />
LNC FITC ROLIPRAM 3<br />
ROLIPRAM 3<br />
PBS 3<br />
Abb. 22: Darstellung der mittleren Spiralganglienzelldichten und der Standardbweichung des unteren<br />
(1), mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie). Das<br />
Diagramm zeigt den Vergleich der jeweiligen Abschnitte zwischen den unterschiedlichen Gruppen.<br />
Die hier dargestellten Kontrollseiten wurden alle mit PBS behandelt. Signifikanzniveaus sind mittels<br />
Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **).<br />
*<br />
**
107<br />
5.3.4 Vergleich der Spiralganglienzelldichten des unteren, mittleren und oberen<br />
Abschnitts der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie) innerhalb einer<br />
Versuchsgruppe sowie zwischen den Versuchsgruppen<br />
Zur vergleichenden Betrachtung der Einflüsse der Versuchssubstanzen auf das<br />
Spiralganglienzellüberleben wurden auch die Spiralganglienzelldichten der linken Cochleae<br />
in drei Abschnitte zusammengefasst. Hierbei ist nach dem gleichen Verfahren wie bei den<br />
rechten Cochleae (5.3.3) vorgegangen worden um mögliche ortsspezifische Effekte der<br />
benutzten Substanzen zu erkennen.<br />
Die statistische Beurteilung zum Vergleich der verschiedenen Abschnitte innerhalb einer<br />
Versuchsgruppe erfolgte durch den t-Test für abhängige Stichproben. Der Vergleich der<br />
einzelnen Abschnitte zwischen den verschiedenen Gruppen wurde mittels Varianzanalyse<br />
(analysis of variance, ANOVA) und nachfolgendem Student-Newman-Keuls-Test<br />
durchgeführt (Abb. 23).<br />
Die Auswertung der LNC FITC-Gruppe zeigte die signifikant höchste Spiralganglienzell-<br />
dichte in dem obersten Abschnitt mit 3,55 ± 0,64 SGZ/ 10.000 µm 2 (Mittelwert ±<br />
Standardabweichung). Wobei der Unterschied zum mittleren Abschnitt (p < 0,01;<br />
2,77 ± 0,49 SGZ/ 10.000 µm 2 ) größer ist als zum unteren Abschnitt (p < 0,05;<br />
3,07 ± 0,53 SGZ/ 10.000 µm 2 ).<br />
Die Spiralganglienzelldichten in der LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe zeigten dahingegen<br />
keinen signifikanten Unterschied. So lagen die Werte der unteren, mittleren und oberen<br />
Cochleaanteile sehr dicht zusammen (3,63 ± 1,83 SGZ/ 10.000 µm 2 ; respektive<br />
3,07 ± 1,26 SGZ/ 10.000 µm 2 ; respektive 3,16 ± 1,41 SGZ/ 10.000 µm 2 ).<br />
Auch bei den mit Rolipram behandelten Tieren zeigte sich die Spiralganglienzelldichte der<br />
mittleren Anteile als die Geringste (2,99 ± 0,92 SGZ/ 10.000 µm 2 ). So war im oberen<br />
Abschnitt ein signifikant höherer Spiralganglienzelldichtewert zu verzeichnen (p < 0,05;<br />
3,77 ± 1,33 SGZ/ 10.000 µm 2 ), während die Dichte der unteren Cochleaanteile einen nur<br />
tendenziell höheren Wert zu erkennen gab (3,16 ± 0,64 SGZ/ 10.000 µm 2 ).<br />
Mit den Zelldichtewerten von 3,83 ± 2,04 SGZ/ 10.000 µm 2 in dem unteren,<br />
3,88 ± 1,29 SGZ/ 10.000 µm 2 in dem mittleren und 4,70 ± 1,15 SGZ/ 10.000 µm 2 in dem
108<br />
oberen Abschnitt gab es auch in der PBS-Gruppe keine signifikanten Unterschiede zu<br />
verzeichnen.<br />
Durchschnittliche SGZ-Dichte<br />
linker Cochleae (mit Therapie)<br />
(SGZ-Zahl/10.000 µm 2 )<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
*<br />
**<br />
LNC FITC 1<br />
LNC FITC 2<br />
LNC FITC 3<br />
LNC FITC ROLIPRAM 2<br />
LNC FITC ROLIPRAM 3<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1<br />
*<br />
ROLIPRAM 1<br />
ROLIPRAM 2<br />
ROLIPRAM 3<br />
Versuchsgruppe<br />
PBS 1<br />
PBS 2<br />
PBS 3<br />
Abb. 23: Darstellung der mittleren Spiralganglienzelldichten und der Standardabweichung des<br />
unteren (1), mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten linken Cochleae (mit Therapie). Das<br />
Diagramm zeigt den Vergleich der einzelnen Abschnitte innerhalb der einzelnen Gruppen. Die<br />
Cochleae wurden mit LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und PBS behandelt.<br />
Signifikanzniveaus sind mittels Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *;<br />
p < 0,01 = **).<br />
Die vergleichende Betrachtung der einzelnen Abschnitte zwischen den Gruppen erbrachte<br />
keine signifikanten Unterschiede, wobei die Werte der PBS-Gruppe aber in jedem Abschnitt<br />
das tendenzielle Maximum bildeten (Abb. 24).
Durchschnittliche SGZ-Dichte<br />
linker Cochleae (mit Therapie)<br />
(SGZ-Zahl/10.000 µm 2 )<br />
8<br />
7<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
0<br />
LNC FITC 1<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1<br />
ROLIPRAM 1<br />
PBS 1<br />
LNC FITC 2<br />
LNC FITC ROLIPRAM 2<br />
109<br />
ROLIPRAM 2<br />
PBS 2<br />
Versuchsgruppe<br />
LNC FITC 3<br />
LNC FITC ROLIPRAM 3<br />
ROLIPRAM 3<br />
Abb. 24: Darstellung der mittleren Spiralganglienzelldichten und der Standardabweichung des<br />
unteren (1), mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie). Das<br />
Diagramm zeigt den Vergleich der jeweiligen Abschnitte zwischen den unterschiedlichen Gruppen.<br />
Die Cochleae wurden mit LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und PBS behandelt. Es<br />
ergaben sich keine signifikanten Unterschiede innerhalb der einzelnen Abschnitte.<br />
5.3.5 Vergleich der Somadiameter der Spiralganglienzellen zwischen rechter und linker<br />
ertaubter Cochleae der Tiere einer Versuchsgruppe sowie der linken bzw. rechten<br />
Cochleae aller Gruppen untereinander<br />
Neben der Spiralganglienzelldichte wurde als zweiter Parameter der Somadiameter der<br />
Spiralganglienzellen vermessen. Es sollte ein etwaiger Effekt der jeweiligen Testsubstanzen<br />
auf die Größe der Spiralganglienzellen untersucht werden. Hierfür erfolgte ein Vergleich der<br />
rechten Kontrollseite mit der linken, mit der jeweiligen Testsubstanz behandelten Seite. Es<br />
wurden pro Anschnitt des ROSENTHALschen Kanals acht Somadiameter ermittelt, wobei in<br />
vier verschieden Feldern der Anschnittfläche je zwei Zellen ausgewählt wurden. Waren<br />
PBS 3
110<br />
weniger als acht Zellen vorhanden, wurden alle verbliebenen Zellen vermessen (4.2.3.10).<br />
Der statistische Vergleich der Somadiameter innerhalb einer Gruppe wurde mittels des t-Test<br />
für abhängige Stichproben durchgeführt, während der Vergleich der rechten bzw. linken<br />
Cochleae der Gruppen untereinander mittels Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA)<br />
und nachfolgendem Student-Newman-Keuls-Test durchgeführt wurde.<br />
Der Vergleich der Somadiameter der linken, mit den jeweiligen Testsubstanzen behandelten<br />
Cochleae, gegenüber den Zelldurchmessern, welche in den rechten Kontrollseiten ermittelt<br />
wurden, ergab bei den mit LNC FITC behandelten Tieren einen signifikanten Unterschied<br />
(Abb. 25). So war der Somadiameter der linken Seite signifikant gegen den Mittelwert der<br />
rechten Seite erhöht (14,00 ± 0,76 µm versus 13,14 ± 0,52 µm; p < 0,05).<br />
Die Behandlung mit LNC FITC ROLIPRAM hingegen zeigte nur einen tendenziell erhöhten<br />
Somadiameter auf der linken Seite (13,91 ± 1,33 µm), während die rechte Seite mit einem<br />
Mittelwert von 12,68 ± 0,72 µm keinen signifikant verringerten Wert darstellte.<br />
In der ROLIPRAM-Gruppe setzte sich der linksseitige Wert der mittleren Somadiameter<br />
deutlich signifikant von denen auf der rechten Seite ab (13,78 ± 0,26 µm versus<br />
12,73 ± 0,32 µm ; p < 0,01).<br />
Die PBS-Gruppe zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den Werten der rechten<br />
und linken Seite (13,27 ± 0,56 µm versus 12,68 ± 0,79 µm).
Durchschnittlicher Somadiameter<br />
der SGZ linker und rechter Cochleae [µm]<br />
17.5<br />
15.0<br />
12.5<br />
10.0<br />
7.5<br />
5.0<br />
2.5<br />
0.0<br />
LNC FITC li<br />
Kontrolle PBS re<br />
LNC FITC ROLIPRAM li<br />
Kontrolle PBS re<br />
111<br />
* **<br />
ROLIPRAM li<br />
Kontrolle PBS re<br />
Versuchsgruppe<br />
PBS li<br />
Kontrolle PBS re<br />
Abb. 25: Durchschnittliche Somadiameter (µm; Mittelwert ± Standardabweichung) der Cochleae<br />
ertaubter Meerschweinchen nach linksseitiger Behandlung mit LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM,<br />
ROLIPRAM und PBS im Vergleich mit den jeweils rechtsseitigen, nur mit PBS behandelten, Cochleae.<br />
Signifikanzniveaus sind mittels Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *;<br />
p < 0,01 = **).<br />
Die Auswertung des Vergleichs der Somadiameter der linken Cochleae untereinander, sowie<br />
auch der rechten Kontrollseiten untereinander, ergab keine statistisch signifikanten<br />
Unterschiede.
112<br />
5.3.6 Vergleich der ermittelten Somadiameter des unteren, mittleren und oberen<br />
Abschnitts der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie) innerhalb einer<br />
Versuchsgruppe sowie zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen<br />
Um einen Einfluss der Testsubstanzen auf die verschiedenen Abschnitte der Cochlea von<br />
basal nach apikal beurteilen zu können, wurden die ermittelten Somadiameter der ertaubten,<br />
ansonsten nur mit PBS behandelten rechten Cochleae, in drei Abschnitte zusammengefasst<br />
(4.2.3.10). Durch den Vergleich der Kontrollcochleae der verschiedenen Gruppen soll ein<br />
Rückschluss auf eine mögliche Beeinflussung vom linksseitig behandelten Ohr ermöglicht<br />
werden.<br />
Die Werte der Somadiameter wurden innerhalb einer Gruppe mit dem t-Test für abhängige<br />
Stichproben verglichen wobei die Auswertung der Gegenüberstellung unter den Gruppen<br />
mittels Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) und Student-Newman-Keuls-Test<br />
erfolgte (Abb. 26).<br />
In der mit LNC FITC behandelten Gruppe, zeigten die Somadiameter der mit PBS<br />
behandelten Kontrollcochleae eine deutliche Verringerung des Wertes von basal nach apikal.<br />
So bestand ein signifikanter Unterschied zwischen dem mittleren Somadiameter des unteren<br />
und oberen Abschnitts [13,69 ± 0,82 µm (Mittelwert ± Standardabweichung) versus<br />
12,65 ± 0,45 µm; p < 0,05]. Der mittlere Abschnitt lag mit einem Somadiameter von<br />
13,03 ± 0,58 µm zwischen den beiden anderen, zeigte aber keinen signifikanten Unterschied<br />
zur Kontrollgruppe.<br />
Bei den Kontrollinnenohren der LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe wurde kein signifikanter<br />
Unterschied zwischen den einzelnen Abschnitten deutlich. Jedoch weisen die Werte der<br />
Somadiameter des unteren, mittleren und oberen Abschnitts eine tendenzielle Abnahme des<br />
Spiralganglienzelldurchmessers auf (13,24 ± 1,20 µm; respektive 12,46 ± 0,60 µm; respektive<br />
12,51 ± 0,52 µm).<br />
Auch die Somadiameter der rechtsseitig vermessenen Kontrollohren der ROLIPRAM-Gruppe<br />
zeigten diese Verringerung des Durchmessers von basal nach apikal. Während der untere<br />
Abschnitt mit 13,21 ± 0,28 µm einen signifikanten Unterschied zum mittleren Somadiameter<br />
des apikalen Abschnitts aufwies (12,51 ± 0,60 µm; p < 0,05), zeigte er zum mittleren<br />
Abschnitt sogar eine noch deutlichere Signifikanz (12,66 ± 0,42 µm; p < 0,01).
113<br />
Die Auswertung der PBS-Gruppe zeigte wiederum keine Signifikanzen, jedoch ebenfalls eine<br />
tendenzielle Abnahme des mittleren Somadiameters von basal nach apikal. So betrug der<br />
Durchmesser des unteren Abschnitts 13,34 ± 1,26 µm, des mittleren Abschnitts<br />
12,72 ± 0,84 µm wobei für den oberen Abschnitt ein Wert von 12,46 ± 0,55 µm ermittelt<br />
wurde.<br />
Durchschnittlicher Somadiameter<br />
der SGZ rechter Cochleae<br />
(ohne Therapie) [µm]<br />
17.5<br />
15.0<br />
12.5<br />
10.0<br />
7.5<br />
5.0<br />
2.5<br />
0.0<br />
*<br />
LNC FITC 1<br />
LNC FITC 2<br />
LNC FITC 3<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1<br />
LNC FITC ROLIPRAM 2<br />
LNC FITC ROLIPRAM 3<br />
**<br />
*<br />
ROLIPRAM 1<br />
ROLIPRAM 2<br />
ROLIPRAM 3<br />
Versuchsgruppe (Kontrollseite)<br />
PBS 1<br />
PBS 2<br />
PBS 3<br />
Abb. 26: Darstellung der mittleren Somadiameter und der Standardabweichung des unteren (1),<br />
mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie). Das<br />
Diagramm zeigt den Vergleich der einzelnen Abschnitte innerhalb der einzelnen Gruppen. Die hier<br />
dargestellten Kontrollseiten wurden alle mit PBS behandelt. Signifikanzniveaus sind mittels Klammern<br />
über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **).<br />
Der Vergleich der Somadiameter der einzelnen Abschnitte der Kontrollohren untereinander<br />
zeigte keine Signifikanzen (Abb. 27).
Durchschnittlicher Somadiameter<br />
der SGZ rechter Cochleae<br />
(ohne Therapie) [µm]<br />
17.5<br />
15.0<br />
12.5<br />
10.0<br />
7.5<br />
5.0<br />
2.5<br />
0.0<br />
LNC FITC 1<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1<br />
ROLIPRAM 1<br />
PBS 1<br />
LNC FITC 2<br />
LNC FITC ROLIPRAM 2<br />
114<br />
ROLIPRAM 2<br />
PBS 2<br />
LNC FITC 3<br />
LNC FITC ROLIPRAM 3<br />
Versuchsgruppe (Kontrollseite)<br />
ROLIPRAM 3<br />
Abb. 27: Darstellung der mittleren Somadiameter und der Standardabweichung des unteren (1),<br />
mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie). Das<br />
Diagramm zeigt den Vergleich der jeweiligen Abschnitte zwischen den unterschiedlichen Gruppen.<br />
Die hier dargestellten Kontrollseiten wurden alle mit PBS behandelt. Der Vergleich der jeweiligen<br />
Abschnitte ergab untereinander keine Signifikanzen.<br />
5.3.7 Vergleich der ermittelten Somadiameter des unteren, mittleren und oberen<br />
Abschnitts der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie) innerhalb einer<br />
Versuchsgruppe sowie zwischen den Versuchsgruppen<br />
Durch den Vergleich der Somadiameter der einzelnen Abschnitte der Cochlea können<br />
eventuell aufgetretene lokal verstärkte oder verminderte Effekte der Versuchssubstanzen<br />
evaluiert werden (4.2.3.10). So zeigte der mit dem t-Test für abhängige Stichproben<br />
durchgeführte Vergleich der Abschnitte innerhalb einer Gruppe den Unterschied des<br />
Einflusses der Versuchssubstanz zwischen dem unteren, mittleren sowie oberen Abschnitt<br />
(Abb. 28). Der mittels Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) und nachfolgendem<br />
PBS 3
115<br />
Student-Newman-Keuls-Test durchgeführte Vergleich der einzelnen Abschnitte unter den<br />
verschiedenen Gruppen gab Auskunft über den direkten Einfluss der Testsubstanzen auf den<br />
Somadiameter (Abb. 29).<br />
Der mittlere Somadiameter des unteren Abschnittes der mit LNC FITC behandelten Ohren<br />
wies gegenüber den ermittelten Zelldurchmessern des oberen Abschnitts einen hoch<br />
signifikant erhöhten Wert auf (14,80 ± 1,33 µm; Mittelwert ± Standardabweichung versus<br />
13,02 ± 0,95 µm; p < 0,01). Aber auch zwischen dem mittleren Abschnitt und dem oberen<br />
Abschnitt ist eine deutliche Signifikanz (13,92 ± 0,82 µm; p < 0,01) zu verzeichnen.<br />
Die mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten Cochleae zeigten innerhalb der einzelnen<br />
Abschnitte keinen signifikanten Unterschied wobei aber eine tendenzielle Abnahme des<br />
Somadiameters vom unteren über den mittleren zum oberen Abschnitt zu erkennen war<br />
(14,55 ± 2,43 µm; respektive 13,47 ± 1,25 µm; respektive 12,73 ± 0,93 µm).<br />
Bei der mit Rolipram behandelten Gruppe zeigt sich ein höchst signifikanter Unterschied<br />
(p < 0,001) zwischen dem mittleren und oberen Abschnitt (14,86 ± 0,53 µm;<br />
13,24 ± 0,54 µm). Während der durchschnittliche Somadiameter der unteren Abteilung<br />
(14,20 ± 0,54 µm) der Cochlea zu dem des mittleren Abschnitts keine Signifikanz zeigt, ist<br />
die Verminderung der Zellgröße verglichen mit dem Wert des oberen Abschnittes wiederum<br />
signifikant (p < 0,05).<br />
Auch bei der mit PBS behandelten Gruppe zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den<br />
einzelnen Abschnitten. So ist der untere Abschnitt mit dem Maximum von 14,02 ± 0,66 µm<br />
gegenüber dem mittleren (13,16 ± 0,70 µm) sowie oberen Abschnitt (12,38 µm ± 0,41) höchst<br />
signifikant erhöht (p < 0,001). Während zwischen dem mittleren und oberen Abschnitt auch<br />
eine deutliche Signifikanz mit p < 0,01 vorliegt.
Durchschnittlicher<br />
Somadiameter der SGZ linker Cochleae<br />
(mit Therapie) [µm]<br />
17.5<br />
15.0<br />
12.5<br />
10.0<br />
7.5<br />
5.0<br />
2.5<br />
0.0<br />
LNC FITC 1<br />
**<br />
LNC FITC 2<br />
*<br />
LNC FITC 3<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1<br />
LNC FITC ROLIPRAM 2<br />
LNC FITC ROLIPRAM 3<br />
116<br />
ROLIPRAM 1<br />
ROLIPRAM 2<br />
Versuchsgruppe<br />
ROLIPRAM 3<br />
Abb. 28: Darstellung der mittleren Somadiameter und der Standardabweichung des unteren (1),<br />
mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie). Das Diagramm<br />
zeigt den Vergleich der einzelnen Abschnitte innerhalb der einzelnen Gruppen. Die Cochleae wurden<br />
mit LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und PBS behandelt. Signifikanzniveaus sind<br />
mittels Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **;<br />
p < 0,001 = ***).<br />
Im Vergleich der einzelnen Abschnitte unter den Gruppen zeigte die Gegenüberstellung der<br />
zweiten Abschnitte einen hoch signifikant (p < 0,01) erhöhten Somadiameter der mit<br />
Rolipram behandelten Tiere gegenüber den mit PBS behandelten Tieren. Der Vergleich der<br />
unteren sowie oberen Somadiameter ließ keine Signifikanzen evident werden (Abb. 29).<br />
*<br />
***<br />
PBS 1<br />
***<br />
***<br />
PBS 2<br />
**<br />
PBS 3
Durchschnittlicher<br />
Somadiameter der SGZ linker Cochleae<br />
(mit Therapie) [µm]<br />
17.5<br />
15.0<br />
12.5<br />
10.0<br />
7.5<br />
5.0<br />
2.5<br />
0.0<br />
LNC FITC 1<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1<br />
ROLIPRAM 1<br />
PBS 1<br />
LNC FITC 2<br />
LNC FITC ROLIPRAM 2<br />
117<br />
**<br />
ROLIPRAM 2<br />
PBS 2<br />
Versuchsgruppe<br />
LNC FITC 3<br />
LNC FITC ROLIPRAM 3<br />
ROLIPRAM 3<br />
PBS 3<br />
Abb. 29: Darstellung der mittleren Somadiameter und der Standardabweichung des unteren (1),<br />
mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie). Das Diagramm<br />
zeigt den Vergleich der jeweiligen Abschnitte zwischen den unterschiedlichen Gruppen. Die Cochleae<br />
wurden mit LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und PBS behandelt. Signifikanzniveaus<br />
sind mittels Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,01 = **).<br />
Abbildung 30 zeigt beispielhaft Anschnitte des ROSENTHALschen Kanals der<br />
verschiedenen Versuchsgruppen.
118<br />
1 2<br />
3<br />
Abb. 30: Beispielhafte Darstellung von Hämalaun-Eosin-gefärbten Anschnitten des<br />
ROSENTHALschen Kanals von 21 Tage ertaubten Meerschweinchen. Die Einzelabbildungen 1-4<br />
zeigen dabei ein charakteristisches Bild aus der jeweiligen Versuchsgruppe. Die Pfeile kennzeichnen<br />
in jedem Bild eine repräsentative Spiralganglienzelle, welche als vital bewertet wurde. Um in die<br />
Auswertung zur Dichtebestimmung mit einzufließen, war der Anschnitt des Nukleus erforderlich, damit<br />
ein wiederholtes Zählen derselben Zelle im darauffolgenden Anschnitt ausgeschlossen werden<br />
konnte. Die Aufnahmen zeigen ein relativ homogenes Bild zwischen allen Gruppen. Die<br />
Zwischenräume zwischen den Zellen weisen auf eine fortgeschrittene Spiralganglienzelldegeneration<br />
hin. Bild 1 zeigt den Anschnitt des ROSENTHALschen Kanals unter Behandlung mit LNC FITC in der<br />
Verdünnung von 1:100 (Stammlösung 45 mg/ml LNC). Bild 2 zeigt den Einfluss von LNC FITC<br />
ROLIPRAM in der Verdünnung von 1:100 (Stammlösung 45 mg/ml LNC, 19 µg/ml Rolipram), Bild 3<br />
gibt ein repräsentatives Bild nach der Behandlung mit ROLIPRAM in der Verdünnung 1:100 wieder<br />
(Stammlösung 19 µg/ml Rolipram). Bild 4 zeigt die Situation nach der Behandlung mit PBS.<br />
Vergrößerung Bilder 1-4: 200-fach.<br />
4
6 Diskussion<br />
119<br />
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss des Phosphodiesterase-Hemmers Rolipram, in<br />
alleiniger Verabreichung sowie in einer Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination, auf das<br />
Überleben von Spiralganglienzellen zu evaluieren. Bei diesem neuartigen Drug-Delivery-<br />
System handelt es sich um Nanopartikel auf der Basis von Triglyceriden, in dessen Kern der<br />
Wirkstoff zum Transport inkorporiert wurde.<br />
Über die zunächst durchgeführten Zellkulturversuche wurde der Effekt des Roliprams, sowie<br />
der Effekt der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination auf das Überleben, das<br />
Neuritenauswachsverhalten sowie den Somadurchmesser von neonatal angezüchteten<br />
Spiralganglienzellen evaluiert (MALGRANGE et al. 1996; HEGARTY et al. 1997). Der<br />
Versuchsansatz erfolgte unter Durchführung einer Konzentrationsreihe, so dass eine<br />
möglichst optimale Konzentration für die nachfolgenden Tierversuche ausgewählt werden<br />
konnte und eventuell toxische Einflüsse ausgeschlossen werden konnten.<br />
In einer weiteren In-vitro-Versuchsreihe wurden dendritische Zellen mit Rolipram sowie der<br />
Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination behandelt. Um eine Aussage über die Freisetzung<br />
des Arzneimittels zu treffen, wurden die behandelten Zellen mit Lipopolysacchariden zur<br />
Sekretion von TNF-α stimuliert. Je nach Stärke der arzneimittelinduzierten Zytokinhemmung<br />
ließ sich so eine Aussage über die Wirksamkeit des Roliprams sowie der Nanopartikel-<br />
Arzneimittel-Kombination treffen. Aufgrund der Schlüsselstellung des TNF-α im<br />
Entzündungsgeschehen können darüber hinaus auch Rückschlüsse auf eine<br />
antiinflammatorische Wirksamkeit getroffen werden.<br />
Die anschließenden In-vivo-Versuche sollten Auskunft über die spiralganglienzellprotektiven<br />
Eigenschaften des Roliprams sowie der Nanopartikel-Rolipram-Kombination im ertaubten<br />
Versuchstier geben. Hierbei wurde die zuvor in den Zellkulturstudien ermittelte Verdünnung<br />
verwendet, welche sich als optimal für das Überleben der Spiralganglienzellen gezeigt hatte.<br />
Zur Bewertung des biologischen Effekts der verwendeten Testsubstanzen wurde die<br />
histologische Bestimmung der mittleren Spiralganglienzelldichte durchgeführt. Zusätzlich<br />
sollte durch die Vermessung der Somadiameter der Einfluss der verwendeten Substanzen auf<br />
die Zellgröße untersucht werden.
120<br />
Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern dabei grundlegende Informationen über die Eignung von<br />
Rolipram zum Erhalt von Spiralganglienzellen in Zellkultur sowie im ertaubten Organismus.<br />
Weiterhin können Aussagen über die Effektivität des verwendeten Drug-Delivery-Systems<br />
getroffen werden über welches durch noch durchzuführende Modifikationen ein gezielter<br />
Transport und eine zeitlich kontrollierte Freisetzung des Arzneimittels in den Zielzellen<br />
erreicht werden könnte.<br />
6.1 Bewertung der In-vitro-Ergebnisse<br />
6.1.1 Auswirkungen von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BD�F<br />
auf das Überleben von vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen<br />
Das signifikant beste Überleben wurde bei den mit BDNF (50 ng/ml) behandelten<br />
Spiralganglienzellen beobachtet. Schon frühere Studien mit neonatal kultivierten<br />
Spiralganglienzellen wiesen eine maximale Überlebensrate in der hier verwendeten BDNF-<br />
Konzentration nach (HEGARTY et al. 1997; MARZELLA et al. 1999; WEFSTEDT 2006). In<br />
der vorliegenden Arbeit sollte durch die Reproduktion der positiven Eigenschaften des BDNF<br />
eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen den einzelnen Versuchen der weiteren<br />
Testsubstanzen gesichert werden. Die mit BDNF behandelten Zellen dienten also als<br />
Positivkontrolle, wobei die Untersuchung der einzelnen Spiralganglienzellüberlebensraten<br />
zwischen den unterschiedlichen Konzentrationen der Testsubstanzen LNC FITC, LNC FITC<br />
ROLIPRAM und ROLIPRAM den eigentlichen Kern dieser Versuchsreihe darstellte.<br />
Die gewonnenen Ergebnisse zeigten, dass Rolipram in der alleinigen Applikation keinen<br />
signifikant protektiven Effekt auf das Zellüberleben ausübt. Dennoch muss hinzugefügt<br />
werden, dass die Betrachtung der Ergebnisse in allen verwendeten Konzentrationen ein<br />
tendenziell erhöhtes Spiralganglienzellüberleben gegenüber der unbehandelten<br />
Kontrollgruppe aufweist. Durch nahezu fehlende Schwankungen der ermittelten Werte kann<br />
darüber hinaus aber keine weiterführende Aussage getroffen werden, ob eine mögliche<br />
Erhöhung oder Erniedrigung der Arzneimittelkonzentration zu einer signifikanten<br />
Spiralganglienzellprotektion führen könnte. Aufgrund des intrazellularen
121<br />
Wirkungsmechanismus von Rolipram mögen die in dieser Gruppe beobachteten Ergebnisse<br />
durch eine ungenügende Aufnahme des Arzneimittels in die Zellen erklärbar sein. So kann<br />
sich ein neuroprotektiver Effekt nur nach Überwindung der Zellmembran entfalten. Durch die<br />
Applikation des Arzneimittels über Lipidnanokapseln mag dieser Effekt positiv beeinflusst<br />
werden.<br />
Neben dem stark protektivem Effekt des BDNF zeigte sich bei der Nanopartikel-<br />
Arzneimittel-Kombination (LNC FITC ROLIPRAM) in der Verdünnung 1:100<br />
(Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln 45 mg/ml; 19 µg/ml Rolipram) ein<br />
annähernd gleich gutes Spiralganglienzellüberleben. Innerhalb der Gruppe war die<br />
Überlebensrate gegenüber den anderen verwendeten Konzentrationen (1:50; 1:200; 1:300)<br />
signifikant erhöht, weshalb die Konzentration 1:100 für die nachfolgenden Tierversuche<br />
ausgewählt wurde. Das geringe Überleben der Spiralganglienzellen in der 1:50 Verdünnung<br />
kann durch die hohe Konzentration der Nanopartikel bedingt sein, welche einen negativen,<br />
gar toxischen Einfluss auf die Zellen ausgeübt haben könnten. Durch welchen Mechanismus<br />
diese Nanopartikel einen zytotoxischen Effekt in hohen Konzentrationen erreichen, ist bis<br />
heute nur unzureichend geklärt. So stellte WOLF im Jahr 2009 die Vermutung an, dass die<br />
phospholipidhaltige Hülle der Lipidnanokapseln nicht näher beschriebene Veränderungen in<br />
der Zellmembran der Zielzellen bewirken. Dadurch ist eine Störung des Zellmetabolismus<br />
denkbar, indem endo- und exozytotische Vorgänge beeinflusst werden. WOLF (2009) bezieht<br />
bei dieser Überlegung die Beobachtungen von SANTINI et al. (1997) mit ein, welche<br />
Versuche mit Polylysin-Partikeln durchgeführt haben und dabei zu ähnlichen Ergebnissen<br />
kamen. Eine aktuelle Studie zeigt darüberhinaus eine gute Bioverträglichkeit der<br />
Lipidnanokapseln auf Fibroblastenkulturen. Zytotoxische Effekte traten erst ab einer<br />
Konzentration von 2,2 mg/ml auf (ZHANG et al. 2011). Die Beobachtungen der eigenen<br />
Versuche zeigten aber bereits in der 1:50 Verdünnung (0,9 mg/ml) einen negativen Effekt auf<br />
das Spiralganglienzellenüberleben, was für einen empfindlicheren Zellmetabolismus der<br />
neuronalen Zellen spricht.<br />
Die Beurteilung der Zellvitalität erfolgte in dieser Studie über die von MARZELLA et al.<br />
(1999) beschriebene Methode, nach welcher nur Zellen als vital bezeichnet wurden, die einen<br />
Neuritenausläufer von der Länge des dreifachen Somadurchmessers aufwiesen. Neben der<br />
Auszählung der durch die beschriebene Methode als vital angesehenen Spiralganglienzellen
122<br />
wäre eine zusätzliche Vitalfärbung denkbar gewesen, um den toxischen Effekt zu<br />
untermauern. Jedoch hätte diese zusätzliche Methode keinen weiteren Erkenntnisgewinn<br />
erbracht und war daher nicht notwendig. Verglichen mit der SGZ-Überlebensrate in den LNC<br />
FITC Rolipram 1:50 behandelten Spiralganglienzellen erwiesen sich die Überlebensraten der<br />
mit 1:200 und 1:300 Verdünnung behandelten Gruppen als signifikant erhöht. Die protektive<br />
Wirkung konnte jedoch mit hoher Wahrscheinlichkeit auf Grund der geringen Konzentration<br />
des Roliprams in diesen Verdünnungen im Vergleich zur 1:100 Verdünnung nicht voll<br />
entfaltet werden.<br />
Ein tendenziell ähnliches Bild zeigte sich bei den mit LNC FITC behandelten Zellen.<br />
Ebenfalls in der 1:100 Verdünnung war ein gegenüber der unbehandelten Negativkontrolle<br />
signifikant gesteigertes Spiralganglienzellüberleben zu verzeichnen, während die 1:50<br />
Verdünnung wiederum den niedrigsten Wert ergab, die 1:200 Verdünnung gegenüber der<br />
Negativkontrolle signifikant erhöht war und die 1:300 Verdünnung nur ein tendenziell<br />
gesteigertes Spiralganglienzellüberleben zeigte. Hierfür mögen ähnliche Erklärungen wie für<br />
die LNC FITC ROLIPRAM Gruppe gelten. Als Besonderheit ist anzumerken, dass die LNC<br />
FITC-Nanopartikel als solche unbeladen sind, das heißt sie trugen kein Arzneimittel in sich,<br />
welches protektiv hätte wirken können. Somit muss der auf das Spiralganglienzellüberleben<br />
positiv wirkende Effekt durch die Nanopartikel bzw. einen ihrer Bestandteile ausgelöst<br />
worden sein. Eine mögliche Erklärung könnte durch die mit Polyethylenglykol (PEG)<br />
modifizierte Oberfläche der Nanopartikel gegeben werden. Hierbei dient PEG zur Maskierung<br />
des Partikels gegenüber dem Komplementsystem des Körpers, was zu einer verminderten<br />
Opsonisierung führt (VONARBOURG et al. 2009; KIM et al. 2010). Weiterhin dient PEG zur<br />
kovalenten Bindung des Fluoreszenzmarkers Fluoreszein-5-isothiocyanat (FITC). LAVERTY<br />
et al. (2004) konnten in einer Studie mit Hunden einen neuroprotektiven Effekt für dieses<br />
Polymer nachweisen, wobei er den protektiven Effekt auf eine Stabilisierung der<br />
Zellmembran zurückführte. Auch SHI und BORGENS konnten bereits im Jahre 1999 am<br />
isolierten Meerschweinchenrückenmark Ähnliches feststellen. So wurde durch die<br />
Applikation von PEG eine Aufnahme von Ethidiumbromid in das Zellinnere der zuvor durch<br />
Kompression beschädigten neuronalen Zellen verhindert. Daraus wurde auf eine regelrechte<br />
Versiegelung der geschädigten Zellmembranen geschlossen. KOOB et al. (2008) beschrieben<br />
die Wirkung ebenfalls als mechanische Reparatur von beschädigten Zellmembranen im
123<br />
spinal-cord injury-Modell. Weiterhin zeigten CHEN et al. (2009) zusätzlich einen positiven<br />
Effekt auf die Membranstabilität von Mitochondrien. So ist es denkbar, dass PEG als<br />
Bestandteil des Nanopartikels zu dem spiralganglienzellprotektiven Effekt der unbeladen<br />
sowie auch der beladenen Nanopartikel geführt hat, indem die Vitalität der Zellen durch eine<br />
länger intakt gehaltene Membran aufrecht erhalten werden konnte. Weiterhin kann aber auch<br />
der Fluoreszenzmarker FITC als Auslöser des neuroprotektiven Effekts vermutet werden.<br />
Eigene Zellkulturversuche konnten jedoch keinen signifikanten Unterschied auf das<br />
Spiralganglienzellüberleben von LNC FITC-Nanopartikeln und unmarkierten LNC BLANK-<br />
Nanopartikeln ermitteln (6.1.4.). Daher wird ein neuroprotektiver Einfluss des PEG als<br />
ursächlich angenommen.<br />
Der Vergleich der Überlebensraten der unbeladenen sowie der mit Rolipram inkorporierten<br />
Nanopartikel lässt darüber hinaus einen signifikanten Unterschied in der Wirksamkeit<br />
zugunsten der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination erkennen. Dieser Unterschied lässt<br />
sich durch die Wirksamkeit des Roliprams erklären, da sich die Partikel nur in dieser<br />
Charakteristik unterscheiden. Obwohl Rolipram in der alleinigen Verabreichung keinen<br />
signifikanten Unterschied zur Negativkontrolle erbrachte, scheint es in der 1:100<br />
Konzentration in Kombination mit den Nanopartikeln einen synergistischen Effekt auf das<br />
Spiralganglienzellüberleben auszuüben. Denkbar wäre hierbei ein verbesserter Transport des<br />
Arzneimittels über die Nanopartikel in das Zellinnere. Die nur tendenziellen Unterschiede der<br />
1:200 und 1:300 Verdünnungen der arzneimittelbeladenen und -unbeladenen<br />
Nanopartikelgruppen untereinander können durch eine zu geringe Konzentration des<br />
Roliprams in diesen Verdünnungen erklärt werden.<br />
Es kann zusammengefasst werden, dass Rolipram in den untersuchten Konzentrationen keine<br />
Steigerung der Überlebensrate der in vitro angezüchteten Spiralganglienzellen hervorgerufen<br />
hat. Dahingegen wurde in Kombination mit den Nanopartikeln ein positiver Effekt des<br />
Roliprams auf das Spiralganglienzellüberleben beobachtet. Da Rolipram seine Wirkung im<br />
Zytoplasma der Zelle entfaltet, kann hinsichtlich der alleinigen Applikation von Rolipram ein<br />
gesteigerter Transport dieses Arzneimittels durch die Nanopartikel in das Zellinnere vermutet<br />
werden.
124<br />
6.1.2 Wirkungen von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BD�F auf<br />
die �euritenlängen der vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen<br />
Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigen bezüglich der Neuritenlängen ein<br />
maximales Auswachsverhalten für die mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen. Die<br />
Verdünnungen von 1:100 sowie 1:200 wiesen dabei einen signifikant erhöhten Wert<br />
verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe auf. Aber auch in der LNC FITC-Gruppe<br />
war ein gesteigertes Neuritenauswachsverhalten in der Verdünnung 1:300 zu erkennen.<br />
Rolipram zeigte als solitär gegebenes Arzneimittel neben der nicht signifikant erhöhten<br />
Spiralganglienzellprotektivität auch in diesem Fall keinen positiven Effekt gegenüber der<br />
Negativkontrolle, wobei aber, wie auch bei der Spiralganglienzellprotektivität, ein<br />
tendenzieller Anstieg der Werte zu erkennen ist. So kann davon ausgegangen werden, dass es<br />
durch die alleinige Applikation von Rolipram, eine zu geringe Aufnahme dieses Arzneimittels<br />
in die Zellen stattgefunden hat.<br />
BDNF zeigte in diesen Versuchen ein tendenzielles, jedoch nicht signifikant gesteigertes<br />
Neuritenauswachsverhalten. Dieses Resultat steht entgegen der Ergebnisse von GILLESPIE<br />
et al. (2001). Auch WEFSTAEDT konnte 2006 ein verlängertes Neuritenauswuchsverhalten<br />
in der entsprechenden Versuchskondition nachweisen. Jedoch wurde von GILLESPIE et al.<br />
(2001) und WEFSTAEDT (2006) zur Kultivierung der Spiralganglienzellen Dulbecco's<br />
Modified Eagle's Medium (DMEM) verwendet, während die Spiralganglienzellen in der<br />
eigenen Studie mit Panserin-Medium (10.2) kultiviert wurden. So ist es möglich, dass<br />
hierdurch die Ergebnisse der Neuritenlängen beeinflusst wurden. Allerdings zeigten die<br />
Ergebnisse eines weiteren eigenen Zellkulturversuchs (5.1.5) ebenfalls verlängerte<br />
Neuritenlängen in der BDNF-Kondition, wobei auch hier Panserin verwendet wurde und<br />
somit als Ursache ausgeschlossen werden kann.<br />
Eine deutliche Verkürzung der Neuriten zeigen die mit hochkonzentrierter<br />
Nanopartikellösung (1:50) behandelten Zellen. Sowohl die mit LNC FITC behandelten Zellen<br />
als auch die mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen wiesen verkürzte Neuritenlängen<br />
auf. Der Vergleich der Neuritenlängen dieser beiden Gruppen zeigt ein signifikant erhöhtes<br />
Auswachsverhalten für die mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen. Hierbei lässt sich<br />
der Unterschied wiederum durch das in den LNC FITC ROLIPRAM-Partikeln vorhandene
125<br />
Rolipram erklären, welches solitär keinen signifikanten Effekt erzielt, in Kombination mit<br />
dem Nanopartikel aber eine gesteigerte positive Wirkung auf das Neuritenauswachsverhalten<br />
auszuüben vermag. So zeigt der Vergleich zwischen den mit LNC FITC ROLIPRAM<br />
behandelten Zellen in den Konzentrationen 1:100 und 1:200 ein signifikant erhöhtes<br />
Auswachsverhalten gegenüber der Negativkontrolle. Da die mit LNC FITC behandelten<br />
Zellen in den entsprechenden Verdünnungen kein gesteigertes Neuritenauswachsverhalten zur<br />
Negativkontrolle zeigen, kann angenommen werden, dass der positive Effekt durch das<br />
Rolipram hervorgerufen wird, da es sich hierbei um den einzigen Unterschied zwischen den<br />
beiden Experimentalgruppen handelt. Jedoch konnte zwischen den Neuritenlängen der<br />
anderen Verdünnungsgruppen (1:50 und 1:300) kein signifikanter Unterschied festgestellt<br />
werden, was gegen diese Überlegung spricht. Der grundlegende Mechanismus, welcher zu<br />
einem gesteigerten Neuritenwachstum führt, ist letztlich nicht vollständig aufgeklärt. So soll<br />
der Aufbau des Aktinzytoskeletts eine Schlüsselposition im Bezug auf das neuronale<br />
Auswachsverhalten haben (GALLO u. LETOURNEAU 1999).<br />
Für das Neurotrophins BDNF ist bekannt, dass seine Bindung an den p75-Rezeptor zu einer<br />
Inaktivierung der guanosine triphosphate-(GTP)-ase ras homolog gene family, member A<br />
(RhoA) führt, welche modulatorische Eigenschaften gegenüber dem Zytokinskelett aufweist.<br />
So zeigten frühere Studien, dass eine Hemmung dieses Enzyms zu einem gesteigerten<br />
Auswachsverhalten der Neuriten führt (YAMASHITA et al. 1999). Jedoch kann dieser<br />
Mechanismus nicht auf die Wirkungsweise des Roliprams übertragen werden, da dieses im<br />
Zellinneren wirkt und nicht wie BDNF an zellmembranständige Rezeptoren bindet. Neuere<br />
Studien belegten jedoch ein verstärktes Neuritenauswachsverhalten kultivierter Motoneurone<br />
durch die Applikation von Rolipram. Hierbei wird die cAMP-abhängige Aktivierung der<br />
Proteinkinase A als ursächlich für ein nicht näher beschriebenes, gesteigertes<br />
Neuritenauswachsverhalten angenommen (AGLAH et al. 2008).<br />
Weiterhin mag die gesteigerte Vitalität der Zellen gleichzeitig zu einem positiv korrelierten<br />
Auswachsverhalten führen. So ist anzunehmen, dass positive Effekte auf das Zellüberleben<br />
über einen generell optimierten Zellmetabolismus auch in der Länge der Neuriten sichtbar<br />
werden. So wurde für die LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe in der Verdünnung 1:100 die nach<br />
der BDNF-Gruppe beste Überlebensrate sowie das längste Neuritenwachstum beobachtet,<br />
was diese These untermauern könnte. Die vergleichsweise geringen Neuritenlängen der mit
126<br />
BDNF behandelten Zellen mögen durch eine sehr hohe Spiralganglienzelldichte, welche bei<br />
BDNF in allen Versuchsansätzen das Maximum bildete, beeinflusst worden sein. Die hohe<br />
Überlebensrate könnte eine Minderversorgung von Nährstoffen nach sich gezogen haben,<br />
weshalb es zu einer verkürzten Ausbildung der Neuriten gekommen sein könnte.<br />
6.1.3 Effekte von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BD�F auf die<br />
Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen<br />
Durch die Vermessung der Somadiameter wurden im Vergleich zur Negativkontrolle nur in<br />
der mit LNC FITC behandelten Zellgruppe in der Verdünnung 1:50 signifikant verkleinerte<br />
Somadiameter festgestellt. Der verkleinerte Somadurchmesser lässt sich durch den negativen<br />
Einfluss der hohen Nanopartikelkonzentration erklären, wobei analog in den mit LNC FITC<br />
ROLIPRAM (1:50) behandelten Zellen kein signifikanter aber dennoch tendenziell<br />
verringerter Somadiameter zu verzeichnen war. Hierbei ist wahrscheinlich, dass das Rolipram<br />
den negativen Einfluss des LNC FITC kompensieren konnte und so zu einem vergleichsweise<br />
größeren Somadurchmesser führte.<br />
Entgegen anderen Studien zeigte auch BDNF in diesem Versuch keine signifikante<br />
Vergrößerung des Somadiameters. SHEPHERD et al. konnten im Jahr 2005 eine<br />
Vergrößerung des Somadiameters nach BDNF-Behandlung beobachten. Auch AGTERBERG<br />
et al. zeigten im Jahre 2009 eine Vergrößerung der Somadiameter im Vergleich zur<br />
Kontrollkondition. Andere Studien hingegen ermittelten nach BDNF-Therapie Somadiameter,<br />
die denen der Versuchskontrolle ähnlich waren (MCGUINNES u. SHEPHERD 2005;<br />
HAVENITH et al. 2011), was sich mit den Ergebnissen der eigenen Zellkulturexperimente<br />
deckt.<br />
Letztlich ist auch in diesem Fall der grundlegende Mechanismus, welcher zu einer<br />
Vergrößerung des Somadurchmessers nach der Behandlung mit neurotrophen Faktoren führt,<br />
nicht geklärt (SCHEPER et al. 2009a). Folglich ist eine endgültige Bewertung dieses<br />
erhobenen Parameters momentan nicht möglich, dennoch erlaubt er Rückschlüsse auf die<br />
Vitalität der Spiralganglienzellen, da eine Anschwellung oder Schrumpfung eine veränderte<br />
biologische Funktion vermuten lässt.
127<br />
6.1.4. Bewertung der Auswirkungen der �anopartikel-Komponenten auf das Überleben<br />
von vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen durch die vergleichende Behandlung der<br />
Spiralganglienzellen mit L�C FITC, L�C BLA�K sowie BD�F<br />
In diesem Versuch sollte der in den vorhergehenden Versuchen ermittelte protektive Effekt<br />
der unbeladenen Nanopartikel (LNC FITC) genauer untersucht werden. Hypothetisch<br />
kommen für diesen Effekt zwei Komponenten der Lipidnanokapseln in Frage: der<br />
Fluoreszenzmarker Fluoreszein-5-isothiocyanat (FITC) und das Polyethylenglycol (PEG).<br />
Für diesen Zusatzversuch wurden die Auswirkungen der Arzneimittel-unbeladenen LNC<br />
FITC-Nanopartikel mit den ebenfalls unbeladenen sowie auch nicht fluoreszenzmarkierten<br />
LNC BLANK-Nanopartikeln auf das Spiralganglienzellüberleben verglichen. Da sich die<br />
1:50 Verdünnung im ersten Zellkulturversuch negativ auf das Spiralganglienzellüberleben<br />
ausgewirkt hatte, wurden jeweils nur die Verdünnungen 1:100, 1:200 und 1:300 verwendet.<br />
Das höchste Spiralganglienzellüberleben bei der mit LNC FITC behandelten Zellgruppe<br />
zeigte sich in der 1:100 Verdünnung. In der 1:200 sowie 1:300 Verdünnung war kein<br />
signifikant erhöhtes Spiralganglienzellüberleben zu beobachten, wobei aber ein tendenzieller<br />
Abwärtstrend analog zu den Ergebnissen des ersten Zellkulturversuches erkennbar war. Die<br />
ermittelten Werte der mit LNC BLANK behandelten Zellen zeigten ein ähnliches Bild, wobei<br />
auch hier in der 1:100 Verdünnung das signifikant höchste Spiralganglienzellüberleben zu<br />
verzeichnen war. Das Überleben der mit 1:200 und 1:300 Konzentration behandelten Zellen<br />
erwies sich hingegen als niedriger, aber dennoch signifikant erhöht gegenüber der Kontrolle.<br />
Untereinander waren in Bezug auf das Spiralganglienzellüberleben keine signifikanten<br />
Unterschiede hinsichtlich einer gesteigerten Protektion der LNC BLANK Partikel gegenüber<br />
den mit FITC markierten Partikeln erkennbar. Tendenziell wurden durch die Verwendung der<br />
unmarkierten Partikel sogar bessere Ergebnisse erzielt, was auf einen negativen Einfluss des<br />
Fluoreszenzmarkers auf das Spiralganglienzellüberleben deuten kann, da sich die<br />
Experimentalgruppen nur in dieser Eigenschaft unterschieden. So konnte in diversen Studien<br />
die anaphylaktische Potenz des FITC nachgewiesen werden (KINSELLA u. MOONEY 1988,<br />
GOMEZ-ULLA et al. 1991, EL HARRAR et al. 1996), was im Haptencharakter dieses<br />
Fluoreszenzfarbstoffs begründet liegt (HVID et al. 2009). Ob sich jedoch dadurch ein<br />
negativer Einfluss auf das Spiralganglienzellüberleben in vitro erklären ließe, ist durch die in
128<br />
der Zellkultur fehlenden Immunzellen unwahrscheinlich. Weiterhin sind in der Literatur keine<br />
Angaben zu einer FITC-vermittelten Toxizität zu finden.<br />
Zusammenfassend kann vermutet werden, dass der spiralganglienzellprotektive Effekt durch<br />
die Nanopartikel selber, bzw. durch einen ihrer Bestandteile vermittelt werden und nicht<br />
durch den Fluoreszenzmarker FITC. Als eine mögliche Erklärung kann Polyethylenglykol<br />
(PEG) als Bestandteil der Oberfläche der Nanopartikel in Betracht gezogen werden. So nahm<br />
LAVERTY et al (2004) einen zellmembranstabilisierenden Effekt an, was den positiven<br />
Einfluss auf die Spiralganglienzellen erwirkt haben könnte. Auch SHI und BORGENS (1999)<br />
sowie KOOB et al. (2008) kamen zu entsprechenden Ergebnissen. Darüber hinaus wiesen<br />
CHEN et al. im Jahre 2009 auch einen protektiven Effekt auf die Membranintegrität von<br />
Mitochondrien nach (6.1.1).<br />
6.1.5 Auswirkungen von L�C FITC, L�C BLA�K sowie BD�F auf das<br />
�euritenauswachsverhalten sowie den Somadiameter von kultivierten<br />
Spiralganglienzellen<br />
In diesem Versuch zeigten sich signifikant erhöhte Neuritenlängen in allen<br />
Versuchskonditionen im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Die Behandlung der<br />
Zellen mit einer Verdünnung von 1:200 im Falle der LNC FITC- sowie der LNC BLANK-<br />
Gruppe bewirkte das längste Neuritenauswachsverhalten. Im Gegensatz zu der LNC FITC-<br />
Gruppe induzierte die Zugabe von unmarkierten Partikeln ein besseres Auswachsverhalten.<br />
Da sich die Partikelgruppen, wie zuvor beschrieben, nur durch die Fluoreszenzmarkierung<br />
unterschieden, besteht die Annahme, dass der negative Effekt durch den Fluoreszenzmarker<br />
Fluoreszein-5-isothiocyanat (FITC) bedingt sein könnte. Eine ursächliche Erklärung erscheint<br />
wie bei der Betrachtung des Spiralganglienzellüberlebens schwierig (6.1.4).<br />
Alle anderen Verdünnungen führten zu geringeren aber dennoch signifikant erhöhten<br />
Neuritenlängen verglichen mit der Kontrollkondition. Die Zugabe von BDNF (50 ng/ml)<br />
verursachte ebenfalls ein signifikant erhöhtes Auswachsverhalten, wie es auch durch<br />
GILLESPIE et al. (2001) nachgewiesen wurde.
129<br />
Bei den ermittelten Somadiametern zeigten sich, ähnlich wie im ersten Zellversuch, bei der<br />
vergleichenden Betrachtung, keine signifikanten Unterschiede. Von einer weiterführenden<br />
Diskussion wird daher abgesehen und hierfür auf Kapitel 6.1.3 verwiesen.<br />
6.1.6 Wirkung von ROLIPRAM, L�C FITC ROLIPRAM, L�C BLA�K und L�C<br />
FITC auf die LPS-induzierte T�F-α-Sekretion dendritischer Zellen<br />
Dieser Versuch sollte neben der Wirkung des Roliprams auf die dendritischen Zellen auch<br />
eine Aussage zur Freisetzung des Roliprams aus der Nanopartikel-Rolipram-Kombination<br />
liefern. Weiterhin können Rückschlüsse auf die Hemmung von entzündungsbedingten<br />
Prozessen gezogen werden. So produzieren die dendritischen Zellen (DC) neben ihrer<br />
Aufgabe als klassische Antigen-präsentierende Zellen, nach der Aktivierung auch eine Reihe<br />
von Zytokinen, welche eine zentrale Rolle im Entzündungsprozess spielen. Über die<br />
Sekretion des Zytokins TNF-α kommt es dabei zu einer Vielzahl von entzündungsrelevanten<br />
Prozessen, wobei TNF-α im Rahmen von lokalen und systemischen Entzündungsreaktionen<br />
eine zentrale Funktion als pleiotropes, proinflammatorisches Zytokin aufweist. Neben<br />
weiteren Zytokinen wie IL-1α, IL-1ß und Interferon-γ stellt TNF-α einen wichtigen Mediator<br />
der nicht-adaptiven Immunantwort dar (ABBAS et al. 2005). TNF-α dient als Signalmolekül,<br />
um die Aktivität unterschiedlichster Immunzellen zu modulieren. Des Weiteren führt die<br />
Sekretion von TNF-α zu einer Neubildung von Adhäsionsmolekülen wie dem Inter-Cellular<br />
Adhesion Molecule-1 (ICAM-I), wodurch die Diapedese von Granulozyten und Monozyten<br />
aus dem Blutstrom in die betroffenen Gewebe ermöglicht wird (WUNG et al. 2005). Letztlich<br />
sollen diese Mechanismen zur Eliminierung der auslösenden Noxe führen, wobei parallel aber<br />
die klassischen Entzündungssymptome auftreten. Weiterhin zeigt sich auch ein<br />
proliferationsverstärkender Effekt auf Fibroblasten (POSTLETHWAITE u. KANG 1983).<br />
Neben Makrophagen und Monozyten, welche als Hauptproduzenten dieses Zytokins gelten,<br />
können auch andere Zellen, wie beispielsweise dendritische Zellen, neutrophile Granulozyten<br />
oder Endothelzellen TNF-α freisetzen (HIGUCHI et al. 1990).<br />
Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigten, dass durch die Inkubation mit Rolipram<br />
die LPS-induzierte TNF-α-Bildung in allen verwendeten Konzentrationen (0,01 µM, 0,1 µM;
130<br />
1 µM; 10 µM) signifikant zur Kontrollgruppe verringert werden konnte. Hierbei war ein<br />
dosisabhängiger Abfall der TNF-α-Produktion zu erkennen. Die ermittelten Ergebnisse stehen<br />
im Einklang mit den Resultaten von HEYSTEK und Kollegen (2003), welche in Versuchen<br />
mit LPS-stimulierten humanen DC nach Rolipram-Behandlung ebenfalls einen<br />
dosisabhängigen Abfall der TNF-α-Konzentration beobachten konnten. Somit konnten die in<br />
der vorliegenden Studie ermittelten Ergebnisse neben der detektierten neuronalen<br />
Protektivität des Roliprams auch einen Einfluss des Arzneimittels auf den Ablauf des<br />
Entzündungsgeschehens belegen. Durch die Verringerung der TNF-α-Konzentration können<br />
die Symptome der Entzündung abgeschwächt werden. In Kombination mit Cochlea-<br />
Implantaten könnte Rolipram somit zu einer Verringerung oder sogar Hemmung des<br />
entzündungsbedingten, postoperativen Bindegewebswachstums führen.<br />
Die mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen wiesen eine insgesamt tendenziell<br />
abfallend zu bewertende TNF-α-Konzentration auf, wobei sich im Gegensatz zu den mit<br />
0,01 µM und 0,1 µM LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen durch die Inkubation mit<br />
1 µM LNC FITC ROLIPRAM ein signifikanter Abfall der Zytokinproduktion verzeichnen<br />
ließ. Die mit 10 µM Nanopartikel-Lösung (LNC FITC Rolipram, LNC BLANK und LNC<br />
FITC) behandelten Zellen zeigten zellmorphologische Veränderungen im mikroskopischen<br />
Bild sowie im Vitalitätstest eine deutlich verminderte Lebensfähigkeit. Dies erklärt den bei<br />
Anwendung dieser Nanopartikelkonzentrationen ermittelten signifikant erniedrigten<br />
Zytokinwert. Hinzuzufügen ist, dass die hohen Werte der photometrischen Auswertung bei<br />
LNC FITC ROLIPRAM 10 µM und LNC FITC 10 µM (10.7) nicht auf eine Umfärbung des<br />
gelblichen Methyltetrazoliums zu dem violetten Formazonfarbstoff zurückzuführen waren,<br />
sondern durch die hohe Konzentration des an den Nanopartikel gebundenen<br />
Fluoreszenzmarkers beeinflusst wurden. Das mikroskopische Bild zeigte abgestorbene Zellen<br />
und Kristallbildungen, des Weiteren fand kein Farbumschlag statt, welcher das<br />
Vorhandensein von vitalen Zellen signalisierte. Dennoch konnte gezeigt werden, dass durch<br />
die Inkubation mit 1 µM LNC FITC ROLIPRAM genug Rolipram freigesetzt wird, um eine<br />
signifikante Hemmung der TNF-α-Produktion zu erreichen, ohne dabei zelltoxische Effekte<br />
auszulösen. Zudem ähnelt das Gesamtbild der mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten<br />
Zellen durch den dosisabhängigen Abfall der TNF-α-Konzentration stark dem Bild der mit<br />
ROLIPRAM behandelten Zellen. Hierbei ist aber eine deutlich schwächere Wirkung zu
131<br />
erkennen, was auf eine geringe Freisetzung des Roliprams aus den Nanopartikeln schließen<br />
lässt.<br />
Durch die Inkubation mit Arzneimittel-unbeladenen und unmarkierten LNC BLANK<br />
Nanopartikeln konnte in der 1 µM Konzentration eine signifikante, wenn auch relativ geringe<br />
inhibitorische Wirkung auf die TNF-α-Produktion erkannt werden, während die niedrigeren<br />
Konzentrationen (0,01 µM; 0,1 µM) keinen hemmenden Effekt erzielten. Die entsprechenden<br />
Parameter des Vitalitätstests gaben im Fall der 1 µM Konzentration keinen Hinweis auf eine<br />
herabgesetzte Lebensfähigkeit der DC, und auch kein inkorporiertes Arzneimittel kann<br />
ursächlich für die Hemmung der TNF-α-Produktion in Frage kommen. Als mögliche<br />
Erklärung kann eine durch Streuung gegebene Abweichung der Messwerte nicht<br />
ausgeschlossen werden. Trotz der statistischen Signifikanz ist die biologische Signifikanz<br />
fraglich (etwa 16 % Inhibition im Vergleich zur Positivkontrolle). Weiterhin wurde auch für<br />
diese Nanopartikelgruppe im Vitalitätstest ein deutlich toxischer Effekt in der 10 µM<br />
Konzentration nachgewiesen, wodurch der hierbei gemessene signifikant erniedrigte TNF-α-<br />
Wert erklärt werden kann.<br />
Ein ähnliches Bild zeigt auch die Behandlung der DC mit den Arzneimittel-unbeladenen,<br />
fluoreszenzmarkierten LNC FITC Nanopartikeln. Hierbei trat ebenfalls eine aufgrund<br />
zytotoxischer Effekte hervorgerufene signifikante Erniedrigung der TNF-α-Konzentration in<br />
der mit 10 µM LNC FITC behandelten Zellgruppe auf, wobei die Inkubation mit den übrigen<br />
Konzentrationen (0,01 µM; 0,1 µM; 1 µM) keine Signifikanzen im Vergleich zu den nur mit<br />
LPS-behandelten Zellen lieferten.<br />
Zur Beurteilung der Wirksamkeit der Arzneimittel-Nanopartikel Kombination LNC FITC<br />
ROLIPRAM eignet sich die gesonderte Betrachtung der in den 1 µM Konzentrationen<br />
ermittelten TNF-α-Werte. Begründet wird dies in der Feststellung, dass die verwendeten<br />
Nanopartikel in keiner Gruppe (LNC FITC ROLIPRAM, LNC BLANK, LNC FITC) eine<br />
signifikante Hemmung der TNF-α-Konzentration durch die Behandlung mit den<br />
Konzentrationen von 0,01 µM und 0,1 µM erzielten, was durch eine zu geringe Dosierung<br />
begründet werden kann. Die ermittelten TNF-α-Werte der mit 10 µM Nanopartikellösungen<br />
behandelten Zellen eignen sich für diesen Vergleich aufgrund der beobachteten zytotoxischen<br />
Effekte ebenfalls nicht. In der Konzentration 1 µM konnte die ROLIPRAM-Gruppe die<br />
signifikant beste Hemmung der TNF-α-Produktion erzielen. Die mit LNC FITC ROLIPRAM
132<br />
behandelten Zellen zeigten ebenfalls eine deutliche Inhibierung der TNF-α-Sekretion. Diese<br />
Wirkung kann nur durch eine Freisetzung des Roliprams aus den Partikeln erklärt werden, da<br />
im Vergleich zu den Arzneimittel-unbeladenen Nanopartikeln (LNC BLANK, LNC FITC)<br />
eine deutliche Erniedrigung des TNF-α-Wertes erkennbar war. Dennoch konnte die<br />
Verwendung der LNC FITC ROLIPRAM-Nanopartikel nicht die Effizienz der ROLIPRAM-<br />
Behandlung erreichen, obwohl die verwendete Konzentration des Roliprams in beiden<br />
Gruppen identisch war. Daraus kann auf eine Freisetzung des Arzneimittels aus den<br />
Nanopartikeln geschlossen werden, die nicht der Rolipramkonzentration entsprach, die als<br />
freies Arzneimittel zu den Zellen gegeben wurde.<br />
Die Überlegung, dass die Nanopartikel an sich eine verstärkte Stimulation der DC und in der<br />
Folge eine erhöhte TNF-α-Sekretion erzeugen und darüber die geringere TNF-α-Inhibition im<br />
Vergleich zur ROLIPRAM-Gruppe erklärt werden könnte, kann durch die Betrachtung der<br />
ermittelten TNF-α-Werte der Arzneimittel-unbeladenen Nanopartikel (LNC BLANK, LNC<br />
FITC) widerlegt werden. Die dort ermittelten TNF-α-Konzentrationen wiesen gegenüber der<br />
unbehandelten LPS-stimulierten Kontrolle sogar tendenziell geringere Werte auf. Durch die<br />
unbeladenen Nanopartikel wurde in den hier verwendeten Konzentrationen keine gesteigerte<br />
Aktivität der DC festgestellt. Diese Beobachtung liefert eine wichtige Erkenntnis für den<br />
Einsatz im lebenden Organismus, da Entzündungsprozesse gerade im Zusammenhang mit<br />
Cochlea-Implantaten zu erheblichen Nachteilen führen. Weiterhin zeigte sich, dass die<br />
unbeladenen Partikel keine Hemmung der TNF-α Bildung bewirkten und somit auch hier ein<br />
Einfluss durch die Nanopartikel selbst ausgeschlossen werden kann. Eine Ausnahme bildet<br />
der für die mit 1 µM LNC BLANK behandelten Zellen ermittelte Wert, wobei die ermittelte<br />
Signifikanz weder durch eine herabgesetzte Vitalität der Zellen noch durch ein inkorporiertes<br />
Arzneimittel hervorgerufen sein konnte. Dennoch weist diese Beobachtung aber gegenüber<br />
der TNF-α-Konzentration für die mit 1 µM LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen einen<br />
hoch signifikant erhöhten Wert auf. Auch die mit 1 µM LNC BLANK behandelten Zellen<br />
zeigten eine deutlich signifikant höhere TNF-α-Produktion. Damit zeigt sich für die LNC<br />
FITC ROLIPRAM-Kombination eine signifikant bessere Hemmung der TNF-α-Produktion<br />
verglichen mit den unbeladenen Nanopartikeln, wobei dieser Effekt auf eine biologisch<br />
wirksame Freisetzung des Roliprams zurückgeführt werden kann.
133<br />
Des Weiteren konnte über den durchgeführten Vitalitätstest gezeigt werden, dass alle zuvor<br />
beschriebenen Effekte der Testsubstanzen auf die TNF-α-Produktion nicht durch eine<br />
verminderte Zellvitalität beeinflusst wurden. Davon ausgenommen sind jedoch die<br />
Beobachtungen, welche durch die 10 µM Nanopartikellösungen (LNC FITC ROLIPRAM,<br />
LNC BLANK, LNC FITC) hervorgerufen wurden (10.7).<br />
Die in dem Versuch mit dendritischen Zellen ermittelten Ergebnisse belegen, dass sich der<br />
Phosphodiesterase-Inhibitor Rolipram zur Hemmung der TNF-α- Produktion eignet, wodurch<br />
vorherige Ergebnisse unter Verwendung von humanen DC bestätigt wurden (HEYSTECK et<br />
al. 2003). Zusätzlich bestätigen die Ergebnisse die Hypothese, dass sich Lipidnanokapseln als<br />
Applikationssystem für diesen Arzneistoff eignen, da sie das Rolipram in einer biologisch<br />
wirksamen Konzentration freisetzen, wenngleich die Effizienz der direkten Applikation nicht<br />
erreicht werden konnte.<br />
Wie eingangs dargestellt (3.4.3), wird angenommen, dass Phosphodiesterase-4-Inhibitoren die<br />
Aktivierung des Transkriptionsfaktors nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated<br />
B-cells (NF-κB) hemmen, indem die Phosphorylierung des nuclear factor of kappa light<br />
polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor alpha (IκBα) durch cAMP-abhängige<br />
Proteinkinasen verhindert wird (DEREE et al 2008). Durch die Hemmung des NF-κB wird<br />
die Transkription von proinflammatorischen Zytokinen wie TNF-α verhindert. Aber auch eine<br />
cAMP-induzierte Aktivierung des Transkriptionsfaktors cAMP responsive element binding<br />
protein (CREB) wird als weitere Ursache für den antiinflammatorischen Effekt von<br />
Phosphodiesterase-4-Hemmern zugrundegelegt. So wird eine kompetetive Hemmung des NF-<br />
κB über die Konkurrenz zu dem Kostimulator CREB binding protein (CBP) vermutet, an<br />
welchen auch CREB bindet (DEREE et al. 2008). Darüber hinaus spielt auch der Einfluss von<br />
Phosphodiesterase-4-Hemmern auf das mitogen activated protein (MAP)-Kinasesystem eine<br />
Rolle, welches zentrale Bedeutung in der Expression von Zytokinen hat (KWAK et al. 2005).
6.2 Bewertung der In-vivo-Ergebnisse<br />
134<br />
6.2.1 Bewertung der Auswirkungen der unterschiedlichen Testsubstanzen auf das<br />
Überleben von Spiralganglienzellen in ertaubten Cochleae<br />
Hinsichtlich des Vergleichs zwischen den ermittelten Spiralganglienzelldichten der linken<br />
und rechten Cochleae ergab sich in den mit den Nanopartikeln (LNC FITC, LNC FITC<br />
ROLIPRAM) sowie in der mit Rolipram behandelten Tiergruppe kein signifikanter<br />
Unterschied. Nur die beidseitig mit PBS behandelten Tiere zeigten im Mittel einen signifikant<br />
erhöhten Dichtewert der rechtsseitigen Cochleae. Bei allen Tieren wurde die linke Seite mit<br />
der jeweiligen Testsubstanz behandelt, während rechtsseitig lediglich PBS als Kontrolle<br />
injiziert wurde. Der Wert der Kontrollseite spiegelt die vorhandene Spiralganglienanzahl nach<br />
21 Tagen Ertaubung wider, wobei der Unterschied zur behandelten linken Seite die<br />
Effektivität der jeweiligen Testsubstanz auf die Erhaltung der Spiralganglienzellen erkennen<br />
ließ. Auch im Vergleich der Spiralganglienzelldichten der linken Ohren untereinander war<br />
kein Unterschied zwischen den Gruppen ersichtlich. Dies steht im Gegensatz zu der eingangs<br />
formulierten Hypothese mittels Rolipram oder in Nanopartikeln inkorporiertem Rolipram eine<br />
neuroprotektive Wirkung gegenüber einer nach initialem Haarzellverlust eintretenden<br />
Spiralganglienzelldegeneration zu erwirken.<br />
Die Ergebnisse der eigenen Zellversuche zeigten positive Eigenschaften der Nanopartikel-<br />
Rolipram-Kombination LNC FITC ROLIPRAM sowie auch der Arzneimittel-unbeladenen<br />
Nanopartikel LNC FITC auf die Überlebensrate der neuronalen Zellen und bildeten die<br />
Grundlage der genannten Hypothese. Im In-vitro-Versuch schien die alleinige Gabe von<br />
Rolipram zumindest zu einer tendenziellen Verbesserung der Überlebensrate zu führen. Diese<br />
positiven, in den Zellversuchen erzielten Ergebnisse, konnten innerhalb der<br />
Tierversuchsstudie nicht reproduziert werden.<br />
Möglicher Grund für diese Ergebnisse kann eine zu geringe Konzentration der verwendeten<br />
Substanzen sein. So zeigte sich im Zellversuch die stärkste protektive Wirkung der LNC<br />
FITC- und LNC FITC ROLIPRAM-Nanopartikel bei einer Verdünnung der Stammlösung<br />
von 1:100, in welcher 0,19 µg/ml Rolipram enthalten war. Um mögliche toxische Effekte auf<br />
die Zellen des Innenohres auszuschließen, welche sich im Zellversuch in der 1:50
135<br />
Verdünnung gezeigt haben, wurde die Verwendung einer höheren Konzentration im<br />
Tiermodell vermieden. Trotzdem können die im Organismus vorherrschenden Gegebenheiten<br />
nicht direkt mit den Beschaffenheiten in der Zellkultur verglichen werden. Vor allem durch<br />
die Perilymphe in der Scala tympani könnte es zu einer weiteren Verdünnung gekommen<br />
sein, was das im Zellversuch ermittelte Wirkpotenzial der Testsubstanzen verringert haben<br />
könnte. Auch ein Abtransport der injizierten Substanzen über den Perilymphgang (Ductus<br />
perilymphaticus), der die Scala tympani mit dem Liquorraum verbindet, könnte eine zu<br />
geringe Konzentration der wirksamen Substanzen zur Folge gehabt haben.<br />
Eine weitere mögliche Erklärung für die Diskrepanz der durch die Zellkultur und die<br />
Tierversuche ermittelten Daten könnte die Verwendung unterschiedlicher Tierarten sein. So<br />
wurden die Spiralganglienzellen der Zellkulturexperimente aus neugeborenen Ratten<br />
gewonnen. Diese Methode ist für die hier bearbeiteten Fragestellungen etabliert und in der<br />
Literatur vielfach beschrieben (LEFEBVRE et al. 1991, ALETSEE et al. 2000, WEFSTEDT<br />
2006, WARNECKE et al. 2010). Für die Tierversuche wurden hingegen Meerschweinchen<br />
verwendet, die ebenfalls als anerkanntes Modell für die Untersuchung von hypothetischen<br />
spiralganglienzellprotektiven Substanzen verwendet wurden (KANZAKI et al. 2002,<br />
GILLESPIE et al. 2003, YAMAGATA et al. 2004, WARNECKE et al. 2010). Zudem sind<br />
unterschiedliche trophische Bedürfnisse sowie eine Veränderung in der Rezeptorenexpression<br />
zwischen neonatalen und adulten Spiralganglienzellen wahrscheinlich (GILLESPIE et al.<br />
2003), sodass die Zusammensetzung der Testsubstanzen im Organismus unter Umständen<br />
nicht mehr adäquat gewesen sein könnte.<br />
Eine andere Erklärung für den nicht signifikanten Unterschied zwischen behandelter und<br />
unbehandelter Seite, mag hinsichtlich der LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe eine zu geringe<br />
Freisetzung des Arzneimittels Rolipram gewesen sein. Im Rahmen der Versuche mit<br />
dendritischen Zellen konnte eine Freisetzung des Arzneimittels aus den Partikeln<br />
nachgewiesen werden, die aber geringer war als die Applikation von reinem Rolipram in der<br />
mit den Partikeln verwendeten analogen Konzentration. Das alleinig applizierte Rolipram<br />
erzielte hierbei eine stärkere Hemmung der TNF-α-Sekretion. Somit könnte ein auf die<br />
Spiralganglienzellen potenziell wirksamer Effekt aufgrund einer zu geringen Dosis<br />
unterblieben sein. Gegen diese Überlegung spricht, dass die Nanopartikel als solches auch<br />
einen neuroprotektiven Effekt in Zellkultur gezeigt haben. Dieser ist vermutlich auf den
136<br />
Bestandteil Polyethylenglykol (LAVERTY et al. 2004) zurückzuführen und auch bei einer<br />
verminderten Freisetzung des Roliprams hätte ein Effekt durch die Nanopartikel selber<br />
detektierbar sein müssen.<br />
Letztlich spielt auch die Applikationsdauer eine wesentliche Rolle. Die Versuchsansätze der<br />
dendritischen Zellen betrugen nur 24 Stunden. Der Zeitabstand zwischen der Behandlung der<br />
ertaubten Tiere und dem Ende jedes In-vivo-Experiments betrug 14 Tage. Es sind keine Daten<br />
über die intrazelluläre Freisetzungskinetik des Roliprams aus den Lipidnanokapseln bekannt,<br />
sodass eine Aussage über eine vollständige Freisetzung des Arzneimittels nach 14 Tagen<br />
nicht möglich ist. WOLF (2009) konnte zeigen, dass LNC FITC-Nanopartikel noch vier<br />
Wochen nach intracochleärer Applikation in den Zellen der Cochlea nachzuweisen waren.<br />
Die verwendeten Partikel waren in diesem Fall aber mit keinem Transportgut ausgestattet,<br />
weshalb über einen beginnenden Abbau der Nanopartikel und einer damit einsetzenden<br />
Freisetzung des Transportguts keine Aussagen getroffen werden konnten.<br />
Die Verwendung von osmotischen Pumpen zur dauerhaften Applikation der verwendeten<br />
Testsubstanzen wurde bewusst nicht gewählt. So sollte ein Vergleich zwischen der<br />
einmaligen Applikation des alleinig gegebenen Roliprams im Vergleich zu dem einmalig, im<br />
Nanopartikel inkorporiertem Rolipram durchgeführt werden. So wäre ein positiver Effekt<br />
durch eine längerfristige Abgabe aus dem Nanopartikel gegensätzlich zur alleinigen<br />
Applikation des Roliprams denkbar gewesen. Die Verwendung osmotischer Pumpen hätte<br />
diesen Vergleich nicht zugelassen. Die einmalige Applikation der Testsubstanzen könnte<br />
einen, den protektiven Effekt des Roliprams aufhebenden Mechanismus in Gang gesetzt<br />
haben. GILLESPIE et al. (2003) konnten nachweisen, dass sich die Spiralganglienzelldichte<br />
nach dem Aussetzen einer neuroprotektiven Behandlung mit BDNF bereits nach zwei<br />
Wochen der Spiralganglienzellanzahl der über einen Zeitraum von sechs Wochen<br />
unbehandelten Kontrollseite angepasst hat. Die Beobachtungen zeigten also eine wesentlich<br />
beschleunigte Spiralganglienzelldegeneration der zuvor behandelten Seite. Die<br />
zugrundeliegenden Ursachen für diesen Effekt sind letztlich nicht geklärt. So vermuten<br />
MILLER et al. (1997) einen indirekt protektiven Effekte von BDNF über die Einwirkung auf<br />
Bindegewebszellen. Diese werden über den neurotrophen Faktor angeregt und setzen dadurch<br />
wiederum nicht näher beschriebene neuroprotektive Substanzen frei. Hierüber kommt es<br />
neben der direkten Wirkung von BDNF auf die Spiralganglienzellen zu einer zusätzlichen
137<br />
Protektion, was aufgrund einer vermehrten Dichte von Bindegewebszellen in mit BDNF<br />
behandelten Cochleae angenommen wurde. Bei einem Therapieabbruch kommt es durch den<br />
Verlust des direkt wirkenden BDNF sowie durch den zusätzlichen Verlust der von den<br />
Bindegewebszellen sezernierten Faktoren zu einer deutlich gesteigerten<br />
Spiralganglienzelldegeneration, so die Hypothese. Geht man nun davon aus, dass die in dieser<br />
Arbeit verwendeten Testsubstanzen zunächst einen protektiven Effekt gezeigt haben, so<br />
könnte man auf eine schnellere Degeneration der Spiralganglienzellen im Anschluss daran<br />
schließen, da die Therapie nach der einmaligen Behandlung, wie bei GILLESPIE et al.<br />
(2003), als beendet angesehen werden kann. Studien von AGTERBERG et al. 2009 hingegen<br />
konnten den von GILLESPIE et al. (2003) beschriebenen Effekt nicht nachweisen. So wurde<br />
hierbei für den Zeitraum der Studie von zwei Wochen eine anhaltende Protektion<br />
nachgewiesen, wobei dieser Effekt laut AGTERBERG et al. (2009) möglicherweise auf eine<br />
zweimal wöchentlich durchgeführte elektrische Stimulation zur Messung der Hörschwellen<br />
zurückzuführen sein könnte, welche von GILLESPIE et al. (2003) nicht durchgeführt wurde.<br />
Diese Erklärung stützt er auf Beobachtungen weiterer Studien, in denen eine<br />
Spiralganglienzellprotektion durch wiederholte electrically evoked auditory brainstem<br />
response (eABR)-Messungen vermutet wurde. So stellten CHIKAR et al. (2008) nach der<br />
einmaligen Injektion von Adenoviren und dadurch vermittelter endogener BDNF-Produktion<br />
noch nach 12 Wochen einen protektiven Effekt auf die Spiralganglienzellen fest. Hier wurden<br />
die 14-tägig durchgeführten eABR-Messungen als auslösend diskutiert. Aber auch die<br />
alleinige Messung von eABRs ohne zusätzliche Behandlung mit neuroprotektiven Substanzen<br />
scheint einen positiven Effekt auf das Überleben von Spiralganglienzellen zu haben<br />
(MITCHELL et al. 1997).<br />
Weiterhin kann vermutet werden, dass positive Effekte der Testsubstanzen im basalen<br />
Bereich der Cochlea denkbar wären, welche aber durch die hier zusammengefasste<br />
Darstellung aller Cochleaabschnitte nicht zu erkennen sind. So könnten auch negative<br />
Ergebnisse in dem mittleren und oberen Abschnitt einen eventuell positiven Effekt im basalen<br />
Bereich der Applikation maskieren. Die Betrachtung der einzelnen Abschnitte konnte diese<br />
Annahme jedoch nicht bestätigen (6.2.2).<br />
Der anfangs erwähnte Unterschied zwischen der linken und rechten Seite der PBS-Gruppe<br />
erscheint schwer erklärbar. Diese Gruppe diente als Kontrolle. Etwaige Beeinflussungen
138<br />
zwischen linkem und rechtem Ohr, wie die Diffusion der Testsubstanzen über den<br />
Cochlearaquädukt zur kontralateralen Seite, sollten mit Hilfe dieser Gruppe untersucht<br />
werden. Die ermittelten Werte sollten sich aufgrund des beidseits applizierten PBS nicht<br />
unterscheiden. Eine Erklärungsmöglichkeit für die signifikant besseren Werte der rechten<br />
Seite könnte in der unterschiedlichen Beeinflussung der Spiralganglienzelldichten durch<br />
intraoperativ erfolgte Traumen gegeben werden, wobei der Einfluss von äußeren<br />
mechanischen Manipulationen auf die im Inneren des Modiolus vorhandenen Zellen fraglich<br />
erscheint.<br />
6.2.2 Bewertung der Auswirkungen der unterschiedlichen Testsubstanzen auf das<br />
Überleben von Spiralganglienzellen hinsichtlich der apikalen, mittleren und basalen<br />
Abschnitte der ertaubten Cochleae<br />
Durch den Vergleich der Spiralganglienzelldichten in den unterschiedlichen Abschnitten der<br />
Cochlea lässt sich eine Aussage über eine tendenziell lokal oder generell über die gesamte<br />
Cochlea verteilte Wirksamkeit der verwendeten Substanzen treffen. So wäre die lokale<br />
Wirksamkeit einer Behandlung hinsichtlich der Therapie vollständiger Taubheit in allen<br />
Frequenzbereichen mittels Cochlea-Implantaten von Nachteil. Wären beispielsweise nur die<br />
basalen Abschnitte von der Effektivität einer Behandlung beeinflusst, so könnten die mittleren<br />
und apikalen Strukturen der Cochlea nicht mehr optimal durch ein Cochlea-Implantat genutzt<br />
werden. Die in der Literatur angegeben Daten zur Verteilung der<br />
Spiralganglienzelldichtewerte geben im Wesentlichen keinen signifikanten Unterschied<br />
zwischen basalen und apikalen Anteilen wieder. Die Angaben von AGTERBERG et al.<br />
(2008) beziehen sich dabei auf normal hörende und unbehandelte Meerschweinchen des<br />
Stammes Dunkin Hartley. Bei ertaubten Tieren konnte ebenfalls kein Unterschied festgestellt<br />
werden (AGTERBERG et al. 2009), was auf eine gleichmäßige Degeneration der<br />
Spiralganglienzellen in den verschiedenen Abschnitten der Cochlea schließen lässt. Des<br />
Weiteren konnten die Beobachtungen von YAGI et al. (2000) auch keine signifikanten<br />
Unterschiede zwischen den Abschnitten nachweisen, wobei die Meerschweinchen 4 Tage<br />
nach der Ertaubung mit artifizieller Perilymphe (AP) behandelt wurden und der Versuch
139<br />
4 Wochen nach der Ertaubung beendet wurde. Auch nach einer Ertaubungszeit von 48 Tagen<br />
wurde kein signifikanter Unterschied zwischen unterer und oberer Abteilung der Cochlea<br />
erkennbar, wobei die Tiere in diesem Fall an Tag 21 mit AP als Kontrolle zu dem dort<br />
verwendeten GDNF behandelt wurden (SCHEPER et al. 2009a). Damit wird gezeigt, dass<br />
sich die Dichtewerte sowohl in normal hörenden als auch in ertaubten Tieren von der basalen<br />
bis zur apikalen Lokalisation nicht unterscheiden. Dies bedeutet, dass Unterschiede in den<br />
ermittelten Spiralganglienzelldichten der verschiedenen Abschnitte nach Substanzapplikation<br />
durch die Wirkung der jeweiligen Testsubstanzen hervorgerufen sein müssen. Darüber hinaus<br />
kann damit auch auf eine dementsprechende Verteilung der Testsubstanzen geschlossen<br />
werden.<br />
Für die vorliegende Arbeit wurden die Dichtewerte der einzelnen Anschnitte des<br />
Rosenthalschen Kanals in drei Abschnitte unterteilt. Hierfür wurden für den ersten Abschnitt<br />
die Dichtewerte des unteren und oberen basalen Anschnitts gemittelt, wobei mit dem 1. und 2.<br />
mittleren Anschnitt in gleicher Weise verfahren wurde und der 3. und 4. mittlere und apikale<br />
Anschnitt als dritter Abschnitt zusammengefasst wurden.<br />
Die in der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigen für die rechtsseitig miteinander<br />
verglichenen Abschnitte innerhalb einer Gruppe für die mit LNC FITC, LNC FITC<br />
ROLIPRAM sowie mit PBS behandelten Tiere keine signifikanten Unterschiede. Nur in der<br />
mit Rolipram behandelten Gruppe zeigt sich kontralateral eine signifikant erhöhte<br />
Spiralganglienzelldichte im oberen Bereich der Cochlea. Nun könne man spekulieren, dass<br />
diese erhöhte Spiralganglienzelldichte auf eine eventuelle Wirksamkeit des Roliprams<br />
zurückzuführen ist, da der Übertritt von unilateral cochleär applizierten Substanzen auf die<br />
kontralaterale Seite nachgewiesen werden konnte (STÖVER et al. 1999), doch wäre ein<br />
Effekt des Arzneimittels zunächst in den basalen Bereichen anzunehmen, da dort die höchste<br />
Konzentration des Roliprams aufgrund der Einmündung des Ductus perilymphaticus zu<br />
erwarten wäre.<br />
Vergleicht man die beobachteten Dichtewerte der einzelnen Abschnitte nun untereinander, so<br />
zeigen sich für die rechten Cochleae bei den unteren und mittleren Abschnitten keine<br />
signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. Nur in dem apikalen Abschnitt<br />
waren Differenzen bezüglich eines signifikant erhöhten Dichtewertes in der Rolipram sowie<br />
der PBS-Gruppe erkennbar. Da die PBS-Gruppe als Kontrolle dient, kann ein erhöhter Wert
140<br />
in dieser Versuchsgruppe auf eine insgesamt negative Wirkung der Nanopartikel auf das<br />
Spiralganglienzellüberleben schließen lassen, wobei Rolipram keinen negativen Effekt erzielt.<br />
Aufgrund der oben beschriebenen, eher unwahrscheinlichen Diffusion des Roliprams von der<br />
linken Seite in die oberen Abschnitte der rechten Cochlea, erscheint diese Erklärung<br />
fragwürdig.<br />
Auf der therapierten Seite zeigten die mit den jeweiligen Testsubstanzen behandelten<br />
Cochleae in der LNC FITC-Gruppe signifikante Unterschiede bezüglich der ermittelten<br />
Dichtewerte. So weist der basale und der mittlere Abschnitt eine signifikant verringerte<br />
Dichte bezüglich des apikal gemessenen Wertes auf. Hieraus kann auf eine eventuell negative<br />
Beeinflussung von Seiten des Nanopartikels ausgegangen werden. Vergleicht man aber die<br />
beiden unteren Abschnitte mit den entsprechenden Werten der nur mit PBS behandelten<br />
Tiere, so zeigt sich kein signifikanter Unterschied, was wiederum auf keinen toxischen aber<br />
auch keinen protektiven Wert der Partikel schließen lässt. Gleiches gilt für den in der<br />
ROLIPRAM-Gruppe ermittelten Spiralganglienzelldichtewert des oberen Abschnitts. Dieser<br />
ist im Vergleich zum mittleren Abschnitt signifikant erhöht, kann aber im Vergleich zur PBS-<br />
Gruppe keinen signifikanten Unterschied erkennen lassen.<br />
Die ermittelten Daten der anderen Gruppen weisen keine signifikanten Unterschiede auf, was<br />
auf keine toxische aber auch auf keine protektive Wirkung schließen lässt. Auch der<br />
Vergleich der einzelnen Abschnitte untereinander zeigte keine Signifikanzen. Mögliche<br />
Gründe für die nicht vorhandene Wirkung der LNC FITC ROLIPRAM-Nanopartikel wurden<br />
bereits im vorigen Kapitel erörtert (6.2.1).<br />
6.2.3 Bewertung der Auswirkung der Testsubstanzen auf den ermittelten Somadiameter<br />
Als zweiter Parameter wurde neben der Spiralganglienzelldichte der Somadiameter der<br />
verbliebenen Spiralganglienzellen verglichen. So zeigten eine Reihe von Beobachtungen, dass<br />
sich der Zelldurchmesser der Spiralganglienzellen durch die Behandlung mit neurotrophen<br />
Faktoren wie BDNF (MCGUINESS u. SHEPHERD 2005; GLÜCKERT et al. 2008) oder<br />
GDNF (ANAND et al. 2006; ZHOU u. WU 2006) in ertaubten Cochleae vergrößert. Welcher<br />
Mechanismus für diese Vergrößerung verantwortlich ist, bleibt momentan unklar. In
141<br />
Anlehnung an diese Ergebnisse sollte der Vergleich der in dieser Arbeit erhobenen Daten<br />
einen Hinweis darauf geben, ob sich die Somadiameter der linksseitig mit den Testsubstanzen<br />
behandelten Ohren, von denen der rechtsseitig als Kontrolle mit PBS behandelten Seiten<br />
unterscheidet. Die Gegenüberstellung der links- und rechtsseitigen Somadiameter in den<br />
einzelnen Gruppen ergab nur in der LNC FITC- sowie ROLIPRAM-Gruppe einen signifikant<br />
erhöhten Wert der linken Seite. Es kann angenommen werden, dass auch diese Substanzen<br />
ähnlich wie neurotrophe Faktoren zu einer Vergrößerung des Somadiameters geführt haben.<br />
Doch ist die Bewertung eines etwaigen Benefits oder Nachteils dieser Somavergrößerung<br />
aufgrund der unverstandenen Prozesse nicht möglich.<br />
Auch in Bezug auf den Somadiameter wurden die ermittelten Daten entsprechend den<br />
Dichtewerten in drei Abschnitte unterteilt um lokal erzeugte Effekte zu ermitteln (4.2.3.10).<br />
SHEPHERD et al. (2005) konnten für die Größe der Spiralganglienzellen ein zum Dichtewert<br />
analoges Bild aufzeigen. So zeigen sich auch beim Vergleich der Zellgrößen zwischen den<br />
verschiedenen Abschnitten der Cochlea keine signifikanten Unterschiede. Auch findet im<br />
Verlauf der nach initialem Haarzellverlust einsetzenden Spiralganglienzelldegeneration eine<br />
gleichmäßige Abnahme der Zellgröße statt (GLÜCKERT et al. 2008). Somit würden<br />
mögliche Einflüsse der Testsubstanzen durch ermittelte Unterschiede zwischen den einzelnen<br />
Abschnitten erkennbar. Die Daten der mit LNC FITC-Nanopartikel behandelten rechtsseitig<br />
ermittelten Somadiameter zeigen einen signifikant größeren Somadiameter der basal<br />
vermessenen Spiralganglienzellen im Vergleich zu den apikal beobachteten Daten. Die<br />
Behandlung der ROLIPRAM-Gruppe lieferte ein ähnliches Bild. So könnte durch den<br />
Übertritt dieser Substanzen durch den Perilymphatischen Gang eine Beeinträchtigung der<br />
unteren Abschnitte der rechten Seite eingetreten sein. Die Betrachtung der anderen beiden<br />
Gruppen weist ein tendenziell ähnliches Bild auf, wobei aber keine Signifikanzen zu erkennen<br />
sind. Aber gerade die Ähnlichkeit zu den Werten der PBS-Gruppe machen einen Einfluss der<br />
LNC FITC-Nanopartikel sowie des Roliprams unwahrscheinlich, vielmehr lässt sich die<br />
Vermutung äußern, dass die unteren Abschnitte auch im normal hörenden, unbehandelten<br />
Tier, tendenziell größere Somadiameter aufweisen. Des Weiteren spricht auch der Vergleich<br />
der einzelnen Abschnitte unter den Gruppen gegen eine Auswirkung der Testsubstanzen auf<br />
den Somadiameter. So ergeben sich in keinem Fall signifikante Unterschiede, wobei sich aber<br />
ein tendenzieller Abfall der Somadiameter von basal nach apikal beobachten lässt.
142<br />
Linksseitig zeigt sich dahingegen eine deutlichere Signifikanz zwischen den einzelnen Werten<br />
der LNC FITC-Gruppe, was im Zusammenhang mit den rechtsseitigen Ergebnissen für einen<br />
Einfluss der Testsubstanzen auf die Zellgröße spricht. Wiederum zeigt sich auch in der PBS-<br />
Gruppe eine signifikant abnehmende Somagröße, wobei hier keine unterschiedliche<br />
Auswirkung durch die Substanz zu erwarten war, was wiederum für eine normale<br />
Größenabnahme im apikalen Bereich spricht. Die Behandlung mit Rolipram zeigt dagegen<br />
den signifikant höchsten Wert im mittleren Abschnitt. Im basalen Bereich lassen sich jedoch<br />
auch hier größere Zellen als im apikalen Bereich beobachten, was ebenfalls auf eine Abnahme<br />
des Somadiameters von basal nach apikal hindeutet. Auch in der Gegenüberstellung der<br />
einzelnen Abschnitte untereinander zeigt sich die signifikante Erhöhung des mittleren Wertes.<br />
Da ansonsten keine signifikanten Unterschiede zu sehen sind, wird die Vermutung einer<br />
falsch positiven Somavergrößerung angenommen.<br />
Letztlich sind die hier ermittelten Ergebnisse der Somadiameter im Vergleich zur<br />
Überlebensrate der Spiralganglienzellen als weniger aussagekräftig anzusehen. Es ist<br />
anzunehmen, dass die geringen Schwankungen der beobachteten Zellgrößen kaum mit dem<br />
Effekt einer erhöhten Zelldichte in Relation zu setzen sind.<br />
6.3 Zusammenfassende Bewertung der durchgeführten In-vitro- und In-<br />
vivo-Versuche<br />
Mit dieser Arbeit sollten im Wesentlichen zwei Fragestellungen bearbeitet werden. Zum einen<br />
wurde der neuroprotektive Einfluss von Rolipram auf Spiralganglienzellen überprüft. Zum<br />
anderen wurde dieser Phosphodiesterase-Hemmer in Lipidnanokapseln inkorporiert, um die<br />
Eignung dieses neuartigen Drug-Delivery-Systems zur Arzneimittelapplikation im Innenohr<br />
zu untersuchen. Rolipram wurde zunächst auf seine neuroprotektiven Eigenschaften<br />
gegenüber in vitro angezüchteten Spiralganglienzellen bewertet. Nach der Evaluierung der<br />
optimalen Konzentration sollte dieser Effekt im Tiermodell mittels ertaubter<br />
Meerschweinchen reproduziert werden. Hierbei wurde der Effekt Rolipram beladener<br />
Lipidnanokaspeln (LNC FITC ROLIPRAM) mit der Wirkung von alleinig verabreichtem
143<br />
Rolipram verglichen um einen eventuellen Vorteil des Arzneimitteltransports über dieses<br />
neuartige Drug-Delivery-System zu bewerten.<br />
Die Zellkulturversuche zeigten für Rolipram in allen verwendeten Konzentrationen<br />
(1:50= 1:100 = 0,19 µg/ml, 1:200 = 0,095 µg/ml, 1:300 = 0,063 µg/ml) nur einen tendenziell<br />
protektiven Effekt auf das Spiralganglienzellüberleben, während sich in der 1:100<br />
Verdünnung der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination (LNC FITC ROLIPRAM,<br />
0,19 µg/ml Rolipram) eine deutlich gesteigerte Spiralganglienzelldichte zeigte. Ebenso konnte<br />
für den unbeladenen Nanopartikel (LNC FITC) ein signifikant gesteigertes<br />
Spiralganglienzellüberleben gezeigt werden, wobei wahrscheinlich der Bestandteil<br />
Polyethylenglykol (LAVERTY et al. 2004) für diesen Effekt verantwortlich ist. Auch der<br />
Einfluss des Roliprams scheint in der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination einen<br />
wesentlichen Einfluss auf die Spiralganglienzellprotektion zu haben. Da sich durch die direkte<br />
Rolipramapplikation kein gesteigertes Zellüberleben nachweisen ließ, kann vermutet werden,<br />
dass ein durch den Nanopartikel verbesserter Transport des Arzneimittels in die Zelle erreicht<br />
wurde.<br />
Die im Tierversuch ermittelten Spiralganglienzelldichten konnten die Ergebnisse des<br />
Zellkulturversuchs nicht reproduzieren. Die applizierten Testsubstanzen werden durch die in<br />
der Scala tympani vorhandene Perilymphe um einen weiteren Faktor verdünnt, wodurch die<br />
in den Zellversuchen beobachteten Effekte nicht erreicht werden konnten. Das Volumen der<br />
Scala tympani ist zwar bekannt, doch handelt es sich hierbei um kein statisches System<br />
sondern um einen mit dem Liquorraum verbundenen Bereich, wobei sogar Substanzen zur<br />
kontralateralen Seite diffundieren können (STÖVER et al. 1999). Hierdurch ist eine vorherige<br />
Kalkulation der letztlich wirkenden Konzentration erschwert. Eine höher dosierte Applikation<br />
birgt dabei die Risiken von zytotoxischen Effekten. Nach einer basalen Applikation der<br />
Testsubstanzen besteht die Annahme, dass eine vergleichsweise hohe Konzentration von den<br />
Zellen dieses Abschnitts aufgenommen wird, bevor sich die Nanopartikellösung in dem<br />
Lumen der Scala tympani zur gewünschten Konzentration verdünnt hätte. Dennoch wäre die<br />
Untersuchung der Applikation höherer Konzentrationen ein denkbarer Ansatz, um den<br />
positiven Effekt der Zellkulturversuche im Tiermodell zu reproduzieren.<br />
Ein weiterer Zellkulturversuch zeigte unter der Verwendung von dendritischen Zellen eine<br />
vergleichsweise geringe Freisetzung des Roliprams aus den Nanopartikeln. Auch diese
144<br />
Beobachtung lässt eine höher dosierte Applikation im Tiermodell sinnvoll erscheinen, um die<br />
geringe Freisetzung zu kompensieren.<br />
Die Ergebnisse belegen, dass eine Modifikation der Nanopartikel hinsichtlich der Freisetzung<br />
ihres Ladungsgutes anzustreben ist. Eine weitere Optimierung durch die Steigerung der<br />
Ladungsmenge wäre ebenfalls vorteilhaft. Dadurch könnte eine höhere Konzentration von<br />
Arzneimitteln transportiert werden, um gleichzeitig toxische Effekte der Partikel zu<br />
minimieren. Letztlich soll über eine Modifikation der Nanopartikeloberfläche mittels<br />
spezieller Liganden eine Gewebespezifität erreicht werden, die einen Wirkstofftransport zu<br />
dem jeweiligen zu therapierenden Zelltyp ermöglichen soll.<br />
Diese Arbeit liefert wertvolle Grundlageninformationen, die zur Optimierung dieses viel<br />
versprechenden Drug-Carrier-Sytems beitragen können. Weiterhin ist durch das verwendete<br />
Arzneimittel Rolipram neben neuroprotektiven Eigenschaften auch ein positiver Effekt<br />
hinsichtlich eines postoperativ einsetzenden Bindegewebswachstums zu erwarten. Hierdurch<br />
könnte bei Cochlea-Implantaten die Interaktion zwischen Nerven und Elektrode effizienter<br />
genutzt werden. Letztlich sind neben der kombinierten Therapie mit Cochlea-Implantaten<br />
nicht nur Einsatzgebiete im Innenohr denkbar. Auch in anderen Organsystemen könnten die<br />
Vorteile von Nanopartikeln verstärkt genutzt werden. So soll ein gezielter Transport der<br />
Arzneimittel erreicht werden, wobei das Ladungsgut solange geschützt ist, bis es die<br />
Zielzellen erreicht hat und damit zu einer erheblichen Reduktion von Nebenwirkungen führen<br />
kann.
7 Zusammenfassung<br />
Hartwig Meyer (2011):<br />
145<br />
„Untersuchungen zum biologischen Effekt von Rolipram sowie in Lipidnanokapseln<br />
eingeschlossenem Rolipram auf Spiralganglienzellen und dendritische Zellen in vitro<br />
und Spiralganglienzellen in vivo“<br />
Sensorineuraler Hörverlust stellt ein weit verbreitetes Krankheitsbild in den industrialisierten<br />
Nationen dar. Mittlerweile ist es möglich, betroffenen Patienten mittels eines Cochlea-<br />
Implantates ein erneutes Hörempfinden zu verschaffen, was Ihnen die sprachliche<br />
Kommunikation mit der Umwelt ermöglicht und ihnen neben einer verbesserten<br />
gesellschaftlichen Integration eine wesentlich gesteigerte Lebensqualität bietet. Neben dem<br />
Schutz neuronaler Spiralganglienzellen ist ein möglichst enger Nerv-Elektrodenkontakt<br />
anzustreben um die funktionelle Effizienz der Cochlea-Implantate und damit den Grad des<br />
Therapieerfolges zu erhöhen.<br />
In dieser Arbeit wurde der Phosphodiesterase-Hemmer Rolipram auf seine<br />
spiralganglienzellprotektiven Eigenschaften getestet. Des Weiteren wurde der Einfluss dieses<br />
Arzneimittels auf die Spiralganglienzellen über die Applikation mittels eines neuartigen<br />
Drug-Delivery-Systems untersucht. Hierfür wurde das Rolipram in Lipidnanokapseln<br />
inkorporiert, was einen optimierten Transport in die Zelle ermöglichen sollte. Zunächst<br />
wurden Zellkulturversuche mit vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen 3-5 Tage alter<br />
Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt. Unter Einfluss der Testsubstanzen wurden diese Zellen<br />
für 48 Stunden kultiviert und anschließend über eine immunozytochemische Markierung<br />
quantitativ bewertet. Hintergrund dieses Versuchs war neben der Beurteilung der durch<br />
Rolipram und der Arzneimittel-Nanopartikel-Kombination erreichten Spiralganglien-<br />
zellprotektivität die Ermittlung einer optimalen Wirkstoffkonzentration für die anschließend<br />
durchgeführten In-vivo-Versuche. Alle Testsubstanzen wurden in den Verdünnungen 1:50,<br />
1:100, 1:200 und 1:300 der Stammlösung (Lipidnanokapseln 45 mg /ml; 19 µg/ml Rolipram)<br />
im Hinblick auf das Spiralganglienzellüberleben untersucht. Die ermittelten Ergebnisse
146<br />
belegten kein signifikant erhöhtes Spiralganglienzellüberleben für das alleinig applizierte<br />
Rolipram. Die Kombination mit den Nanopartikeln zeigte hingegen einen stark positiven<br />
Effekt auf die Überlebensrate der kultivierten Spiralganglienzellen in der Verdünnung 1:100,<br />
welche auch in den anschließenden Tierversuchen verwendet wurde. Auch die unbeladenen<br />
Nanopartikel führten in der 1:100 Verdünnung zu einer gesteigerten Spiralganglienzelldichte,<br />
was auf die neuroprotektiven Eigenschaften des Partikelbestandteils Polyethylenglykol<br />
zurückgeführt werden kann. Der Vergleich zwischen diesen beiden Gruppen lässt darüber<br />
hinaus einen Einfluss des im Nanopartikel inkorporierten Roliprams erkennen, da im<br />
Vergleich die Arzneimittel-Nanopartikel-Kombination ein signifikant höheres Zellüberleben<br />
aufzeigte.<br />
Zusätzlich wurde ein Zellkulturversuch mit dendritischen Zellen (DC), welche nach einer<br />
Aktivierung mit Lipopolysacchariden TNF-α produzieren, durchgeführt. Die Hemmung der<br />
Zytokinproduktion ließ Rückschlüsse auf die Freisetzung des zu testenden Arzneimittels zu.<br />
So konnte eine Aussage über die Freisetzung und die Effektivität der Arzneimittel-<br />
Nanopartikel-Kombination im Vergleich zu dem direkt applizierten Rolipram getroffen<br />
werden. Darüber hinaus geben diese Versuche Auskunft auf die entzündungshemmenden<br />
Eigenschaften des Roliprams, da dendritische Zellen eine Schlüsselrolle im<br />
Entzündungsgeschehen einnehmen. Für diese Versuchsreihe wurden DC aus dem<br />
Knochenmark von BALB/c-Mäusen gewonnen und nach einer neuntägigen Kultivierung mit<br />
den Testsubstanzen behandelt. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde erfolgte die<br />
Zugabe von Lipopolysacchariden, worüber die Zellen zur Maturation und TNF-α-Sekretion<br />
angeregt wurden. Die nach 24 Stunden per ELISA ermittelten Ergebnisse belegen eine<br />
konzentrationsabhängige Hemmung der Zytokinproduktion für das direkt applizierte<br />
Rolipram (1 µM), was auf einen entzündungshemmenden Effekt schließen lässt und Vorteile<br />
gegenüber dem Auftreten fremdkörperbedingter Bindegewebsbildung im Zusammenhang mit<br />
Cochlea-Implantaten bietet. Die Nanopartikel-Rolipram-Kombination bewirkte ebenfalls eine<br />
signifikant gehemmte Zytokinproduktion in der Konzentration von 1 µM, wobei diese im<br />
Vergleich zum direkt applizierten Rolipram aber wesentlich schwächer war. Diese<br />
Beobachtungen lassen auf eine, wenn auch geringe, Freisetzung des Roliprams aus den<br />
Nanopartikeln schließen, da die Applikation von purem Rolipram in den gleichen<br />
Konzentrationen eine stärkere TNF-α-Hemmung erzielte.
147<br />
Für die In-vivo-Studien wurden unpigmentiere Meerschweinchen des Typs Dunkin Hartley<br />
verwendet. In die Studie wurden nur Tiere einbezogen, welche ein physiologisch normales<br />
Hörvermögen zeigten, welches am Tag null der Versuche durch eine aABR-Messung<br />
verifiziert wurde. Am gleichen Tag erfolgte die systemische Ertaubung der Tiere mit einer<br />
kombinierten Gabe von Kanamycin und Furosemid, welche durch eine wiederholte aABR-<br />
Messung an Tag sieben kontrolliert wurde. Die Testsubstanzen wurden im Anschluss über<br />
eine Cochleostomie zu je 5 µl in die Scala tympani der jeweils linken Ohren eingebracht,<br />
wohingegen rechtsseitig, zur Kontrolle, nur PBS injiziert wurde. Nach zwei weiteren Wochen<br />
wurden die Cochleae gewonnen. Durch die histologische Aufarbeitung konnte der Einfluss<br />
der Testsubstanzen auf die ermittelten Spiralganglienzelldichten ausgewertet werden. Hierbei<br />
wurden die im Zellversuch ermittelten Ergebnisse nicht reproduziert, da die Ergebnisse<br />
keinen spiralgangliezellprotektiven Effekt erkennen ließen. Als Hauptursache hierfür wird<br />
eine zu geringe Konzentration der Testsubstanzen angenommen. Durch die in der Cochlea<br />
vorhandenen Flüssigkeitsvolumina kommt es zu einer Verdünnung der injizierten<br />
Testsubstanz, welche im Voraus nur schwer kalkulierbar ist.<br />
Zusammenfassend zeigten die In-vitro-Studien vielversprechende Ergebnisse. Diese könnten<br />
möglicherweise durch eine Modifikation der Tierversuche auch in vivo erfolgreich<br />
reproduziert werden. So wäre die Durchführung von tierexperimentellen Studien unter der<br />
Verwendung von höheren Konzentrationen oder kontinuierlichen Applikationsformen, wie<br />
osmotischen Pumpen, denkbar.<br />
Die mit dieser Arbeit gewonnenen Grundlageninformationen liefern wertvolle Anhaltspunkte<br />
für eine weitere Optimierung dieses viel versprechenden Drug-Delivery-Sytems. So wäre<br />
neben einer verbesserten Freisetzung auch eine höhere Transportkapazität wünschenswert.<br />
Letztlich soll durch die Modifikation der Partikeloberfläche eine Gewebespezifität erreicht<br />
werden, wodurch ein gezielter Einsatz der in den Nanopartikeln inkorporierten Substanzen<br />
bewirkt werden könnte.
8 Summary<br />
Hartwig Meyer (2011):<br />
148<br />
“Investigations concerning the biological effect of rolipram and in lipid nanocapsules<br />
encapsulated rolipram on spiral ganglion cells and dendritic cells in vitro and spiral<br />
ganglion cells in vivo”<br />
Sensorineural hearing loss is a widespread disease in industrialized nations. The treatment of<br />
deaf patients with cochlear implants gains a renewed sense of hearing, allowing linguistic<br />
communication with the environment, which leads to a better social integration and increases<br />
quality of life. For the optimal function of cochlear implants, spiral ganglion cell protection<br />
and a close nerve-electrode contact is desirable.<br />
In this study, the phosphodiesterase inhibitor rolipram was tested on its efficiency to protect<br />
spiral ganglion cells. Moreover, the effect of this drug was investigated by application of a<br />
novel drug-delivery system. For this purpose, rolipram was incorporated in lipidic nano-<br />
capsule nanoparticles, which leads to an optimized transport into the cell by releasing the drug<br />
only inside.<br />
First, in-vitro-experiments with isolated cultured spiral ganglion cells of 3-5 days old Sprague<br />
Dawley rats were performed. Under the influence of the test substances, these cells were<br />
cultured for 48 hours and then evaluated quantitatively by a immunocytochemical marker.<br />
Reasons for this experiment were the evaluation of the neuroprotecive properties of rolipram<br />
and the drug-nanoparticle combination as well as the determination of an optimal drug<br />
concentration for the subsequently performed in-vivo-experiments. For all test substances<br />
dilutions of 1:50, 1:100, 1:200 and 1:300 of stock solution (lipid nanocapsules 45 mg / ml, 19<br />
mg / ml rolipram) were examined on the spiral ganglion cell survival. The calculated results<br />
showed no significantly increased spiral ganglion cell survival for the pure administered<br />
rolipram. The combination with the nanoparticles was found to have a strong positive effect<br />
on the survival of cultured spiral ganglion cells in the dilution of 1:100, which was used in<br />
subsequent animal experiments. The unloaded nanoparticles in the 1:100 dilution showed an<br />
increased spiral ganglion cell survival as well, which may be caused by the neuroprotective
149<br />
properties of the particle component polyethylene glycol. The comparison between these two<br />
groups also reveals an effect of rolipram incorporated in the nanoparticles. Compared with the<br />
unloaded nanoparticles the drug-nanoparticle-combination led to a significantly higher cell<br />
survival.<br />
In addition, a cell culture experiment with dendritic cells (DC) was performed to evaluate the<br />
effectiveness of the TNF-α inhibition of the drug-nanoparticle combination compared to the<br />
directly administered rolipram. Furthermore, these experiments give information on the anti-<br />
inflammatory properties of rolipram, since dendritic cells play a key role in inflammatory<br />
processes. For these experiments bone marrow derived DC of BALB/c mice were treated after<br />
a 9-day cultivation with the test substances. Following an incubation period of one hour, DC<br />
were stimulated by the addition of lipopolysaccharides to obtain maturation and TNF-α<br />
secretion. The following day, ELISA obtained results showed a concentration-dependent<br />
inhibition of cytokine production for the directly administered rolipram, suggesting an anti-<br />
inflammatory effect, offering advantages over the occurrence of foreign body-related<br />
connective tissue growth associated with cochlear implants. The drug-rolipram-combination<br />
also showed a significantly inhibited cytokine production at a concentration of 1 µM. But<br />
compared to the directly administered rolipram this effect was less pronounced. These<br />
observations suggest a reduced release of rolipram from the nanoparticles, hence pure<br />
administered rolipram showed higher TNF-α-inhibition in the same concentrations.<br />
For the in-vivo-studies unpigmented Dunkin Hartley guinea pigs were used. In the study, only<br />
animals were included, which showed a physiologically normal hearing, which was verified<br />
on day 0 of experiments by aABR measurement. On the same day, the animals were<br />
systemically deafened with a combined administration of kanamycin and furosemide, which<br />
was controlled by repeated aABR measurement on day seven. The test substances were then<br />
injected by cochleostomy. A volume of 5 µl was applied in the scala tympani of the left ears,<br />
while the right control side was treated PBS. After two more weeks, the cochleae were<br />
harvested. The influence of the test substances was evaluated on the determined spiral<br />
ganglion cell densities. The experimental results obtained in the in-vitro-studies has not been<br />
reproduced, no spiral ganglion cell protection was evident. The reasons for this might be<br />
caused by an insufficient concentration of the test substances. Due to the cochlear fluid<br />
volumes a further dilution occurs, which is difficult to calculate in advance.
150<br />
In summary, the in-vitro-studies showed promising results, which could possibly be<br />
reproduced by a modification of the animal experiments by using higher concentrations or<br />
continuous application forms, e. g. by means of osmotic pumps.<br />
The collected data provides basic information for further optimization of this promising drug-<br />
delivery system. In addition to an improved release a higher transport capacity would be<br />
desirable. Finally, further modifications of the particle surface should achieve tissue<br />
specificity, which leads to a targeted application of the incorporated substances.
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10 Anhang<br />
173<br />
10.1 Herstellung von Lösungen und Medien<br />
• Spiralganglienzell-Medium (SGZ-Medium)<br />
- 30 ml Panserin (10.2)<br />
- 750 µl 1 M HEPES (10.2)<br />
- 550 µl D-PBS (10.2)<br />
- 450 µl Penizillin (600 iE/ml D-PBS, 10.2)<br />
- 165 µl Glukose-Lösung (30 % in D-PBS, 10.2)<br />
- 30 µl N2-Supplement (100X, 10.2)<br />
- 70 µl Insulin (4 mg/ml, 10.2)<br />
• Enzymatische Verdauungslösung zur Spiralganglienzell-Vereinzelung<br />
- 100 ml Hank´s gepufferte Salzlösung (HBSS) ohne Ca 2+ und Mg 2+ (10.2)<br />
- 0,1 g Trypsin (10.2)<br />
- 0,1 g DNase I (10.2)<br />
- 0,01 g Collagenase (10.2)<br />
• Dendritische Zellen-Medium (DC-Medium)<br />
- RPMI 1640 (10.2)<br />
- 10 % FBS (10.2)<br />
- 50 µmol/l β-Mercaptoethanol (10.2)<br />
• Hämolyse Puffer pH 7,3<br />
- 8,29 g NH4CL (10.2)<br />
- 0,037 g Na2 EDTA (10.2)<br />
- 0,839 g NaHCO3 (10.2)<br />
- Aqua bidest ad 1000 ml (10.2)
• Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)<br />
174<br />
Die phosphatgepufferten Kochsalzlösung (0,14 M NaCl, 0,01 M PO4-Puffer, 0,0003<br />
M KCl; pH 7,45) wird durch lösen einer Tablette PBS (10.2) in 500 ml VE-Wasser<br />
(9.3) hergestellt. Anschließend wird die Lösung filtriert (10.4).<br />
• 20%ige EDTA Lösung<br />
Zunächst werden 200 g EDTA Pulver (10.2) abgewogen und in ein Gefäß mit einem<br />
Liter VE-Wasser (10.6) überführt. Nachdem sich das Pulver gelöst hat, wird der stark<br />
alkalische pH-Wert mit 25%iger Salzsäure (10.2) neutralisiert. Das Lösen des Pulvers<br />
kann durch Hinzufügen eines Rührfisches auf einem Magnetrührer beschleunigt<br />
werden.<br />
• Paraformaldehyd 4% (PFA)<br />
Zur Herstellung von einem Liter 4%iger PFA-Lösung benötigt man zunächst 40 g<br />
PFA-Pulver (10.2). Dieses wird in einem Glasgefäß (10.4) mittels Rührfisch auf einem<br />
Magnetrührer (10.6) in 500 ml VE- Wasser gelöst und dabei auf 60 °C erwärmt. Ist die<br />
Temperatur erreicht, so wird die Lösung durch Zugabe von einigen µl Natronlauge<br />
geklärt. Der leicht alkalische pH-Wert wird anschließend mit Salzsäure (10.2)<br />
neutralisiert und in einem weiteren Schritt wird die Lösung filtriert (10.4).<br />
Abschließend werden 500 ml 200%ige PBS Lösung hinzugegeben. Zur Herstellung<br />
dieser Lösung werden auf 500 ml VE-Wasser (10.2) zwei Tabletten PBS (10.1) gelöst.<br />
Die fertige 4%ige PFA-Lösung wird im Kühlschrank (10.6) bei 4°C gelagert.<br />
10.2 Lösungen und Reagenzien<br />
Aceton Baker, Deventer, Holland 8003<br />
Alexa Fluor ® 488 phalloidin Invitrogen, Molecular<br />
Probes ® , Eugene, Oregon,<br />
USA<br />
A 12379<br />
Alexa Fluor ® 568 phalloidin Invitrogen, Molecular A 12380
175<br />
Probes ® , Eugene,Oregon,<br />
USA<br />
Ammoniumchlorid (NH4CL) Merck, Darmstadt -<br />
BDNF, recombinant human R&D Systems, Wiesbaden 248-BD<br />
bovines Insulin Biochrom AG, Berlin 3510<br />
CellTiter 96 AQueos One<br />
solution cell proliferation Assay<br />
Deoxyribonuclease I (DNase I)<br />
Amplification Grade; 10 x<br />
DNase-Reaktions-Puffer;<br />
25 mM EDTA (pH 8,0)<br />
Promega, USA -<br />
Invitrogen, Karlsruhe 18068-015<br />
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt -<br />
Ethylendiamintetraessigsäure,<br />
EDTA, ~ 95 %<br />
Sigma Aldrich Chemie<br />
GmbH, Steinheim<br />
CAS 13235-30-4<br />
Eosin G Merck, Darmstadt 1.15935.0100<br />
Ethanol, vergällt 99 % BÜFA Chemikalien,<br />
Hude/Altmoorhausen<br />
Eukitt ® , Schnelleinschlussmittel Sigma Aldrich, Steinheim 0001432837<br />
Granulocyte macrophagecolony<br />
stimulating factor (GM-CSF)<br />
Fötales Rinderserum, FBS,<br />
hitzeinaktiviert Invitrogen,<br />
R&D System,<br />
Minneapolis, USA<br />
Karlsruhe GIBCO TM 10108-157<br />
Hämalaun nach Mayer Merck, Darmstadt 1.09249.2500<br />
Hanks' gepufferte Salzlösung<br />
(HBSS)<br />
ohne Ca 2+ und Mg 2+<br />
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-<br />
piperazinyl)-ethansulfonsäure-<br />
Puffer (HEPES)<br />
Invitrogen, GIBCO TM ,<br />
Karlsruhe<br />
Sigma, Steinheim -<br />
-<br />
-<br />
REF 14170-070<br />
Karboxylatzement Durelon ® ESPE Dental AG, Seefeld Flüssigkeit: 44000725596/01
176<br />
Laminin, Natural Mouse Invitrogen, Karlsruhe 23017-015<br />
Lipidnanokapseln (LNC) Universität von Angers,<br />
Frankreich<br />
Lipopolysaccharid (LPS) Merck, Darmstadt -<br />
Mercaptoethanol Sigma, Steinheim -<br />
Pulver: 44000725620/01<br />
UA4_50<br />
Methanol Baker, Deventer, Holland 9070-03<br />
UA39_50 (mit Rolipram)<br />
Methylbenzoat, reinst Merck, Darmstadt 1.06059.1000<br />
N-2 Supplement, (100X), 5 ml Invitrogen, GIBCO TM ,<br />
Natriumhydrogencarbonat<br />
(NaHCO3)<br />
Natronlauge min. 10 % (1,11)<br />
zur Analyse<br />
Neurofilament 200 kD,<br />
monoklonaler Maus-Antikörper<br />
Karlsruhe<br />
Merck, Darmstadt -<br />
17502-048<br />
Merck, Darmstadt 1.05588.1000<br />
novocastra TM , Newcastle,<br />
UK<br />
NCL-NF 200<br />
Panserin 401 Biotech GmbH, Berlin Cat. No.: P04-710401<br />
Paraffin Pastillen für die<br />
Histologie<br />
Merck, Darmstadt 1.07164.2500<br />
Paraformaldehyd (PFA) Merck, Darmstadt 1.04005.1000<br />
Penicillin (10.000 IE/ml)/<br />
Streptomycin<br />
Biochrom AG, Berlin A2210<br />
Peroxidase Substrat Kit DAB Vector Lab., Burlingame,<br />
Phosphatgepufferte<br />
Kochsalzlösung<br />
(PBS), Tabletten<br />
USA<br />
Invitrogen Cooperation,<br />
GIBCO, Karlsruhe<br />
SK-4100<br />
Poly-DL-Ornithin Sigma, St. Louis, USA P-8638<br />
ProLong ® Gold antifade reagent<br />
with DAPI<br />
Invitrogen, Molecular<br />
Probes ® , Eugene, Oregon,<br />
USA<br />
Cat.No 18912-014<br />
P 136931
Rhodamin Phalloidin<br />
177<br />
Invitrogen, Molecular<br />
Probes ® , Eugene, Oregon,<br />
USA<br />
Rolipram TOCRIS, bioscience,<br />
Roswell Park Memorial Institute<br />
(RPMI)1640 Medium<br />
Ellisville, Missouri, USA<br />
Biochrom AG, Berlin -<br />
R 415<br />
Cat. No : 0905<br />
Salzsäure, 25 % Merck, Darmstadt 1.00316.1011<br />
t-Octylphenoxypolyethoxy-<br />
ethanol (Triton X-100)<br />
Sigma Aldrich Chemie<br />
GmbH, Steinheim<br />
Trypanblau 0,5 % Biochrom AG, Berlin -<br />
Trypsin<br />
Vectastain ABC Kit ELITE<br />
Mouse IgG<br />
SERVA, Heidelberg 37290<br />
Vector Lab., Burlingame,<br />
USA<br />
CAS 9002-93-1<br />
PK-6102<br />
Xylol Merck, Darmstadt 1.08685.2500<br />
10.3 Verwendete Arzneimittel<br />
Atropinsulfat (0,5 mg/ml), 1 ml B. Braun Melsungen AG,<br />
Atipamezolhydrochlorid<br />
(5 mg/ml), Antisedan ® , 10 ml<br />
Carprofen (50 mg/ml),<br />
Rimadyl ® , 20 ml<br />
Dexpanthenol (5 %) Bepanthen ®<br />
Augen- und Nasensalbe<br />
Enrofloxacin (25 mg/ml),<br />
Baytril ® 2,5 %, Lösung zum<br />
Melsungen<br />
Zul.Nr. 5899.98.98<br />
Pfizer, Berlin Zul.Nr. 23554.00.00<br />
Pfizer GmbH, Karlsruhe Zul.Nr. 400684.00.00<br />
Bayer, Leverkusen Zul.Nr. 6029009.00.00<br />
Bayer, Leverkusen Zul.Nr. 13113.01.02
Eingeben<br />
Enrofloxacin (25 mg/ml),<br />
Baytril ® 2,5 % Injektionslösung,<br />
50 ml<br />
Furosemid (10 mg/ml),<br />
Furosemid-ratiopharm ® ,<br />
5 x 4 ml<br />
178<br />
Glucose-Lösung 5 % Delta Select GmbH,<br />
Isotone Natriumchlorid-Lösung<br />
0,9 %, 10 ml<br />
Kanamycin (333 mg/ml),<br />
3 ml<br />
Ketaminhydrochlorid (100<br />
mg/ml), Ketamin 10 %, 10 ml<br />
Kodan ® , alkoholisches<br />
Hautantiseptikum<br />
Lactobacillen (L. fermentum, L.<br />
casei, L. plantarum, L.<br />
acidophilus, je 60 mg/g),<br />
Pediococcus acidilacti<br />
(60 mg/g), Enterococcus<br />
faecium (60 mg/g), Bene-Bac ® ,<br />
1g Tube<br />
Medetomidin (1mg/ml),<br />
Domitor ® , 10 ml<br />
Penicillin (10.000 IE/ml)/<br />
Streptomycin<br />
Bayer, Leverkusen Zul.Nr. 400614.00.00<br />
ratiopharm, Ulm Zul.Nr. 36544.00.00<br />
Dreieich<br />
B. Braun Melsungen AG,<br />
Melsungen<br />
Abraxis Pharmacy<br />
Products, Schaumburg,<br />
IL, USA<br />
Zul.Nr. 4999.99.99<br />
Zul.Nr. 6697366.00.00<br />
NDC 63323-359-03<br />
WDT, Garbsen Zul.Nr. 9089.01.00<br />
Schülke & Mayr GmbH,<br />
Norderstedt<br />
A. Albrecht GmbH &<br />
Co., Aulendorf<br />
23584-A, PZN-7830495<br />
Pfizer, Berlin Zul.Nr. 32457.00.00<br />
Biochrom AG Berlin A2210<br />
Povidon-Iod, Braunol ® 1000 ml B. Braun Melsungen AG,<br />
Melsungen<br />
-<br />
Zul.Nr. 6182894.00.00
Prilocainhydrochlorid<br />
(20 mg/ml), Xylonest ® %, 10 ml<br />
Ringer Acetat Infusionslösung,<br />
1000 ml<br />
179<br />
AstraZeneca GmbH,<br />
Plankstadt<br />
B. Braun Melsungen AG,<br />
Melsungen<br />
Rolipram Elbion AG, Dresden -<br />
10.4 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien<br />
Abdecktücher Barrier,<br />
75 cm x 90 cm<br />
Deckgläser 24 x 60 mm Menzel-Gläser,<br />
Zul.Nr. 6461252.00.00<br />
Zul.Nr. 1829.99.99<br />
WDT, Garbsen REF 800530-07<br />
Braunschweig<br />
Einbettform Eigenanfertigung aus<br />
Einmalhandschuhe, Peha-Soft ® ,<br />
puderfrei, Größe M<br />
Einmalkanülen Sterican®,<br />
27 G x 11/2´´, 0,4 mm x 12 mm<br />
Einmalkanülen, 23 G x 1´´, 0,6<br />
mm x 25 mm, Nr. 16 LUER<br />
Einmalspritze, Injekt ® 1 ml,<br />
25 G x 5/8’’ (0,5mm x 16mm)<br />
Einmalspritze, Injekt ® 10 ml,<br />
steril<br />
Einmalspritze, Injekt ® 2 ml,<br />
steril<br />
Einmalspritze, Injekt ® 5 ml,<br />
steril<br />
Silikon<br />
Hartmann AG,<br />
Heidenheim<br />
B. Braun Melsungen AG,<br />
Melsungen<br />
Terumo ® Europe,<br />
Leuven, Belgien<br />
B. Braun Melsungen AG,<br />
Melsungen<br />
B. Braun Melsungen AG,<br />
Melsungen<br />
B. Braun Melsungen AG,<br />
Melsungen<br />
B. Braun Melsungen AG,<br />
Melsungen<br />
Art. No J 1800 AMZ<br />
-<br />
REF 942162<br />
-<br />
-<br />
REF 9166033 V<br />
REF 4606108 V<br />
REF 4606027 V<br />
REF 4606051 V
Einweg Skalpellklingen Nr. 11<br />
Aesculap<br />
Eppendorfgefäße, Safe Lock<br />
Tubes, 1,5 ml<br />
180<br />
Produkte für die Medizin<br />
AG, pfm,<br />
Köln<br />
Eppendorf AG, Hamburg 0030 120.086<br />
Färbegestelle und Färbebehälter Omnilab, Gerden -<br />
Filterpapier, gefaltet, 289 Sartorius GmbH,<br />
Göttingen<br />
Gewebekleber, Epiglu ® Meyer-Haake Medical<br />
Infusionsgerät BD R 87 P, 150<br />
cm<br />
Kanüle, 23 G x 1 ¼’’<br />
(0,6 mm x 30 mm)<br />
Laborglaswaren<br />
(Erlenmeyerkolben,<br />
Bechergläser, Flaschen, etc.)<br />
Laborglaswaren<br />
(Erlenmeyerkolben, Flaschen,<br />
Bechergläser, etc.)<br />
Innovatons, Wherheim<br />
Becton Dickinson GmbH,<br />
Heidelberg<br />
Becton Dickinson GmbH,<br />
Heidelberg<br />
Omnilab, Gehrden/<br />
VWR, Darmstadt<br />
Omnilab, Gehrden/<br />
VWR, Darmstadt<br />
-<br />
Best. Nr. FT-4-202-320<br />
ArtikelNr. EPIGLU04<br />
REF 396351<br />
REF 300700<br />
Mikrotommesser R 35 pfm GmbH, Köln 501348P<br />
Mullkompressen, 5 cm x 5 cm Lohmann & Rauscher,<br />
Rengsdorf<br />
Multiwell-Zellkulturplatte 96 Nunc A/S, Roskilde,<br />
Multiwell-Zellkulturplatte 96,<br />
Polystyrol-Nunc-Immuno_platte<br />
Dänemark<br />
Nunc GmbH, Wiesbaden -<br />
Mundschutz zum Binden WDT, Garbsen -<br />
Nahtmaterial nicht resorbierbar,<br />
Seralon®, 3/0<br />
Serag Wiessner, Naila -<br />
-<br />
-<br />
-<br />
Cat No. 161093
Nahtmaterial resorbierbar,<br />
Vicryl ®<br />
rapide, USP 3/0, RB-1<br />
181<br />
Ethicon GmbH,<br />
Norderstedt<br />
Objektträger Superfrost ® Plus Menzel-Gläser,<br />
Operationshandschuhe<br />
sempermed ®<br />
supreme, Gr. 7 ½<br />
Pasteurpipetten, 22,5 mm aus<br />
Glas<br />
Petrischalen 100mm/ 20mm<br />
Petrischalen 60mm/ 15mm<br />
Braunschweig<br />
Semperit Technische<br />
Produkte, Wien,<br />
Österreich<br />
-<br />
Art. No. J 1800AMNZ<br />
REF 8227 51721<br />
Brand, Wertheim Cat.No. 7477 20<br />
Sarstedt Inc., Newton,<br />
NC, USA<br />
Greiner Bio-One GmbH,<br />
Kremsmünster, Öster-<br />
reich<br />
pH-Indikatorpapier, pH-Box Merck, Darmstadt<br />
Pipette zum Einmalgebrauch,<br />
serologisch, 2 ml<br />
Pipette zum Einmalgebrauch,<br />
serologisch, 10 ml<br />
Pipette zum Einmalgebrauch,<br />
serologisch, 25 ml<br />
Pipettenaufsatz, Combitips plus<br />
5 ml<br />
Sarstedt AG & Co.,<br />
Nümbrecht<br />
Sarstedt AG & Co.,<br />
Nümbrecht<br />
Sarstedt AG & Co.,<br />
Nümbrecht<br />
Pipettenspitzen, 1-10 µl, TipOne, Starlab,<br />
83.1802.003<br />
ArtikelNr. 628102<br />
1.09565.0001<br />
No./REF 86.1252.001<br />
No./REF 86.1254.001<br />
No./REF 86.1685.001<br />
Eppendorf AG, Hamburg 0030 069.250<br />
Ahrensburg<br />
Pipettenspitzen,101-1000 µl TipOne, Starlab,<br />
Ahrensburg<br />
Pipettenspitzen,1-200 µl, TipOne, Starlab,<br />
Ahrensburg<br />
Cat. No. S1120-3810<br />
Cat. No. S1126-7810<br />
Cat. No. S1120-8810
182<br />
Polyimidschlauch Micro Lumen Inc.,<br />
Tampa, Florida, USA<br />
049-I<br />
Precision Tips, 27 GP GLT, Pforzheim ZC 5127-B<br />
Puderfreie<br />
Untersuchungshandschuhe,<br />
Purple Nitrile<br />
Rührstäbchenset<br />
Schwesternhaube, grün, mit<br />
Gummizug<br />
Silikonschlauch Fluidflex,<br />
Innendurchmesser 0,3 mm,<br />
Außendurchmesser 0,7 mm<br />
Wattestäbchen mit Holzstab,<br />
15 cm<br />
Zentrifugenröhrchen, 50 ml,<br />
konisch<br />
10.5 Operationsbesteck<br />
Kimberley & Clark,<br />
Roswell, GA, USA<br />
IKA ® -Werke GmbH und<br />
Co. KG, Stauben<br />
WDT, Garbsen -<br />
LiquidScan GmbH & Co.<br />
KG, Überlingen<br />
WDT, Garbsen -<br />
Techno Plastic Products<br />
AG, Trasadingen,<br />
Schweiz<br />
Chirurgische Pinzette Fine Science Tools,<br />
Metzenbaumschere gebogen,<br />
14,5 cm<br />
Heidelberg<br />
Fine Science Tools,<br />
Heidelberg<br />
Mikroliterspritze, 10 µl Fa. Hamilton Bonaduz<br />
AG, Bonaduz, Schweiz<br />
Nadelhalter Halsey, 13 cm Aesculap, Tuttlingen -<br />
REF 52003 M<br />
1358600<br />
400 100 2HGH<br />
-<br />
11021-14<br />
-<br />
-
183<br />
Pinzette Dumont Nr. 3, gerade Carl Roth GmbH & Co.<br />
KG, Karlsruhe<br />
Pinzette Dumont Nr. 5, gerade Carl Roth GmbH & Co.<br />
Pinzette Dumont Nr. 7,<br />
gebogen<br />
Pinzette nach Adson, 1 x 2<br />
Zähne, 12 cm<br />
Rongeur nach Pearson<br />
Schere chirurgisch, spitz-<br />
stumpf, gebogen<br />
Schere chirurgisch, spitz-<br />
stumpf, gerade<br />
KG, Karlsruhe<br />
Carl Roth GmbH & Co.<br />
KG, Karlsruhe<br />
Fine Science Tools,<br />
Heidelberg<br />
Fine Science Tools,<br />
Heidelberg<br />
WDT, Garbsen -<br />
WDT, Garbsen -<br />
Skalpellgriff Aesculap, klein WDT, Garbsen -<br />
Sonde, gerade, spitz, 15,5 cm Fine Science Tools,<br />
Verbandsschere nach Lister,<br />
20 cm<br />
Wundspreizer modifiziert nach<br />
Alm<br />
10.6 Geräte<br />
Absaugpumpe mit Schlauch für<br />
Flüssigkeiten,Typ EKF 56 ex-4<br />
Auflichtstereomikroskop Leica<br />
MZ6<br />
Heidelberg<br />
WDT, Garbsen -<br />
Fine Science Tools,<br />
Heidelberg<br />
Greifenberger<br />
Antriebstechnik,<br />
Marktredwitz<br />
Leica, Wetzlar -<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
16015-17<br />
-<br />
-<br />
-
Autoklav Typ 23 Melag oHG<br />
184<br />
Medizintechnik, Berlin<br />
Typ 23<br />
Autoklav, Type DE-65 Systec GmbH, Wettenberg DE-65<br />
CCD Kamera ColorView III Olympus Soft Imaging<br />
Solutions GmbH, Münster<br />
CO2-Flasche Linde, Höllriegelskreuth<br />
CO2-Inkubator, Typ B 5060<br />
EK-CO2<br />
Computereinheit mit Software:<br />
cellP, MS Excel, MS Word,<br />
Graph Pad Prism 4<br />
Durchlichtmikroskop, Nikon<br />
Eclipse 80i<br />
Heraeus Instruments,<br />
Hanau<br />
Olympus, Hamburg -<br />
Nikon Instruments Inc.,<br />
USA<br />
IEEE 1394 A<br />
26136000<br />
Eismaschine, Typ ZBE 70-35 Ziegra, Isernhagen ZBE 70-35<br />
Haarschneidemaschine<br />
Contura, Typ HS61<br />
Inverses Materialmikroskop<br />
Axiovert 25C<br />
Kühlgefrierkombination, Typ<br />
56134, 4 °C, -20°C<br />
Wella, Darmstadt -<br />
Carl Zeiss AG,<br />
Oberkochen<br />
Liebherr, Bieberach -<br />
Laborabzug, TA 1500 S Bense GmbH, Hardegsen -<br />
Laborwaage, Typ 440-49 N Kern & Sohn GmbH,<br />
Magnetrührer mit Heizplatte,<br />
K-RET basic<br />
Magnetrührer mit Heizplatte,<br />
MR-Hei-Standard<br />
Mehrkanalpipette,<br />
Transferpette ® S-8, 30-300 µl<br />
Mikroliterpipette pipetman ® ,<br />
10 µl<br />
Balingen<br />
IKA-Werke GmbH & Co.<br />
KG, Staufen<br />
Heidolph, Schwabach -<br />
BRAND GmbH + Co KG,<br />
Wertheim<br />
-<br />
451205<br />
Gilson Inc., Frankreich U72427C<br />
-<br />
-
Mikroliterpipette pipetman ® ,<br />
1000 µl<br />
Mikroliterpipette pipetman ® ,<br />
200 µl<br />
Multifunktionsprozessor RX6<br />
Lautsprechertreibereinheit<br />
(ED 1)<br />
Freifeld-Lautsprecher (ES 1)<br />
Niedrig-Impedanz-Headstage<br />
(RA4LI)<br />
RA4PA 4-channel Medusa<br />
preamp<br />
Mikrophonverstärker 1 MA 3<br />
185<br />
Gilson Inc., Frankreich S50646B<br />
Gilson Inc., Frankreich T69871N<br />
Tucker-Davis<br />
Technologies (TDT),<br />
Alachua, FL, USA<br />
multipette ® plus Eppendorf AG, Hamburg -<br />
Nadelelektroden, 12 mm Medtronic Xomed,<br />
Jacksonville, FL,<br />
USA<br />
Neubauer-Zählkammer Omnilab, Bremen -<br />
Olympus inverses Mikroskop,<br />
Typ CKX 41<br />
Olymps Europa GmbH,<br />
Hamburg<br />
-<br />
939125<br />
pH-Meter, Sartorius PB-20 Omnilab, Gehrden PB-20<br />
Photometer MicoplateReader<br />
MRX<br />
Pipettierhelfer pipetus ® -<br />
Standard<br />
Reagenzglasschüttler, REAX<br />
2000<br />
Reinstwasseraufbereitung:<br />
Milli-Q<br />
Biocel System Gard 2<br />
Dynatech Laboratories<br />
Inc., Chantilly, VA, USA<br />
Hirschmann ® Laborgeräte,<br />
Eberstadt<br />
Heidolph, Schwabach -<br />
Millipore GmbH,<br />
Schwalbach<br />
Rotationsmikrotom Slee, Mainz -<br />
-<br />
SZ27<br />
-
Cut 6062<br />
Schallschutzkammer,<br />
maßangefertigt<br />
Sicherheitswerkbank CA/REV<br />
4<br />
186<br />
Industrial Acoustics<br />
Company GmbH,<br />
Niederkrüchten<br />
Stativmikroskop OPMI-6-M Carl Zeiss AG,<br />
Stereomikroskop Nikon SMZ<br />
1000<br />
Clean Air, Haan CA/REV 4<br />
Oberkochen<br />
Nikon Instruments Inc.,<br />
USA<br />
Streckbad Typ 1052 GFL, Burgwedel -<br />
Temperaturregler TC-1000 und<br />
Wärmematte<br />
Wärmebad Type B 465 Büchi Labortechnik<br />
Wärmeinkubator HERA cell<br />
150<br />
Wärmematte Hico-Aquatherm<br />
660 mit Polyurethan<br />
Wassermatte 50 cm x 30<br />
CWE, Inc., PA, USA Seriennummer 273190<br />
GmbH, Flawil, Schweiz<br />
Heraeus Instruments,<br />
Hanau<br />
Fa. Hirtz, Köln -<br />
Wärmeschrank Typ B 6 Heraeus Instruments,<br />
Wärmeschrank, Thermo<br />
Scientific, Typ 12P<br />
Hanau<br />
Heraeus Instruments,<br />
Hanau<br />
Zentrifuge, Centrifuge 5804R EPPENDORF-<br />
NETHELER-HINZ<br />
GmbH, Hamburg<br />
-<br />
-<br />
08-13015<br />
-<br />
-<br />
Best.Nr. 50042301<br />
Best.Nr. 50042304<br />
-
187<br />
10.7 Einfluss der Testsubstanzen auf die Vitalität dendritischer Zellen<br />
Vitalitätswerte der dendritischen Zellen nach Inkubation mit den jeweiligen Testsubstanzen und LPS-<br />
Stimulation. Die Werte sind als Zahlenwerte einheitslose Relativwerte und geben die optische Dichte<br />
wieder. Hohe Werte korrelieren mit einer ungestörten Vitalität der Zellen. Die Werte der LNC FITC-<br />
und LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe sind durch den Fluoreszenzmarker FITC beeinflusst und zeigen<br />
eine falsch positive Erhöhung (6.1.6); n=3.<br />
ROLIPRAM 0,01 µmol 0,414 0,399 0,391<br />
ROLIPRAM 0,1 µmol 0,406 0,419 0,417<br />
ROLIPRAM 1 µmol 0,4 0,413 0,423<br />
ROLIPRAM 10 µmol 0,421 0,367 0,433<br />
LNC FITC ROLIPRAM 0.01 µmol 0,502 0,399 0,416<br />
LNC FITC ROLIPRAM 0,1 µmol 0,411 0,374 0,438<br />
LNC FITC ROLIPRAM 1 µmol 0,446 0,499 0,455<br />
LNC FITC ROLIPRAM 10 µmol 0,922 0,84 0,784<br />
LNC BLANK 0,01 µmol 0,497 0,482 0,476<br />
LNC BLANK 0,1 µmol 0,42 0,431 0,418<br />
LNC BLANK 1 µmol 0,493 0,451 0,463<br />
LNC BLANK 10 µmol 0,172 0,249 0,186<br />
LNC FITC 0,01 µmol 0,497 0,422 0,396<br />
LNC FITC 0,1 µmol 0,429 0,42 0,359<br />
LNC FITC 1 µmol 0,519 0,474 0,446<br />
LNC FITC 10 µmol 0,67 0,654 0,619<br />
DMSO (Vehikelkontrolle) 0,32 0,319 0,322<br />
LPS (Positivkontrolle) 0,518 0,465 0,444
Erklärung<br />
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation<br />
188<br />
„Untersuchungen zum biologischen Effekt von Rolipram sowie in Lipidnanokapseln<br />
eingeschlossenem Rolipram auf Spiralganglienzellen und dendritische Zellen in vitro<br />
und Spiralganglienzellen in vivo“<br />
selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch<br />
genommen:<br />
1. Die Materialien und Geräte wurden von der Klinik für Hals-Nasen-Ohren-<br />
Heilkunde der Medizinischen <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> (Leiter: Prof. Prof. Dr. Th. Lenarz)<br />
zur Verfügung gestellt.<br />
2. Die verwendeten Nanopartikel wurden von den Mitarbeitern des „Laboratoire d’Ingénierie<br />
de la Vectorisation Particulaire, INSERM U646 University of Angers, Angers, Frankreich“<br />
hergestellt und zur Verfügung gestellt.<br />
3. Die Präparation der Spiralganglien zur Gewinnung der Spiralganglienzellen wurde<br />
dankenswerter Weise von Frau Heike Bürger übernommen.<br />
4. Die statistische Auswertung erfolgte unter Anleitung von Frau Annika Müller-Heine,<br />
Biometrie der Medizinischen <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong>.<br />
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- oder Beratungsdiensten<br />
(Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir<br />
unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im<br />
Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.<br />
Ich habe die Dissertation bei folgenden Institutionen angefertigt:<br />
Klinik für Hals- Nasenund Ohrenheilkunde der Medizinischen <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong>.<br />
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tiermedizinischen <strong>Hochschule</strong><br />
<strong>Hannover</strong><br />
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen<br />
Zweck zur Beurteilung eingereicht.<br />
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen und der Wahrheit<br />
entsprechend gemacht habe.<br />
<strong>Hannover</strong>, den 14.04.2011
Danksagung<br />
189<br />
Als erstes möchte ich Herrn Prof. T. Stöver für die Überlassung dieses höchstinteressanten<br />
Dissertationsthemas danken. Durch seine unkomplizierte und sympathische Art konnte er mir<br />
in aufgetretenen Problemsituationen stets weiterhelfen. Seine außerordentlich beeindruckende<br />
Arbeits- und Berufsauffassung haben mir in hohem Maße imponiert und werden mir<br />
weiterhin ein großes Vorbild sein.<br />
Herrn Prof. W. Bäumer, meinem Doktorvater an der <strong>Tierärztliche</strong>n <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong>,<br />
möchte ich ganz herzlich für die wunderbare Zusammenarbeit und die Betreuung meiner<br />
Doktorarbeit danken. Sein unermüdliches Engagement und seine ausgesprochen freundliche<br />
Art haben mich in besonderem Maße beeindruckt. Die Betreuung hätte ich mir nicht besser<br />
vorstellen können.<br />
Herrn Prof. Prof. Dr. T. Lenarz, dem Leiter der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der<br />
Medizinischen <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong>, möchte ich ganz herzlich für die Bereitstellung des<br />
Arbeitsplatzes sowie der Arbeitsmittel danken.<br />
Frau Dr. Verena Scheper möchte ich in ganz besonderem Maße für die wissenschaftliche<br />
Betreuung und Unterstützung während meiner Zeit an der MHH danken. Sie hat es stets<br />
verstanden mich in schwierigen Momenten zu motivieren. Weiterhin konnte sie durch ihren<br />
beispiellosen Einsatz so manches Problem lösen, welches zunächst ausweglos erschien.<br />
Den Mitarbeitern Florian Fouchet, Guillaume Bastiat und Patrick Saulnier des „Laboratoire<br />
d’Ingénierie de la Vectorisation Particulaire, INSERM U646 University of Angers, Angers,<br />
Frankreich“, danke ich für die Herstellung und Bereitstellung der in dieser Studie<br />
verwendeten Nanopartikel.
190<br />
Herrn Dr. Henning Voigt danke ich zuallererst für seine ausgesprochen humorvolle<br />
Kollegialität. Es war mir stets eine ganz besondere Freude seinen Sinn für Humor teilen zu<br />
dürfen. Aber nicht weniger möchte ich ihm für seine schier grenzenlose Geduld und<br />
Hilfsbereitschaft in diversen Fragestellungen danken.<br />
Für die besonders liebevolle Betreuung meiner Meerschweinchen möchte ich mich bei Nicki<br />
und Claudia bedanken, die immer zur Stelle waren, wenn ich nicht dazu die Möglichkeit<br />
hatte.<br />
Heike und Darja möchte ich für die unendliche Geduld und die vielen Erklärungen danken.<br />
Ich konnte in so vielen Dingen von ihren Erfahrungen lernen, wofür ich mich nochmals<br />
bedanken möchte.<br />
Frau Dr. Athanasia Warnecke, Frau Dr. Kirsten Wissel, Frau Alexandra Gellert, Herrn Dr.<br />
Gerrit Paasche und Herrn Thilo Rode danke ich dafür mir wichtige Ideen und Denkanstöße<br />
gegeben zu haben, und dass sie immer spontan bereit waren mir in wichtigen Fragestellungen<br />
weiterzuhelfen.<br />
Herrn Peter Erfurt danke ich für die unkomplizierte Art mir in praktischen Fragestellungen<br />
immer ein guter Ratgeber gewesen zu sein.<br />
Frau Annika Müller-Heine danke ich für die Beratung bei der Auswahl geeigneter<br />
statistischer Auswertungsmethoden.<br />
Weiterhin danke ich meinen lieben Kollegen und Mitdoktoranden aus dem dritten Stock für<br />
ihre Hilfsbereitschaft und Gesellschaft. Es war mir immer eine Freude mit Tanja, Piera,<br />
Antonina, Mareike, Annett, Odett, Alice, Feli, Nadine, Alexander, Ronnie und Werner neben<br />
der Arbeit auch über Persönliches reden zu können.
191<br />
Auch die Mitarbeiter und Doktoranden des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und<br />
Pharmazie der Tiermedizinischen <strong>Hochschule</strong> <strong>Hannover</strong> sollen nicht vergessen werden,<br />
wobei mein besonderer Dank für zeitraubenden Anleitungen und Erklärungen an Katrin und<br />
Viktoria geht. Aber auch allen anderen Mitarbeitern sei gedankt, die mir bei Fragen immer<br />
sofort Auskunft geben konnten.<br />
Meiner Familie danke ich für die Unterstützung und den Halt, ohne die ich mein Studium und<br />
auch die Zeit meiner Doktorarbeit nur schwer hätte meistern können.<br />
Zu allerletzt gilt mein ganz besonderer Dank Nicole. Ohne ihre Unterstützung und ihren Rat<br />
wären die letzten Jahre nicht vorstellbar gewesen. Aus tiefem Herzen möchte ich mich für<br />
ihre bedingslose Unterstützung und vor allem für ihre Geduld bedanken. Der für diese Arbeit<br />
entscheidende Abend in der Küche wird uns immer in Erinnerung bleiben. Ich habe durch sie<br />
die nötige Kraft und Motivation gewonnen, meine eigenen Ziele sogar zu übertreffen.