Tiho Bibliothek elib - Tierärztliche Hochschule Hannover

Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zum biologischen Effekt von Rolipram sowie in
Lipidnanokapseln eingeschlossenem Rolipram auf
Spiralganglienzellen und dendritische Zellen in vitro und
Spiralganglienzellen in vivo
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Hartwig Meyer
Rotenburg/Wümme
Hannover 2011

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer
1. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Bäumer
Prof. Dr. Timo Stöver
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Prof. Dr. Timo Stöver
Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde
der Johann Wolfgang Goethe-Universität,
Frankfurt am Main
Prof. Prof. h. c. Dr. Thomas Lenarz
Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde
der Medizinischen Hochschule Hannover
Dr. med. vet. Verena Scheper
2. Gutachter: Prof. Dr. Marion Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2011
Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde
der Medizinischen Hochschule Hannover
Gefördert durch die Europäische Union im Rahmen des „3g-Nanotechnology-based targeted
drugdelivery using the inner ear as a model target organ“ - Projektes „NanoEar“
(Projektnummer NMP4-CT-2006-026556).

Meinen lieben Eltern
in
tiefer Dankbarkeit
für ihre bedingungslose
Unterstützung gewidmet
Stufen
Wie jede Blüte welkt
und jede Jugend dem Alter weicht,
blüht jede Lebensstufe,
blüht jede Weisheit auch und jede Tugend
zu ihrer Zeit und darf nicht ewig dauern.
Es muss das Herz bei jedem Lebensrufe
bereit zum Abschied sein und Neubeginne,
um sich in Tapferkeit und ohne Trauern
in and're, neue Bindungen zu geben.
Und jedem Anfang wohnt ein Zauber inne,
der uns beschützt und der uns hilft zu leben.
Wir sollen heiter Raum um Raum durchschreiten,
an keinem wie an einer Heimat hängen,
der Weltgeist will nicht fesseln uns und engen,
er will uns Stuf' um Stufe heben, weiten!
Kaum sind wir heimisch einem Lebenskreise
und traulich eingewohnt,
so droht Erschlaffen!
Nur wer bereit zu Aufbruch ist und Reise,
mag lähmender Gewöhnung sich entraffen.
Es wird vielleicht auch noch die Todesstunde
uns neuen Räumen jung entgegen senden:
des Lebens Ruf an uns wird niemals enden.
Wohlan denn, Herz, nimm Abschied und
gesunde!
(Hermann Hesse)

Inhaltsverzeichnis
V
VERZEICH�IS VO� EIGE�E� VORTRÄGE� U�D POSTER�................................. X
ABKÜRZU�GSVERZEICH�IS........................................................................................ XII
1 EI�LEITU�G ....................................................................................................................... 1
2 LITERATURÜBERSICHT.................................................................................................. 6
2.1 Das Hörorgan der Säugetiere.......................................................................................... 6
2.1.1 Anatomie des Hörorganes.......................................................................................... 7
2.1.2 Das Spiralganglion................................................................................................... 10
2.1.3 Physiologisches Prinzip des Hörvorgangs ............................................................... 11
2.2 Hörminderung und Ertaubung ...................................................................................... 13
2.2.1 Formen der Hörschädigungen.................................................................................. 13
2.2.2 Sensorineuraler Hörverlust ...................................................................................... 14
2.2.3 Kompensation des sensorischen Hörverlusts durch Cochlea-Implantate ................ 17
2.2.4 Ansätze zur Verbesserung der Nerv-Elektroden-Interaktion................................... 18
2.2.5 Applikationswege zur medikamentösen Therapie des Innenohres.......................... 22
2.3 Nanotechnologien ......................................................................................................... 25
2.3.1 Definition, Eigenschaften von Nanostrukturen und deren Anwendung .................. 25
2.3.2 Nanotechnologie in der Medizin.............................................................................. 26
2.3.3 Anwendung von Nanomedizin in der Otologie ....................................................... 28
2.3.4 Nanomedizin in der Veterinärmedizin..................................................................... 29
2.3.5 Lipidnanokapseln..................................................................................................... 30
2.4 Phosphodiesterase-Hemmer ......................................................................................... 34
2.4.1 Wirkungsweise der Phosphodiesterase-Hemmer..................................................... 34
2.4.2 Einteilung der Phosphodiesterase-Hemmer............................................................. 35
2.4.3 Rolipram .................................................................................................................. 36
3 ZIELSETZU�G .................................................................................................................. 40
4 MATERIAL U�D METHODE� ...................................................................................... 42
4.1 Material......................................................................................................................... 42
4.1.1 Reagenzien, Laborbedarf, Verbrauchsmaterialien, Pharmaka und Geräte .............. 42
4.1.2 Herstellung der Lipidnanokapseln ........................................................................... 42
4.1.3 Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit Spiralganglienzellen...... 44

VI
4.1.4. Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit dendritischen Zellen ..... 45
4.1.5 Versuchstiere und Tierhaltung für die In-vivo-Experimente ................................... 46
4.1.6 Versuchsgruppen...................................................................................................... 46
4.2 Methoden ...................................................................................................................... 48
4.2.1 Methoden für die In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen................................ 48
4.2.1.1 Übersicht der In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen ...................... 48
4.2.1.2 Versuch zur Bewertung des Einflusses der Nanopartikel-Komponenten
auf das Überleben von vereinzelt angezüchteten Spiralganglienzellen .. 49
4.2.1.3 Beschichtung der 96-Multiwellplatten zur Kultivierung von
Spiralganglienzellen ................................................................................ 50
4.2.1.4 Gewinnung der Spiralganglienzellen ....................................................... 51
4.2.1.5 Die Vereinzelung der Spiralganglienzellen ............................................. 53
4.2.1.6 Einsaat der Spiralganglienzellen.............................................................. 54
4.2.1.7 Fixation der Spiralganglienzellen ............................................................ 55
4.2.1.8 Markierung der vereinzelten Spiralganglienzellen über die
immunozytochemische ABC-Methode ................................................... 56
4.2.1.9 Vermessung der Spiralganglienzellen und statistische Auswertung der
Spiralganglienzellversuche...................................................................... 58
4.2.2 Methoden für die In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen ................................ 59
4.2.2.1 Die Generierung und Kultivierung dendritischer Zellen ......................... 59
4.2.2.2 Übersicht der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen ...................... 61
4.2.2.3 Messung der TNF-α-Konzentration......................................................... 63
4.2.2.4 Vitalitätsbestimmung ............................................................................... 64
4.2.3 Methoden für die In-vivo-Versuche ......................................................................... 65
4.2.3.1 Übersicht der In-vivo-Versuche ............................................................... 65
4.2.3.2 Anästhetische Versorgung; prä- und postoperative Versorgung der
Versuchstiere........................................................................................... 65
4.2.3.3 Akustisch-evozierten Hirnstammpotentiale (aABR) ............................... 66
4.2.3.4 Systemische Ertaubung von Meerschweinchen....................................... 68
4.2.3.5 Applikation von Flüssigkeiten ins Innenohr via Cochleostomie ............. 69
4.2.3.6 Transkardiale Perfusion ........................................................................... 72

VII
4.2.3.7 Gewinnung der Cochleae ......................................................................... 73
4.2.3.8 Entkalkung, Entwässerung und Einbetten der Cochleae.......................... 74
4.2.3.9 Herstellung und Anfärbung der Paraffinschnitte ..................................... 75
4.2.3.10 Auswertung der Paraffinschnitte............................................................ 76
4.2.3.11 Statistische Auswertung der In-vivo-Versuche ...................................... 79
5 ERGEB�ISSE ..................................................................................................................... 81
5.1 Ergebnisse der In-vitro-Versuche mit vereinzelten Spiralganglienzellen .................... 81
5.1.1 Einfluss von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BDNF auf
die Überlebensrate vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen.............................. 81
5.1.2 Einfluss von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BDNF auf
das Neuritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen ......... 83
5.1.3 Einfluss von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BDNF auf
den Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen .............................. 87
5.1.4 Einfluss von LNC FITC, LNC BLANK und BDNF auf die Überlebensrate
vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen............................................................. 88
5.1.5 Einfluss von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf das
Neuritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen................ 90
5.1.6 Einfluss von LNC, LNC BLANK sowie BDNF auf den Somadiameter vereinzelt
kultivierter Spiralganglienzellen.............................................................................. 92
5.2 Ergebnisse der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen......................................... 92
5.2.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die TNF-α-Sekretion ............................................ 93
5.2.2 Einfluss der Testsubstanzen in der Konzentration von 1 µM auf die TNF-α-
Sekretion .................................................................................................................. 97
5.2.3 Ergebnisse der Vitalitätstestsbestimmung der dendritischen Zellen ....................... 99
5.3 Ergebnisse der In-vivo-Versuche................................................................................ 100
5.3.1 Ergebnisse der aABR-Messungen ......................................................................... 100
5.3.2 Vergleich der Spiralganglienzelldichten zwischen rechten und linken ertaubten
Cochleae der Tiere einer Versuchsgruppe sowie der linken bzw. rechten
Cochleae aller Gruppen untereinander .................................................................. 102

VIII
5.3.3 Vergleich der Spiralganglienzelldichten des unteren, mittleren und oberen
Abschnitts der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen ............... 104
5.3.4 Vergleich der Spiralganglienzelldichten des unteren, mittleren und oberen
Abschnitts der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den Versuchsgruppen ....................................... 107
5.3.5 Vergleich der Somadiameter der Spiralganglienzellen zwischen rechter und
linker ertaubter Cochleae der Tiere einer Versuchsgruppe sowie der linken
bzw. rechten Cochleae aller Gruppen untereinander............................................. 109
5.3.6 Vergleich der ermittelten Somadiameter des unteren, mittleren und oberen
Abschnitts der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen ............... 112
5.3.7 Vergleich der ermittelten Somadiameter des unteren, mittleren und oberen
Abschnitts der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den Versuchsgruppen ....................................... 114
6 DISKUSSIO� .................................................................................................................... 119
6.1 Bewertung der In-vitro-Ergebnisse............................................................................. 120
6.1.1 Auswirkungen von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und
BDNF auf das Überleben von vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen.......... 120
6.1.2 Wirkungen von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BDNF
auf die Neuritenlängen der vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen............... 124
6.1.3 Effekte von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BDNF auf die
Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen................................... 126
6.1.4. Bewertung der Auswirkungen der Nanopartikel-Komponenten auf das
Überleben von vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen durch die
vergleichende Behandlung der Spiralganglienzellen mit LNC FITC,
LNC BLANK sowie BDNF................................................................................... 127
6.1.5 Auswirkungen von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf das
Neuritenauswachsverhalten sowie den Somadiameter von kultivierten
Spiralganglienzellen .............................................................................................. 128

6.1.6 Wirkung von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM, LNC BLANK und
IX
LNC FITC auf die LPS-induzierte TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen........... 129
6.2 Bewertung der In-vivo-Ergebnisse ............................................................................. 134
6.2.1 Bewertung der Auswirkungen der unterschiedlichen Testsubstanzen auf das
Überleben von Spiralganglienzellen in ertaubten Cochleae.................................. 134
6.2.2 Bewertung der Auswirkungen der unterschiedlichen Testsubstanzen auf das
Überleben von Spiralganglienzellen hinsichtlich der apikalen, mittleren und
basalen Abschnitte der ertaubten Cochleae ........................................................... 138
6.2.3 Bewertung der Auswirkung der Testsubstanzen auf den ermittelten
Somadiameter ........................................................................................................ 140
6.3 Zusammenfassende Bewertung der durchgeführten In-vitro- und In-vivo-Versuche 142
7 ZUSAMME�FASSU�G .................................................................................................. 145
8 SUMMARY........................................................................................................................ 148
9 LITERATURVERZEICH�IS ......................................................................................... 151
10 A�HA�G ......................................................................................................................... 173
10.1 Herstellung von Lösungen und Medien.................................................................... 173
10.2 Lösungen und Reagenzien........................................................................................ 174
10.3 Verwendete Arzneimittel.......................................................................................... 177
10.4 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien .................................................................. 179
10.5 Operationsbesteck..................................................................................................... 182
10.6 Geräte........................................................................................................................ 183
10.7 Einfluss der Testsubstanzen auf die Vitalität dendritischer Zellen .......................... 187
ERKLÄRU�G...................................................................................................................... 188
DA�KSAGU�G................................................................................................................... 189

Verzeichnis von eigenen Vorträgen, und Postern
X
Ein Teil der im Rahmen der Dissertation ermittelten Ergebnisse wurden bereits auf folgenden
Fachtagungen präsentiert:
• SCHEPER, V., HÜTTEN, M., MEYER, H., FOUCHET, F., BASTIAT, G.,
SAULNIER, P., LENARZ, T., STÖVER, T.
Nanoparticles as carriers for Rolipram to increase the neuroprotective effect on Spiral
Ganglion Cells
In: 33 rd MidWinter Meeting of Association for Research in Otolaryngology, Anaheim,
California, USA, 2010 (Poster)
• MEYER, H., STÖVER, T., FOUCHET F., BASTIAT, G., SAULNIER, P.,
BÄUMER, W., LENARZ, T., SCHEPER, V.
Increase of the Neuroprotective Effect of Rolipram on Spiral Ganglion Cells via
Nanoparticle Carriage
In: 47 th Inner Ear Biology Workshop, Prague, Czech Republic, 2010 (Poster)
• MEYER, H., STÖVER, T., FOUCHET F., BASTIAT, G., SAULNIER, P.,
BÄUMER, W., LENARZ, T., SCHEPER, V.
In-vitro- and in-vivo-Effects of Rolipram on Spiral Ganglion Cells and Dendritic Cells
via Nanoparticle Carriage
In: 15 th Conference on Implantable Auditory Prostheses, Pacific Groove, USA, 2011
(Poster)

XI
• SCHEPER, V., MEYER, H., STÖVER, T., BASTIAT, G., SAULNIER, P., VOIGT,
H., LENARZ, T.
Untersuchungen zum neuroprotektiven Effekt von Rolipram und nanopartikel-
vermittelter Rolipram Applikation
In: 82. Jahresversammlung 2011 der Deutschen Gesellschaft für Hals-Nasen-
Ohrenheilkunde, Kopf- und Hals-Chirurgie e.V., Bonn
Für die vorliegende Arbeit wurden die in den Vorträgen und Postern präsentierten Ergebnisse
in einen Kontext gesetzt, ausführlicher beschrieben sowie durch weitere Ergebnisse ergänzt.

Abkürzungsverzeichnis
XII
aABR acoustically evoked auditory brainstem response (akustisch evozierte
Abb. Abbildung
auditorische Hirnstamm-Potenziale)
ABC Avidin-Biotin-Complex
Ak Antikörper
AP artifizielle Perilymphe
BDNF brain-derived neurotrophic factor
bzw. beziehungsweise
ca. zirka
cAMP cyclic adenosin monophosphate (zyklisches Adenosin-Monophosphat)
cGMP cyclic gunanosin monophosphate (zyklisches Guanosin-Monophosphat)
d day (Tag)
DAB Diaminobenzidin
dB Dezibel
DC Dendritic cell
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
DNase I Deoxyribonuclease I
EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat
ELISA enzyme linked immunoabsorbent assay
EPR-Effekt enhanced permeability and retention-Effekt
et al. et alii (und andere)
etc. et cetera (und so weiter)
EU Europäische Union
FBS Fetal bovine serum
FITC Fluoreszein-5-isothiocyanat
°C Grad Celsius
g Erdschwerebeschleunigung
g Gramm
GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor

XIII
GM-CSF granulocyte macrophage-colony stimulating factor
h hora (Stunde)
HBSS Hank’s balanced salt solution
Hz Hertz
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
i.m. intramuskulär
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
kHz Kilohertz
l Liter
LNC Lipidnanokapsel
LPS Lipopolysaccharide
µ mikro (1 x 10 -6 )
MAP mitogen activated protein
mg Milligramm
ml Milliliter
MW Mittelwert (arithmetischer Mittelwert)
n Stichprobenumfang
NaCl Natriumchlorid
NAD Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid
NADP Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
NF-κB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells
nm Nanometer (1 x 10 -9 m)
NO Stickstoffmonoxid
ns nicht signifikant
NS Normalserum
OD Optische Dichte
PBS phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PEG Polyethylenglykol
PFA Paraformaldehyd

XIV
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoff-Ionenkonzentration
PIT-Methode phase inversion temperature-Methode
RhoA ras homolog gene family, member A
RNS reactve nitrogen species (reaktive Stickstoff Spezies)
ROS reactive oxygen species (reaktive Sauerstoff Spezies)
rpm rotation per minute (Umdrehungen pro Minute)
s Sekunde
s.c. subcutan
SGZ Spiralganglienzelle
SPION superparamagnetic iron oxide nanoparticles
SPL sound pressure level (Schalldruckpegel)
Std. Stunden
Tab. Tabelle
TNF Tumornekrosefaktor
Trk Tyrosin Kinase
z. B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem

1 Einleitung
1
Die Beeinträchtigung des Hörvermögens im Sinne einer Hörminderung oder Ertaubung stellt
eine der in Deutschland am häufigsten verbreiteten Erkrankungen dar. Nach einer im Jahr
2000 durchgeführten Studie wurde die Zahl der Betroffenen in Deutschland auf über
10 Millionen geschätzt (SOHN 2001).
Die Ursachen der Hörminderungen sind meist durch einen Verlust der sensorineuralen
Strukturen begründet. Neben erblichen Faktoren spielen auch erworbene Ursachen, wie
beispielsweise eine erhöhte Lärmexposition (MINAMI et al. 2007) oder die Applikation von
ototoxischen Arzneimitteln (YAMANE et al. 1988; SELIMOGLU 2007) eine entscheidende
Rolle. Bei dem durch Lärm verursachten Hörverlust (noise induced hearing loss) kommt es
zu einer reflektorischen Abnahme der Durchblutung im Innenohr, wodurch eine negative
Energiebilanz in den Zellen ausgelöst wird. In der Folge führt die Bildung von freien
Radikalen sowie ein vermehrter Kalzium-Einstrom zur Degeneration der Haarzellen
(MINAMI et al. 2007). Der arzneimittelinduzierte Haarzellverlust wird ebenfalls über die
Bildung von freien Radikalen ausgelöst. Dabei wird die Degeneration der Haarzellen auch
hier über die dem Lärm induzierten Hörverlust entsprechenden Mechanismen eingeleitet.
(SELIMOGLU 2007).
Eine Therapie der geschädigten Haarzellen im Sinne einer Protektion vor schädigenden
Einflüssen oder gar die Regeneration von bereits degenerierten Sinneszellen des Innenohres
ist beim Menschen bisher nicht möglich. Vielmehr wird versucht, das geschädigte Organ
durch apparative Therapieformen zu ersetzen, bzw. zu unterstützen. So werden bei gering- bis
mittelgradig schwerhörigen Patienten Hörgeräte eingesetzt. Bei hochgradig schwerhörigen
sowie ertaubten Patienten ist die Implantation von elektronischen Innenohrprothesen, den
Cochlea-Implantaten, die Therapieform der ersten Wahl. So gehört die Behandlung von
taubgeborenen Kindern mittels eines Cochlea-Implantats mittlerweile zur Routine. Der über
das Cochlea-Implantat vermittelte Höreindruck ermöglicht den Betroffenen das Erlernen von
Sprache (LENARZ 1997), was einen entscheidenden Beitrag zur Verbesserung der
Integrationsfähigkeit in die Gesellschaft leistet und darüber hinaus eine wesentlich gesteigerte
Lebensqualität bietet.

2
Das Cochlea-Implantat übernimmt bei fehlenden Haarzellen durch die in die Scala tympani
eingeführte Mehrkanalelektrode die elektrische Anregung der Spiralganglienzellen. Durch die
Bildung und Weiterleitung von Aktionspotentialen durch die Spiralganglienzellen kann somit
auch nach einer Haarzelldegeneration ein künstlich erzeugter Höreindruck erzielt werden.
Jedoch kommt es durch den Verlust der Haarzellen zu einer progressiven Abnahme der
Spiralganglienzelldichte (SPOENDLIN 1984), was durch das Fehlen von elektrischer und
neurotropher Stimulation bedingt ist (INCESULU u. NADOL 1998; ALTSCHULER et al.
1999). Um die Funktion eines Cochlea-Implantats möglichst lange auf hohem Niveau
gewährleisten zu können, stellt eine Verzögerung oder gar ein Verhindern der
Spiralganglienzelldegeneration einen wesentlichen Aspekt bei der Optimierung von Cochlea-
Implantaten dar (INCESULU u. NADOL 1998).
Bis heute wurden eine Vielzahl von unterschiedlichen Substanzen ermittelt, welche sich als
neuroprotektiv erwiesen haben. Durch die lokale Applikation dieser neurotrophen Faktoren
konnte die fortschreitende Degeneration der Spiralganglienzellen signifikant verlangsamt
werden. Wichtige Vertreter dieser Stoffgruppe stellen brain derived neurotrophic factor
(BDNF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), Neurotrophin-3 (NT-3) sowie
fibroblast growth factor (FGF) dar (STAECKER et. al. 1996; GILLESPIE u. SHEPHERD
2005). MILLER et al. (1997) konnten anhand einer Studie mit ertaubten Meerschweinchen
belegen, dass sich eine Behandlung mit BDNF als besonders effektiv auf das Überleben der
Spiralganglienzellen erwiesen hat. Des Weiteren zeigte sich, dass eine elektrische Stimulation
der Spiralganglienzellen ebenfalls zu einer Verzögerung der Degeneration führt
(HARTSHORN et. al. 1991). Letztlich ist hierbei aber in jedem Fall eine dauerhafte,
begleitende Therapie nötig, da nach Behandlungsabbruch eine fortschreitende Verminderung
der Spiralganglienzelldichte nachgewiesen wurde (GILLESPIE et. al. 2003). Erste Ansätze zu
dauerhaften Drug-Delivery-Systemen stellen mit Mikrokathetern versehene osmotische
Pumpen dar, die es ermöglichen, über einen längeren Zeitraum Arzneimittel ins Innenohr zu
applizieren. Dennoch ist die Dauer der Applikation auf wenige Wochen begrenzt. Eine
weitere Option bildet die Gentherapie. Durch das Einschleusen von Gensequenzen
neurotropher Faktoren könnten die Zellen nun selbst für eine dauerhafte Produktion dieser
neuroprotektiven Substanzen sorgen (YAGI et. al. 2000; REJALI et. al. 2007).

3
Über virale Vektoren konnte bereits ein Gentransfer im Innenohr realisiert werden. Obwohl
eine Expression der eingeschleusten Sequenzen in den Zellen des Innenohres nachgewiesen
wurde, zeigten die Ergebnisse jedoch keinen zellspezifischen Gentransfer (HAN et. al. 1999,
SUZUKI et. al. 2003). Des Weiteren wird meist nur eine zeitlich begrenzte Expression von
etwa 3 Wochen erzielt, was im Hinblick auf eine langfristige Therapie nicht wünschenswert
ist (HUSSEMAN u. RAPHAEL 2009). Zusätzlich ergeben sich durch die Verwendung von
viralen Vektoren nicht unerhebliche Nachteile, wie beispielsweise die potenzielle Infektiosität
und die Möglichkeit entzündliche oder immunologische Prozesse auszulösen (KHO et. al.
2000).
Neben den viralen Vektoren bieten künstlich hergestellte Nanopartikel eine vielversprechende
Möglichkeit zum Transport von Arzneimitteln und Gensequenzen. Hierbei handelt es sich um
Partikel, deren Größe im nanoskaligen Bereich angesiedelt ist, für die die amerikanische
�ational �anotechnology Initiative Größenordnungen von 1 bis 100 nm angibt. Heute werden
eine Vielzahl unterschiedlicher Nanopartikel hergestellt, welche aus organischen sowie
anorganischen Grundbausteinen zusammengesetzt sein können. Neben dem Einsatz in der
Industrie findet sich ein breites Anwendungsgebiet im Gesundheitswesen und in der Medizin.
So werden Nanopartikel bereits in einigen Sonnenschutzmitteln verwendet, aber auch zur
Bekämpfung von Brustkrebs können im Rahmen der Therapie Nanopartikel eingesetzt
werden (PAUTLER u. BRENNER 2010). Der Vorteil von Nanopartikeln liegt in der nicht
vorhandenen Infektiosität und der Produktion von biodegradablen Grundgerüsten, welche
eine geringe Reaktion des Körpers erwarten lassen. Weiterhin lassen sich Nanopartikel
kostengünstig herstellen. Durch die Eigenschaft der Herstellung nach biologischen
Bauprinzipien sind Nanopartikel prädestiniert für den Transport von medizinischen
Wirkstoffen oder Genen.
Neben der Transportfunktion besteht die Möglichkeit, die Oberfläche von Nanopartikeln mit
spezifischen Rezeptoren zu funktionalisieren. Über diese Rezeptoren sollen die Nanopartikel
nur an ausgesuchte Zellpopulationen binden, in welche sie daraufhin aufgenommen werden
und ihr Transportgut freisetzen können. Gerade in der Behandlung von Krebs werden durch
traditionelle Verfahren wie der Chemo- oder Strahlentherapie nicht nur die Tumorzellen,
sondern auch die gesunden Körperzellen geschädigt. Durch den Einsatz von Nanopartikeln ist
eine gezielte Behandlung des veränderten Gewebes denkbar, welche entscheidende Vorteile

4
gegenüber den herkömmlichen Therapieformen hinsichtlich der Minderung von
Nebenwirkungen erreichen kann (PAUTLER u. BRENNER 2010).
Auch im Innenohr kann ein gezielter Wirkstofftransport über Nanopartikel eine erhebliche
Dosisminderung und damit ein geringeres Risiko von Nebenwirkungen im Vergleich zu einer
systemischen Behandlung erreichen. Zusätzlich wird durch die geringere Dosis auch ein
beträchtlicher ökonomischer Nutzen erreicht, da weniger Wirkstoff eingesetzt werden muss.
Neueste Forschungsergebnisse belegen, dass durch die lokale Applikation von
fluoreszenzmarkierten Lipidnanokapseln in die Scala tympani eine breite Verteilung der
Nanopartikel in den einzelnen Zellpopulationen erreicht werden kann (SCHEPER et al.
2009b). Die Ergebnisse zeigten die Fähigkeit wirkstoffunbeladener Nanopartikel, die Zellen
zu infiltrieren ohne dabei toxische Effekte auszulösen.
Neben dem Erhalt der Spiralganglienzellen wird die optimale Funktionsweise der Cochlea-
Implantate noch durch einen weiteren wichtigen Faktor beeinflusst. Durch postoperativ
einsetzende Fremdkörperreaktionen versucht der Körper durch Bindegewebszubildung das
Implantat abzukapseln. Hierdurch kommt es zu einer zunehmend verminderten Nerv-
Elektroden-Interaktion, was zu einer verringerten Frequenzselektivität und einer Erhöhung
der Impedanzen sowie des Stromeintrags führt (NEWBOLD et al. 2004). PAASCHE et. al.
(2003) konnten nach der Insertion von Cochlea-Implantaten durch die lokale Applikation von
Glukokortikoiden eine Verringerung der Impedanzen im Vergleich zu unbehandelten
Patienten feststellen.
Die Beurteilung eines biologischen Effekts, welcher durch die Freisetzung eines
Transportgutes im Sinne von Arzneimitteln hervorgerufen werden kann, soll in der
vorliegenden Arbeit evaluiert werden. In dieser Studie werden wirkstoffbeladene
Lipidnanokapseln verwendet. Hierbei ist der Phosphodiesterase-Hemmer Rolipram im
Inneren des Nanopartikels eingekapselt, wodurch das Arzneimittel bis zur Freisetzung im
Zellinneren geschützt wird. Für dieses Arzneimittel konnten WHITAKER et. al. (2008) im
Tierversuch neuroprotektive Eigenschaften nachweisen. In der vorliegenden Arbeit wird
zunächst der Effekt des Roliprams und einer Nanopartikel-Rolipram-Kombination auf das
Überleben von isoliert angezüchteten Spiralganglienzellen untersucht. Des Weiteren werden
Versuche zur Evaluierung des Einflusses von Rolipram und der Nanopartikel-Rolipram-
Kombination auf die TNF-α-Sekretion von dendritischen Zellen durchgeführt. Der Vergleich

5
zwischen dem direkt applizierten Rolipram und der Applikation mittels Nanopartikel lässt
eine Aussage über die Effektivität dieses Drug-Delivery-Systems zu. Nachfolgend wird der
Effekt des Roliprams auf die Dichte der Spiralganglienzellen von zuvor ertaubten
Meerschweinchen in direkter sowie Nanopartikel-vermittelter Applikation untersucht. So
werden mit dieser Arbeit die Fragestellungen des biologischen Effekts von Rolipram, sowie
die Auswirkungen des mittels eines Drug-Delivery-Systems applizierten Arzneimittels auf die
Neurone des Hörsystems in-vitro und im Tiermodell bearbeitet.

2 Literaturübersicht
2.1 Das Hörorgan der Säugetiere
6
Das Ohr der Säugetiere (Auris, Organum vestibulocochleare) dient neben der Aufnahme und
Weiterverarbeitung von akustischen Umweltreizen auch der Wahrnehmung der Lage des
Körpers im Raum und stellt somit ein Doppelsinnesorgan dar (NICKEL et. al. 2004).
Morphologisch-anatomisch wird das Ohr in einen äußeren Anteil, das äußere Ohr (Auris
externa), einen mittleren Anteil, das Mittelohr (Auris media) und in einen inneren Anteil, das
Innenohr (Auris interna) eingeteilt. Das Innenohr verkörpert das eigentliche statoakustische
Sinnesorgan. Es besteht aus dem für den Gleichgewichtssinn verantwortlichen
Vestibularapparat und aus der Hörschnecke (Cochlea), welche das eigentliche innere
Hörorgan darstellt (Abb. 1).
Abb. 1: Aufbau des menschlichen Hör- und Gleichgewichtsorganes (modifiziert nach BOENNINGHAUS
u. LENARZ 2007)

2.1.1 Anatomie des Hörorganes
7
Das äußere Ohr ist durch die aus Knorpel bestehende Ohrmuschel (Auricula) gekennzeichnet.
Sie dient als Schallauffangtrichter und leitet akustische Reize über den äußeren Gehörgang
(Meatus acusticus externus) in Richtung Mittelohr. Der äußere Gehörgang findet sein Ende
im Paukenring (Anulus tympanicus), in dem das Trommelfell (Membrana tympanica)
eingespannt ist, welches das äußere Ohr zur Paukenhöhle (Cavum tympani) des Mittelohres
abgrenzt (NICKEL et al. 2004).
Das im Felsenbein liegende Mittelohr beinhaltet die Paukenhöhle (Cavum tympani) als
luftgefüllten Raum, in welcher sich die Gehörknöchelchen (Ossicula auditus) Hammer
(Malleus), Amboß (Incus) und Steigbügel (Stapes) befinden. Sie dienen der Weiterleitung und
Verstärkung des eintreffenden Schallsignals, in dem die Schwingungen des Trommelfells
über die bewegliche Gehörknöchelchenkette zum Innenohr weitergeleitet werden. Hierbei ist
der Hammerstiel (Manubrium mallei) im Trommelfell verankert. Die Schwingungen werden
über den Amboß, welcher gelenkig mit dem Hammer verbunden ist, auf den Steigbügel
übertragen, wobei die Fußplatte des Steigbügels (Basis stapedis) an das ovale Fenster des
Innenohres grenzt. Des Weiteren steht die Paukenhöhle über die Ohrtrompete (Tuba auditiva,
EUSTACHIsche Röhre) mit dem Nasenrachen in Verbindung, um den Luftdruck zu
regulieren und den Abfluss von Sekreten gewährleisten zu können (NICKEL et. al. 2004).
Das Innenohr bildet ein nach außen geschlossenes System. Es vereint die funktionellen
Eigenschaften des Gleichgewichtssinnes, über den Anteil des Gleichgewichtsorganes
(Vestibularapparat) sowie des Gehörsinnes, durch die nach rostroventral angeordnete
Hörschnecke (Cochlea). Während die Cochlea des Menschen im knöchernen Felsenbein
angesiedelt ist (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007), ragt die konusförmige Hörschnecke
des Meerschweinchens frei ins Mittelohr hervor (COOPER u. SCHILLER 1975). Nach außen
wird sie von einer dünnen knöchernen Ummantelung von der Paukenhöhle abgegrenzt. Im
Inneren bildet die Schneckenspindel (Modiolus) die Achse um die sich der knöcherne
Schneckengang (Canalis spiralis cochleae) beim Menschen in 2,75, beim Meerschweinchen
in 3,5 bis 4 Windungen verjüngt (NADOL 1988). Eine von der Schneckenspindel in den
Schneckengang ragende, spiralig verlaufende Knochenlamelle, (Lamina spiralis ossea) teilt
den Schneckengang mithilfe von zwei an ihm entspringenden Membranen in drei

8
Flüssigkeitsräume. Die oben gelegene Vorhoftreppe (Scala vestibuli) beginnt am ovalen
Fenster (Fenestra vestibuli) und wird zum darunter liegenden Ductus cochlearis (Scala
media) durch die REISSNERsche Membran (Membrana vestibularis) abgegrenzt. An der
Modiolusspitze kommuniziert die Vorhoftreppe über einen Hohlraum (Helicotrema) mit der
Paukentreppe (Scala tympani), welche am runden Fenster (Fenestra cochleae) endet und zur
darüberliegenden Scala media durch die Basilarmembran (Lamina basilaris) abgegrenzt ist
(NICKEL et. al. 2004). Das Flüssigkeitsvolumen der in der Paukentreppe und der
Vorhoftreppe enthaltenen Perilymphe, welche aus dem kaliumarmen Liquor cerebrospinalis
entstammt, wird von SHINOMORI et al. (2001) für Meerschweinchen mit 8,87 µl angegeben.
Zwischen der Vorhof- und der Paukentreppe befindet sich der im Querschnitt dreieckige
Ductus cochlearis, auch Scala media genannt. Dieser wird dorsal zur Scala vestibuli durch die
Membrana vestibularis abgegrenzt. Im ventralen Bereich trennt die Basilarmembran (Lamina
basilaris) die Innenräume von Ductus cochlearis und Paukentreppe. An der lateralen Seite
begrenzt die Stria vascularis den Innenraum. Hierbei handelt es sich um ein gut
vaskularisiertes Epithel, welches für die Produktion von kaliumreicher Endolymphe
verantwortlich ist, wobei für den Ductus cochlearis des Meerschweinchens ein Volumen von
1,5 µl beschrieben wird (SHINOMORI et al. 2001).
Als wesentlicher struktureller Bestandteil zur Generierung der Hörwahrnehmung befindet
sich das Cortische Organ (Organum spirale) im ventralen Bereich des Ductus cochlearis
(Abb 2). Seine Haarsinneszellen und die stabilisierenden Stützzellen sind auf der
Basilarmembran (Lamina basilaris) lokalisiert, welche von der modiolusseitigen Lamina
ossea spiralis bis zum lateral begrenzenden Ligamentum spirale reicht. Beim Menschen
beträgt die durchschnittliche Länge dieser Membran in etwa 35 mm, wobei sie beim
Meerschweinchen mit einer Länge von 16,4 ± 1,4 mm (LINSS et al. 2007) angegeben wird.
Eine besondere Art von Stützzellen, die Pfeilerzellen, bilden den Cortischen Tunnel, zu
dessen abaxialer Seite 3 bis 5 Reihen von äußeren Haarzellen (insgesamt etwa 12-19000 beim
Menschen) und zur axialen Seite eine Reihe von inneren Haarzellen (etwa 3500 beim
Menschen) angeordnet sind (LEONHARDT et al. 1990). Der Limbus spiralis ossea begrenzt
das Cortische Organ modiolusseitig. Sein Labium limbi vestibulare dient als Ansatzstelle für
die Tektorialmembran (Membrana tectoria), welche mit den apikalen Sinneshärchen
(Stereovilli) der äußeren Haarzellen in festem Kontakt steht, während die Stereovilli der

9
inneren Haarzellen keinen festen Kontakt zur Tektorialmembran haben (HOTH u. LENARZ
1997).
Abb. 2: Darstellung der Lage des Cortischen Organs im Querschnitt eines Schneckengangs der
Cochlea (modifiziert nach Nickel et al. 2004)

2.1.2 Das Spiralganglion
10
In der Schneckenspindel der Cochlea verläuft nahe der Basis der Lamina spiralis ossea ein
feiner Knochenkanal (Canalis spiralis modioli, ROSENTHALscher Kanal) in welchem sich
neben Blutgefäßen das Spiralganglion (Ganglion spirale cochleae) befindet (NICKEL et al.
2004).
Hierbei handelt es sich um größtenteils bipolare Nervenzellen, deren periphere Fortsätze die
dendritischen Fasern des Hörnervs bilden. Unter Verlust der Markscheide passieren diese von
ventral die Lamina basilaris und treten in Kontakt mit den inneren Haarzellen oder, nachdem
sie den Cortischen Tunnel durchzogen haben, in Kontakt mit den äußeren Haarzellen. Die
zentralen Axone der Ganglienzellen vereinigen sich schließlich im Inneren der
Schneckenspindel zum �ervus cochlearis, dem eigentlichen Gehörnerv.
Die Neurone des Spiralganglions werden auf Grund morphologischer und funktioneller
Unterschiede in zwei Typen unterteilt. Zum einen wird durch Typ-I-Ganglienzellen die
afferente Versorgung der inneren Haarzellen gewährleistet, während Typ-II-Ganglienzellen
die afferente Versorgung der äußeren Haarzellen übernehmen (RUBEL u. FRITZSCH 2002).
Während Typ-I-Ganglienzellen etwa 95 % der Zellpopulation ausmachen, stellen Typ-II-
Ganglienzellen nur etwa 5 % der Spiralganglienzellpopulation, wobei Typ-I-Ganglienzellen
nur jeweils mit einer inneren Haarzelle in Kontakt treten, Typ-II-Ganglienzellen aber in
Verbindung mit bis 30-60 äußeren Haarzellen stehen können (ROMAND u. ROMAND 1987;
RUBEL u. FRITZSCH 2002). Weiterhin zeigen sich histomorphologische Unterschiede
zwischen den beiden Ganglienzelltypen. Die Perikarien der bipolaren Typ-I-Ganglienzellen
sind von einer Myelinscheide umgeben, während diese bei den pseudounipolaren Typ-II-
Ganglienzellen nicht nachzuweisen ist. Zudem weisen die Zellen des Ganglion-II-Typs einen
hellen runden Kern mit einem ausgeprägten Nucleolus auf. (LEONHARDT et al. 1990). Des
Weiteren zeigen die Durchmesser der Perikarien der Typ-I-Ganglienzellen mit 12-25µm ein
im Mittel etwas größeres Ausmaß als Typ-II-Ganglienzellen (BICHLER 1984).

11
2.1.3 Physiologisches Prinzip des Hörvorgangs
Die Sinnesempfindung des Hörens wird durch die Aufnahme von akustischen Reizen und
deren Weiterleitung durch Nervenfasern zum Gehirn charakterisiert, wo diese letztlich im
Bereich der Hörrinde als solche gedeutet werden.
Der Entstehung eines akustischen Reizes liegt ein schwingender Körper zugrunde, welcher als
Schallquelle durch Druck- und Dichteschwankungen in elastischen Medien wie Gasen,
Flüssigkeiten oder Festkörpern, Schallwellen erzeugt. Die Frequenz dieser Schwingungen
definiert die Höhe des Tones und wird in Hertz (Hz) angegeben wobei die Amplitude der
Auslenkung den Schalldruck, also die Lautstärke, bestimmt. Der Schalldruckpegel (sound
pressure level = SPL) wird in Dezibel (dB) gemessen und umfasst für die Leistung des
menschlichen Ohres einen so großen Rahmen, dass er in einem logarithmischen Maß
angegeben wird (ENGELHARDT u. BREVES 2004). Weiterhin werden akustische Reize in
zwei unterschiedliche Qualitäten unterteilt. Töne werden durch eine Sinusschwingung einer
einzigen Frequenz charakterisiert, während Geräusche aus vielen, übereinandergelagerten
Frequenzen bestehen (ZENNER 1994).
Die Leistungsfähigkeit des Gehörs weist, gerade in der Fähigkeit ein bestimmtes
Frequenzspektrum zu verarbeiten, eine hohe artspezifische Variabilität auf. So können
Elefanten Infraschall bis zu einer Wellenlänge von 14 Hz wahrnehmen. Die langwelligen
Frequenzen werden über viele Kilometer transportiert, was den Tieren eine Kommunikation
über große Distanzen ermöglicht. Ein anderes Extrem findet sich bei nachtaktiven
Fledermäusen, welche sich mit Hilfe von sehr hochfrequenten Schallimpulsen auch in
absoluter Dunkelheit orientieren können. Sie sind in der Lage Frequenzen im
Ultraschallbereich bis zu 200 kHz wahrzunehmen. Die Wahrnehmung des menschlichen
Gehörs weist ein Frequenzspektrum von 20 Hz bis 20 kHz auf, wohingegen die in dieser
Studie als Tiermodell verwendeten Meerschweinchen ein Frequenzspektrum von 50 Hz bis
50 kHz aufweisen (FAY 1988; PENZLIN 1991; SCHMIDT-NIELSEN 1999). Aber nicht nur
in der Wahrnehmung der Tonhöhe, auch in der Verarbeitung von akustischen Reizen
unterschiedlicher Schallintensitäten sind speziesspezifische Unterschiede evident. Besonders
nachtaktive Carnivoren zeigen gegenüber dem Menschen ein leistungsfähigeres Gehör. So
liegt die Hörschwelle von Hauskatzen im Bereich von 1 bis 10 kHz etwa 20 dB unter der des

12
Menschen. Der gesamte Bereich der wahrnehmbaren Schallintensitäten wird als dynamische
Breite bezeichnet und liegt beim Menschen in einem Rahmen von 0-120 dB SPL
(ENGELHARDT u. BREVES 2004).
Die physiologischen Vorgänge des Hörens lassen sich in drei wesentliche Abschnitte
unterteilen. Zunächst wird der Schall über Gase oder Flüssigkeiten transportiert, was als
Konduktion bezeichnet wird. Im Anschluss werden die Schallwellen im Ohr über die
Sinneszellen in neuronale Aktivitäten umgewandelt. Bei diesem Vorgang spricht man von
Transduktion. Die Transmission oder auch Reizfortleitung steht am Ende des Prozesses der
Sinneswahrnehmung und evoziert durch die Verarbeitung im Gehirn die Wahrnehmung und
die Interpretation der Qualität des akustischen Reizes (WEHNER u. GEHRING 2003).
Am Beginn des eigentlichen Hörvorganges treffen die Schallwellen, welche durch die
Ohrmuschel zum Gehörgang geleitet werden, auf das Trommelfell. Dieses wird dadurch in
Schwingung versetzt und gibt diese mechanische Bewegung an den mit ihm verbundenen
Hammer der Gehörknöchelchen weiter. Amboss und Steigbügel leiten diese Bewegung
weiter, wodurch letztlich über die Steigbügelplatte ein Druck auf die Membran des ovalen
Fensters ausgelöst wird. Dieser Druckimpuls wird auf die dahinterliegende Perilymphe
übertragen. Durch die Inkompressibilität der Perilymphe bildet sich eine Wanderwelle. Diese
beginnt am ovalen Fenster und verläuft über die Scala tympani bis zur Schneckenspitze und
über das Helicotrema in die Scala vestibuli, worüber sie letztlich zum runden Fenster gelangt.
Hierdurch wird die Basilarmembran in Schwingungen versetzt, wodurch es zu Scherkräften
zwischen den Stereovilli der Haarzellen und der darüberliegenden Tektorialmembran kommt
(LEONHARDT 1990). Durch die Auslenkung der Stereovilli werden am apikalen Zellende
Ionenkanäle geöffnet. So strömen aus der kaliumreichen Endolymphe des Ductus cochlearis
Kalium-Ionen in die Zelle, wodurch es zur Depolarisation und zum Einstrom von Kalzium-
Ionen kommt. Durch die Depolarisation werden am basalen Zellpol in der Folge
exzitatorische Neurotransmitter freigesetzt, wobei es sich hier vermutlich um Glutamat
handelt (JANSSEN et al. 1991). Somit werden an den Afferenzen der Spiralganglienzellen
Aktionspotentiale ausgelöst, was den Transduktionsprozess, also die Umwandlung eines
äußeren Reizes in ein neuronales Körpersignal, abschließt.
Die Wahrnehmung von unterschiedlichen Tonhöhen wird durch das Prinzip der
Frequenzdispersion ermöglicht. Hierbei kommt es zu einer ortstonotopen Auslenkung der

13
Basilarmembran durch die Wanderwelle. Dies bedeutet, dass unterschiedliche
Schallfrequenzen zu einer maximalen Amplitude der Wanderwelle an unterschiedlichen Orten
der Basilarmembran führen. So zeigt der Durchmesser des Schneckenganges im basalen
Bereich eine wesentlich weitere Ausdehnung als apikal. Zudem besitzt die Basilarmembran in
Apexnähe eine 1000-fach höhere Steifigkeit als im basalen Bereich. Dadurch kommt es zum
Amplitudenmaximum der Wanderwelle hoher Frequenzen im basalen Bereich, während tiefe
Frequenzen Wanderwellen mit einem Maximum in Apexnähe bilden (ALLEN 1980;
ZENNER 1994). Zu dieser passiv durch die Wanderwelle ausgelösten Frequenzselektivität
wird zusätzlich eine aktive Verstärkung der Wanderwelle durch die äußeren Haarzellen
erreicht. Diese besitzen, neben der Fähigkeit zur Umwandlung von Schallenergie in
elektrische Energie, motorische Eigenschaften durch ihr Aktinfilamentskelett und antworten
auf Beschallung mit einer Kontraktion. Durch diesen aktiven Prozess verstärken sie die
Amplitude der Wanderwelle und dämpfen benachbarte Basilarmembranabschnitte. Die
Frequenzselektivität beruht damit auf der passiven Wanderwelle sowie auf einer durch die
äußeren Haarzellen hervorgerufenen aktiven Verstärkung der Wanderwelle, wobei dieser
Anteil den passiven Vorgang wesentlich übersteigt (REISS 2009).
2.2 Hörminderung und Ertaubung
2.2.1 Formen der Hörschädigungen
Ätiologisch können Beeinträchtigungen des Hörempfindens in angeborene und erworbene
Schädigungen eingeteilt werden. Während eine Fehlfunktion des Genoms ursächlich für
hereditär bedingte Defekte ist, entstehen erworbene Schädigungen des Hörempfindens im
Wesentlichen durch exogen zugeführte Noxen. Hierbei sind die Applikation von ototoxisch
wirksamen Arzneimitteln (YAMANE et al. 1988; SELIMOGLU 2007) oder eine verstärkte
Lärmexposition (MINAMI 2007) als Hauptursachen zu sehen.
Weiterhin werden Hörschädigungen topographisch in schallleitungsbedingte, konduktive
Beeinträchtigungen sowie in schallempfindungsbedingte, sensorineurale Beeinträchtigungen
unterteilt (HOTH u. LENARZ 1994).

14
Die konduktiven Fehlfunktionen betreffen das äußere und das Mittelohr. Hierbei kann es
durch eine Vielzahl von möglichen Veränderungen zu einer gestörten Weiterleitung der
Schallwellen kommen. Dadurch kann das Hörempfinden auch bei einem völlig intakten
Innenohr gedämpft erscheinen oder völlig fehlen. Beispiele hierfür können eine vermehrte
Ansammlung von Cerumen, Otosklerose, Neoplasien oder auch entzündliche Schwellungen
sein.
Ursachen von Schallempfindungsschwerhörigkeiten finden sich zum einen im Innenohr und
werden als sensorische Fehlfunktionen (cochleär) bezeichnet. Weiterhin werden Störungen
des Hörnervs als neurale und Fehlfunktionen im Bereich der zentralen Hörbahn als zentrale
Störungen (retrocochleär) benannt (HOTH u. LENARZ 1994). Erkrankungen und
Schädigungen der cochleären, sowie der retrocochleär gelegenen Strukturen werden als
sensorineuraler Hörverlust zusammengefasst.
Im Folgenden wird auf den sensorineuralen Hörverlust genauer eingegangen, da sich die
vorliegende Studie mit der Verwendung von Nanopartikeln als Medikamentenapplikations-
System (Drug-Delivery-System) zur potentiellen intracochleären Therapie bei Patienten mit
sensorineuralem Hörverlust befasst.
2.2.2 Sensorineuraler Hörverlust
Der sensorineurale Hörverlust fasst Erkrankungen und Schädigungen der cochleären, sowie
der retrocochleär gelegenen Strukturen zusammen.
Der retrocochleäre, bzw. neurale Hörverlust ist ätiologisch durch Veränderungen des
Hörnerves oder durch die Beeinträchtigung der weiterführenden Anteile der zentralen
Hörbahn charakterisiert. Hierbei handelt es sich häufig um neoplastische Veränderungen,
wobei aber auch entzündliche Prozesse oder Traumata nicht selten als Ursache in Frage
kommen (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007).
In der Humanmedizin stellt aber der cochleäre oder auch sensorische Hörverlust die weitaus
häufigste Form der Schwerhörigkeit dar. Durch eine initiale Schädigung der Haarzellen ist die
Transduktion von akustischen Reizen nicht mehr gegeben, wodurch ein Hörempfinden nicht

15
mehr ermöglicht werden kann. Ursachen für diese Form der Hörschädigung können
angeboren sowie erworbenen sein.
Bei den angeborenen Formen unterscheidet man syndromale von nichtsyndromalen
Ausprägungen. Beispiele für syndromale Ausprägungen sind mit Nieren- (z.B. Alport-
Syndrom) oder Augenerkrankungen (z.B. Cogan-Syndrom, Wardenburg-Syndrom)
assoziierte Hörschädigungen. Nichtsyndromale Ausprägungen werden beim Menschen
hauptsächlich durch eine Mutation der gap-junction-Proteine Connexin 26 und 31
hervorgerufen (LEFEBVRE u. VAN DE WATER 2000; LIU et al. 2008).
Weiterhin kann der Verlust von Haarzellen aber auch durch Erkrankungen der Mutter
während der Schwangerschaft ausgelöst werden, welche metabolische (bspw. Diabetes
mellitus) oder infektiöse (bspw. Röteln) Ursachen haben können. Auch bei einem erschwerten
Geburtsverlauf kann durch das Auftreten von Hypoxie eine Schädigung des Gehörs eintreten
(BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007).
In der Veterinärmedizin sind angeborene Hörminderungen in der Regel mit einer
Pigmentierungsstörung assoziiert. So ist die Fellfarben-assoziierte sensorineurale Taubheit bei
Katzen, Hunden, Pferden und Neuweltkameliden beschrieben (WEBB u. CULLEN 2010).
Als Ursache werden zum einen Defekte in der Differenzierung und Reifung von Melanozyten
diskutiert, zum anderen aber auch ein frühzeitiges Absterben sowie eine Fehlfunktion dieser
auch in der Stria vascularis angesiedelten Zellen. So kann eine physiologische Funktion
dieses in der Cochlea befindlichen Epithels nicht erreicht werden. In der Folge kommt es zum
Absterben der Sinneszellen, wodurch das Tier letztlich ertaubt (STEEL u. BARKWAY 1989;
OHLEMILLER 2009). So ist bei Katzen mit weißer Fellfärbung und blaugefärbter Iris eine
polygenetische Ursache für den Hörverlust beschrieben (GEIGY et al. 2007). Bei Pferden,
insbesondere Paint-Horses, wurde eine Assoziation zu dem endothelian receptor type B
(EDNRB)-Gen nachgewiesen, welches auch für die Ausprägung des letalen, weißen,
Fohlensyndroms verantwortlich ist (MAGDESIAN et al. 2009). Bei Hunden hingegen
erwiesen sich Assoziationen zum Merle-Gen (z.B. Bobtail, Blue-Merle-Collie,
harlekinfarbige-Dogge) sowie zum Piebald-Gen (z.B. Dalmatiner, Greyhound) als ursächlich
(STRAIN et al. 2004; PLATT et al. 2006).
Ursachen für einen erworbenen Verlust von Haarzellen können ebenfalls sehr vielfältig sein.
So stellt neben altersbedingtem Hörverlust der Einfluss von ototoxischen Substanzen einen

16
wesentlichen Anteil der erworbenen Hörminderungen dar. Aber auch Schädigungen durch
eine erhöhte Lärmexposition führen zu einem Verlust von Haarzellen.
Durch die Applikation von ototoxisch wirksamen Arzneimitteln, wie Aminoglykosid-
Antibiotika oder Schleifendiuretika, kommt es nach systemischer Anwendung zu einer
Schädigung der Haarzellen. So ist bereits nach wenigen Stunden post applicationem ein von
der Basis der Cochlea ausgehender Haarzellverlust zu verzeichnen (WU et al. 2002). Hierbei
wird die arzneimittelinduzierte Apoptose der Haarzellen im Wesentlichen durch zwei
Mechanismen initiiert. Einerseits kommt es zur vermehrten Bildung von reactive oxygen
species (ROS), welche über die Bildung freier Radikale die Apoptose der Zellen hervorrufen.
Andererseits wird über eine Aktivierung der Stickstoffmonoxid-(NO)-Synthase die NO-
Konzentration in den Zellen erhöht, was letztlich wieder zur Bildung von freien Radikalen
und somit zur Apoptose führt (PRIUSKA u. SCHACHT 1995; TAKUMIDA et al. 1999).
WEST et al. (1973) wiesen in Tierversuchen den Effekt des Haarzellverlustes durch die
kombinierte Injektion des Aminoglykosids Kanamycin und des Schleifendiuretikums
Ethacrynsäure nach. Aus diesen Ergebnissen etablierte sich ein häufig angewendetes Modell
für die Erforschung der Taubheit nach initialem Haarzellverlust, wobei gleiche Erfolge durch
die Verwendung des Schleifendiuretikums Furosemid erzielt werden konnten (VERSNEL et
al. 2007). Eine weitere anerkannte Methode zur Ertaubung von Versuchstieren stellt ein durch
erhöhte Lärmexposition hervorgerufener Hörverlust (noise induced hearing loss, NIHL) dar.
Auch hier werden die apoptotischen Vorgänge über die Bildung von ROS und reactive
nitrogen species (RNS) eingeleitet, indem sie zur Bildung von freien Radikalen führen
(MINAMI 2007). Die schädigenden Effekte der durch Aminoglykoside sowie durch Lärm
erzeugten Ertaubung führen demnach durch denselben Startmechanismus zur Apoptose der
Haarzellen (KOPKE et al. 1999).
Durch den primären Verlust von Haarzellen kommt es im weiteren Verlauf zu einer
sekundären Degeneration der Spiralganglienzellen (OTTE et al. 1978; WEBSTER u.
WEBSTER 1981; SPOENDLIN 1984), welche die erste Station der Reizweiterleitung in
Bezug auf das Hörempfinden bilden. So hat die Anzahl der Spiralganglienzellen einen
entscheidenden Einfluss auf die Funktionalität und den damit verbundenen therapeutischen
Erfolg von Cochlea-Implantaten (GANTZ et al. 1993). Als Hauptursachen für die Apoptose
der Spiralganglienzellen nach initialem Haarzellverlust werden zum einen die fehlende

17
elektrische Stimulierung durch die von den Haarzellen gebildeten Neurotransmitter
beziehungsweise Aktionspotentiale gesehen, zum anderen produzieren die Haarzellen eine
Reihe von neurotrophen Faktoren. Von diesen üben unter anderem Neurotrophin-3, brain-
derived neurotrophic factor (BDNF) und glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)
einen essentiellen Einfluss auf die Vitalität der Spiralganglienzellen aus. Ohne die
Anwesenheit der neurotrophen Faktoren ist langfristig das Überleben der Spiralganglienzellen
nicht möglich (DODSON 1997; KANZAKI et al. 2002).
2.2.3 Kompensation des sensorischen Hörverlusts durch Cochlea-Implantate
Nach Verlust der Haarzellen ist es heute mittels eines Cochlea- Implantats möglich, ertaubten
Patienten die Wiedererlangung eines Höreindrucks zu vermitteln. Hierdurch kann betroffenen
Personen ein erneutes Sprachverständnis ermöglicht werden, was in einer erheblichen
Steigerung der Lebensqualität resultiert (MATSCHKE u. PLATH 1988). Um jedoch eine
Therapie mit Cochlea-Implantaten gewährleisten zu können, muss nach der Schädigung der
sensorischen Strukturen die vollständige Funktionalität der den reizweiterleitenden Anteile
der Hörbahn gegeben sein (BOENNINGHAUS u. LENARZ 2007).
Cochlea-Implantate bestehen aus mehreren externen sowie internen, implantierten Anteilen.
Zu den äußeren Anteilen zählt der im Außenohrbereich getragene Sprachprozessor, welcher
über ein Mikrophon empfangene Schallschwingungen nach Filterung, Entrauschung und
Komprimierung in elektrische Signale umwandelt. Das erzeugte Signalmuster wird an die
ebenfalls externe, an der Kopfhaut getragene Sendespule weitergeleitet. Durch
elektromagnetische Induktion wird die Information transkutan an die im Bereich des Mastoids
implantierte Sendespule übermittelt. Letztlich gelangen die Signale über die mit der
Sendespule verbundene Elektrode zum Hörnerv (LEHNHARDT et al. 1986). Die über eine
Cochleostomie oder über die Rundfenstermembran in die Scala tympani eingeführte und
möglichst modiolus- und damit spiralganglienzellnah positionierte Mehrkanalelektrode,
ermöglicht durch die bis zu 22 Elektrodenkontakte eine frequenzabhängige elektrische
Reizung der Spiralganglienzellen. Diese generieren daraufhin Aktionspotentiale, welche über

18
die zentrale Hörbahn zum auditorischen Cortex weitergeleitet werden, wo sie einen
Höreindruck evozieren (LENARZ 1997).
In den letzten Jahren konnte unter anderem durch die Weiterentwicklungen der Elektroden ein
immer besseres Hörempfinden und damit auch ein erheblich gesteigertes Sprachverständnis
erzielt werden (HELMS u. MÜLLER 1999; BRADLEY et al. 2010). Dennoch ist der durch
das Implantat erreichte Höreindruck nicht mit den physiologischen Leistungen zu
vergleichen. Des Weiteren treten zuweilen beträchtliche Unterschiede zwischen behandelten
Personen auf, welche in den individuellen Voraussetzungen begründet liegen (GANTZ et al.
1993). Zusätzlich wird die Funktionalität des Cochlea-Implantats durch zwei wesentliche
Faktoren beeinträchtigt. Zum einen muss die Anzahl der durch die Hörprothese angeregten
Spiralganglienzellen auf einem möglichst hohen Niveau erhalten werden (INCESULU u.
NADOL 1998), zum anderen kommt es durch postoperative Gewebsreaktionen zu
Bindegewebsproliferationen und somit zu einer verschlechterten Nerv-Elektroden Interaktion,
welche eine suboptimale Signalübertragung zwischen Elektrode und Spiralganglienzellen
bedingt (NEWBOLD et al. 2004; PAASCHE et al. 2009).
2.2.4 Ansätze zur Verbesserung der �erv-Elektroden-Interaktion
Durch den Verlust der Haarzellen im Zuge der sensorischen Hörminderung kommt es
aufgrund fehlender Haarzell-vermittelter elektrischer Stimulation, sowie der ausbleibenden
Produktion von neurotrophen Faktoren zu einer progressiven Degeneration der
Spiralganglienzellen (DODSON 1997; KANZAKI et al. 2002). Diesen sekundär eintretenden
Zellverlust gilt es aufzuhalten, da eine Therapie mittels Cochlea-Implantat ohne eine
ausreichende Dichte dieser Nervenzellen nicht optimal genutzt werden kann.
Durch intensive Forschung konnten eine Vielzahl von neuroprotektiven Substanzen ermittelt
werden, welche einen positiven Einfluss auf das Spiralganglienzellüberleben in vitro, sowie
auch im Tierversuch nach erfolgter Ertaubung, zeigten (GILLESPIE u. SHEPHERD 2005).
In Zellkulturexperimenten wurde ein protektiver Effekt auf das Spiralganglienzellüberleben
unter anderem für brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin-3 (NT-3) sowie
neurotrophin-4/5 (NT-4/5) nachgewiesen. Diese zu den Neurotrophinen gehörenden

19
Substanzen stellen körpereigene Signalstoffe dar, welche über die Bindung an
membranständige Rezeptoren die Interaktionen zwischen Neuronen modulieren und einen
Einfluss auf das Überleben (HEMPSTEAD et al. 2006) und die Funktion der Neurone haben
(REICHHARDT et al. 2006). Es werden zwei Arten von Rezeptoren unterschieden. Zum
einen können Neurotrophine über den p75NT-Rezeptor binden, welcher zu den Rezeptoren
der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-Familie gehört und alle Neurotrophine binden kann und
dadurch einen programmierten Zelltod auslöst. Im Vergleich zu den Rezeptoren der
Tyrosinkinase-Rezeptor-Familie (TrkA, TrkB, TrkC) ist seine Affinität zu Neurotrophinen
aber vergleichsweise gering. Diese hingegen binden nur spezifische Neurotrophine, wobei
nach erfolgreicher Bindung eine Kaskade antiapoptotischer Vorgänge ausgelöst wird. Der für
BDNF spezifische Rezeptor wird als TrkB bezeichnet (HUANG u. REICHARDT 2001). So
erwiesen sich BDNF und NT-4/5 als sehr potente Substanzen, um das Überleben von
kultivierten Spiralganglienzellen neonataler Ratten im Vergleich zu unbehandelten
Kontrollgruppen zu sichern, während der Effekt von NT-3 zwar schwächer ist, aber dennoch
eine signifikante Protektion zeigte (ZHENG et al. 1995; MALGRANGE et al. 1996;
MARZELLA et al. 1999). Durch BDNF konnte des Weiteren eine Stimulation des
Neuritenwachstums bei neonatal gewonnenen Spiralganglienzellen beobachtet werden
(HARTNICK et al. 1996; MALGRANGE et al. 1996; GILLESPIE et al. 2001). Aber nicht
nur Versuche mit neonatal gewonnenen, auch Studien mit Spiralganglienzellen adulter Ratten
zeigten einen positiven Einfluss von BDNF auf die Überlebensrate (LEFEBVRE et al. 1994).
So scheint der trophische Support der Spiralganglienzellen durch neurotrophe Faktoren auch
im ausgewachsenen Organismus eine entscheidende Rolle zu spielen (GILLESPIE u.
SHEPHERD 2005), dennoch konnte bei Studien mit Spiralganglienzellen adulter Ratten kein
vermehrtes Neuritenauswachsverhalten gezeigt werden (LEFEBVRE et al. 1994).
Auch im Tierversuch konnten die in den Zellkulturexperimenten gewonnen Erkenntnisse
reproduziert werden. So wurden in zahlreichen Studien die Effekte unterschiedlicher
neurotropher Faktoren an experimentell ertaubten Versuchstieren evaluiert. Besonders BDNF
stellte sich in Versuchen mit mittels Kanamycin und Furosemid ertaubten Meerschweinchen
als stark protektiv heraus. So wurde die Applikation von 0,25 µl/h BDNF in einer
Konzentration von 62,5 µg/ml über einen Zeitraum von 28 Tagen ab dem fünften Tag nach
der Ertaubung über eine osmotische Pumpe reguliert und bewirkte eine signifikant erhöhte

20
Spiralganglienzellüberlebensrate (SHEPHERD et al. 2005). GILLESPIE et al. (2004) konnten
des Weiteren auch protektive Effekte für NT-3, NT-4/5 in einer Konzentration von 62,5 µl/ml
bei einer Verabreichung von 0,25 µl/h nachweisen. Hierbei wurden die Tiere erst nach 14
Tagen mittels osmotischer Pumpen für 4 Wochen versorgt.
Aber auch ein nicht zu den Neurotrophinen gehörender neurotropher Faktor stellte sich im
Tiermodell als vielversprechend heraus. Der zur Transforming Growth Factor-β-(TGF-β)-
Superfamilie gehörende glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF) bewirkte bei
durch Lärmexposition ertaubten Meerschweinchen ein signifikant gesteigertes
Spiralganglienzellüberleben. Die Applikation des GDNF erfolgte dabei über einen Zeitraum
von 3 Wochen mittels osmotischer Pumpe. Die Behandlung wurde 4 Tage nach der Ertaubung
begonnen wobei zunächst eine Applikation von 72 ng/h GDNF über einen Zeitraum von
7 Tagen erfolgte. Die darauf folgenden 14 Tage wurde die Menge jedoch auf 50 ng/h GDNF
reduziert (YLIKOSKI et al. 1998).
Neben der Applikation von neuroprotektiv wirkenden Substanzen wurden auch Studien zur
Ermittlung eines spiralganglienzellprotektiven Effekts durch elektrische Stimulierung
durchgeführt. Die Ergebnisse der Studien durch HEGARTY et al. (1997) zeigten einen
positiven Effekt auf die Vitalität von isoliert angezüchteten Spiralganglienzellen durch
Wechselstrom. WEFSTAEDT (2006) konnte dahingegen in einem ähnlichen Versuchsaufbau
keine signifikant gesteigerten Überlebensraten im Vergleich zu unstimulierten Zellgruppen
feststellen. Die Anwendung von elektrischer Stimulation zeigte im Tiermodell in
Kombination mit Neurotrophen Faktoren vielversprechende Ergebnisse (KANZAKI et al.
2002; GILLESPIE u. SHEPHERD 2005; SHEPHERD et al. 2005). Aber auch der alleinige
Einfluss der elektrischen Stimulation auf die Spiralganglienzelldichte ertaubter
Meerschweinchen wurde von LOUSTEAU (1987) als signifikant erhöht beschrieben.
Weiterhin zeigte SCHEPER (2007) im Versuch mit Kanamycin/Ethacrynsäure ertaubten
Meerschweinchen, dass durch die Kombination von GDNF und elektrischer Stimulation eine
noch höhere Spiralganglienzelldichte erreicht werden kann als durch die einzeln verabreichten
Faktoren. Hierbei wurde mit der Behandlung über die elektrischen Stimuli, sowie auch die
Applikation der entsprechenden neurotrophen Faktoren, drei Wochen nach der Ertaubung
begonnen.

21
Neben dem Erhalt der noch verbleibenden Spiralganglienzellen ist für die Therapie mittels
eines Cochlea-Implantats eine möglichst optimale Nerv-Elektroden-Interaktion anzustreben.
Daher ist während der Insertion der Elektrode auf eine modiolusnahe Positionierung zu achten
(SHEPHERD et al. 1993). So wurden mittlerweile Cochlea-Implantate entwickelt, deren
spiralförmig hergestellte Elektrode zunächst über ein Stilett in gerader Position gehalten wird.
Während der Insertion der Elektrode wird das Stilett entfernt und die Elektrode kehrt in ihre
Ausgangsformation zurück und kann sich so in Modiolusnähe positionieren (RAU et al.
2010). Durch die spiralganglienzellnähere Position wird so ein wesentlicher Einfluss auf die
Hörschwelle genommen (SHEPHERD et al. 1993).
Ein weiterer wichtiger Einflussfaktor bezüglich der Nerv-Elektroden-Interaktion ist die
Gewebsmanipulation im Rahmen der Operation. So kommt es durch die Insertion des
Implantats zu einer Fremdkörperreaktion, in deren Verlauf der Organismus die Elektrode
durch Bildung von Bindegewebe vom Körper abkapselt (TYKOCINSKI et al. 2001;
PAASCHE et al. 2006). Dadurch kommt es zu einer Erhöhung der Impedanzen zwischen
Nerv und Elektrode, was zum einen zu einer Erhöhung der Hörschwelle, zum anderen aber
auch zu einem erhöhten Energieverbrauch des Implantats führt. So richtet sich ein
Schwerpunkt der Forschungen auf eine Verminderung der postoperativen
Bindegewebsbildung.
Als möglichen Ansatz für die Hemmung des Bindegewebswachstums eignen sich
antiinflammatorisch wirkende Substanzen, wie zum Beispiel Glukokortikoide. Vertreter
dieser Arzneimittelgruppe zeichnen sich durch ihre hohe antiinflammatorische und
immunsuppressive Wirkung aus. In einer humanen Versuchsreihe konnte durch die einmalige
intraoperative Applikation des Glukokortikoids Triamcinolon eine signifikante Verringerung
der Impedanz von Patienten mit Cochlea-Implantaten im Vergleich zur Kontrollgruppe
erreicht werden. Hierbei wurde das Glukokortikoid in Form einer Kristall-Suspension
verabreicht, was die Freisetzung des Arzneimittels über einen verlängerten Zeitraum von
mehreren Wochen sicherstellte (PAASCHE et al. 2006). Auch HUANG und Kollegen (2000)
konnten zeigen, dass durch Glukokortikoidtherapie posttraumatische Gewebsreaktionen und
die darauffolgende Fibrosierung verringert werden kann. Weiterhin konnte WEFSTAEDT
(2006) belegen, dass eine Applikation des Glukokortikoids Dexamethason in einer
Konzentration von 100 ng/ml keinen Einfluss auf das Überleben von in Zellkultur

22
angezüchteten Spiralganglienzellen hat. In einer weiteren Studie am Meerschweinchenmodell
zeigte sich jedoch durch die Applikation von 0,5 µl Dexamethason in einer Konzentration von
100 ng/ml über einen Zeitraum von 4 Wochen nach Insertion eines Elektrodenträgers, keine
signifikante Verringerung des postoperativen Bindegewebswachstums (SCHEPER 2007).
Ein weiterer Ansatz zur verbesserten Nerv-Elektroden-Interaktion besteht in der
Modifizierung der Implantatoberflächen. Hierdurch soll die Adhärenz von entstehendem
Bindegewebe verhindert werden, was in einer verringerten Impedanz resultieren würde.
In-vitro-Studien zeigten, dass auf mittels Lasertechnik mikrostrukturierten Modelloberflächen
aus Silikon bzw. Platin das Fibroblastenwachstum signifikant gehemmt werden kann (REICH
et al. 2008). Somit ist anzunehmen, dass durch die speziell strukturierte Elektrodenoberfläche
eine weitere Optimierung der Leistung von Cochlea-Implantaten ermöglicht werden könnte.
2.2.5 Applikationswege zur medikamentösen Therapie des Innenohres
Die systemische Behandlung von Erkrankungen des Innenohres wird durch das
Vorhandensein der Blut-Cochlea-Schranke erschwert. Nur durch die Applikation von
Arzneimitteln in sehr hohen Dosierungen kann ein ausreichender Wirkstoffspiegel im
Innenohr erreicht werden, was zu einem hohen Risiko von Nebenwirkungen führt (SWAN et
al. 2008). Somit stellen lokale Therapien meist die einzige Möglichkeit dar, eine gezielte
Behandlung von Innenohrerkrankungen durchzuführen.
Hierzu eignet sich zunächst die Applikation von Wirkstoffen über die Rundfenstermembran.
Im Gegensatz zur direkten intracochleären Verabreichung von Arzneimitteln wird eine
genaue Dosierung durch erhebliche individuelle Unterschiede in der Dicke der Membran und
der daraus variablen Diffusionsgeschwindigkeit erschwert (BANERJEE u. PARNES 2004).
Vorteile hinsichtlich der intracochleären Applikation ergeben sich aber durch ein geringeres
Infektionsrisiko sowie einem geringeren Operationstrauma. Neben der Applikation von
lipophilen Arzneimitteln, wie Glukokortikoiden, zeigten Studien auch den Übertritt von
adenoviralen Vektoren durch die Rundfenstermembran in das Innere der Cochlea. So konnte
mit Hilfe von Gensequenzen, welche in diesem viralen Drug-Carrier transportiert wurden, die
erfolgreiche Transfektion von Zellen der Cochlea nachgewiesen werden, obgleich sie

23
wesentlich geringer war, als es in Studien mit intracochleärer Applikation gezeigt werden
konnte (STÖVER et al. 1999). Aber auch die Applikation von Nanopartikeln, als mögliches
Drug-Carrier-System, zeigte gute Penetrationseigenschaften durch die Rundfenstermembran
(ZHANG et al. 2011).
Trotz des höheren Infektionsrisikos haben intracochleäre Applikationswege aufgrund der
genaueren Dosierungsmöglichkeiten und der besseren intracochleären Verteilung erhebliche
Vorteile gegenüber der Behandlung über die Rundfenstermembran. So können Arzneimittel
durch die einmalige Applikation per Mikroliterspritze und angeschlossenem
Injektionskatheter in die Scala tympani gebracht werden (LEGOUIX u. PIERSON 1977;
PAASCHE et al. 2006; SCHEPER et al. 2009b). Eine weitere Möglichkeit bieten osmotische
Pumpen, welche über einen Mikrokatheter die entsprechenden Wirkstoffe kontinuierlich über
einen längeren Zeitraum in die Cochlea bringen können, wobei sich aber das Risiko einer
Fibrosierung durch den im Innenohr positionierten Katheter ergibt (BROWN et al. 1993).
Das Einschleusen von Gensequenzen stellt eine weitere Möglichkeit dar, erhebliche Erfolge
in der Behandlung von Innenohrerkrankungen zu erzielen. Durch die Verwendung von
Gensequenzen neurotropher Faktoren könnten die intracochleär transfizierten Zellen die
Produktion dieser Substanzen selbst übernehmen (YAGI et. al. 2000; REJALI et. al. 2007).
Aber auch Gensequenzen zur Transdifferenzierung von Stützzellen des Cortischen Organs
könnten eine hoffnungsvolle Therapiemöglichkeit ergeben. So konnten Stützzellen durch die
Transfektion mit dem Math1 bzw. Atoh1-Gen in funktionelle Haarzellen umgewandelt
werden (KAWAMOTO et al. 2003; IZUMIKAWA et al. 2005).
Der Transport dieser Gensequenzen ist über Drug-Delivery-Systeme, wie zum Beispiel virale
Vektoren, durchführbar. Trotz vielversprechender Ergebnisse hinsichtlich der Expression und
daraus erzielten protektiven Wirkungen auf die Zellen des Innenohres (DUAN et al. 2004;
YAGI et. al. 2000), weisen virale Vektoren erhebliche Nachteile auf. So zeigen sie meist sehr
niedrige Transfektionsraten von geringer Dauer und sind gegenüber den unterschiedlichen
Zelltypen sehr unspezifisch. Darüber hinaus zeigte sich ein hohes Potential für entzündliche
und immunologische Reaktionen. Zudem weisen die Vektoren die Fähigkeit zur Migration in
das kontralaterale Innenohr auf (KHO et al. 2000; STÖVER et al. 2000). Letztlich stellt die
potentielle Infektiosität ein weiteres Risiko bei der Behandlung von Menschen dar, welches
zudem ethische Bedenken begründet.

24
Eine weitere Behandlungsmöglichkeit besteht darin, über die zellbasierte Therapie
neurotrophe Faktoren in der Cochlea freizusetzen. So können genmodifizierte Fibroblasten
das Neurotrophin brain derived neurotrophic factor (BDNF) produzieren und über eine
modifizierte Elektrode in die Cochlea gebracht werden (REJALI et al. 2007). Jedoch sind
noch keine Daten über die Dauer der BDNF-Produktion sowie andere etwaige Einflüsse auf
die Cochlea durch Abwanderung und einer dadurch möglichen Fibrosierung durch die
eingebrachten Zellen bekannt.
Begründet durch die noch nicht absehbaren Gefahren der zellbasierten Therapie, sowie den
Nachteilen der viralen Vektoren, besteht die Notwendigkeit, neue Therapiemöglichkeiten zu
entwickeln, wobei ein viel versprechender Ansatz in der Entwicklung nonviraler Vektoren
liegt. So bieten synthetisch hergestellte Nanopartikel eine aussichtsreiche Möglichkeit zum
Transport von Arzneimitteln oder Gensequenzen und zeigen dabei nicht die erheblichen
Nachteile viraler Vektoren auf. Die Vorteile der nanopartikelbasierten Therapie liegen in der
nicht vorhandenen Infektiosität sowie in der Produktion von biodegradablen Grundgerüsten,
welche eine möglichst geringe Reaktion des Körpers erwarten lassen. Weiterhin ist eine
kostengünstige Herstellung realisierbar, wobei durch die Möglichkeit der
Oberflächenmodifikation des Partikels mit spezifischen Rezeptoren eine Zellselektivität
erreicht werden soll, sodass ganz bestimmte Gewebe oder Zellpopulationen angesteuert
werden können. Durch den Einsatz von Nanopartikeln ist demnach eine gezielte Behandlung
von verändertem Gewebe denkbar, was entscheidende Vorteile gegenüber den
herkömmlichen Therapieformen hinsichtlich der Minderung von Nebenwirkungen bewirken
kann (PAUTLER u. BRENNER 2010).

2.3 �anotechnologien
2.3.1 Definition, Eigenschaften von �anostrukturen und deren Anwendung
25
Eine präzise Definition des Terminus “Nanotechnologie” stellt sich als Herausforderung dar.
So ist in der Literatur keine einheitliche Beschreibung über die Größe der hergestellten
Strukturen zu finden. Die Angaben geben dennoch einen Rahmen von 0,1 bis 500 nm an
(WOLF 2009; PHILPOTT 2011 et al.), wobei sich der Großteil der Quellen auf einen
Größenbereich von 1 bis 100 nm beschränkt (NARDUCCI 2007; RIVIERE 2007; SCOTT
2007; KIM et al. 2010). In diesem Maßstab zeigen sich aufgrund der physikalischen,
chemischen und biologischen Eigenschaften von Materialen häufig abweichende
Eigenschaften im Vergleich zum makroskopischen Level (RIVIERE 2007; SCOTT 2007). So
wird die chemische Reaktivität durch die extrem große Oberfläche im Verhältnis zum
Volumen immens gesteigert, wodurch Nanostrukturen eine katalytische Wirkung
zugeschrieben werden kann (SCOTT 2007; LIU u. GU 2009; KIM et al. 2010)
Die Grundgerüste der Nanostrukturen sind vielgestaltig, so ist es möglich, je nach
gewünschtem Einsatzgebiet organische wie auch anorganische Strukturen zu synthetisieren,
welche die unterschiedlichsten Formen aufweisen können. Neben den aus Kohlenstoffatomen
bestehenden sphärischen Fullerenen sind auch sogenannte �anotubes herstellbar, bei denen
die Kohlenstoffatome in Form einer Röhre angeordnet sind. Die beachtliche mechanische
Belastbarkeit dieser Nanostrukturen (ZHANG et al. 2005) macht den Einsatz zur
Stabilisierung der unterschiedlichsten Materialien denkbar. So reichen die Visionen über die
Verbesserung der Belastbarkeit von Alltagsgegenständen bis hin zur Optimierung von
schusssicherer Kleidung (COLLINS 2000). Des Weiteren werden im Bereich der
Medizinforschung liposomale Partikel als Arzneimitteltransporter eingesetzt. Aber auch
sogenannte Dendrimere, welche sich durch eine verzweigte Grundstruktur auszeichnen, sind
für die Ankopplung von Arzneimitteln geeignet und werden in diesem Gebiet eingesetzt.
(KIM et al. 2010).
Aufgrund der besonderen Eigenschaften findet Nanotechnologie heute in den
unterschiedlichsten Bereichen Anwendung, wobei Nanostrukturen allein oder im Hinblick auf
die Modifikation von Oberflächen anderer Materialen genutzt werden. Diese vielfältige

26
Anwendbarkeit fördert Weiterentwicklungen insbesondere in den Bereichen der Medizin
(Diagnose, Monitoring, Behandlung) und Elektronik (z.B. Mikrochips). Aber auch in den
Materialwissenschaften werden vermehrt Nanostrukturen angewendet, wobei beispielsweise
mit „Manufactured Nanomaterials“ beschichtetes Glas einen Lotuseffekt aufweist, was in der
Solarzellindustrie einen entscheidenden Beitrag zu einer langfristig hohen Energiegewinnung
führt (LEE et al. 2010). Zudem konnten in den letzten Jahren Erfolge zur Verlängerung der
Haltbarkeit von Lebensmitteln durch speziell mit Nanotechnolgie optimierten
Verpackungsstoffen erreicht werden. Durch antibakteriell wirksame Nanobeschichtungen
kann so ein frühzeitiges Verderben der Nahrung verhindert werden (IMRAN et al. 2010).
2.3.2 �anotechnologie in der Medizin
Nanotechnologien finden bereits heute ein breites Anwendungsspektrum in der Medizin. So
werden nanoskalige Strukturen in Diagnose und Therapie von Krankheiten eingesetzt, wobei
der Wirkstofftransport via Nanopartikel zur Entwicklung wirkungsvoller Drug-Delivery-
Systeme das größte Anwendungsfeld darstellt (VENUGOPAL et al. 2008).
Besonders in der Diagnose und Behandlung von Tumoren werden Nanomaterialien vermehrt
verwendet (KIM et al. 2010). Mit speziell designten Nanopartikeln ist es bereits möglich,
Tumorgewebe aufzuspüren, wobei die Partikel zum einen als Arzneimittel-Carrier wirken
können aber auch als Kontrastmittel für diagnostische Zwecke dienen. So reichern sich
Nanostrukturen, bedingt durch eine größere Permeabilität der Gefäße und einem gleichzeitig
gestörtem Lymphsystem (MORILLE et al. 2010), im tumorös veränderten Gewebe an
(HOBBS et al. 1998). Dadurch können an Nanopartikel gekoppelte antineoplastische
Arzneimittel im Vergleich zu herkömmlich applizierten Medikamenten eine höhere
Wirkstoffkonzentration im Zielgewebe erreichen. Weiterhin kann durch Modifikation der
Polymerzusammensetzung des Carriersystems eine kontrollierte Abgabe der Arzneimittel
erzielt werden. Dadurch wird die Dauer der Degradation des Partikels und damit die
Freisetzungsgeschwindigkeit des Ladungsgutes verändert. Durch die Beschichtung der
Partikeloberfläche mit Polyethylenglycol (PEG) kann zudem die Halbwertszeit im Blutstrom
verlängert werden, da auf diese Weise eine wirkungsvolle Opsonisierung dieser

27
körperfremden Stoffe verhindert wird und somit dem Immunsystem gegenüber maskiert
werden (PRENCIPE et al. 2009). Weiterhin zeigt sich ein entscheidender Vorteil der
Nanomedizin in verringerten Nebenwirkungen, da eine unspezifische Aufnahme von
Arzneimitteln in gesundes Gewebe verhindert werden soll (ALEXIS et al. 2008; PRENCIPE
et al. 2009). So zeigten VISARIA et al. (2006) eine Anreicherung von mit TNF-α-
beschichteten Goldnanopartikeln in Tumorgewebe von betroffenen Personen, welche auf eine
herkömmliche Therapie nicht mehr responsiv waren. Über dieses Drug-Delivery-Systgem war
es möglich, den Patienten ohne Nebenwirkungen eine 20-mal höhere Dosis von TNF-α zu
applizieren. Weitere Therapiemöglichkeiten bieten sich durch die Injektion von speziellen
Nanopartikeln, sogenannten Nanoshells. Hierbei handelt es sich um einen Nanopartikel mit
einem dielektrischen Kern (bspw. Silicium) welcher mit einer ultradünnen Metalloberfläche
beschichtet ist (bspw. Gold) (SCOTT 2007). Durch die Anregung mit Licht im Nah-
Infrarotbereich (700-800 nm), werden die Elektronen des Metalls angeregt und zerstören
durch eine lokalisierte Erwärmung das sie umgebene Tumorgewebe (HIRSCH et al. 2003).
Aber nicht nur in der Therapie, auch in der Diagnose von Neoplasien werden
Nanotechnologien eingesetzt. So werden „superparamagnetic iron oxide nanoparticles“
(SPION) verwendet, welche in der Bildgebung der Magnetresonanztomographie einen hohen
Kontrast zu nanopartikelfreiem Gewebe aufzeigt (HARISINGHANI et al. 2003). Durch die
Beschichtung mit krankheitsspezifischen Liganden, welche durch spezifische Antikörper
gestellt werden könnten, wäre es möglich bestimmte Krankheiten vor einer klinischen
Symptomatik zu erkennen oder aber den Erfolg einer Therapie zu evaluieren (MULDOON et
al. 2006; SUMER u. GAO 2008).
Weiterhin findet die Nanotechnologie auch im Bereich der Implantatforschung Anwendung.
Durch den Einsatz von Diamantbeschichtungen kann eine Erhöhung der Stabilität von
Implantaten erreicht werden. Des Weiteren finden Oberflächenmodifikationen mit
Silbernanopartikeln als antibakterielle Beschichtungen erfolgreich Verwendung
(SCHIERHOLZ et al. 1998).
Neben den Anwendungen im lebenden Organismus bieten Nanopartikel zudem auch Vorteile
im Bereich der In-vitro-Diagnostik. Hier liegt der Fokus auf der Früherkennung von
diagnostisch relevanten Proteinen, Nukleinsäuren oder Genen. Als besonders geeignet haben
sich Goldnanopartikel herausgestellt, welche durch eine Beschichtung mit speziellen DNA-

28
Sequenzen als hochspezifisches Suchinstrument für unterschiedlichste Krankheiten verwendet
werden kann (NAM et al. 2003).
2.3.3 Anwendung von �anomedizin in der Otologie
Systemische Behandlungen von Erkrankungen des Innenohres sind aufgrund der
anatomischen Gegebenheiten in ihrer Effizienz limitiert. So ist die Blut-Cochlea-Schranke,
welche im physiologischen Sinne die Eigenschaften der Blut-Hirn-Schranke aufweist, dafür
verantwortlich, dass systemisch applizierte Arzneimittel nur unter hohen Dosierungen den
erforderlichen Wirkstoffspiegel im Innenohr erreichen (SWAN et al. 2008). Aufgrund der
dadurch entstehenden Belastung des gesunden Gewebes durch die vom hochdosierten
Arzneimittel hervorgerufenen Nebenwirkungen, ist ein gezielter Transport des Arzneimittels
zu den veränderten Geweben anzustreben.
Nun bietet die Nanomedizin zwei wesentliche Ansätze zur Therapie von
Innenohrerkrankungen. Eine Möglichkeit bietet die Modifikation der Oberfläche von
Cochlea-Implantaten, durch die ein gezielter Transport von Wirkstoffen (Gene, Arzneimittel-
insbesondere neurotrophe Faktoren) zu den Zielzellen erreicht werden soll. Dadurch kann die
Funktionalität des Implantats bei hochgradig hörgeschädigten Patienten optimiert werden. Ein
weiterer Ansatz wäre die Möglichkeit einer Applikation auf die Rundfenstermembran, wobei
die Nanopartikel durch Permeation die gewünschten Zielzellen der Cochlea erreichen können.
Im Vergleich zu einer direkten Applikation über die Eröffnung des Innenohres, stellt diese
Methode einen weitaus weniger invasiven Vorgang dar.
Ein weiterer Vorteil der Nanopartikel-basierten Medizin eröffnet sich über die
Zusammensetzung des Carriersystems, durch welche sich eine zeitlich gesteuerte Freisetzung
der Arzneimittel ermöglichen ließe, sodass auch eine längerfristige Freisetzung von
Wirkstoffen möglich ist (KIM et al. 2010).
In ersten Studien mit Chinchillas konnten GE et al. (2007) nachweisen, dass auf die
Rundfenstermembran applizierte Polylactoglykolsäurenanopartikel diese durchdringen und
sich intracochleär verteilen. Eine andere Studie zeigte ein ähnliches Verhalten von Rhodamin
markierten Polylactoglykolsäurenanopartikel, wobei die Nanopartikel auch in geringer

29
Konzentration nach systemischer Applikation in der Cochlea nachgewiesen werden konnten
(TAMURA 2005). Die Verteilung der Nanopartikel in den unterschiedlichen
Zellpopulationen der Cochlea wies aber in beiden Fällen keine Spezifität auf. Auch
SCHEPER et al. (2009b) konnten durch die intracochleäre Applikation von Fluoreszein-5-
isothiocyanat (FITC) markierten hyperverzweigten Polylysin-Nanopartikeln sowie
Lipidnanokapseln keine Selektivität nachweisen. Dennoch zeigten diese Partikel eine gute
zelluläre Aufnahme, wobei keine zytotoxischen Effekte evident waren.
Weitere Studien belegten sogar einen protektiven Effekt auf die Spiralganglienzellen von
Meerschweinchen, welche eine Woche zuvor medikamentös ertaubt wurden. An Tag sieben
der Studie wurde den Tieren ein Hydroxyapatit-Nanopartikel mit einem rekombinanten green
fluorescent protein (GFP) + Neurotrophin-3 (NT-3)-Plasmid intrachochleär injiziert. Der
Nachweis der GFP-NT-3 Expression gelang bereits an Tag 14 der Studie durch
immunohistochemische Auswertung, wobei sich der protektive Effekt auf die
Spiralganglienzellen durch die Histologie sowie durch die Durchführungen von aABR-
Messungen zeigte (ZHU et al. 2005; JIANG et al. 2007).
Die Ergebnisse der oben genannten Studien zeigen vielversprechende Ansätze zur
zukünftigen Therapie von Innenohrerkrankungen mittels Nanotechnologien, sei es durch die
Modifikation von Cochlea-Implantaten oder durch die lokale bzw. systemische Applikation
von biologisch aktiven, d.h. mit Arzneimitteln oder Genen gekoppelten Nanopartikeln.
2.3.4 �anomedizin in der Veterinärmedizin
Auch in der Veterinärmedizin wird die Nanomedizin in Zukunft einen erheblichen Einfluss
ausüben. Gerade in den Bereichen der Diagnostik und Therapie werden analog zur
Humanmedizin dramatische Veränderungen vorausgesagt (SCOTT 2007). Durch immer
höhere Sicherheitsstandards in der Nahrungsmittelindustrie aber auch durch immer älter
werdende und in einem zunehmenden Maße an „Zivilisationskrankheiten“ leidenden
Haustieren kommt es zu rapide steigenden Kosten. Deshalb muss nach neuen
Lösungsansätzen gesucht werden, welche die Nanomedizin bieten könnte (NARDUCCI 2007;
RIVIERE 2007).

30
So ist es denkbar, dass insbesondere in der Diagnostik und Behandlung von Tumoren große
Fortschritte erzielt werden. Schon heute ist es möglich, mittels Anreicherung von Nanoshell-
Nanopartikeln in neoplastischen Zellverbänden von Mäusen Tumorgewebe gezielt zu
zerstören, indem die Partikel durch äußere Anregung über langwelliges Licht im Nah-
Infrarotbereich das sie umgebene Tumorgewebe auf bis zu 55 °C erwärmen und damit
zerstören (HIRSCH et al. 2003).
Weitere, in naher Zukunft nutzbare Errungenschaften der Nanomedizin stellen sogenannte
Drug-Carrier-Systeme dar. Diese sollen nach dem „Smart Drug-Delivery-Prinzip“ wirken. So
wird dieses Prinzip von SCOTT (2007) im makroskaligen Bereich mit den Diensten der
Postzustellung verglichen. Verschlossene und adressierte Sendungen werden erst nach
Zustellung beim Empfänger geöffnet. Auf den nanoskaligen Bereich übertragen bedeutet das,
dass die in Nanostrukturen eingeschlossenen oder angekoppelten bioaktiven Substanzen
(Arzneimittel, Gene) erst im Zielgewebe freigesetzt werden. Somit können Krankheiten mit
einer wesentlich geringeren Arzneimitteldosis behandelt werden, was gerade im Hinblick auf
die Therapie mit antimikrobiellen Wirkstoffen im Bereich der Nahrungsmittelindustrie
erhebliche Vorteile aufzeigt. So werden nicht nur Wartezeiten für Nahrungsmittel von
lebensmittelliefernden Tieren verringert, sondern auch potentielle Restrisiken für den
Endverbraucher minimiert (SCOTT 2007).
Zusätzlich werden Veränderungen im Bereich der Tierzucht erwartet. Durch die subkutane
Injektion von Nanotubes sollen über Fluoreszenz im Nah-Infrarotbereich feinste
Schwankungen des Estradiolspiegels im Bereich der Nutztiergynäkologie bei Schweinen und
Rindern festgestellt werden können, wodurch eine stark vereinfachte und genauere,
sensorgesteuerte Östrusbestimmung ermöglicht werden soll (SCOTT 2007).
2.3.5 Lipidnanokapseln
Bei den in dieser Arbeit verwendeten Lipidnanokapseln (LNC) handelt es sich um
Nanopartikel mit einem flüssigen Kern auf der Basis von Triglyceriden (Labrafac ® ), welcher
von einer Phasengrenzschicht aus oberflächenaktiven Tensiden (Lipoïd ® und Solutol ® )
umgeben ist. Um den Partikel gegenüber metabolischen Einflüssen im Körper zu schützen,

31
wurde die Partikeloberfläche zusätzlich mit Polyethylenglycol (PEG) modifiziert, wodurch
die Opsonisierung über das Komplementsystem des Körpers erschwert wird. Hierüber kann
eine wirkungsvolle Maskierung des Partikels gegenüber dem Immunsystem erwirkt werden
(KIM et al. 2010; VONARBOURG et al. 2009), was zu einer längeren Halbwertszeit im Blut
und damit zu einer längeren Zirkulation im Körper führt (ABDEL-MOTTALEB et al. 2010;
PERRIER et al. 2010). Des Weiteren wurde der Nanopartikel über eine Bindung zum PEG
mit dem Fluoreszenzmarker Fluoreszein-5-isothiocyanat (FITC) markiert, um eine
Lokalisation der Partikel in vitro und in vivo zu ermöglichen.
In den vorliegenden Versuchen wurde der Einfluss des Phosphodiesterase-Hemmers
Rolipram auf den Erhalt von Spiralganglienzellen untersucht. So konnten WHITAKER et al.
(2008) bereits einen neuroprotektiven Effekt für Rolipram nachweisen. Da Rolipram im
Intrazellularraum wirkt, wurde neben einer direkten Behandlung der Effekt über eine
Applikation mittels LNC als Drug-Delivery-System untersucht. So wäre eine verlängerte
Freisetzung des Arzneimittels aus dem Nanopartikel denkbar, worüber ein gesteigerter Effekt
erzielt werden kann.
So konnten im Hinblick auf die Therapie von Tumoren bereits eine große Vielzahl von
unterschiedlichen Medikamenten in das Innere der Lipidnanokapseln eingefügt werden,
wobei Doxorubicin, Paclitaxel, Docetaxel und Hydroxytamoxifen als Beispiele genannt seien
sollen (HUYNH et al. 2009). Allen Arzneimitteln ist eine hohe Lipophilität gemeinsam, die es
vergleichsweise einfach macht, sie in den lipophilen Kern des Nanopartikels einzuschließen.
Aber auch hydrophile DNA Abschnitte konnten über eine besondere Methode in
Lipidnanokapseln eingeschlossen werden. So bediente man sich eines Lipoplexnanopartikels
in welchem die DNA eingeschlossen wurde und somit in die LNC eingeschleust werden
konnte. Im Tierversuch zeigte sich nach der intravenösen Applikation der Partikel in die
Schwanzvene von Mäusen, dass eine wesentlich längere Verweildauer der LNCs im
Organismus erreicht werden konnte, was auf eine signifikant verbesserte Stabilität der LNC
im Vergleich zu solitär injizierten Lipoplexen hinweist. So wurden nach 60 Minuten noch
etwa 40 % der fluoreszenzmarkierten LNCs im Blut der Mäuse nachgewiesen
(VONARBOURG et al. 2009), während die Konzentration der Lipoplexe nach fünf Minuten
bereits einen Wert von unter 1 % erreicht hatte (BARRON et al. 1998). Diese Stabilität zeigt
entscheidende Vorteile der Lipidnanokapseln im Hinblick auf eine verlängerte Abgabe von

32
Arzneimitteln. So konnten LAMPRECHT et al. (2002) in früheren Studien mittels High-
performance liquid chromatography (HPLC) nachweisen, dass die LNCs bei einem
physiologischen pH-Wert von 7,4 und 37 °C die Hälfte ihres Ladungsgutes erst nach etwa
einer Woche freigegeben haben. Ein initialer Burst-Effekt, d. h. die Freisetzung des
vollständigen Ladungsgutes nach etwa einer Minute, wie er sich bei solid lipid nanocapsules
gezeigt hatte (ZUR MÜHLEN et al. 1998), konnte nicht beobachtet werden. So können die
hergestellten Nanopartikellösungen bei einer Temperatur von 4 °C über Monate gelagert
werden, ohne dass sie ihr Ladungsgut freisetzen (HUYNH et al. 2009). Eine weitere
interessante Studie zeigte, dass mit PEGylierten DNA-Lipidnanokapseln eine erheblich
erhöhte Transfektionsrate in neoplastischem Gewebe erzielt werden konnte (MORILLE et al.
2010). Hierbei wurde die Genexpression der in den Partikeln inkorporierten Luciferase nach
intravenöser Injektion in Tumorgewebe, Lungen, Nieren, Leber und Milz der Versuchstiere
evaluiert. Durch die Synergie von der erhöhten Zirkulationsdauer der mit PEG
oberflächenmodifizierten Nanopartikel und dem EPR-Effekt (enhanced permeability and
retention) konnte eine 84-fach höhere Luciferaseexpression im Tumorgewebe im Vergleich
zu den anderen Organen erzielt werden. Hierbei kommt es durch den EPR-Effekt zu einer
Anreicherung der Nanopartikel im Gewebe des Tumors, was im Wesentlichen durch die
höhere Vaskularisation des tumorösen Gewebes, insbesondere aber auch durch die erhöhte
Permeabilität dieser Gefäße bedingt ist und zum Übertritt der Partikel in das Gewebe führt.
Durch die erheblichen Mängel des lymphatischen Systems im neoplastischen Gewebe werden
Fremdstoffe über die Lymphe nur unzureichend abgeführt. Folglich kommt es zur Retention
der Nanopartikel im Tumorgewebe (MATSUMURA und MAEDA 1986).
Neben der Tumormedizin bieten sich Lipidnanokapseln aber auch in vielen anderen Gebieten
der Medizin als vielversprechendes Drug-Carrier-System an. Als Beispiel sei die Möglichkeit
einer effektiveren Vakzination genannt. Über die Oberflächenmodifikation mit
Mannosederivaten wird eine Aufnahme der Partikel über Mannoserezeptoren von
antigenpräsentierenden Zellen erleichtert (HEURTAULT et al. 2010). Weiterhin konnten
erfolgreiche Studien mit antikörperbeschichteten LNCs hinsichtlich der Überwindung der
Blut-Hirn-Schranke durchgeführt werden. So zeigten mit monoklonalen OX-26 Antikörpern
beschichtete Nanopartikel eine nach intravenöser Injektion um 100 % erhöhte Konzentration
im Gehirn im Vergleich zu nichtkonjugierten Nanokapseln. Über den OX-26 Antikörper wird

33
eine zielgerichtete Verbindung zum Transferrinrezeptor des zerebralen Endotheliums
ermöglicht, wodurch eine verbesserte Überwindung der Blut-Hirn-Schranke erzielt wird
(BEDUNEAU et al. 2008).
Die Überwindung von Barrieren spielt auch in der Behandlung von Innenohrerkrankungen
eine große Rolle. So sind die Strukturen der Cochlea durch die Blut-Cochlea-Schranke vor
Fremdstoffen aus dem Blut weitgehend geschützt, was eine systemische Behandlung von
Innenohrerkrankungen sehr schwierig macht (SWAN et al. 2008). Erste Studien zielten darauf
ab, die Verteilung von Lipidnanokapseln im Inneren der Cochlea zu untersuchen, nachdem sie
über eine Eröffnung des Mittelohres auf die Rundfenstermembran von Ratten appliziert
wurden. ZOU et al. (2008) zeigten, dass die fluoreszenzmarkierten Lipidnanokapseln bereits
30 Minuten post applicationem die Rundfenstermembran auf parazellulärem Weg
durchdrungen hatten und in den zellulären Strukturen der Cochlea aufgenommen wurden. Die
Verteilung zeigte sogar eine intranukleare Aufnahme der Partikel in Spiralganglienzellen,
deren Behandlung bei Patienten mit sensorineuralem Hörverlust von besonderem Interesse ist.
Weitere Studien mit Meerschweinchen wiesen eine homogene Verteilung in den Zellen des
Innenohres nach intracochleärer Applikation via Cochleostomie auf. Hierbei wurde die
Fragestellung nach einer etwaigen spezifischen Verteilung sowie nach toxischen Effekten
bearbeitet. Die Ergebnisse zeigten eine hervorragende Aufnahme der ebenfalls
fluoreszenzmarkierten Partikel in die unterschiedlichen Zellpopulationen, wobei die
Auswertung von Zytocochleogrammen keine toxischen Effekte an den Haarzellen erkennen
ließ. SCHEPER et al. (2009b) konnten mit dieser Studie grundlegende Resultate hinsichtlich
dieses auch für die Otologie sehr vielversprechenden Drug-Carrier-Systems erzielen.

2.4 Phosphodiesterase-Hemmer
34
2.4.1 Wirkungsweise der Phosphodiesterase-Hemmer
Phosphodiesterase-Hemmer sind Arzneimittel, welche die im Zytoplasma vorhandenen
Phosphodiesterasen hemmen. Erstmals konnten sie 1972 aus Rattengehirnen isoliert werden
(UZUNOV u. WEISS 1972). Kurze Zeit später stellte man eine Hemmung dieser auch in
anderen Geweben vorhandenen Esterasen durch eine Vielzahl von Arzneimitteln fest (WEISS
1975; FERTEL 1976). Die Phosphodiesterase ist ein Enzym, welches bei Wirbeltieren in 11
verschiedenen Isoenzymen bekannt ist (BOSWELL-SMITH et al. 2006). Durch Hydrolyse ist
es diesen Enzymen möglich, die Second-Messenger cyclic adenosin monophosphate (cAMP)
und cyclic guanosine monophosphate (cGMP) zu Adenosinmonophosphat (AMP) und
Guanosinmonophosphat (GMP) abzubauen, wobei es cAMP- und cGMP-spezifische aber
auch unspezifische Phosphodiesterasen gibt, welche beide Messenger-Moleküle spalten
können. Bei diesen Messenger-Molekülen handelt es sich um Nukleotide, d.h. sie sind aus
Nukleosiden [Nukleinbase Adenin bzw. Guanin sowie einer Pentose (Ribose)] und einem
Phosphatrest aufgebaut. Da sie durch den Abbau der Phosphodiesterasen an der Position 3’
bzw. 5’ hydrolytisch gespalten werden, bezeichnet man diese Enzymgruppe auch genauer als
3’, 5’-Zyklonukleotid-Phosphodiesterasen. Hierdurch findet eine nomenklatorische
Abgrenzung zu einer Vielzahl von weiteren Enzymen im Organismus statt, welche
nichtzyklische Phosphodiesterbindungen spalten können und somit auch als
Phosphodiesterasen bezeichnet werden. Als Beispiele seien hierfür DNAsen und RNAsen
genannt. Da die Second-Messenger eine Vielzahl von unterschiedlichen Reaktionen über die
Phosphorylierung von Proteinkinasen einleiten (bspw. Lipolyse und Glykogenabbau) werden
diese Vorgänge durch den Abbau über die Phosphodiesterase gehemmt. So wird durch den
Einsatz von Phosphodiesterase-Hemmern eine erhöhte Second-Messenger Konzentration
erzielt, wodurch eine große Anzahl von zellmetabolischen Aktivitäten initiiert werden, auf die
im Weiteren genauer eingegangen wird.

35
2.4.2 Einteilung der Phosphodiesterase-Hemmer
Phosphodiesterase-Hemmer werden in zwei Gruppen unterteilt. Zum einen gibt es die
nichtselektiven Phosphodiesterase-Hemmer, welche unspezifisch alle Enzyme dieser Gruppe
inhibieren, zum anderen gibt es die spezifisch wirkenden Phosphodiesterase-Hemmer, welche
nur einen bestimmten Typ von Phosphodiesterasen hemmen. Zu den nichtselektiven
Phosphodiesterase-Hemmern gehören beispielsweise Methylxanthine wie Koffein,
Theobromin und Theophyllin. Theophyllin wird in der Behandlung der chronisch
obstruktiven Lungenerkrankung (chronic obstructive pulmonary disease, COPD) eingesetzt,
ist aber selektiven Phophodiesterasehemmern aufgrund der Stärke seiner Nebenwirkungen,
wie Übelkeit und Tachykardie, unterlegen (RABE et al. 2007). Die Einteilung der selektiven
Phosphodiesterase-Hemmer richtet sich nach der Spezifität für einen bestimmten Typ der 11
Isoformen der Phosphodiesterase, wobei für die Hemmung der Phosphodiesterase 10 und 11
keine Inhibitoren bekannt sind. So kommen die jeweiligen Phosphodiesterasen in bestimmten
Geweben gehäuft vor, während sie in anderen fehlen können (SIEGEL et al. 1999).
Dementsprechend werden Phosphodiesterase-3-Inhibitoren wie beispielsweise Milrinon bei
akuter Herzinsuffizienz eingesetzt (FORTH et al. 2002). Durch die Hemmung der
Phosphodiesterase-3 erhöht sich die Konzentration des intrazellulären Second-Messenger
Moleküls cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Hierüber werden Proteinkinasen
aktiviert, wodurch es zur Öffnung von Kalzium-Kanälen kommt, was die Kontraktionskraft
des Myokards erhöht und somit eine inotrope Wirkung erzielt. Im Bereich der
Veterinärmedizin findet Pimobendan (Vetmedin ® ) Anwendung bei der Behandlung der
dilatativen Kardiomyopathie. Als sogenannter Kalzium-Sensitizer erhöht es die
Empfindlichkeit der Herzmuskelfasern auf Kalzium-Ionen, wodurch die Kontraktiliät des
Myokards verstärkt wird. Parallel kommt es durch die Hemmung der Phosphodiesterase-3 zu
einem gefäßerweiternden Effekt, was den Einsatz bei Herzklappenerkrankungen ebenso
sinnvoll macht (LOMBARD et al. 2006). Aufgrund dieser beiden Eigenschaften wird
Pimobendan auch als Inodilatator bezeichnet. Großen Bekanntheitsgrad erlangte der
Phosphodiesterase-5-Inhibitor Sildenafil (VIAGRA ® ), welcher durch die selektive Hemmung
der cGMP-sensitiven Phosphodiesterase-5 zu einer erhöhten Konzentration von cGMP in den
Muskelzellen der Gefäße des Corpus Cavernosum führt (SOLDINI 1999). Über die

36
Aktivierung der Proteinkinase G kommt es zu einem intrazellulärem Kalzium-Abfall, welcher
die Entspannung der Gefäßmuskulatur bedingt und durch einen erhöhten Bluteinstrom zur
Erektion führt.
Die Phosphodiesterase-4 kommt hauptsächlich in den Zellen der Organe Hoden, Niere,
Gehirn, Leber, Lunge, sowie in Leukozyten vor (SIEGEL et al. 1999). Dementsprechend
bestehen hinsichtlich der Pathologien dieser bestimmten Organe prädestinierte Einsatzgebiete
für Inhibitoren dieser Enzymsubklasse. So zeigt sich die Effektivität von Phosphodiesterase-
4-Inhibitoren besonders in der Behandlung von entzündlich bedingten Lungenerkrankungen
(WESTON et al. 1997; FUHRMANN et al. 1999; GAMBLE et al. 2003). Aber auch bei
neurodegenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems zeigt sich ein großes
Potential. In diversen Studien konnten antipsychotische Effekte nachgewiesen werden
(MAXWELL et al. 2004; KANES 2007). Des Weiteren wurden positive Effekte auf das
Langzeitgedächtnis festgestellt (BARAD et al. 1998). Darüber hinaus konnten in anderen
Arbeiten vielversprechende Ergebnisse hinsichtlich der Therapie von Alzheimer und
Parkinson (SMITH et al. 2009) erzielt werden. Durch diese Studien können neuroprotektive
und antiinflammatorische Wirkungen von Phosphodiesterase-4-Inhibitoren erwartet werden.
Somit könnten die Spiralganglienzellen vor der Degeneration nach primärem Haarzellverlust
geschützt werden, wobei Phosphodiesterase-4-Inhibitoren aber auch in der Hemmung von
postoperativen Gewebsreaktionen von Nutzen sein könnten.
Ein interessanter Vertreter und als Archetyp geltender Phosphodiesterase-4-Inhibitor ist
Rolipram. Da Rolipram in dieser Arbeit verwendet wurde, soll im Folgenden eingehender auf
diesen Phosphodiesterase-4-Inhibitor eingegangen werden.
2.4.3 Rolipram
Bei dem Phosphodiesterase-4-Hemmer Rolipram handelt es sich um einen experimentellen
Arzneistoff, welcher das erste Mal Ende der siebziger Jahre in der Literatur genannt wird.
KARPANEN et al. (1979) führten Studien an männlichen Sprague-Dawley-Ratten
hinsichtlich der antihypertensiven Wirkung von Rolipram durch und konnten einen
dosisabhängigen Effekt nachweisen. So wurde durch eine intracerebroventriculär injizierte

37
Dosis von 64 µg Rolipram pro Ratte ein Blutdruckabfall von 30 % erreicht. Des Weiteren
wurden im Tierversuch antipsychotische Wirkungen nachgewiesen (MAXWELL 2004). So
führte eine geringe intrazelluläre Konzentration von cyclic adenosin monophosphate (cAMP)
im Krankheitsbild der Schizophrenie zu Signaltransduktionsabnormalitäten. Frühere Studien
versuchten diesen Effekt durch die Blockade von Dopaminrezeptoren zu unterbinden,
wodurch ein Anstieg des intrazellulären cAMP erreicht wurde. Mit Rolipram konnte somit die
Wirksamkeit eines nichtrezeptorvermittelten Therapieansatzes zur Behandlung von
Schizophrenie belegt werden (KANES 2007). Grundlagenforschungen zur Huntington´s
disease, einer autosomal dominant vererbten neurodegenerativen Erkrankung, zeigten
vielversprechende Ergebnisse. So kommt es im Verlauf der Krankheit zu einer verminderten
Aktivität des cAMP responsive element binding protein (CREB). Dieses Protein ist für die
Transkription von unterschiedlichen Genen verantwortlich, unter anderem für das Gen des
neuroprotektiv wirkenden BDNF (PURVES 2007). Wird durch Rolipram die
Phosphodiesterase-4 gehemmt, so kommt es zu einem Anstieg der Konzentration von cAMP.
Dieses aktiviert die Proteinkinase-A, welche über einen Phosphorylierungsschritt im Nukleus
der Zelle CREB aktiviert und so zur Bildung von BDNF beitragen kann, wodurch ein
neuroprotekiver Effekt erzielt wird. Im Tiermodell wurde ein neurodegenerativer Effekt durch
Applikation von Quinolonsäure (DE MARCH et al. 2007), einer exzitotoxisch wirkenden
Substanz, ins Corpus Striatum von Mäusen, erzielt. Hierbei kommt es zur Überreizung des
exzitatorisch wirkenden N-methyl-D-aspartat (NMDA)-Rezeptors, was eine verringerte
CREB-Aktivität (HARDINGHAM et al. 2002), sowie einen erhöhten Kalzium-Einstrom zur
Folge hat und somit zum Tod der neuronalen Zelle führt (STAVROVSKAYA u. KRISTAL
2005; GUZMAN-LENIS et al. 2009). Durch die tägliche, intraperitoneale Applikation von
1,5 mg/kg Rolipram über einen Zeitraum von 2 Wochen, konnten die durch Quinolonsäure
hervorgerufenen Läsionen um 62 % gegenüber der Kontrollgruppe verringert werden (DE
MARCH et al. 2007). In anderen Versuchen am Quinolonsäuremodell zeigten BLOCK et al.
(2001), dass die neuroprotektive Wirkung des Phosphodiesterase-Hemmers Rolipram auch
über die Hemmung von TNF-α erzielt wird. So zeigten WHITAKER et al. (2008) im Spinal
Cord Injury-Tiermodell einen großen Einfluss des Zytokins TNF-α auf den sekundär
induzierten Zelltod. Durch die Applikation von Rolipram konnte eine verminderte Expression
von TNF-α nachgewiesen werden, wobei die entstehenden Läsionen um 40 % verringert

38
werden konnten. Eine weitere Studie von VALERA et al. (2008) zeigte die Rolipram-
vermittelte Protektion primärer neuronaler Zellen, welche aus Rattengehirnen gewonnen
wurden. Durch die Zugabe von exzitotoxisch wirkendem NMDA konnte die Degeneration der
Zellen durch die Applikation von Rolipram verringert werden, was durch einen intrazellulären
Anstieg von aktiviertem CREB erklärt wurde. Des Weiteren werden positive Effekte von
Phosphodiesterase-4-Inhibitoren auf die axonale Regeneration im Spinal Cord Injury-Modell
beschrieben. Hierbei reguliert über cAMP aktiviertes CREB die Expression der Gene für IL-6
und Arginase I, welche einen direkten Einfluss auf eine gesteigerte Axonregeneration haben
sollen (HANNILA u. FILBIN 2007).
Neben der Wirkung auf die Zellen des Zentralen Nervensystems zeigten viele Studien die
potente antiinflammatorische Wirkung von Rolipram. So werden nahezu alle Zellen, die im
Prozess des Entzündungsgeschehens eine Rolle spielen, von Rolipram beeinflusst. Ursächlich
soll hierfür die präferierte Hemmung der Phosphodiesterase-4A/B sein, welche hauptsächlich
in Monozyten, Makrophagen, Granulozyten und T-Zellen expremiert wird (MACKENZIE u.
HOUSLAY 2000, ZHU et al. 2001). Ein entscheidender Wirkmechanismus dieses
antiinflammatorischen Effekts wird durch die Hemmung der Bildung des Zytokins TNF-α
erzielt (WACHTEL 1982).
Neben Makrophagen und Monozyten, welche als Hauptproduzenten des Zytokins TNF-α
gelten, können auch andere Zellen, wie beispielsweise dendritische Zellen, neutrophile
Granulozyten oder Endothelzellen TNF-α freisetzen (HIGUCHI et al. 1990). TNF-α spielt im
Rahmen von lokalen und systemischen Entzündungsreaktionen eine zentrale Rolle. Als
pleiotropes, proinflammatorisches Zytokin ist TNF-α neben weiteren Zytokinen wie IL-1α,
IL-1ß und Interferon-γ ein wichtiger Mediator der nicht-adaptiven Immunantwort.
Dementsprechend ist TNF-α im Abwehrgeschehen von viralen sowie bakteriellen Infektionen
entscheidend beteiligt (ABBAS et al. 2005). So dient TNF-α als Signalmolekül, um die
Aktivität unterschiedlichster Immunzellen zu modulieren. Weiterhin zeigt sich auch ein
proliferationsverstärkender Effekt auf Fibroblasten (POSTLETHWAITE u. KANG 1983).
Ansätze zur Erklärung des zugrunde liegenden Wirkmechanismus der Phosphodiesterase-4-
Inhibitoren finden sich in der Initiierung von Signalkaskaden. So findet durch den
verminderten Abbau von cAMP eine verstärkte Phosphorylierung der Proteinkinase A statt.
Diese aktiviert den Transkriptionsfaktor CREB, der unter anderem die Transkription von

39
proinflammatorischen Zytokinen steuert (DEREE et al. 2008). Des Weiteren wird eine
Beeinflussung des Transkriptionsfaktors nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of
activated B-cells (NF-κB) diskutiert, wobei die Transkription des Zytokins TNF-α von diesem
Faktor abhängig ist. Durch den Phosphodiesterase-Inhibitor vermittelten Anstieg von
phosphoryliertem CREB wird eine Konkurrenz um den Koaktivator CREB binding protein
(CBP) angenommen, wodurch die Wirkung des NF-κB inhibiert wird (DEREE et al. 2008).
Aber auch eine Hemmung der Phosphorylierung und des nachfolgenden Abbaus des nuclear
factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor alpha (IκBα) wird als
ursächlich für den antiinflammatorischen Effekt von Phosphodiesterase-4-Inhibitoren
angesehen. So liegt der Transkriptionsfaktor NF-κB im Zytosol in einer inaktiven Form vor
indem es an den Inhibitorkomplex IκBα gebunden ist. Um die aktive Form des NF-κB
freizusetzen wird IκBα unter anderem über Lipopolysaccharid induzierte Signalwege
phosphoryliert, worüber der Abbau dieses Inhibitorkomplexes eingeleitet wird (DEREE et al.
2008). Durch cAMP-abhängige Proteinkinasen wird eine Inhibierung der Phosphorylierung
und Degradation von IκBα vermutet (KWAK et al. 2005)
Neuere Studien zeigten zudem einen Einfluss von Phosphodiesterase-Hemmern auf das
entzündungsmodulierende mitogen activated protein (MAP)-Kinasesystem. So zeigte
Rolipram eine Hemmung der INF-γ induzierten Phosphorylierung der p38-MAP-Kinase
(KWAK et al. 2005).
Diese Studien belegen somit die antiinflammatorische und neuroprotektive Wirkung von
Rolipram. Die vorliegende Arbeit soll zum einen den Effekt des Roliprams auf
degenerierende Spiralganglienzellen untersuchen und zum anderen das Potential zur
Fibrosehemmung nach erfolgter Cochlea-Implantat-Insertion beurteilen.

3 Zielsetzung
40
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu prüfen, ob der Phosphodiesterase-4-Hemmer Rolipram
geeignet ist, das Ergebnis, welches mit Cochlea-Implantaten im Patienten erzielt werden
kann, zu optimieren.
Es wird der neuroprotektive Effekt des Roliprams auf die im Innenohr lokalisierten
neuronalen Zellen, die Spiralganglienzellen, in vitro und in vivo untersucht. Zudem wird in-
vitro die Wirkung des Roliprams auf die proinflammatorische TNF-α-Produktion bestimmt,
um zu prüfen, ob mittels Rolipramapplikation das postoperative Bindegewebswachstum um
den Elektrodenträger des Cochlea-Implantats vermindert werden kann.
Zur Hemmung der Phosphodiesterase-4 muss Rolipram durch die Zellmembran in das
Zytoplasma der Zelle gelangen. Im Rahmen dieser Studie wird zusätzlich untersucht, ob die
Rolipramaufnahme in die Zelle, und somit der biologische Effekt des Arzneimittels, durch
Lipidnanokapseln als Transportsystem gesteigert werden kann.
Zunächst werden hierzu In-vitro-Studien durchgeführt:
• Untersuchung des neuroprotektiven Effektes von Rolipram, sowie auch von in
Lipidnanokapseln eingeschlossenem Rolipram auf die Überlebensrate von isoliert
angezüchteten Spiralganglienzellen neonataler Sprague-Dawley-Ratten. Des Weiteren
werden das Neuritenauswachsverhalten sowie der Somadiameter der überlebenden
Spiralganglienzellen beurteilt. Der Versuchsansatz wird in vier unterschiedlichen
Konzentrationen durchgeführt, um eine möglichst optimale Konzentration für die
potentiell nachfolgenden In-vivo-Experimente zu ermitteln.
• Ferner werden Untersuchungen mit murinen dendritischen Zellen durchgeführt, anhand
derer die Freisetzung des Roliprams aus dem Nanopartikel verifiziert werden kann.
Zunächst werden die Zellen mit Rolipram und in Nanopartikeln inkorporiertem Rolipram
behandelt. Eine anschließende Stimulation mit Lipopolysacchariden führt zur Reifung und
Aktivierung der Zellen, wodurch eine Sekretion des Zytokins TNF-α erwirkt wird. Je nach
Ausprägung lassen sich Aussagen über einen entzündungshemmenden Effekt treffen. Für

41
die Kombination mit Cochlea-Implantaten könnten so positive Effekte hinsichtlich einer
postoperativ auftretenden, fremdkörperbedingten Bindegewebsbildung erzielt werden.
Folgende In-vivo-Studien werden, basierend auf den Erkenntnissen der In-vitro-Studien,
durchgeführt:
• Untersuchung des Einflusses von Rolipram und mittels Lipidnanokapseln appliziertem
Rolipram auf das Überleben der Spiralganglienzellen ertaubter Meerschweinchen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit sollen Rückschlüsse darauf zulassen, ob Rolipram die
Spiralganglienzellen nach Ertaubung vor Degeneration schützen kann, beziehungsweise das
Fortschreiten der Degeneration verlangsamen kann.
Eine zusätzliche Erkenntnis soll sein, ob Rolipram die Fremdkörperreaktion nach
Implantation von Cochlea-Implantaten potentiell verringern kann.
Weiterhin soll geklärt werden, ob Lipidnanokapseln die Wirkung des Roliprams steigern
können.

4 Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Reagenzien, Laborbedarf, Verbrauchsmaterialien, Pharmaka und Geräte
42
Die verwendeten Lösungen, Reagenzien (10.2), Pharmaka (10.3), Geräte (10.6) und eine
Auflistung des verwendeten Laborbedarfs, sowie der benötigten Verbrauchsmaterialien
(10.4), finden sich im Anhang in Tabellenform wieder. In diesem Kapitel wird ebenfalls die
Herstellung von einzelnen Lösungen und Medien besprochen (10.1).
4.1.2 Herstellung der Lipidnanokapseln
Alle in dieser Arbeit verwendeten Nanopartikel (Lipidnanokapseln, LNC) wurden in den
„Laboratoires d’Ingénierie de la Vectorisation Particulaire“ der Universität Angers in
Frankreich hergestellt.
Die Herstellung der Lipidnanokapseln basiert auf der neuartigen Methode der
Phaseninversion (phase inversion temperature method, PIT-Methode) bei welcher eine Öl-in-
Wasser Emulsion durch wiederholte Erwärmung und Abkühlung in eine Wasser-in-Öl
Emulsion umgekehrt wird (HEURTAULT et al. 2002; BEDUNEAU et al. 2006).
Bei den Lipidnanokapseln handelt es sich um Nanopartikel bestehend aus einem flüssigen
Kern, welcher von einer Schicht aus oberflächenaktiven Substanzen umgeben ist (Abb 3. A).
Die zur Herstellung benötigte ölige Phase bestand aus dem Caprin- und Caprylsäure-
Triglyzerid Labrafac ® WL 1349 (Gattefossé S.A., Saint-Priest, Frankreich), während die
wässrige Phase aus mit Natriumchlorid angereichertem, steril gefilterten Wasser bestand. Des
Weiteren war das Hinzufügen von zwei Tensiden nötig, dem Lipoïd ® S75-3 (Lipoïd GmbH,
Ludwigshafen, Deutschland), einem aus Sojabohnen gewonnenem Lecithin und dem Solutol ®
HS 15 (BASF, Ludwigshafen, Deutschland), einem aus Polyethylenglycol bestehenden,
künstlich hergestellten Tensid. Um Lipidnanokapseln mit dem gewünschten Durchmesser von
etwa 50 nm herzustellen, wurden die Komponenten in den folgenden Mengen verarbeitet:

43
1,028 g Labrafac ® , 0,075 g Lipoïd ® , 0,846 g Solutol ® , 0,089 g NaCl und 2,962 g steril
gefiltertes Wasser.
Um zunächst eine Öl-in-Wasser Emulsion zu erhalten, wurden alle Komponenten vermengt
und auf einem Magnetrührer bei Raumtemperatur und 200 rounds per minute (rpm)
vermischt. Unter kontinuierlicher Erwärmung bei einer steigenden Temperatur von 4 °C pro
Minute, wurde bei etwa 70 °C ein kurzes Intervall der Transparenz beobachtet, wonach die
vollständige Phasenumkehr bei einer Temperatur von etwa 85 °C erreicht wurde.
Anschließend wurden drei Temperaturzyklen nahe der Phasenumkehr, alternierend von 60 bis
85 °C, wiederholt, um eine stabile Wasser-in-Öl Emulsion zu erhalten. Die vorliegende
Mischung wurde daraufhin mit 12,5 ml Wasser im Verhältnis 1:2,5 verdünnt, wobei das
Wasser zudem auf 2 °C herabgekühlt war um die Reaktionsprozesse zu stoppen und somit die
Herstellung der LNC zu vollenden.
Eine anschließende Modifikation der Oberfläche wurde im Vorfeld der
Fluoreszenzmarkierung der Nanopartikel vorgenommen. 1,75 ml LNC (10 17 Nanopartikel/ml)
wurden für 90 Minuten bei einer Temperatur von 60 °C mit 1,25 ml wässriger Lösung
(15 mg/ml) von 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Amino(Polyethylene-
Glycol)2000] (DSPE-PEG2000-amino) (Alabaster, USA) inkubiert. Die Suspension wurde
alle 15 Minuten aufgeschüttelt und am Ende in einem Eisbad für 1 Minute abgeschreckt.
Danach wurden die Nanopartikel mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszein-5-isothiocyanate
(FITC, Sigma-Aldrich Frankreich) markiert, um die Lokalisation der Partikel in Zellen und
Geweben nachvollziehen zu können (Abb. 3. B.). Hierfür wurden 1 ml FITC mit einer
Konzentration von 2 mg/ml auf 2,95 ml LNC Suspension gegeben, wobei der pH-Wert
langsam durch tropfenweise Zugabe von Na3PO4 auf 9 erhöht wurde. Unter Lichtabschluss
wurde die Mischung in einem Wasserbad für 45 Minuten bei 37 °C inkubiert um abschließend
die Reaktion, durch Überführung in ein Eisbad für 3 Minuten, zu beenden. Bei den in den
Zellversuchen verwendeten Nanopartikeln ohne Fluoreszenzmarkierung entfiel dieser Schritt
der Herstellung.
Um das Arzneimittel Rolipram in die Partikel aufzunehmen, wurde der Phosphodiesterase-
Hemmer vor den drei Temperaturzyklen in einer Konzentration von 1 mg/ml Labrafac ®
hinzugefügt (Abb. 3. B.), wobei dieser Schritt bei den Nanopartikeln ohne Rolipram entfiel.

4.1.3 Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit Spiralganglienzellen
44
A B C
Für die zu Beginn der vorliegenden Arbeit durchgeführten Zellkulturexperimente wurden
neonatale Sprague-Dawley-Ratten (eigene Zucht) beiderlei Geschlechts verwendet. Insgesamt
fanden in dieser Studie 138 Tiere im Alter von 3-5 Tagen Verwendung.
Durch die den In-vivo-Experimenten vorangegangenen Zellkulturexperimente wurde der
Einfluss des biologischen Effekts von Rolipram sowie der Nanopartikel auf das Überleben der
Spiralganglienzellen untersucht, um die Studien am Tier auf ein Minimum zu reduzieren. So
konnte durch die Zellversuche im Rahmen dieser Arbeit diejenige Konzentration der
Nanopartikellösung ermittelt werden, welche ein optimales Überleben der
Spiralganglienzellen in vitro zeigte. Die daraus ermittelte Konzentration wurde anschließend
im Tiermodell untersucht.
Labrafac ®
Mixture of Lipoïd ® and Solutol ®
DSPE-PEG2000-amino
FITC
Rolipram
Abb. 3: (A) Lipidnanokapsel; (B) Lipidnanokapsel mit FITC markiert; (C) Lipidnanokapsel mit FITC
markiert und inkorporiertem Rolipram.
Die Verwendung der Tiere zu wissenschaftlichen Zwecken (Tierschutzgesetz, §4) wurde dem
zuständigen Amt gemeldet (Veterinäramt Hannover). Die Tierhaltung und Zucht wurde unter

45
spezifisch pathogen-freien Bedingungen in den Räumlichkeiten des Zentralen Tierlabors der
Medizinischen Hochschule Hannover unter identischen Bedingungen für alle Tiere
durchgeführt.
Die Haltung der Muttertiere erfolgte in Zweiergruppen in Typ 3 Makrolon ® -Käfigen (Uno
Roestvaststaal B.V., Zevenaar, Holland). Bei einer Raumtemperatur von 20-24 °C und 50-
60 % relativer Luftfeuchtigkeit wurde der Tagesrhythmus der Tiere durch einen täglichen
Hell/Dunkel-Zyklus von 12 Stunden reguliert. Die Versorgung der Tiere erfolgte durch ein
Trockenpelletfutter (Altromin-1324 ® , Altromin GmbH, Lage) und Trinkwasser ad libitum,
wobei die Tiere auf einer Standardeinstreu gehalten wurden.
Zur Gewinnung der Spiralganglienzellen wurden die Jungtiere 1-2 h vor der Verwendung von
den Muttertieren separiert.
4.1.4. Tiere und Tierhaltung für die Zellkulturexperimente mit dendritischen Zellen
Zur Generierung der dendritischen Zellen wurden Stammzellen aus dem femoralen
Knochenmark von BALB/c Mäusen gewonnen. Die Versuche sollten neben der
zytokinproduktionshemmenden Wirkung des Roliprams auch einen Aufschluss über die
Freisetzung des Arzneimittels aus der Nanopartikel-Rolipram-Kombination geben.
Für die Gewinnung von Stammzellen aus dem femoralen Knochenmark der BALB/c Mäuse
erfolgte eine Anzeige zur Organentnahme für das Anlegen von Zellkulturen beim
Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES
Oldenburg). Insgesamt wurden drei Tiere für die Durchführung der Experimente verwendet.
Hierbei handelte es sich um weibliche BALB/c Mäuse mit einem Gewicht von ca. 20 g. Die
Tiere wurden in der Tierhaltung des Instituts der Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover in Kleingruppen von 5-6 Tieren auf einer
Standardeinstreu gehalten, wobei der Tagesrhythmus durch einen Hell/Dunkel-Zyklus von
12 Stunden reguliert wurde. Zur Versorgung wurde den Tieren eine Altromin-Standarddiät
(Altromin-1324 ® , Altromin GmbH, Lage) sowie Wasser zur freien Verfügung gestellt.

4.1.5 Versuchstiere und Tierhaltung für die In-vivo-Experimente
46
Für die den Zellkulturversuchen nachfolgenden In-vivo-Experimente wurden weibliche,
Dunkin-Hartley-Meerschweinchen vom Züchter Charles-River verwendet. Das
Ausgangsgewicht betrug 330-460 g. Für die Durchführung der Studie wurden 32 Tiere
verwendet. Das Tierversuchsvorhaben wurde beim Niedersächsischen Landesamt für
Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) unter der Nummer 33.9-42502-04-
07/1266 angemeldet und genehmigt.
Die Haltung, sowie alle Eingriffe am Tier, erfolgten in den Räumlichkeiten des CrossBIT-
Gebäudes, Feodor-Lynen-Straße 31 in 30625 Hannover. Zu Versuchsbeginn wurde die
Hörschwelle der Versuchstiere mittels akustisch evozierter Hirnstammpotentiale ermittelt. In
die Studie wurden nur Tiere aufgenommen, deren Hörstatus der physiologischen Norm
entsprach (KANO u. STARR 1987; MITCHELL et al. 1997).
Nachfolgend wurden die Tiere systemisch ertaubt und sieben Tage später einer erneuten
Messung der Hirnstammpotentiale zur Verifizierung des Ertaubungserfolges unterzogen.
Anschließend wurden die zu untersuchenden Substanzen intracochleär appliziert.
Die Tierhaltung wurde entsprechend der EU-Richtlinie 86/609/EWG unter identischen
Bedingungen durchgeführt. Die Tiere wurden in Gruppen zu je 4 Individuen in Typ 3
Makrolon ® -Käfigen (Uno Roestvaststaal B.V., Zevenaar, Holland) auf einer Standard-
Einstreu (Weichholzfaser) gehalten. Ihr Tagesrhythmus wurde durch einen Hell/Dunkel-
Zyklus von 12 Stunden reguliert. Die Raumtemperatur wurde konstant in einem Bereich von
20-24 °C gehalten wobei die Luftfeuchtigkeit einen Wert von 50-60 % aufwies. Zur
Versorgung erhielten die Tiere Trinkwasser und Heu ad libitum, wobei ihnen zusätzlich ein
Trockenpelletfutter (ssniff MS-2, ssniff Spezialdiäten GmBH, Soest) angeboten wurde.
4.1.6 Versuchsgruppen
Die folgende Tabelle (Tab.1) gibt einen Überblick über die Einteilung der
Versuchstiergruppen. Es wurde eine Gruppengröße von je acht Tieren gewählt. Alle
Versuchstiere wurden am ersten Tag der Studie systemisch ertaubt, wobei zuvor die

47
Hörschwelle mittels acoustically evoked auditory brainstem response (aABR)-Messung
bestimmt wurde. In die Studie wurden nur normalhörende Tiere einbezogen. Am siebten Tag
der Studie wurde die Ertaubung mittels wiederholter aABR-Messung bestätigt. Die Studie
umfasst den Vergleich von vier Gruppen, wobei den Tieren der ersten Gruppe eine Woche
nach der Ertaubung per Cochleostomie 5 µl Lipidnanokapsellösung mit inkorporiertem
Rolipram in einer Verdünnung mit phospate buffered saline (PBS) von 1:100 in die Scala
tympani der linken Cochlea injiziert wurde (Konzentration der Stammlösung:
Lipidnanokapseln 45 mg/ml; 19 µg/ml Rolipram). Die Tiere der zweiten Gruppe wurden in
gleicher Weise auf der linken Seite mit einer Injektion von 5 µl Lipidnanokapsellösung in
einer Verdünnung von 1:100 behandelt (Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln
45 mg/ml). Bei der dritten Versuchsgruppe wurden 5 µl Rolipramlösung in der zu Gruppe 1
entsprechenden Konzentration injiziert wobei die letzte Gruppe eine Injektion von 5 µl PBS
in die Scala tympani beider Cochleae erhielt. Bei den Gruppen 1-3 wurden in die Scala
tympani der rechten Cochlea je 5 µl PBS als Kontrolle injiziert. Die Perfusion wurde bei allen
Gruppen nach wiederholter aABR-Messung am Tag 21 vorgenommen.
Tab. 1: Darstellung des zeitlichen Verlaufs sowie der vorgenommenen Eingriffe während der in-vivo-
Versuche. PBS = phosphate buffered saline, aABR = acoustically evoked auditory brainstem response
Tiergruppe Tag 0 Tag 7 Tag 21
Gruppe 1
aABR
aABR
aABR
�anopartikel/Rolipram Ertaubung Cochleostomie Tötung
Gruppe 2
aABR
aABR
aABR
�anopartikel
Ertaubung Cochleostomie Tötung
Gruppe 3
aABR
aABR
aABR
Rolipram
Ertaubung Cochleostomie Tötung
Gruppe 4
aABR
aABR
aABR
PBS
Ertaubung Cochleostomie Tötung

4.2 Methoden
4.2.1 Methoden für die In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen
48
4.2.1.1 Übersicht der In-vitro-Versuche mit Spiralganglienzellen
Im Vorfeld der In-vivo-Versuche wurden die benutzten Nanopartikel zunächst in vitro
getestet, um die optimale Konzentration der verwendeten Nanopartikel zu ermitteln und
mögliche toxische Effekte auf die im Tiermodell relevanten Zelltypen auszuschließen. Hierzu
wurden Spiralganglienzellen von neonatalen Sprague-Dawley-Ratten kultiviert und mit
unterschiedlichen Konzentrationen der Nanopartikel inkubiert. Insgesamt wurden vier
unterschiedliche Gruppen getestet. Bei diesen Gruppen handelte es sich um:
- mit FITC fluoreszenzmarkierte Lipidnanokapseln (LNC FITC)
- mit FITC markierte Lipidnanokapseln in welchen Rolipram (LNC FITC ROLIRPAM)
inkorporiert war
- verdünntes Rolipram, welches in den zu den arzneimittelkombinierten Nanokapseln
entsprechenden Konzentrationen verwendet wurde
- brain derived neurotrophic factor (BDNF) in der Konzentration von 50 ng/ml als
Positivkontrolle
Diese Gruppen wurden jeweils in vier verschiedenen Konzentrationen im Sinne einer
Verdünnungsreihe der Stammlösungen (Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln
45 mg/ml; 19 µg/ml Rolipram) mit Panserin (10.2), von 1:50, 1:100, 1:200 und 1:300
verwendet. Eine Ausnahme bildet die mit BDNF behandelte Gruppe. Hier wurden die Zellen
nur mit der Konzentration von 50 ng/ml behandelt, da sich diese Konzentration als besonders
protektiv auf das Überleben von Spiralganglienzellen in vitro erwiesen hat (LEFEBVRE et al.
1994; HEGARTY et al. 1997) und in diesem Versuch als Positivkontrolle diente. Insgesamt
erfolgten fünf Wiederholungen der Versuche, wobei die Auszählungen der Zellanzahlen,
sowie die Ausmessungen der Neuritenlängen und Somadurchmesser gemittelt und
miteinander verglichen wurden (Tab. 2).

Tab. 2: Übersicht über die in-vitro-Versuche mit kultivierte Spiralganglienzellen. Es werden die ver-
wendeten Konzentrationen und die Anzahl der behandelten Kavitäten der Versuchsgruppen LNC
49
FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BDNF dargestellt.
Versuchsgruppe Konzentration
�anopartikel
[mg/ml]
LNC FITC 1:300= 0,15
1:200= 0,225
1:100= 0,45
LNC FITC
ROLIPRAM
1:50 = 0,9
1:300= 0,15
1:200= 0,225
1:100= 0,45
1:50 = 0,9
Konzentration
Rolipram
[µg/ml]
1:300= 0,063
1:200= 0,095
1:100= 0,19
1:50 = 0,38
ROLIPRAM 1:300= 0,063
1:200= 0,095
1:100= 0,19
1:50 = 0,38
Anzahl der Wells
pro Versuchstag
4
4
4
4
4
4
4
4
Anzahl der
Wells
insgesamt
BDNF 50 ng/ml 4-8 30
4.2.1.2 Versuch zur Bewertung des Einflusses der Nanopartikel-Komponenten auf das
Überleben von vereinzelt angezüchteten Spiralganglienzellen
Da im ersten Zellkulturversuch ein positiver Effekt der Nanopartikel ohne Rolipram
(LNC FITC) auf das Überleben der kultivierten Spiralganglienzellen zu erkennen war, wurde
ein zusätzlicher Versuch durchgeführt, um einen etwaigen Einfluss des Fluoreszenzmarkers
FITC auf die Vitalität der Spiralganglienzellen zu evaluieren. Die Fragestellung war hierbei,
ob der Nanopartikel alleine oder das an ihm gebundene FITC den protektiven Einfluss ausübt.
Auch für diesen Versuch wurden Spiralganglienzellen aus neonatalen Sprague-Dawley-Ratten
gewonnen und kultiviert. Folglich wurden drei Gruppen gebildet:
- mit FITC fluoreszenzmarkierte Lipidnanokapseln (LNC FITC)
- Lipidnanokapseln ohne Fluoreszenzmarker (LNC BLANK)
- brain derived neurotrophic factor (BDNF) in der Konzentration von 50 ng/ml als
Positivkontrolle
4
4
4
4
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20

50
Die Versuche wurden dreimal wiederholt. Je Gruppe wurden drei unterschiedliche
Konzentrationen getestet. Es wurde eine Verdünnung der Stammlösungen mit Panserin (10.2)
von 1:100, 1:200 und 1:300 durchgeführt (Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln
45 mg/ml). BDNF wurde wiederum nur in der Konzentration von 50 ng/ml als
Positivkontrolle mitgeführt. Eine Übersicht der Gruppen wird in Tabelle 3 gegeben.
Tab. 3: Übersicht über die in-vitro-Versuche mit kultivierten Spiralganglienzellen. Es werden die
verwendeten Konzentrationen und die Anzahl der behandelten Kavitäten der Versuchsgruppen LNC
FITC, LNC BLANK und BDNF dargestellt.
Versuchsgruppe Konzentration
�anopartikel [mg/ml]
LNC FITC 1:300= 0,15
1:200= 0,225
1:100= 0,45
LNC BLANK 1:300= 0,15
1:200= 0,225
1:100= 0,45
Anzahl der Wells pro
Versuchstag
3
3
3
Anzahl der
Wells
insgesamt
BDNF 50 ng/ml 3 9
4.2.1.3 Beschichtung der 96-Multiwellplatten zur Kultivierung von Spiralganglienzellen
Zur Kultivierung von Spiralganglienzellen wurden die in 96-Multiwell-Kulturplatten (10.4)
vorhandenen Kavitäten mit Poly-D/L-Ornithin (10.2) und Laminin (10.2) beschichtet. Diese
Behandlung gewährleistete eine bessere Adhäsion der Spiralganglienzellen am Boden des
Wells und verhinderte somit eine Ablösung der Zellen durch spätere Spül- und
Färbevorgänge.
Zunächst wurde aus zuvor angelegten und bei -20°C gelagerten Aliquots die benötigte Menge
Poly-D/L-Ornithin entnommen und eine Lösung mit der Konzentration von 0,1 mg/ml Poly-
D/L-Ornithin in phosphate buffered saline (PBS, 10.2) hergestellt. Von dieser Lösung wurden
im ersten Schritt des Beschichtens 100 µl in die einzelnen Vertiefungen pipettiert. Im
Anschluss erfolgte eine Inkubationszeit von einer Stunde bei Raumtemperatur.
3
3
3
9
9
9
9
9
9

51
Vor Ablauf dieser Stunde wurde die Lamininlösung vorbereitet, wobei hier entsprechend der
Lösung des Poly-D/L-Ornithins verfahren wird. Die Konzentration beträgt im Falle des
Laminins 0,01 mg/ml in PBS. Die Poly-D/L-Ornithin Lösung wird nun vorsichtig vom Rand
des Wells beginnend abgesaugt, wobei auch in den folgenden Schritten darauf geachtet wird,
dass der Boden der jeweiligen Vertiefung nicht austrocknet. Hiernach schließt sich ein
Waschvorgang mit 100 µl PBS pro Well an, wobei anschließend je Vertiefung 100 µl
Lamininlösung eingebracht wurde.
Die folgende Inkubationszeit beträgt wiederum 60 Minuten, wobei die Wellplatte im
Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit gelagert wurde.
Abschließend wurde die Lamininlösung vorsichtig entfernt und ein letzter Spülschritt mit
100 µl PBS pro Well schloss sich an. Bis zur Verwendung konnte die beschichtete Platte 5
Tage bei 4 °C gelagert werden.
4.2.1.4 Gewinnung der Spiralganglienzellen
Zur Gewinnung der Spiralganglienzellen wurden 3-5 Tage alte Sprague-Dawley-Ratten
zunächst durch einen Scherenschlag dekapitiert. Anschließend wurden die Unterkieferäste mit
einer geraden chirurgischen Schere (10.5) von rostral nach caudal entfernt. Vom Schädel
wurde im nächsten Schritt die Haut entfernt wonach, beginnend vom Hinterhauptsloch, die
Schädeldecke und die Schädelbasis durch zwei Scherenschnitte eröffnet wurde. Auf Höhe der
Verbindungslinie der caudalen Augenwinkel erfolgte anschließend ein Transversalschnitt,
wodurch die zwei caudalen Anteile des Schädels vom rostralen Anteil separiert wurden. Die
zügige Überführung der beiden Schädelhälften in eiskalte phosphate buffered saline (PBS,
10.2) erfolgte nach der Entnahme der Gehirnanteile.
Die weiteren Dissektionsschritte wurden unter einem Auflichtstereomikroskop (10.6) mithilfe
von Uhrmacherpinzetten (10.5) durchgeführt. Hierbei erfolgte zunächst eine präparatorische
Darstellung des Felsenbeines, wonach die Cochleakapsel eröffnet wurde. Anschließend
konnten die Anteile der häutigen Schnecke entnommen und in eine neue Petrischale mit
eiskaltem PBS überführt werden. Vom Modiolus wurden nun das Cortische Organ und die
Stria vascularis entwunden. Letztlich erfolgte die Trennung des Spiralganglions vom

52
Modiolus, welches sofort in eisgekühltes Hank´s balanced salt solution (HBSS, 10.2)
überführt wurde. In Abbildung 4 werden einzelne Präparationsschritte bildlich dargestellt.
Für einen Versuchsansatz von 15 x 10 4 Zellen pro Vertiefung auf einer 96-Multikulturplatte
(10.4), wurden etwa 18-20 Tiere benötigt, was der Präparation von 36-40
Spiralgangliensträngen entspricht. Mit den gewonnenen Zellen konnten 60 Vertiefungen
belegt werden.
Abb. 4: Darstellung einzelner Präparationsschritte zur Gewinnung des Spiralganglions. Bild 1 zeigt die
eröffnete Schädelkapsel einer 4 Tage alten Sprague-Dawley-Ratte. Bild 2 veranschaulicht die
Präparation und Entnahme der Cochlea. In Bild 3 ist die häutige Schnecke dargestellt. Nach der
Entfernung von Stria vascularis und Cortischem Organ zeigt Bild 4 das aus dem Modiolus
herausgetrennte Spiralganglion.

53
4.2.1.5 Die Vereinzelung der Spiralganglienzellen
Zunächst wurde für die Kultivierung und Vereinzelung der Spiralganglienzellen
supplementiertes, serumfreies Zellkulturmedium hergestellt. Die Herstellung wurde nach dem
im Anhang (10.1) aufgeführtem Schema vollzogen und entsprach in ihrer Zusammensetzung
den Protokollen von LEFEBVRE et al. (1991) und ALETSEE et al. (2000). Die so gefertigte
Lösung konnte bis zur Verwendung sieben Tage im Kühlschrank bei 4 °C gelagert werden.
Bevor mit der eigentlichen Vereinzelung begonnen werden konnte, wurden die Überstände
aus den zuvor beschichteten 96-well Platten (10.4) verworfen und pro Vertiefung mit 100 µl
serumfreiem Spiralganglienzellkulturmedium gewaschen. Die Multiwell-Kulturplatte wurde
im Anschluss unter dem Laborabzug (10.6) gelagert, sodass das die Platte vor der Einsaat der
Spiralganglienzellen Raumtemperatur erreichen konnte, um ein möglichst schonendes
Einsäen der Zellen zu gewährleisten.
Die Separierung der Spiralganglienzellen erfolgte in einen enzymatischen sowie
mechanischen Schritt der Vereinzelung. Bei der Vorgehensweise wurde nach in der Literatur
anerkannten Protokollen verfahren (LEFEBVRE et al. 1991; HEGARTY et al. 1997).
Bevor mit der enzymatischen Vereinzelung der nach obigem Schema (4.2.1.4) präparierten
Spiralganglienzellstränge begonnen werden konnte, wurden die hierfür benötigten 2 ml
Verdaulösung [Hank’s balanced salt solution (HBSS) inklusive 0,1 % Trypsin, 0,1 % DNase
I und 0,01 % Kollagenase, 10.2] sowie das anschließend verwendete FBS (200 µl) bei 37 °C
und 5 % CO2 für mindestens 30 Minuten im Brutschrank (10.6) inkubiert. Die in
eisgekühltem HBSS vorliegenden Spiralganglienzellstränge wurden zunächst mittels
Pipettierhilfe (10.6) vom Überstand befreit. Sofern sich noch einige Stränge frei in der
Lösung befanden und sich noch kein vollständiger Bodensatz gebildet hatte, wurden die
Zellstränge für etwa 20 Sekunden bei 6000-7000 rounds per minute (rpm) zentrifugiert (10.6).
Anschließend erfolgte die Zugabe von 2 ml erwärmter Verdaulösung mit einer nachfolgenden
Inkubationszeit von 20 min bei 37 °C und 5 % CO2. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde
die Verdaulösung so vollständig wie möglich entfernt und durch sofortige Zugabe von 200 µl
erwärmten FBS konnte die enzymatische Vereinzelung der Zellen gestoppt werden. Im
nächsten Schritt wurden die Zellen noch dreimalig mit je einem Milliliter serumfreien
Spiralganglienzellmedium gespült, wonach sich die mechanische Verdauung angeschlossen

54
hat. Hierfür wurden die Zellen mittels einer 1000 µl Pipettierhilfe (10.6) und einem
entsprechenden Pipettenaufsatz (10.4) etwa 100 Mal auf- und abpipettiert, wobei sehr
vorsichtig verfahren werden musste um durch die entstehende Schaumbildung keine Zellen zu
verlieren. Anschließend wurde mit einer 200 µl Pipettierhilfe (10.6) und entsprechendem
Aufsatz (10.4) in gleicher Weise verfahren wodurch eine Suspension mit einzelnen Zellen
entstand um die für die Einsaat der Spiralganglienzellen benötigte Zellzahl bestimmen zu
können.
4.2.1.6 Einsaat der Spiralganglienzellen
Um die für den Versuch benötigte Zellanzahl von 1,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung bestimmen
zu können, wurde zunächst die Gesamtzellzahl der zuvor verdauten Zellen bestimmt. Hierfür
entnahm man dem vorliegenden Milliliter Zellsuspension 10 µl und überführte diese in ein
0,5 ml Eppendorffgefäß (10.4). Aus Gründen der optimierten Visualisierung sowie zur
Identifizierung von bereits letalen Zellen wurden noch 10 µl Trypanblau (10.2) hinzugefügt.
Das Trypanblau-Zellgemisch wurde zur besseren Homogenisierung noch einige Male auf-
und abpipettiert um anschließend je 7 µl auf beide Seiten einer Neubauer-Zählkammer (10.6)
einzubringen. Die acht Felder der Zählkammer wurden unter einem Aufsichtmikroskop (10.6)
einzeln ausgezählt und gemittelt, wobei der Mittelwert mit 2 x 10 4 multipliziert (Faktor 2
ergibt sich durch das Hinzufügen des Trypanblaus) die Gesamtzellzahl in dem hergestellten
Milliliter Zellsuspension ergab. Fielen während der Zählung größere Zellcluster auf, so wurde
die Zellsuspension erneut mechanisch vereinzelt, da neben der nicht durchzuführenden
Zählung auch die spätere Auswertung der Spiralganglienzellanzahl zu nicht tolerablen
Abweichungen geführt hätte.
Anhand der Gesamtzellzahl wurde die Zellsuspension mit der entsprechenden Menge
serumfreien Spiralganglienzellmedium verdünnt, um eine Konzentration von 1,5 x 10 4 Zellen
pro 50 µl zu erreichen. Diese wurden nach Verwerfen des serumfreien
Spiralganglienzellkulturmediums in die Vertiefungen der Multikulturwellplatte eingebracht.
Weitere 50 µl wurden in je nach Versuchsansatz entsprechenden Anteilen Medium und
Nanopartikel- oder Arzneimittellösungen aufgefüllt um ein Gesamtvolumen von 100 µl pro

55
Well zu erreichen. In jedem Versuch wurden neben den unterschiedlich konzentrierten
Nanopartikel- und Arzneimittelgruppen auch mindestens zwei Kontroll- und zwei
Einsaatansätze mitgeführt. Die Einsaatkontrolle wurde bereits nach vier Stunden fixiert,
wodurch sich in der späteren Auswertung die relative Überlebensrate der Spiralganglienzellen
aller Gruppen ermitteln ließ. Hierfür wurden die immunozytochemisch angefärbten
Spiralganglienzellen der Einsaatkontrolle ausgezählt. Der Mittelwert der pro Versuchsansatz
mitgeführten Einsaatkontrollansätze galt als Bezugsgröße (100 %) und wurde mit den
Anzahlen der als vital geltenden Spiralganglienzellen der mit den Testsubstanzen behandelten
Versuchsansätze sowie der Negativkontrolle ins Verhältnis gesetzt (5.1.1). Die
Kontrollgruppe wurde nur mit serumfreiem Spiralganglienzellkulturmedium angesetzt, wobei
keine weiteren Zusätze hinzugegeben wurden um den Effekt auf die Überlebensrate der
Spiralganglienzellen der Nanopartikel und des Arzneimittels zu verifizieren. Versuchs- und
Kontrollgruppen wurden nach 48 Stunden Inkubationszeit im Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2
und 95 % Humidität fixiert.
4.2.1.7 Fixation der Spiralganglienzellen
Zur Fixierung der Spiralganglienzellen wurde zunächst das serumfreie
Spiralganglienzellmedium entfernt wobei die Flüssigkeit vorsichtig vom Rand her abgesaugt
wurde, um die am Boden adhärenten Zellen nicht zu beschädigen oder gar zu entfernen.
Hierbei wurde auch darauf geachtet, dass der Boden nicht vollständig austrocknen durfte,
bevor der nächste Schritt erfolgte. Anschließend wurde die Fixierlösung, welche zu gleichen
Teilen aus Methanol und Aceton (10.2) besteht, hinzugefügt. Pro Well wurden 100 µl
verwendet, welche für 10 Minuten bei Raumtemperatur einwirken mussten. Nach dreimaligen
Spülvorgängen mit je 150 µl PBS (10.2) wird im letzten Durchgang die Lösung in der Kavität
belassen und die Versuchsplatte von außen mit Parafilm abgedicht. So konnte die
abgedichtete Platte bei 4 °C bis zur immunozytochemischen Anfärbung gelagert werden. Die
Weiterverarbeitung sollte innerhalb der darauffolgenden 2 Monate abgeschlossen sein.

56
4.2.1.8 Markierung der vereinzelten Spiralganglienzellen über die immunozytochemische
ABC-Methode
Da man durch die Präparation und Vereinzelung des Spiralganglionzellstrangs eine
Mischkultur aus Spiralganglienzellen, Bindegewebszellen sowie Gliazellen erhält, ist es
notwendig, die kultivierten Spiralganglienzellen nach der Fixierung zu markieren. Dadurch
war es möglich, die Zielzellen sicher zu identifizieren, weiterhin wurde eine genaue
Vermessung der Dendriten und Somadurchmesser ermöglicht.
In der vorliegenden Arbeit erfolgte die spezifische Anfärbung der Spiralganglienzellen durch
die Avidin-Biotin-Complex-(ABC-)Methode. Hierbei handelt es sich um eine
Immunperoxidase-Methode, bei der ein biotinylierter Sekundärantikörper an einem gegenüber
dem Zielantigen sensitiven Primärantikörper bindet (HSU et al. 1981). Der Mechanismus
dieser Methode beruht auf dem Vorhandensein von vier Bindungsstellen für das
wasserlösliche Vitamin Biotin am Molekül des Glykoproteins Avidin, wobei drei
Bindungsstellen durch ein biotinyliertes Markerenzym besetzt werden. Bei diesem
Markerenzym handelt es sich um eine Peroxidase. Die verbleibende Bindungsstelle wird zur
Bindung eines biotinylierten Sekundärantikörpers verwendet, wobei dieser an einen gegen
Spiralganglienzellantigene gerichteten Primärantikörper bindet. Anschließend wird durch die
Zugabe des Chromogens Diaminobenzidin (DAB) eine Enzym-Substrat-Reaktion
herbeigeführt, welche letztlich zu einer farbigen Markierung der Spiralganglienzellen führt.
Für die selektive Anfärbung der Spiralganglienzellen wurde neben den einzelnen
Bestandteilen des „Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit, Mouse IgG“ (10.2) und „Peroxidase
Substrate Kit DAB“ (10.2), sterilisierte PBS (10.2) sowie der als Primärantikörper dienende
„ANF-AK (Neurofilament 200 kD, NCL-NF200)“-Antikörper (10.2) verwendet. Die
Arbeitsabfolge entsprach hierbei dem Schema von in der Literatur publizierten Protokollen
(DAZERT et al. 1998; ALETSEE et al. 2000).
Vor dem Beginn der einzelnen Färbeschritte stellt man eine 1,5%ige Pferdenormalserum-
lösung her, wobei für einen Versuchsumfang von 50 Wells einer 96-Multiwellplatte zu 13 ml
PBS 3 Tropfen Pferdeserum aus dem Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit hinzugegeben
wurden. Anschließend wurden für die Herstellung der Antikörperlösung 1 in 6 ml
Pferdenormalserumlösung 13 µl ANF-Antikörper hinzugegeben, was einer Konzentration von

57
1:500 entspricht. Die Antikörperlösung 2 wurde durch die Zugabe von 30 µl Biotin-Ak aus
dem Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit in 6 ml Pferdenormalserumlösung hergestellt. Die
Endkonzentration entspricht in diesem Fall einer Verdünnung von 1:200.
Nach Fertigstellung dieser Lösungen wurden die Zellen aus dem Brutschrank entnommen.
Das überstehende PBS wurde vorsichtig vom Rand her entfernt, woraufhin 100 µl der
Antikörperlösung 1 in jede Vertiefung gebracht wurden und eine Inkubationszeit von einer
Stunde bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank erfolgte. Nach Ablauf der Inkubationszeit
wurde der Überstand verworfen und es folgte ein Spülvorgang mit 150 µl PBS pro
Vertiefung. Anschließend wurde eine Inkubationszeit von 30 Minuten bei Raumtemperatur
mit 100 µl Antikörperlösung 2 pro Kavität durchgeführt. Während dieser Zeit wurde die
ABC-Lösung hergestellt, wozu 7,5 ml PBS mit jeweils drei Tropfen der Reagenzien A und B
aus dem Peroxidase Vectastain Elite ABC-Kit versetzt wurden. Die Lösung sollte dabei etwa
30 Minuten vor der Verwendung hergestellt werden.
Nach einem weiteren Spülschritt mit jeweils 150 µl PBS wurden anschließend pro Vertiefung
100 µl ABC Lösung hinzugegeben und für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
In der Zwischenzeit erfolgte die Herstellung des DAB-Substrats aus den Reagenzien des
Peroxidase Substrate Kits DAB. Hierzu wurden 7,5 ml Aqua bidest (10.2) mit 3 Tropfen
Puffer-Stammlösung, 6 Tropfen DAB-Stammlösung sowie 3 Tropfen Wasserstoffperoxid
vermischt. Das DAB-Substrat wurde letztlich nach einem wie oben beschriebenen Spülschritt
in einer Menge von 100 µl pro Well hinzugegeben, wobei dieser Färbevorgang nach einer
Dauer von 12 Minuten durch die Hinzugabe von 300 µl PBS pro Kavität gestoppt wurde.
Nach Verwerfen des Überstandes erfolgte ein weiterer Spülvorgang mit jeweils 150 µl PBS,
wobei zur abschließenden Lagerung bei 4 °C 150 µl PBS pro Well hinzugegeben wurden, was
ein Austrocknen der fixierten und gefärbten Zellen verhindert. Bis zur Auswertung war eine
Lagerung der Zellen durch Abdichten mit Parafilm bei 4 °C bis zu zwei Monate möglich.

58
4.2.1.9 Vermessung der Spiralganglienzellen und statistische Auswertung der
Spiralganglienzellversuche
Zur Auswertung der Versuche wurden mittels eines inversen binokularen Mikroskops (10.6)
und einer charged-coupled-device-(CCD)-Kamera (10.6) sowie dem angeschlossenem
rechnergestützten Bildbearbeitungssystem cellP (Olympus Soft Imaging Solutions, Münster;
10.6) drei Parameter der überlebenden und zuvor immunozytochemisch angefärbten
Spiralganglienzellen ermittelt. Zunächst erfolgte die Bestimmung der Zellanzahl von vitalen
Spiralganglienzellen. Als vital wurden Zellen definiert, deren Neuritenaussprossungen
mindestens die dreifache Länge des Somadurchmessers aufgewiesen haben (MARZELLA et
al. 1999). Als zweiter Parameter wurde mittels softwaregestützter Vermessung die Länge der
Neuriten bestimmt. Hierbei wurden pro Kavität 5 Gesichtsfelder bestimmt und je Gesichtsfeld
diejenige Spiralganglienzelle mit der längsten Neuritenaussprossung vermessen (GILLESPIE
et al. 2001). War in dem entsprechenden Gesichtsfeld keine vitale Spiralganglienzelle
visualisierbar, so wurde eine Zelle aus einem benachbartem Bereich hinzugezogen. Letztlich
erfolgte in entsprechender Weise die Vermessung des Somadurchmessers, wobei die Messung
vertikal zur Richtung der Neuritenaussprossung vorgenommen wurde. Weiterhin wurde bei
der Erhebung der Parameter auch auf morphologische Abweichungen der Zellen geachtet,
welche Aufschluss auf eine Beeinträchtigung durch die Testsubstanzen geben könnten.
Abbildung 5 gibt eine beispielhafte Darstellung der angezüchteten Spiralganglienzellen
wieder.
Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Softwareprogramm GraphPad Prism ® 4 (10.6).
Zunächst wurden die Daten mittels Kolmogorow-Smirnow-Test auf Normalverteilung
geprüft, anschließend wurde eine Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) mit
Student-Newman-Keuls-Test durchgeführt.
Die ermittelten Signifikanzniveaus wurden dabei wie folgt definiert:
- p > 0,05 = nicht signifikant unterschiedlich (ns)
- p < 0,05 = signifikant unterschiedlich (*)
- p < 0,01 = hoch signifikant unterschiedlich (**)
- p < 0,001 = höchst signifikant unterschiedlich (***)

59
Abb. 5: Beispielhafte Darstellung in Zellkultur angezüchteter und immunozytochemisch angefärbter
(DAB-Färbung) Spiralganglienzellen. Als vital wurden Zellen bewertet, deren Neuritenausläufer
mindestens die dreifache Länge des Somadurchmessers aufweisen konnten. Immunozytochemisch
angefärbte Spiralganglienzellen ohne Ausläufer wurden als nicht lebensfähig bewertet (Pfeile).
4.2.2 Methoden für die in-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen
4.2.2.1 Die Generierung und Kultivierung dendritischer Zellen
Die Generierung dendritischer Zellen erfolgte durch die Gewinnung von Stammzellen aus
dem Knochenmark des Femurs von BALB/c Mäusen. Hierbei wurde nach dem in der
Literatur beschrieben Protokoll von LUTZ et al. (1999) verfahren.

60
Zunächst wurden die verwendeten Tiere durch zervikale Dislokation getötet. Danach erfolgte
die Entnahme des Femurs, welcher im Anschluss für 5 Minuten in 70%igem Ethanol
desinfiziert und anschließend in sterile PBS-Lösung (10.2) überführt wurde.
Mittels eines Skalpells wurden die Epiphysen des Femurs abgesetzt, um die Stammzellen
mithilfe einer Spritze und 5 ml PBS aus dem Knochen zu spülen. Durch vorsichtiges hin und
herschaben mit der Kanüle in der Markhöhle wurde die Gewinnung von möglichst vielen
Zellen sichergestellt, welche in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen (10.4) aufgefangen wurden.
Um die Zellen zu vereinzeln, wurde die gewonnene Suspension mit einer Pipette einige Male
auf und ab pipettiert, um anschließend bei 300 g für 10 Minuten und 4 °C zentrifugiert zu
werden. Der entstehende Überstand wurde verworfen und das Zellpellet im Anschluss mit
5 ml Roswell Park Memorial Institute-Medium (RPMI, 10.2) Medium resuspendiert. Um die
Anzahl der gewonnen Zellen zu bestimmen, wurden 100 µl der Zellsuspension in ein
Eppendorffgefäß überführt und mit 100 µl Schwintzer-Lyse (10.2) für 5 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Hierdurch kommt es zur Lyse der in der Suspension ebenfalls
vorhandenen Erythrozyten. Zur Auszählung der vitalen Zellen wurden aus dieser Lösung
wiederum 50 µl entnommen um in 100 µl Trypanblau (10.2) überführt zu werden. Durch das
Trypanblau können tote Zellen visualisiert werden, indem der Farbstoff aufgrund einer
verstärkten Permeabilität der Zellmembran abgestorbener Zellen ins Zytoplasma
aufgenommen wird und die Zelle folglich blau anfärbt. Positiv angefärbte Zellen wurden
nicht ausgezählt. Im Anschluss wurden 10 µl des Trypanblau-Zellgemischs auf eine
Neubauerkammer aufgetragen und die vorhandenen Zellen in vier Feldern der Kammer unter
einem Mikroskop (10.6) ausgezählt. Die daraus resultierende Gesamtzellzahl wurde mit der
Formel: Anzahl der ausgezählten Zellen x 2 x 3 x 10.000/4, errechnet. Die Faktoren 2 und 3
ergeben sich durch die Verdünnung mit Schwintzer-Lyse und dem Trypanblau wobei das
Ergebnis durch die Anzahl der vier ausgezählten Felder geteilt wird.
Zu Beginn des Zellansatzes zur Reifung der dendritischen Zellen, wurde eine Zellzahl von
3 x 10 6 Zellen in eine Petrischale mit 10 ml sterilem DC-Medium (10.1) eingesät. Die Zellen
wurden insgesamt 10 Tage im Brutschrank bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. An Tag 3
erfolgte eine Zugabe von 10 ml frischem, sterilem DC-Medium mit 20 ng/ml granulocyte
macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Am 6. sowie 8. Tag erfolgte ein teilweiser
Mediumwechsel, wobei 10 ml aus der Kultur entnommen wurden und die darin enthaltenen

61
Zellen bei 300 g und 4 °C für 10 Minuten herunterzentrifugiert wurden. Der Überstand des
alten Mediums wurde verworfen, wobei die Zellen mit 10 ml frischem Medium resuspendiert
wurden. Im Anschluss wurden die Zellen wieder in die Petrischale überführt. Des Weiteren
wurde auch an diesen Tagen 20 ng/ml GM-CSF hinzugefügt.
Die optimale Kultivierungsdauer wird für aus dem Knochenmark gewonnene dendritische
Zellen mit etwa 8 Tagen angegeben (INABA et al. 1992). Bei einer längeren Kultivierung von
über 10 Tagen nehmen die Reinheit und die Ausbeute der Zellen wieder ab.
4.2.2.2 Übersicht der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen
In diesem Versuchsaufbau sollte der Einfluss von Rolipram, sowie von in Lipidnanokapseln
inkorporiertem Rolipram auf die TNF-α-Produktion dendritischer Zellen untersucht werden.
So wurden die kultivierten Zellen am Tag neun des Versuchs mit den jeweiligen
Testsubstanzen behandelt. Eine Stunde später erfolgte die Zugabe von 0,5 µg/ml LPS
(Lipopolysacchariden; 10.2), was zur Reifung und Aktivierung der dendritischen Zellen führt.
Durch die Anregung der Zellen mit LPS kommt es zur Produktion des Zytokins TNF-α. Die
Stärke der Hemmung der Zytokinproduktion durch die verwendeten Versuchssubstanzen
wurde durch die Bestimmung der TNF-α-Konzentration ermittelt (4.2.2.3). Je geringer die
TNF-α-Produktion, desto höher die Effizienz der hemmenden Wirkung der Substanz. Um ein
Ausbleiben der TNF-α-Produktion durch eine verminderte Vitalität der Zellen durch eine
mögliche Toxizität der eingesetzten Substanzen auszuschließen wurde ein CellTiter 96 ®
Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay am Ende des Versuchs (Tag 10) durchgeführt
(4.2.2.4). Hierfür wurde die gesamte Mikrotiter-Wellplatte zunächst für 10 min bei 1000 g
(g = Erdschwerebeschleunigung) und 4 °C zentrifugiert, um die Abnahme eines zellfreien
Überstandes zu gewährleisten. Bis zur Auswertung wurden die Überstände bei -80 °C
eingefroren.
Dieser Versuch sollte neben der Wirkung des Roliprams auch eine Aussage über die Effizienz
der Nanopartikel-Rolipram-Kombination liefern. Des Weiteren können auch Rückschlüsse
auf den Einfluss des Roliprams auf entzündungsbedingte Prozesse gezogen werden, da TNF-α

62
hierbei eine Schlüsselrolle spielt und die Hemmung dieses Zytokins zu einer Abschwächung
der Symptome führt.
Sechs Gruppen wurden gebildet und in drei Versuchsansätzen wiederholt, wobei die
Ergebnisse zusammengefasst und statistisch ausgewertet wurden. Die verwendeten
Konzentrationen wurden in Anlehnung an HEYSTEK et al. (2003) gewählt.
- Zu dem ersten Zellkulturansatz (Versuchsgruppe ROLIRPAM) wurden vier
unterschiedliche Verdünnungen von Rolipram hinzugegeben (10 µmol, 1 µmol,
0,1 µmol, 0,01 µmol).
- Der zweiten Gruppe wurde die Nanopartikel-Rolipram Kombination (LNC FITC
ROLIPRAM) hinzugegeben, wobei die Konzentrationen des Roliprams analog zur
ersten Gruppe gewählt wurden (10 µmol, 1 µmol, 0,1 µmol, 0,01 µmol).
- Die dritte Gruppe (LNC FITC) wurde mit unbeladenen Nanopartikeln behandelt,
wobei diese den Fluoreszenzmarker FITC an ihrer Oberfläche gekoppelt hatten.
Die Partikelanzahlen entsprechen in den unterschiedlichen Konzentrationen den
Werten der zweiten Gruppe.
- Als Kontrollgruppe wurde ein unbeladener, sowie unmarkierter Partikel gewählt
(LNC BLANK), um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Die
Konzentrationen entsprechen ebenfalls den Werten der Gruppe 1.
- Als Negativkontrolle wurde in einer fünften Gruppe der Effekt des Vehikels, also
des Lösungsmittels (DMSO > 0,01 Vol. %) auf die TNF-α-Produktion der
dendritischen Zellen untersucht. Die dendritischen Zellen dieser Gruppe (Gruppe
VEHIKEL) wurden nicht mit LPS behandelt.
- Die sechste Gruppe diente als Positivkontrolle, wobei die dendritischen Zellen mit
keiner weiteren Substanz behandelt, aber mit LPS angeregt wurden (Gruppe LPS).
Als Übersicht zur Gruppenaufteilung sowie zu den verwendeten Konzentrationen soll die
untenstehende Tabelle 4 dienen.

63
Tab. 4: Übersicht der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen zur Beurteilung der TNF-α Produktion
nach LPS-induzierter Stimulation und Zugabe von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM, LNC FITC und
LNC BLANK
Versuchsgruppe Konzentration
Nanopartikel
Gruppe1:
ROLIPRAM
Gruppe 2:
LNC FITC
ROLIRPAM
Gruppe 3
LNC FITC
Gruppe 4:
LNC BLANK
Gruppe 5:
VEHIKEL
(DMSO > 0,01
Vol.-%)
Gruppe 6:
LPS
1,06 x 10 11
1,06 x 10 12
1,06 x 10 13
1,06 x 10 14
1,06 x 10 11
1,06 x 10 12
1,06 x 10 13
1,06 x 10 14
1,06 x 10 11
1,06 x 10 12
1,06 x 10 13
1,06 x 10 14
4.2.2.3 Messung der TNF-α-Konzentration
Konzentration
Rolipram
0,01 µmol
0,1 µmol
1 µmol
10 µmol
0,01 µmol
0,1 µmol
1 µmol
10 µmol
Anzahl der Wells
pro Konzentration
und Versuchstag
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Anzahl der
Wells insgesamt
Die Messung des von den dendritischen Zellen produzierten Zytokins TNF-α wurde mittels
eines TNF-α-Maus ELISA (10.2, R&D Systems, Minneapolis, USA) nach Herstellerprotokoll
durchgeführt. Das Prinzip dieses Tests beruht auf der Bindung von TNF-α an polyklonale
Antikörper, welche fest in den Kavitäten einer Mikrotiterplatte (10.4) gebunden sind. Wird
4
4
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12

64
der Überstand der unterschiedlichen Versuchsansätze nun auf die Platte gegeben, so bindet
darin vorhandenes TNF-α an diesen Antikörper. Durch das Hinzufügen eines
enzymgekoppelten Antikörpers wurde TNF-α erneut gebunden, woraufhin die Zugabe eines
Farbstoffes einen enzyminduzierten Farbumschlag bewirkt. Je mehr TNF-α vorhanden war,
desto stärker ist der Farbumschlag, was durch photometrische Auswertung mittels MRX-
Reader (10.6) bei 450 nm zwischen den unterschiedlichen Gruppen verglichen werden sollte.
Anhand der ermittelten Werte der Standardreihe wurde eine Kalibrationskurve zur
Bestimmung der TNF-α-Konzentration in den mit den Testsubstanzen behandelten Wells
errechnet. Die statistische Auswertung wurde über den Vergleich der jeweiligen
Konzentrationen der Gruppen untereinander durchgeführt und mittels Varianzanalyse
(analysis of variance, ANOVA) und Student-Newman-Keuls-Test ausgewertet. Hierfür wurde
das Softwareprogramm GraphPad Prism ® 4 (10.6) verwendet.
Die ermittelten Signifikanzniveaus wurden dabei wie folgt definiert:
- p > 0,05 = nicht signifikant unterschiedlich (ns)
- p < 0,05 = signifikant unterschiedlich (*)
- p < 0,01 = hoch signifikant unterschiedlich (**)
- p < 0,001 = höchst signifikant unterschiedlich (***)
4.2.2.4 Vitalitätsbestimmung
Zur Bestimmung der Vitalität der dendritschen Zellen wurde am Ende des Versuchs (Tag 10)
ein CellTiter 96 ® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay durchgeführt. Zudem
wurden die Zellen einer mikroskopischen Kontrolle hinsichtlich morphologischer
Abweichungen unterzogen, welche eine tendenzielle Aussage über eine mögliche
Beeinflussung durch die Testsubstanzen zulassen könnte. Die Ergebnisse des Vitalitätstests
lassen eine Aussage über die Beeinträchtigung der Zellen durch die verwendeten
Testsubstanzen zu. So kann eine geringere TNF-α-Produktion nicht nur durch eine Hemmung
der Zytokinbildung sondern auch durch ein vermehrtes Degenerieren der in der Zellkultur
vorhandenen Zellen bedingt sein.

65
Die Funktionsweise dieses Assays basiert auf der Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-
Phosphat (NADPH) oder Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) katalysierten
Umsetzung von dem gelblichen Methyltetrazolium zu einem violetten Formazanfarbstoff.
NADPH/NADH befindet sich nur in lebenden Zellen, sodass der Farbumschlag durch
photometrische Auswertung bei 490 nm einen Aufschluss auf die Vitalität der Zellen gibt. Die
erhaltene Menge des Formazonfarbstoffs ist hierbei direkt proportional zu der Anzahl vitaler
Zellen.
4.2.3 Methoden für die In-vivo-Versuche
4.2.3.1 Übersicht der In-vivo-Versuche
In den vorangegangenen In-vitro-Versuchen zeigte sich das beste Spiralganglienzellüberleben
bei einer Nanopartikel-Rolipram-Konzentration von 1:100 (Konzentration der Stammlösung:
Lipidnanokapseln 45 mg /ml; 19 µg/ml Rolipram). Basierend auf diesem Ergebnis wurde
dieselbe Konzentration in den In-vivo-Versuchen angewendet. Die entsprechenden Lösungen
wurden per Cochleostomie in die Scala tympani der Versuchstiere injiziert. Die Durchführung
der Versuche erfolgte, wie zuvor beschrieben, mit vier Versuchsgruppen (4.1.6).
Nach der histologischen Aufarbeitung wurden die Anzahlen der überlebenden
Spiralganglienzellen sowie deren Somadurchmesser ermittelt. Zunächst erfolgte ein Vergleich
der erhobenen Daten der Gruppen untereinander. Dabei wurden die Daten der mit der
Testsubstanz behandelten Seiten statistisch verglichen. Des Weiteren erfolgte ein statistischer
Vergleich der Ergebnisse innerhalb der einzelnen Gruppen. Hierbei wurden die Daten der mit
der Testsubstanz behandelten Seite mit den Daten der Kontrollseite verglichen.
4.2.3.2 Anästhetische Versorgung; prä- und postoperative Versorgung der Versuchstiere
Sämtliche an den Versuchstieren vorgenommenen Manipulationen, wie elektrophysiologische
Messungen, chirurgische Eingriffe, sowie die transkardiale Perfusion, erfolgten unter

66
Allgemeinanästhesie. Dazu wurde den Tieren nach Ermittlung des aktuellen Körpergewichts
eine Kombination von 40 mg Ketamin/kg Körpergewicht (KGW) und 0,3 mg/kg KGW
Medetomidin (10.3) intramuskulär verabreicht. Bei Bedarf wurde mit einer Zweidritteldosis
der ursprünglichen Konzentration nachdosiert. Davon ausgenommen wurde am Tag 21 der
Studie nach den aABR Messungen mit der vollen Ursprungsdosis nachdosiert, um die
Schmerzfreiheit im Verlauf der Perfusion insbesondere während der Thorakotomie zu
gewährleisten. Während der gesamten Narkosedauer wurden die Meerschweinchen auf einer
Wärmematte (10.3) gelagert, um die Körpertemperatur auf 37-38 °C zu halten.
Des Weiteren erhielten die Tiere 0,05 mg/kg KGW Atropin (10.3), um die Salivation zu
vermindern, sowie 5 mg/kg KGW Carprofen (10.3) zur Analgesie. Die Operationsfelder der
Ertaubung sowie die der Cochleostomie wurden im Anschluss an die elektrophysiologischen
Messungen mittels einer Haarschneidemaschine (10.3) rasiert, sowie mit Cutasept ® (10.3)
desinfiziert, um das Risiko einer Infektion zu minimieren. An den entsprechenden
Schnittstellen wurde zusätzlich eine Lokalanästhesie mittels Prilocain (10.3) vorgenommen.
Die Mengen variierten hierbei je nach Eingriff zwischen 1 ml bei den Hautschnitten der
Ertaubung sowie der Cochleostomie und 6 ml im Vorfeld der Thorakotomie. Die antibiotische
Versorgung der Tiere wurde am Tag der Operation mit einer intramuskulären Injektion von
10 mg/kg Enrofloxacin (10.3) gewährleistet. Zum Schutz der Hornhaut wurden die Tiere lokal
mit dexpanthenolhaltiger Augensalbe (10.3) versorgt, um ein Austrocknen der Cornea
aufgrund des fehlenden Lidreflexes während der Narkose zu verhindern. Die Nachsorge
erfolgte durch eine 5-tägige orale Applikation von Enrofloxacin (10 mg/kg KGW). Am ersten
Tag nach der Operation, sowie einen Tag vor der Operation wurde zusätzlich 0,5 ml Bene
Bac® (10.3) oral verabreicht, um die Darmflora zu stabilisieren.
4.2.3.3 Akustisch-evozierten Hirnstammpotentiale (aABR)
Unmittelbar vor der systemischen Ertaubung am Versuchstag 0 wurde über eine acoustically
evoked auditory brainstem response (aABR)-Messung die physiologische Hörschwelle der
Versuchstiere bestimmt. Bei Meerschweinchen wird die physiologische Hörschwelle in einem
Bereich von unter 50 dB SPL angegeben (KANO u. STARR 1987; MITCHELL et al. 1997).

67
Tiere, die nicht dieser Norm entsprochen hätten, wären aus der Studie genommen worden,
was im Verlauf der Tierversuchsstudien nicht erforderlich war.
Am siebten Versuchstag wurde im Vorfeld der Cochleostomie mittels einer erneuten aABR-
Messung der Erfolg der systemischen Ertaubung kontrolliert. Zeigten die Tiere einen
Hörschwellenanstieg um ≥ 50 dB, so wird der Verlust des Hörempfindens angenommen
(AGTERBERG et al. 2009). War ein geringerer Anstieg der Hörschwelle zu erkennen, so ist
die Annahme eines Resthörvermögens gegeben. Versuchstiere mit Resthörvermögen schieden
aus der Studie aus.
Kurz vor der Perfusion wurde am 21. Versuchstag die letzte aABR-Messung vorgenommen,
um den Erfolg der Ertaubung nochmals zu bestätigen und um eventuelle Veränderungen
hinsichtlich der Hörschwelle festzustellen. Die Ableitung der akustisch evozierten
Hirnstammpotentiale erfolgte durch ein System der Firma Tucker-Davis Technologies (TDT,
Alachua, Florida, USA). Dieses System besteht aus zwei RX6-Multifunktionsprozessoren
(10.6), einer Lautsprechertreibereinheit (ED 1) sowie einem Mikrophonverstärker zur
Kalibrierung der Übertragungsstrecke (10.6). Die anästhesierten und auf einer Wärmematte
(10.6) platzierten Meerschweinchen erhielten die akustischen Stimuli über elektrostatische
Lautsprecher (EC 1) (10.6). Als Ohrsonden dienten umfunktionierte 200 µl Pipettenspitzen,
die auf den Lautsprechern aufgesetzt in den äußeren Gehörgang der Meerschweinchen
platziert wurden.
Zur Ableitung der akustisch evozierten Potentiale wurden vier Nadelelektroden (10.6)
subdermal am Kopf des Tieres angebracht. Die Referenzelektrode wurde am Nasenrücken
befestigt. Relativ dazu wurden vom linken sowie rechten Mastoid die akustisch evozierten
Potentiale über zwei weitere Elektroden abgeleitet. Die Platzierung der Erdungselektrode
erfolgte im Nackenbereich des Tieres zur Unterdrückung von Störsignalen, die z.B. durch
Herzschlag oder Muskelspannung hervorgerufen wurden. Die Ableitelektroden übertrugen die
Potentiale über den Niedrig-Impedanz-Wandler (RA4LI) an einen Vorverstärker (Medusa 4
channel Preamps, RA4PA 4-channel preamp). Dieser setzte die Signale digital um und
überführte sie über ein Glasfaserkabel an den Multifunktionsprozessor.
Ein mit den Hardware-Komponenten der Messeinheit verbundener Computer steuerte über
die TDT-Software (BioSigRP) die einzelnen Messungen. So wurde der Dynamikbereich der
Stimuli (10 ms Sinuspulse; 1ms kosinus Ein- und Ausblendfunktion) in 10 dB Schritten von

68
20-90 dB SPL festgelegt, wobei dem Tier folgende Frequenzen präsentiert wurden: 1 kHz,
4 kHz, 8 kHz, 16 kHz, 32 kHz und 40 kHz. Zur Rauschunterdrückung innerhalb der
abgeleiteten Potentiale wurde ein Bandpassfilter erster Ordnung mit einem Durchlassbereich
von 300 Hz bis 3 kHz bei 3 dB Dämpfung an den Grenzen verwendet. Um weitere Artefakte
zu unterdrücken, wurde eine Schwelle von 70 µV gewählt. Ableitungen, die diese Schwelle
überschritten, wurden verworfen. Für die graphische Darstellung wurden die Ableitungen für
jeden wiederholten Stimulus über 270 Durchläufe gemittelt. Die Hörschwelle wurde
anschließend durch visuelle Auswertung bestimmt und galt als erreicht, sobald ein deutliches
lokales Maximum im Verlauf der gemittelten Wellenform zu erkennen war (YAGI et al.
2000; VIVERO et al. 2007).
4.2.3.4 Systemische Ertaubung von Meerschweinchen
Für die In-vivo-Versuche der vorliegenden Arbeit erfolgte ein induzierter Haarzellverlust
durch die Applikation ototoxisch wirkender Arzneimittel. So ist durch die Verabreichung von
Kanamycin und dem Schleifendiuretikum Furosemid einwirkungsvoller Haarzellverlust
bereits nach zwei Stunden zu erwarten. Die auf diese Weise ertaubten Tiere dienen als Modell
für Patienten mit sensorineuralem Hörverlust (VERSNEL et al. 2007).
Zu Beginn der medikamentellen Ertaubung wurden die Tiere einer Allgemeinanästhesie
unterzogen (4.2.3.2). Die Narkose ist zum einen für die Bestimmung der Hörschwellen der
Tiere notwendig (4.2.3.3), zum anderen wird die Applikation des Furosemids in die externe
Vena jugularis vorgenommen, deren Zugang nur über eine operative Eröffnung der ventralen
Halsmuskulatur möglich ist.
Nachdem die Tiere narkotisiert waren, erfolgte vor der Bestimmung der Hörschwelle eine
subkutane Injektion von 400 mg Kanamycin/kg KGW (10.3). War die Messung beendet,
wurden die Tiere für die Operation vorbereitet indem eine Rasur des Haarkleides am
ventralen Halsbereich vorgenommen wurde und im Bereich der Schnittlinie ein Milliliter
Xylonest ® Lokalanästhetikum (10.3) subkutan injiziert wurde. Zu Beginn der Operation
wurden die Tiere auf einer Wärmematte (10.3) auf dem Rücken liegend gelagert, um einen
optimalen Zugriff auf das Operationsfeld zu erhalten. Nach der lokalen Desinfektion durch

69
Cutasept ® erfolgte ein medianer Hautschnitt am ventralen Hals um nachfolgend die
Halsmuskulatur mit Hilfe einer chirurgischen Schere (10.5) stumpf zu durchtrennen. Die in
der Tiefe liegende Vena jugularis wurde vorgelagert und auf den geöffneten Schenkeln einer
chirurgischen Pinzette positioniert, wo sie von eventuell anheftendem Bindegewebe befreit
werden konnte. So vorbereitet wurden drei Schlaufen aus resorbierbarem Nahtmaterial (10.4)
um das Gefäß gelegt. Die kopf- und herzwärts gelegenen Schlaufen wurden jeweils an die
Außenseite der Pinzettenschenkel gebracht, um den für die Eröffnung des Gefäßes nötigen
Handlungsraum zu vergrößern. Die mittlere Schlaufe wurde zunächst in Richtung Kopf um
das Gefäß gelegt. Die Eröffnung des Gefäßes wurde mittels einer 1G-Kanüle (10.4)
vollzogen. Mit einer feinen Uhrmacherpinzette (10.5) war es nun möglich, in die perforierte
Stelle vorzudringen und durch Aufziehen der Öffnung einen mit NaCl gefüllten
Silikonschlauch in das Gefäß vorzuschieben. Ließ sich der Schlauch ohne Probleme
vorschieben, so erfolgte das Aufsetzen einer mit Natriumchlorid (NaCl) gefüllten Spritze und
es wurde durch Aspiration von Blut die korrekte Positionierung des Schlauches überprüft.
Danach wurde die mittlere Schlaufe um den im Gefäß positionierten Schlauch leicht
angezogen um einen Austritt des im Anschluss zu applizierenden Furosemids (10.3) zu
verhindern. Die mit NaCl gefüllte Spritze wurde nun durch eine mit Furosemid gefüllte
Spritze ersetzt, wobei pro Kilogramm Körpergewicht 100 mg Furosemid langsam über einen
Zeitraum von 10 Minuten appliziert wurden. Zwischenzeitlich wurde immer wieder Blut
aspiriert, um den richtigen Sitz des Schlauches zu kontrollieren. Nach der Applikation wurde
die mittlere Schlaufe entfernt, und die beiden äußeren Schlaufen wurden ligiert. Abschließend
erfolgte der Verschluss der Muskulatur mittels Einzelheften aus resorbierbarem Nahtmaterial
(10.4), während die äußere Haut mit nichtresorbierbarem Faden verschlossen wurde (10.4).
4.2.3.5 Applikation von Flüssigkeiten ins Innenohr via Cochleostomie
Bevor die eigentliche Applikation von Flüssigkeiten in die Scala tympani des Innenohres via
Cochleostomie durchgeführt werden konnte, musste ein geeignetes Applikationssystem
hergestellt werden (Abb. 6). Hierzu wurde ein etwa 20 cm langer Silikonschlauch
(Innendurchmesser 0,3 mm, Außendurchmesser 0,7 mm) (10.4) auf den Konus einer

70
27 G Kanüle (10.4) geschoben. In das freie Vorderende wurde ein 2,5 cm langer
Polyimidschlauch (Innendurchmesser 0,12 mm, Außendurchmesser 0,28 mm; 10.4)
eingebracht, sodass die eine Hälfte im Silikonschlauch befindlich war. Zur Abdichtung und
Fixierung des Silikonschlauches an der Kanüle, sowie des Polyimidschlauches in dem
Silikonschlauch wurde Gewebekleber (10.4) sowie auch Karboxylatzement (10.2) verwendet.
Etwa 1 mm entfernt von der Spitze des Polyimidschlauches wurde mit Karboxylatzement
(10.2) eine kleine Kugel gebildet, welche die Öffnung der Scala tympani während des
Einbringens von Flüssigkeiten bei der Cochleostomie abdichten soll. Gleichzeitig wird ein zu
weites Vordringen ins Innere der Hörschnecke verhindert, was ungewollten Verletzungen
vorbeugt. Nach dieser Präparation trocknete und härtete der verwendete Kleber und
Knochenzement 2 Tage aus, bevor er durch eine Sterilisation im Autoklaven (10.6) für die
Benuztung bereitgestellt werden konnte.
1 2
3
Abb. 6: Die Abbildung veranschaulicht das Injektionssystem zur Einbringung von Flüssigkeiten in das
Innenohr. Teilbild 1 zeigt eine stumpfe 27 G Kanüle auf welche der Silikonschlauch aufgeschoben und
anschließend mit Gewebekleber fixiert wurde. In Teilbild 2 ist eine Großaufnahme des
Polyimidschlauches zu sehen, welcher in die Spitze des Silikonschlauches eingeschoben und mit
Gewebekleber sowie Karboxylatzement fixiert wurde. Der Pfeil weist auf eine mit Karboxylatzement
geformte Verdickung an der Spitze des Polyimidschlauches, welche ein zu tiefes Eindringen in die
cochleären Strukturen verhindert. Teilbild 3 zeigt die Hamiltonspritze und das Schlauchsystem im
Überblick.

71
Die in den Versuchen benutzten Lösungen wurden am Tag der Operation mit steriler
phosphate buffered saline (PBS)-Lösung (10.2) verdünnt, sodass die Konzentration der
verwendeten Nanopartikellösungen einer Verdünnung von 1:100 der Stammlösung
entsprachen (Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln 45 mg/ml; 19 µg/ml
Rolipram). So enthielt die verdünnte Rolipram-Nanopartikellösung pro Milliliter 0,19 µg
Rolipram. Die Lösung des Arzneimittels Rolipram wurde in der entsprechenden Gruppe mit
PBS ebenfalls auf die Konzentration 0,19 µg pro Milliliter verdünnt.
Am 7. Versuchstag wurden die Tiere zunächst unter Allgemeinanästhesie (4.2.3.2) einer
Hörschwellenbestimmung (4.2.3.3) unterzogen. Diese erneute Messung diente als
Kontrollmessung der am Tag null durchgeführten Ertaubung.
Zu Beginn der Operation wurden die Tiere in Bauchlage auf einer Wärmematte (10.6)
gelagert, nachdem der postaurikuläre Operationsbereich durch Rasur vom Haarkleid befreit
und zusätzlich mit je einem Milliliter Xylonest ® (10.3) lokal anästhesiert wurde. Durch einen
postaurikulären Schnitt erfolgte die Durchtrennung der Haut. Anschließend wurde mit einer
chirurgischen Schere (10.5) stumpf durch die Muskulatur in die Tiefe bis auf den mastoidalen
Anteil des Musculus sternocleidomastoideus präpariert. Die darüber liegenden, bereits
durchtrennten Muskelanteile wurden mittels eines Wundspreizers (10.5) aus dem
Operationsfeld gehalten. Der Ansatz des Muskels wurde in der Folge losgelöst, woraufhin die
Bulla tympanica sichtbar wurde. Nach der Entfernung des dem Knochen aufliegenden
Periosts erfolgte die Eröffnung der Bulla mittels einer spitzen Skalpellklinge (10.4) wodurch
der Zugang zum Mittelohr gegeben war. Unter mikroskopischer Sichtkontrolle (10.6) konnte
die Cochlea nahe des runden Fensters in ihrer basalen Windung eröffnet werden. Dies erfolgte
durch das Bohren eines kleinen Loches mit einer spitzen Sonde (10.5). Durch die
anschließende Cochleostomie wurde der perilymphatische Raum der Scala tympani
zugänglich gemacht. Das freie Ende des Polyimidschlauches wurde nun vorsichtig mittels
einer Uhrmacherpinzette (10.5) durch die Öffnung in die Scala tympani inseriert (Abb. 7).
Zuvor wurde der Schlauch, sowie eine auf den Schlauch aufgesetzte Hamiltonspritze (10.4)
mit der entsprechenden Lösung gefüllt und auf Durchgängigkeit geprüft. In Position gehalten
schloss sich die Injektion von 5 µl Flüssigkeit über eine Dauer von 5 bis 10 Minuten an. Nach
Abschluss der Injektion erfolgte der Verschluss der Cochlea, sowie auch der Bulla durch
Karboxylatzement (10.2). Das Weichteiltrauma wurde mittels Einzelhälften in zwei Schichten

72
adaptiert. Die Muskelnaht erfolgte mit resorbierbarem Nahtmaterial (10.4) während die
Hautnaht mit nichtresorbierbarem Faden verschlossen wurde (10.4).
Bei allen Tieren wurden linksseitig die entsprechenden Versuchslösungen, rechtsseitig
hingegen PBS-Lösung zur Kontrolle injiziert.
Tympanotomie
Abb. 7: Operationssitus der Cochleostomie. Linksseitig wird das eröffnete Mittelohr mit der darin zu
erkennenden Basalwindung der Cochlea gezeigt, wobei ein Teil des runden Fensters zu erkennen ist.
Unter dem runden Fenster wurde die knöcherne Wand der Cochlea mittels einer Lanzette eröffnet
(Cochleostomie), um den mit einer Mikroliterspritze verbundenen Injektionskatheter einführen zu
können (rechts dargestellt).
4.2.3.6 Transkardiale Perfusion
rundes Fenster
Cochleostomie
Polyimidschlauch
Am 21. Studientag wurden die Tiere aller Gruppen einer abschließenden aABR-Messung
(4.2.3.3) unterzogen. Nach Beendigung dieser Messung unter Allgemeinanästhesie (4.2.3.2)
wurde eine weitere volle Narkosedosis appliziert. Eine nachfolgende Lokalänasthesie entlang
der Schnittlinie mit 6 ml Xylonest ® (10.3), welches subkutan sowie intramuskulär verabreicht

73
wurde, diente als zusätzliche Schmerzausschaltung in Vorbereitung auf die anschließende
Thorakotomie. Hierzu wurde der Brustkorb unterhalb des Xyphoids mittels einer
Metzenbaumschere (10.5) eröffnet. Die Schnittlinie folgte durch die Mitte des linken
Rippenbogens bis zur Apertura thoracis um dann in einem Bogen, durch die Mitte des
rechten Rippenbogens, wieder den Ausgangspunkt zu erreichen. Das umschriebene Teilstück
konnte nun abgehoben werden um eine freie Sicht auf das Herz zu erhalten. Vom Apex des
Herzens ausgehend wurde der Herzbeutel mit einer spitzen chirurgischen Schere (10.5)
eröffnet um nachfolgend einen Schnitt ins rechte Herzohr zu vollziehen, was den Abfluss des
Blutes und der Perfusionslösung gewährleisten sollte. Durch das Eröffnen des Herzbeutels
wurde zusätzlich das Entstehen einer Herztamponade durch das aus dem Herzohr
austretenden Blutes verhindert. Dadurch wurde die volle Kraftentfaltung des noch
schlagenden Herzens gesichert, um eine vollständige Perfusion des Blutgefäßsystems und
damit ein blutfreies Präparat zu erhalten.
Anschließend wurde in die linke Herzkammer eine an ein Infusionsbesteck (10.4)
angeschlossene Kanüle (10.4) eingeführt über die eine Infusion von 200 ml phosphate
buffered saline (PBS,10.2) erfolgte, um das Blut aus dem Kreislauf zu spülen. Die Fixierung
des Tierkörpers erfolgte in der gleichen Weise unter Verwendung von 200 ml 4%igem
Paraformaldehyd (10.1).
4.2.3.7 Gewinnung der Cochleae
Nach erfolgter Fixierung wurde das Tier mittels einer Metzenbaumschere (10.5) dekapitiert.
Die ersten Halswirbel wurden entfernt um durch das Foramen magnum in die Schädelhöhle
eindringen zu können und das Schädeldach durch zwei Scherenschläge zu eröffnen. Das nun
freiliegende Gehirn wurde weitestgehend entfernt um die Sicht auf die Felsenbeine
freizugeben. Diese wurden manuell aus der knöchernen Verbindung zum Schädel
herausgebrochen und anschließend mit Zellstoff von anhaftendem Muskelgewebe gesäubert.
Mittels einer chirurgischen Pinzette (10.5) konnte nun die Bulla eröffnet werden, um die freie
Sicht in das Mittelohr und auf die Cochlea zu gewährleisten. Unter einem Aufsichtmikroskop
(10.6) erfolgte die Eröffnung des runden sowie ovalen Fensters der Cochlea mittels einer

74
feinen Uhrmacherpinzette (10.5). Um ein Eindringen von Luft in die unteren Windungen zu
vermeiden, wurden diese Schritte in einer mit 4%igem Paraformaldehyd (10.1) gefüllten
Petrischale (10.4) durchgeführt Zusätzlich wurde die Cochlea im Bereich der obersten
Windung eröffnet um einen optimalen Durchfluss während der nachfolgenden Spülung mit
4%igem Paraformaldehyd zu gewährleisten. Diese wurde vorsichtig, vom runden Fenster
ausgehend durchgeführt. Im Anschluss wurde die Cochlea in 4%iges Paraformaldehyd
überführt und bis zur Weiterverarbeitung 2 Stunden nachfixiert.
4.2.3.8 Entkalkung, Entwässerung und Einbetten der Cochleae
Die nachfixierten Cochleae wurden zunächst drei Waschvorgängen mit phosphate buffered
saline (PBS, 10.2) unterzogen. Hierzu erfolgte das Ausspülen der 4%igen
Paraformaldehydlösung (10.1) auf einem Schwingtisch (10.6) wobei jeder Spülvorgang über
einen Zeitraum von mindestens 5 Minuten vollzogen wurde. Im Anschluss daran wurden die
Cochleae bis zur vollständigen Entkalkung in einer 20%igen EDTA-Lösung (10.1) bei einer
Temperatur von 37 °C für mindestens vier Wochen gelagert. Je nach Verknöcherungsgrad
wurden auch Zeiträume von 5 Wochen durchgeführt. Der richtige Entkalkungsgrad konnte
mittels einer spitzen Sonde (10.5) festgestellt werden, indem man die Konsistenz der Probe
durch vorsichtiges Einstechen in einen Knochenbereich neben der Cochlea prüfte. Das
Einstechen durfte kein deutliches Widerstandsgefühl hervorrufen. Die Probe wies eine
knorpelige Konsistenz auf, Krepitationen durften nicht wahrzunehmen sein.
Zu Beginn der Entwässerung wurden die Proben abermals drei Waschvorgängen mit PBS
unterzogen, hierbei wird nach oben genanntem Schema verfahren, um Reste der EDTA-
Lösung zu entfernen. Im Anschluss erfolgte die Entwässerung mittels einer ansteigenden
Alkoholreihe. Die Proben wurden zunächst in eine 50%ige Ethanollösung (10.2) eingelegt
und für 2 Stunden in dieser belassen. Danach wurden sie in 70%iges Ethanol überführt. Die
Verweildauer der Proben in dieser Lösung beträgt ebenfalls mindestens zwei Stunden,
konnten aber auch über Nacht darin belassen werden. Weiterhin folgten zwei Schritte in
90%igem und 100%igem Ethanol, wobei jeweils 2 Stunden Entwässerungszeit eingehalten
wurden. Daraufhin wurden die Proben in Methylbenzoat überführt und für ebenfalls

75
2 Stunden in diesem belassen um sie anschließend mit flüssigem Paraffin (10.2) zu
durchtränken. Die Proben wurden nun über Nacht bei 70 °C im Wärmeschrank (10.6) in
flüssigem Paraffin belassen um sie am darauf folgenden Tag in die Tags zuvor mit flüssigem
Paraffin gefüllte Einbettform (10.4) zu überführen. Das erneute Umbetten in frisches Paraffin
verhindert einen zu hohen Methylbenzoatrückstand in dem Probenparaffinblock, wodurch die
Schnitteigenschaften des Präparates verbessert werden. Tagsüber wurden die Proben im
Wärmeschrank belassen, damit beim Umbetten eingebrachte Luftbläschen aufsteigen konnten
und keine Hohlräume in den Paraffinblöcken entstanden. Gegen Ende des Tages oder aber
mindestens drei Stunden nach dem Umbetten wurden die Proben in der Einbettform zum
Aushärten aus dem Wärmeschrank entnommen. Zuletzt wurden die Cochleae mit dem runden
Fenster zum Grund der Einbettform ausgerichtet, was eine waagerechte Positionierung des
Modiolus gewährleistete. Die langsam vom Grund und den Rändern her erstarrende
Paraffinflüssigkeit bot die Grundlage zur korrekten Ausrichtung. Über Nacht erstarrten die
eingebetteten Proben nun vollständig bei Raumtemperatur und wurden am nächsten Tag aus
der Form entnommen. Bis zur Weiterverarbeitung war eine Lagerung bei Raumtemperatur
möglich.
4.2.3.9 Herstellung und Anfärbung der Paraffinschnitte
Die zuvor hergestellten Paraffinproben-Blöcke wurden entsprechend zurechtgeschnitten und
auf kleine Holzblöcke aufgeschmolzen und zur optimalen Fixierung an diesen erst am
nächsten Tag weiterbearbeitet. Die Holzblöcke konnten nun in die Halterung des Mikrotoms
(10.6) eingespannt werden ohne die Probe dabei zu beeinflussen. Mittels des Mikrotoms
erfolgte die Herstellung von 5 µm dicken Serienschnitten. Durch die vorherige Ausrichtung
der Cochleae konnten Schnitte parallel zur Modiolusachse angefertigt werden. Die
zusammenhängenden und durch den Schneidevorgang leicht gestauchten Schnitte wurden
zunächst vom Schneidetisch in ein auf 37 °C erwärmtes Streckbad (10.6) überführt und dort
bis zur vollständigen Entfaltung belassen. Anschließend wurden die Schnitte auf Objektträger
(10.4) aufgezogen und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet.

76
Zur Anfärbung der Schnitte wurde die Hämalaun-Eosin-Färbung (10.2) verwendet. Hierzu
wurden die Objektträger zunächst für zweimal fünf Minuten in ein Xylolbad (10.2) gebracht,
wonach sich eine absteigende Alkoholreihe angeschlossen hat. Hierbei wurden die
Objektträger für jeweils fünf Minuten in 100%-, 90%- sowie 70%igem Ethanol belassen um
anschließend für fünf Minuten in Leitungswasser gespült zu werden. Danach erfolgte die
Anfärbung mit Hämalaun für eine Minute. Ein weiterer Spülschritt unter fließendem,
lauwarmem Leitungswasser schloss sich an, um danach die Proben für 45 Sekunden mit Eosin
zu färben. Der darauffolgende, fünfminütige Waschvorgang mit Leitungswasser leitete die
Entwässerung mit 70%-, 90%- und 100%igem Ethanol ein, wobei die Proben für jeweils fünf
Minuten in den Lösungen belassen wurden. Den Abschluss bildeten wiederum zwei mal fünf
Minuten Einwirkzeit in Xylol. Danach wurden die Proben in feuchtem Zustand unter dem
Abzug (10.6) mit Eukitt ® Schnelleinschlussmittel (10.2) unter Deckgläsern (10.4)
eingedeckelt und für mindestens 24 Stunden unter dem Abzug getrocknet.
4.2.3.10 Auswertung der Paraffinschnitte
Zur Auswertung der Proben wurde zunächst ein mitmodiolarer Schnitt ausgewählt.
Ausgehend von diesem Schnitt wurde zusätzlich jeder fünfte nachfolgende Schnitt ausgezählt
sowie ausgemessen. Zur Auswertung wurden pro Cochlea fünf Schnitte herangezogen. Pro
Schnitt erfolgte eine Beurteilung der Anschnitte des ROSENTHALschen Kanals. Hierbei
handelt es sich um die 6-7 Anschnitte des Kanals der unteren und oberen basalen Windung,
der ersten, zweiten, dritten und vierten mittleren Windung sowie der apikalen Windung. Die
vierte mittlere sowie die apikale Windung waren im Schnittbild in den meisten Fällen nicht
getrennt darstellbar. In den Fällen der einzelnen Darstellung wurden die Daten dieser beiden
Anschnitte zusammengefasst (Abb. 8). Weiterhin wurden zur Beurteilung eines lokalen
Effekts der Testsubstanzen die Ergebnisse des unteren und oberen basalen Anschnitts
zusammengefasst und als unterer Abschnitt bezeichnet. Ebenso wurde mit dem ersten und
zweiten mittleren Anschnitt verfahren, wobei diese als mittlerer Abschnitt bezeichnet wurden.
Die oberen Anschnitte wurden entsprechend als oberer Abschnitt bezeichnet.

77
Zur Auswertung wurde ein inverses binokularisches Mikroskop (10.6) mit angeschlossener
charged-coupled-device-(CCD)-Kamera (10.6) verwendet. Rechnergestützt konnte mittels des
Programms cellP (Olympus Soft Imaging Solutions, Münster; 10.6) die Fläche des
ROSENTHALschen Kanals bestimmt werden. Die Spiralganglienzellen wurden markiert und
ausgezählt. In die Zählung wurden nur Zellen mit einem Somadurchmesser von mindestens
10 µm eingeschlossen, weiterhin mussten sie einen sichtbaren Nukleus zeigen. Abbildung 9
zeigt eine beispielhafte Darstellung von Spiralganglienzellen, welche in die Zählung
miteinbezogen wurden. Der Quotient aus Fläche und Spiralganglienzahl ergab die Dichte der
Spiralganglienzellen (SGZ), welche in SGZ pro 10.000 µm 2 angegeben wurde. Zur
Ermittlung der durchschnittlichen Somadurchmesser wurden pro Anschnitt des
ROSENTHALschen Kanals acht Spiralganglienzellen vermessen und deren
Somadurchmesser gemittelt. Je Quadrant wurden zwei Zellen ausgewählt. Bei weniger als
acht vorhandenen Zellen wurden alle Zellen, unabhängig von der Verteilung innerhalb des
Kanalanschnitts, ausgezählt.

Abb. 8: Mittmodiolarer Paraffinschnitt der Cochlea eines Meerschweinchens (Hämalaun-Eosin-
Färbung). Die jeweiligen Anschnitte des ROSENTHALschen Kanals sind rot markiert (u.b. = untere
78
basale Windung, o.b. = obere basale Windung, 1.-4 m. = erste bis vierte mittlere Windung, a. = apikale
Windung)
u. b.
1. m.
3. m.
a.
4. m.
2. m.
o. b.

79
Abb. 9: Darstellung der 3. mittleren Windung des ROSENTHALschen Kanals eines ertaubten
Meerschweinchens. Die verbleibenden Spiralganglienzellen mit erkennbarem Nukleus sind durch
Pfeile gekennzeichnet (Hämalaun-Eosin-Färbung).
4.2.3.11 Statistische Auswertung der In-vivo-Versuche
Die statistische Auswertung der Ergebnisse der Tierversuchsstudien erfolgte computergestützt
mittels des Programms GraphPad Prism ® 4 (10.6). Zu Beginn wurden die jeweiligen
Datensätze auf eine Normalverteilung der Werte geprüft. Hierzu wurde der Kolmogorow-
Smirnow-Test angewendet. Für den Vergleich der Parameter Spiralganglienzelldichte sowie
Somadiameter zwischen rechter und linker Seite einer Versuchsgruppe wurde der t-Test für
abhängige Stichproben durchgeführt. Wurden diese Parameter zwischen den Gruppen

80
verglichen, so fand eine Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) mit Student-
Newman-Keuls-Test Anwendung.
Die ermittelten Signifikanzniveaus wurden dabei wie folgt definiert:
- p > 0,05 = nicht signifikant unterschiedlich (ns)
- p < 0,05 = signifikant unterschiedlich (*)
- p < 0,01 = hoch signifikant unterschiedlich (**)
- p < 0,001 = höchst signifikant unterschiedlich (***)

5 Ergebnisse
81
5.1 Ergebnisse der In-vitro-Versuche mit vereinzelten Spiralganglienzellen
5.1.1 Einfluss von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BD�F auf die
Überlebensrate vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Zur Untersuchung eines spiralganglienzellprotektiven Effekts wurden zunächst aus
neonatalen Sprague-Dawley-Ratten gewonnene Spiralganglienzellen vereinzelt und kultiviert.
Dem Kulturmedium wurden die zu untersuchenden Testsubstanzen zugefügt. Hierbei handelte
es sich um LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM und Rolipram, welche in vier
unterschiedlichen Verdünnungen (1:50, 1:100, 1:200, 1:300) der Stammlösung (45 mg/ml
Lipidnanokapseln; 19 µg/ml Rolipram) getestet wurden. BDNF hingegen diente als
Positivkontrolle und wurde in einer Konzentration von 50 ng/ml verwendet, welche als
besonders protektiv gilt (LEFEBVRE et al. 1994; HEGARTY et al. 1997). Das Medium der
jeweiligen Einsaatkontrollansätze sowie der Negativkontrolle blieb unbehandelt.
Pro Well wurden 15 x 10 4 Zellen eingesät. Der nach einer Kulturdauer von 4 Stunden fixierte
Einsaatkontrollansatz wies im Mittel einen Wert von 229,6 ± 18,1 (Mittelwert ±
Standardabweichung; n=12) eingesäten Spiralganglienzellen auf und lieferte den Bezugswert
(100 %) für die nach 48 Stunden fixierten Zellen der Negativkontrollgruppe sowie der mit den
Testsubstanzen behandelten Gruppen (4.2.1.6).
Nach 48 Stunden Kulturdauer zeigten in der Negativkontrollgruppe (n=12) 10,7 ± 4,2 % der
ursprünglich eingesäten Spiralganglienzellen eine Neuritenaussprossung, welche den
Somadurchmesser der Zelle um das dreifache oder mehr übertraf. Diese Zellen galten als vital
und dienten als Bezugsgröße zur Beurteilung der Effekte der Testsubstanzen (Abb. 10).
Die Verwendung der LNC FITC-Nanopartikel wies in der Verdünnung 1:50 kein erhöhtes
Spiralganglienzellüberleben im Vergleich zur Kontrolle auf (10,3 ± 8,2 %; n=20),
wohingegen die 1:100 Verdünnung mit einem Wert von 24,4 ± 8,8 % (n=20) ein höchst
signifikant (p < 0,001) erhöhtes Überleben bewirkte. Auch in der Verdünnung von 1:200 zur
Stammlösung zeigten die unbeladenen Nanopartikel noch einen hoch signifikant erhöhten

82
Wert (p < 0,01; 20,7 ± 7,6 %; n=20), welcher in der 1:300 Verdünnung nicht mehr zu
erkennen war (17,9 ± 6,8 %; n=20).
Tendenziell konnte für die mit Rolipram beladenen LNCs ein ähnliches Bild gezeigt werden.
In der Verdünnung von 1:50 (16,2 ± 10,2 %; n=20) erbrachte der Zusatz der Nanopartikel-
Arzneimittel-Kombination keine veränderte Überlebensrate der Spiralganglienzellen
verglichen mit der Negativkontrolle, wobei die 1:100 Verdünnung mit dem Maximalwert
dieser Gruppe von 32,6 ± 9,7 % (n=20) einen statistisch höchstsignifikanten Unterschied zur
Negativkontrollgruppe erreichte (p < 0,001). Aber auch die 1:200 und die 1:300 Verdünnung
bewirkten in dieser Gruppe ein erhöhtes Spiralganglienzellüberleben (23,4 ± 7,2 %; n=20;
p < 0,01 respektive 20,0 ± 6,4 %; n=20; p < 0,05). Innerhalb dieser Versuchsgruppe zeigte die
1:100 Verdünnung gegenüber der 1:200 Verdünnung ein hoch signifikant gesteigertes Spiral-
ganglienzellüberleben (p < 0,01).
Ein ebenfalls hoch signifikanter Unterschied bestand zwischen den Werten der 1:100
Konzentrationen der LNCs und der mit Rolipram beladenen LNCs, wobei sich bei der
Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination ein hoch signifikant höheres Überleben zeigte
(p < 0,01).
Rolipram hingegen bewirkte in den verwendeten Konzentrationen ein sehr homogenes Bild
und erbrachte mit durchschnittlichen Werten von 15,7 ± 4,5 % (n=20 pro Konzentration) ein
tendenzielles aber kein signifikant erhöhtes Überleben gegenüber den Zellen der
Negativkontrolle.
Die Zugabe von BDNF in der Konzentration 50 ng/ml (n=30) diente als Positivkontrolle und
zeigte im Vergleich zur Negativkontrollgruppe ein deutlich signifikant erhöhtes
Spiralganglienzellüberleben von 45,7 ± 12,6 % (p < 0,001). Auch im Vergleich zu allen
anderen Gruppen zeigte BDNF den signifikant höchsten Wert (p < 0,001).

SGZ-Überleben [ % von Einsaat]
60
50
40
30
20
10
0
***
**
**
LNC FITC 1:50
LNC FITC 1:100
LNC FITC1:200
LNC FITC 1:300
***
**
**
LNC FITC ROLIPRAM 1:50
LNC FITC ROLIPRAM 1:100
LNC FITC ROLIPRAM 1:200
LNC FITC ROLIPRAM 1:300
83
*
ROLIPRAM 1:50
ROLIPRAM 1:100
ROLIPRAM 1:200
ROLIPRAM 1:300
Versuchsgruppe
***
BDNF 50 ng/ml
Negativkontrolle
Abb. 10: Effekte der unterschiedlichen Verdünnungen von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM,
Rolipram sowie BDNF auf das SGZ-Überleben nach 48 Stunden Kulturdauer in Prozent der
ursprünglich eingesäten SGZ [229,6 ± 18,1 Zellen (Mittelwert ± Standardabweichung; n=12)]. Die
dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 5 unabhängigen Experimenten
(n=20 pro Konzentration je Gruppe, Kontrolle: n=12, BDNF: n=30). Die Signifikanzen sind im Vergleich
zur Kontrollgruppe über den Säulen dargestellt, während Vergleiche unter den Gruppen mittels
Klammern dargestellt sind (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,01 = ***; ns = nicht signifikant).
5.1.2 Einfluss von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BD�F auf das
�euritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Nach 48 Stunden Kultivierungsdauer wurde neben der prozentualen Überlebensrate der
Spiralganglienzellen auch das Neuritenauswachsverhalten der Zellen analysiert. In der
Negativkontrolle zeigten die Zellen ein mittleres Auswachsverhalten von 420,1 ± 181,5 µm
(Mittelwert ± Standardabweichung; n=60). Dieser Wert galt als Bezugsgröße um die Effekte
der Versuchskonditionen in ein gesteigertes sowie verringertes Auswachsverhalten
einzuteilen.

84
Das Auswachsverhalten der Neuriten unter Einwirkung der LNC FITC Nanopartikel in einer
Verdünnung von 1:50 zur Stammlösung (45 mg/ml Lipidnanokapseln) zeigte mit einem Wert
von 265,6 ± 159,4 µm (n=100) eine höchst signifikante Verringerung der Neuritenlängen im
Vergleich zur Negativkontrollgruppe (p < 0,001). In den Verdünnungen von 1:100 und 1:200
wurde hingegen kein signifikanter Unterschied zur Negativkontrollgruppe deutlich
(474,2 ± 185,4; n=100 respektive 500,1 ± 193,6 µm; n=100). So zeigten die mit der 1:300
Verdünnung behandelten Zellen aber ein signifikant verlängertes Neuritenwachstum
verglichen zur Negativkontrollgruppe (p < 0,05; 519,1 ± 205,4 µm).
Die LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe wies analog zu den unbeladenen Nanopartikeln ein
signifikant verringertes Neuritenauswachsverhalten in der Verdünnung von 1:50 auf
(349,3 ± 178,3 µm; p < 0,05, n=100). Mit der 1:100 sowie die 1:200 Verdünnung dieser
Gruppe konnten bei den behandelten Zellen signifikant verlängerte Neuriten im Vergleich zu
den Zellen der Negativkontrolle erreicht werden (547,6 ± 164,1 µm bzw. 536,8 ± 201,1 µm;
p < 0,01 und n=100 je Gruppe). Diese Konzentration 1:100 zeigte im Vergleich zu allen
Konzentrationen der mit Rolipram behandelten Zellen eine signifikant erhöhte Neuritenlänge
(p < 0,05). Die 1:300 Verdünnung hingegen wies keinen signifikanten Unterschied zur
Kontrolle auf (512 ± 197,9 µm; n=100). Der Vergleich zwischen den mit Rolipram beladenen
Partikeln sowie den unbeladenen Partikeln in der Verdünnung 1:50, konnte für die
Arzneimittel-Nanopartikel-Kombination hoch signifikant längere Neuritenlängen zeigen
(p < 0,01). Die Gegenüberstellung der restlichen Verdünnungen ergab untereinander keine
signifikanten Unterschiede.
Rolipram zeigte in allen Verdünnungen ein sehr homogenes Bild und wies lediglich eine
tendenziell verlängerte Neuritenlänge auf, welche aber in keinem Fall eine Signifikanz zur
Kontrollgruppe bot (1:50 = 462,7 ± 196,4 µm; 1:100 = 455,9 ± 177,4 µm; 1:200 =
464,9 ± 185,9 µm; 1:300 = 460,6 ± 190,4; n=100 je Gruppe).
Auch die mit BDNF 50 ng/ml behandelten Zellen zeigten diese Tendenz, wiesen aber
ebenfalls keinen statistisch signifikanten Unterschied auf. (475 ± 151,2 µm; n=130).
In Abbildung 11 ist das Neuritenauswachsverhalten aller Versuchsgruppen graphisch
dargestellt. In Abbildung 12 wird in einer lichtmikroskopischen Aufnahme beispielhaft das
Neuritenauswachsverhalten aller Versuchsgruppen in der Verdünnung von 1:100 gezeigt.

85
BDNF wurde in einer Konzentration von 50 ng/ml verwendet, während die Negativkontrolle
keine weiteren Zusätze erhielt.
SGZ-Neuritenlänge [µm]
800
700
600
500
400
300
200
100
0
***
**
*
LNC FITC 1:50
LNC FITC 1:100
LNC FITC1:200
LNC FITC 1:300
*
** **
LNC FITC ROLIPRAM 1:50
LNC FITC ROLIPRAM 1:100
LNC FITC ROLIPRAM 1:200
LNC FITC ROLIPRAM 1:300
ROLIPRAM 1:50
ROLIPRAM 1:100
ROLIPRAM 1:200
ROLIPRAM 1:300
Versuchsgruppe
*
BDNF 50 ng/ml
Negativkontrolle
Abb. 11: Effekte der unterschiedlichen Verdünnungen von LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM,
Rolipram sowie BDNF auf das Neuritenauswachsverhalten von SGZ nach 48 Stunden Kulturdauer.
Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 5 unabhängigen
Experimenten (n=100 vermessene Neuritenlängen pro Konzentration je Gruppe, Kontrolle: n=60,
BDNF: n=130). Die Signifikanzen im Vergleich zur Kontrollgruppe sind über den Säulen dargestellt,
während Vergleiche unter den Gruppen mittels Klammern dargestellt sind (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **;
p < 0,01 = ***; ns = nicht signifikant).

86
1 2
3 4
5 6
Abb. 12: Mikroskopische Darstellung des Neuritenauswachsverhaltens (Pfeile) vereinzelt kultivierter
Spiralganglienzellen nach 48 Stunden unter Einfluss von folgenden Faktoren: Bild 1: LNC FITC 1:100;
Bild 2: LNC FITC ROLIPRAM 1:100; Bild 3: LNC BLANK 1:100; Bild 4: ROLIPRAM 1:100; Bild 5:
unbehandelte Negativkontrolle; Bild 6: BDNF 50 ng/ml. Stammlösung der Nanopartikel: 45 mg/ml
LNC, 19 µg/ml Rolipram.

87
5.1.3 Einfluss von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, Rolipram sowie BD�F auf den
Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Neben der Evaluierung der prozentualen Überlebensrate der Spiralganglienzellen sowie ihrem
Neuritenauswachsverhalten wurde auch der Durchmesser der Zellkörper unter Zugabe der
Testsubstanzen ermittelt und miteinander verglichen. Der mittlere Somadurchmesser der
Negativkontrolle betrug 14,5 ± 2,6 µm (Mittelwert ± Standardabweichung, n=60). Nur die mit
den LNC FITC-Nanopartikeln in einer Konzentration von 1:50 zur Stammlösung (45 mg/ml
Lipidnanokapseln) behandelten Zellen zeigten einen hoch signifikant geringeren
Somadurchmesser von 12,8 ± 1,9 µm (p < 0,01). Alle anderen Werte lieferten keine statistisch
signifikanten Differenzen verglichen mit dem mittleren Zelldurchmesser der Negativ-
kontrolle. Zur Vollständigkeit seien die ermittelten Werte tabellarisch dargestellt (Tab. 5)
Tab. 5: Ergebnisse der ermittelten Spiralganglienzelldurchmesser (Mittelwert ± Standardabweichung)
nach 48-stündiger Kultivierung unter LNC FITC-, LNC FITC ROLIPRAM-, Rolipram- sowie BDNF-
Einfluss in unterschiedlichen Verdünnungen.
Gruppe Mittelwert des
Somadurchmessers
[µm]
Standardabweichung Anzahl der
vermessenen Somae
Negativkontrollgruppe 14,5 2,6 60
LNC FITC 1:50 12,8 1,9 100
LNC FITC 1:100 13,2 2,2 100
LNC FITC 1:200 13,3 2,2 100
LNC FITC 1:300 14,0 3,2 100
LNC FITC ROLIPRAM 1:50 13,3 2,1 100
LNC FITC ROLIPRAM 1:100 14,0 2,6 100
LNC FITC ROLIPRAM 1:200 13,7 2,8 100
LNC FITC ROLIPRAM 1:300 14,1 3,0 100
Rolipram 1:50 14,4 2,6 100
Rolipram 1:100 14,7 2,9 100
Rolipram 1:200 14,6 3,0 100
Rolipram 1:300 14,6 3,0 100
BDNF 50 ng/ml 14,8 2,7 130

88
5.1.4 Einfluss von L�C FITC, L�C BLA�K und BD�F auf die Überlebensrate
vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Da die Ergebnisse des ersten Zellversuches einen positiven Effekt der Nanopartikel ohne
Rolipram auf das Überleben der Spiralganglienzellen zeigten, wurde ein zweiter Zellversuch
durchgeführt, um die Effekte des Fluoreszenzmarkers FITC und der Lipidnanokapseln (LNC)
als solches auf das Überleben der Spiralganglienzellen zu evaluieren. Hierbei wurde der
Einfluss von mit FITC markierten Lipidnanokapseln (LNC FITC) und unmarkierten LNCs
(LNC BLANK) auf das Überleben von kultivierten Spiralganglienzellen untersucht. Hierfür
erfolgte der Zusatz von LNC FITC Nanopartikeln, welche in drei verschiedenen
Verdünnungen der Stammlösung (1:100, 1:200, 1:300 Verdünnung der Stammlösung von
45 mg/ml Lipidnanokapseln) auf die Zellen gegeben wurden. Mit der LNC BLANK-Gruppe
wurde analog verfahren. Des Weiteren wurden die Zellen mit BDNF 50 ng/ml behandelt,
welche als Positivkontrolle dienten. Das Medium der Einsaatkontrollansätze und der
Negativkontrolle blieb unbehandelt.
Bei einer Einsaat von 15 x 10 4 Zellen pro Kavität konnte bei der Einsaatkontrolle nach einer
Kulturdauer von 4 h eine mittlere Spiralganglienzellanzahl von 247,3 ± 59,8 (Mittelwert ±
Standardabweichung; n=6) ermittelt werden. Dieser Wert galt als Bezugsgröße (100 %) für
die Berechnung der prozentualen Überlebensrate der nach 48 Stunden fixierten
Spiralganglienzellen der Negativkontrolle (6,8 ± 4,9 %; n=9) sowie der mit den
Testsubstanzen behandelten Gruppen (4.2.1.6).
Im Vergleich zur Negativkontrolle konnten die mit LNC FITC behandelten Spiralganglien-
zellen in der Verdünnung von 1:100 eine signifikant erhöhte Zellanzahl aufweisen
(22,0 ± 13,8 %; n=9; p < 0,05). Die Werte der 1:200 sowie 1:300 Verdünnung erwiesen sich
nicht als signifikant erhöht, zeigten aber die Tendenz zu einer erhöhten Überlebenszahl
hinsichtlich der Negativkontrolle (17,4 ± 9,6 %; respektive 12,4 ± 6,8 %; n=9 je Gruppe).
Im Gegensatz dazu bewirkten alle Verdünnungsstufen der LNC BLANK-Versuchsgruppe
einen signifikant erhöhten Anstieg von vitalen Spiralganglienzellen. In der 1:100 Verdünnung
zeigte sich der höchste Wert mit einem hoch signifikanten Unterschied von p < 0,01
(28,4 ± 8,4 %; MW und STABW; n=9). Bei der 1:200 und der 1:300 Verdünnung war ein

89
geringerer aber dennoch signifikanter Anstieg des Spiralganglienzellüberlebens zu erkennen
(p < 0,05; 23,9 ± 10,9 %; respektive 20,6 ± 9,6 %; n=9 je Gruppe).
Die mit BDNF 50 ng/ml behandelten Zellen zeigten den höchsten Signifikanzwert (p < 0,001;
40,8 ± 16,2 %; n=9), wobei diese Gruppe als Positivkontrolle diente und gegenüber LNC
BLANK-Gruppe und der 1:100 Verdünnung der LNC FITC-Gruppe ein signifikant erhöhtes
Zellüberleben bewirkte (p < 0,01). Gegenüber den 1:200 und 1:300 Verdünnungen der LNC
FITC-Gruppe zeigte BDNF sogar ein höchstsignifikant gesteigertes Überleben der
Spiralganglienzellen (p < 0,001). Die im Text erläuterten Ergebnisse sind in Abbildung 13
graphisch dargestellt.
SGZ-Überleben [ % von Einsaat]
60
50
40
30
20
10
0
*
LNC FITC 1:100
LNC FITC 1:200
LNC FITC 1:300
**
LNC BLANK 1:100
LNC BLANK 1:200
LNC BLANK 1:300
Versuchsgruppe
*
*
***
BDNF 50 ng/ml
Negativkontrolle
Abb. 13: Effekte der unterschiedlichen Verdünnungen von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf
das SGZ-Überleben nach 48 h Kulturdauer in Prozent der ursprünglich eingesäten SGZ
[247,3 ± 59,8 SGZ (Mittelwert ± Standardabweichung; n=6 ausgezählte Wells)]. Die dargestellten
Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 3 unabhängigen Experimenten (n=9
ausgezählte Wells pro Verdünnung je Gruppe). Die Signifikanzen im Vergleich zur Kontrollgruppe sind
über den Säulen dargestellt, während die Vergleiche unter den jeweils entsprechenden Verdünnungen
keine signifikanten Unterschiede ergaben (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,01 = ***; ns = nicht
signifikant).

90
5.1.5 Einfluss von L�C FITC, L�C BLA�K sowie BD�F auf das
�euritenauswachsverhalten vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Neben dem prozentualen Überleben wurde auch in diesem Versuch das Auswachsverhalten
der Neuriten bestimmt. So zeigten die Zellen in der unbehandelten Negativkontrollgruppe
nach 48 Stunden Kulturdauer eine mittlere Neuritenlänge von 401,8 ± 166,1 µm (Mittelwert ±
Standardabweichung; n=45) welche als Bezug für die Evaluierung der Neuritenlängen der mit
den Testsubstanzen behandelten Spiralganglienzellen diente.
Die Neuritenlängen aller mit LNC FITC behandelten Gruppen zeigten einen signifikanten
Anstieg im Vergleich zur Negativkontrollgruppe. Die Verdünnung 1:100, 1:200 sowie 1:300
(515,8 ± 131,6 µm; 526,0 ± 166,5 µm, respektive 491,4 ± 184,8 µm; n=45 je Gruppe) der
Stammlösung (45 mg/ml Lipidnanokapseln), zeigten ein moderat signifikant verlängertes
Auswachsverhalten (p < 0,05).
Die mit LNC BLANK behandelten Zellen zeigten ebenfalls alle eine signifikante Erhöhung
des Auswachswertes, wobei der höchste Wert in der Verdünnung 1:200 erreicht wurde
(595,5 ± 187,4 µm; n=45; p < 0,01). Die Verdünnungen 1:100 und 1:300 wiesen im Vergleich
zur Negativkontrolle ein leicht signifikant erhöhtes Neuritenauswachsverhalten auf (p < 0,05;
487,5 ± 143,3 µm, respektive 523,3 ± 188,6 µm, n=45 je Gruppe). Innerhalb dieser Gruppe
ergab sich ein signifikanter Unterschied zwischen der 1:100 und 1:200 Verdünnung, wobei
die mittleren Neuritenlängen der 1:200 Verdünnung den höheren Wert erreichten (p < 0,05).
Jedoch zeigte der Vergleich der sich entsprechenden Verdünnungen der LNC FITC und LNC
BLANK Partikel untereinander keinen statistischen Unterschied.
Auch BDNF konnte in einer Konzentration von 50 ng/ml in diesem Versuch ein signifikant
erhöhtes Neuritenwachstum im Vergleich zur Negativkontrolle erzielen (p < 0,01;
541,8 ± 144,9 µm; n=45).
Die Abbildung 14 stellt die ermittelten Ergebnisse der Neuritenlängen graphisch dar.

SGZ-Neuritenlänge [µm]
600
500
400
300
200
100
0
LNC FITC 1:100
LNC FITC 1:200
LNC FITC 1:300
LNC BLANK 1:100
91
800 ***
700
*
* *
*
*
LNC BLANK 1:200
*
LNC BLANK 1:300
Versuchsgruppe
**
BDNF 50 ng/ml
Negativkontrolle
Abb. 14: Effekte der unterschiedlichen Konzentrationen von LNC FITC, LNC BLANK sowie BDNF auf
das Neuritenauswachsverhalten von SGZ nach 48 Stunden Kulturdauer. Die dargestellten Werte
zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus 3 unabhängigen Experimenten (n=45 vermessene
Neuritenlängen pro Konzentration je Gruppe). Die Signifikanzen sind im Vergleich zur Kontrollgruppe
über den Säulen dargestellt, während Vergleiche unter den Gruppen mit Klammern dargestellt sind
(p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,01 = ***; ns = nicht signifikant).

92
5.1.6 Einfluss von L�C, L�C BLA�K sowie BD�F auf den Somadiameter vereinzelt
kultivierter Spiralganglienzellen
Der Vergleich der Somadiameter unter den mit den verschiedenen Testsubstanzen
behandelten Gruppen ergab keine statistisch signifikanten Unterschiede. Die tabellarische
Darstellung gibt eine Übersicht über die ermittelten Daten (Tab. 6).
Tab. 6: Ergebnisse der ermittelten Spiralganglienzelldurchmesser (Mittelwert ± Standardabweichung)
nach 48-stündiger Kultivierung unter LNC FITC-, LNC BLANK- sowie BDNF-Einfluss in
unterschiedlichen Verdünnungen.
Gruppe Mittelwert des
Somadurchmessers
[µm]
Standardabweichung Anzahl der
vermessenen Soma
Negativkontrolle 14,7 3,2 45
LNC FITC 1:100 14,1 2,2 45
LNC FITC 1:200 13,7 2,2 45
LNC FITC 1:300 13,5 2,8 45
LNC BLANK 1:100 13,5 2,1 45
LNC BLANK 1:200 13,5 2,1 45
LNC BLANK 1:300 13,3 2,0 45
BDNF 50 ng/ml 14,5 2,3 45
5.2 Ergebnisse der In-vitro-Versuche mit dendritischen Zellen
In diesem Versuch wurde der Einfluss der jeweiligen Testsubstanzen auf die TNF-α-Sekretion
der dendritischen Zellen evaluiert. Hierbei wurden die dendritischen Zellen mit Rolipram
(ROLIPRAM), in fluoreszenzmarkierten Lipidnanokapseln inkorporiertem Rolipram (LNC
FITC ROLIPRAM), fluoreszenzmarkierten Lipidnanokapseln (LNC FITC) sowie nicht
markierten Lipidnanokapseln (LNC BLANK) behandelt. Pro Gruppe wurden vier
Konzentrationen angewendet (0,01 µM; 0,1 µM; 1 µM; 10 µM). Eine Stunde nach der

93
Inkubation mit den Testsubstanzen erfolgte die Anregung und Reifung der Zellen zur TNF-α-
Produktion durch die Zugabe von Lipopolysacchariden (LPS).
5.2.1 Einfluss der Testsubstanzen auf die T�F-α-Sekretion
Die Inkubation mit Dimethylsulfoxid (DMSO; > 0,01 Vol %; Vehikelkontrolle) führte zu
keiner TNF-α-Sekretion. Die Gegenüberstellung zu der in der Positivkontrolle (Zellen
ausschließlich mit Lipopolysacchariden behandelt) ermittelten TNF-α-Konzentration von
338,18 ± 41,82 pg/ml TNF-α (Mittelwert und Standardabweichung; n=12) zeigte besonders in
den mit Rolipram inkubierten Zellen eine signifikante Inhibition dieses Zytokins. Alle
gemessenen Werte erwiesen sich gegenüber der Positivkontrolle als signifikant erniedrigt
(p < 0,001; Abb.15). Hierbei zeigte der Vergleich innerhalb der Gruppe einen deutlichen
Abwärtstrend je stärker die eingesetzte Konzentration des Arzneimittels war. So bewirkte die
Zugabe von 0,1 µM Rolipram bereits eine signifikant verringerte TNF-α-Produktion im
Vergleich zu den mit 0,01 µM behandelten Zellen (211,23 ± 56,78 pg/ml TNF-α, n=12 gegen
244,23 ± 47,42 pg/ml TNF-α, n=12; p < 0,05; Abb. 16). Des Weiteren zeigten die mit 1 µM
(123,74 ± 30,27 pg/ml TNF-α; n=12) und 10 µM (100,71 ± 46,24 pg/ml TNF-α; n=12)
Rolipram behandelten Zellen im Vergleich zu den beiden niedrigeren
Rolipramkonzentrationen eine weitere, in diesem Fall höchst signifikant (p < 0,001)
verminderte TNF-α-Produktion.
Die Lipidnanokapsel-Rolipram-Kombination hingegen (LNC FITC ROLIPRAM) hatte in den
Konzentrationen 0,01 µM und 0,1 µM keinen Effekt auf die TNF-α-Sekretion
(326,09 ± 72,52 pg/ml TNF-α; n=12 bzw. 290,20 ± 45,74 pg/ml TNF-α; n=12). Jedoch zeig-
ten sich in der Konzentration von 1 µM sowie 10 µM signifikant verringerte TNF-α-Werte.
(p < 0,01; 245,07 ± 42,22 pg/ml TNF-α; n=12 bzw. p < 0,001; 105,20 ± 90,51 pg/ml TNF-α;
n=12 ). Innerhalb der verschiedenen Konzentrationen wurde zwischen den mit 0,01 µM und
0,1 µM LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen kein signifikanter Unterschied in der
TNF-α-Produktion festgestellt, wobei sich aber zwischen 0,01 µM respektive 0,1 µM und
1 µM ein hoch signifikant (p < 0,01) erniedrigter TNF-α-Wert für die mit 1 µM LNC FITC
ROLIPRAM behandelten Zellen ergab. Die für die 10 µM Konzentration ermittelten Werte

94
wiesen gegenüber allen anderen LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen einen höchst
signifikant verringerten TNF-α-Wert auf (p < 0,001). Im mikroskopischen Bild zeigten die
Zellen jedoch zellmorphologische Abweichungen im Gegensatz zu den Zellen der anderen
Konzentrationen, wobei deutliche Granulationen im Zellinneren zu erkennen waren.
Weiterhin zeigten sich Kristallbildungen.
Bei den mit unbeladenen und unmarkierten Nanopartikeln (LNC BLANK) behandelten Zellen
konnte in den Konzentrationen 0,01 µM (305,56 ± 40,74 pg/ml TNF-α; n=12) und 0,1 µM
(308,59 ± 45,67 pg/ml TNF-α; n=12) keine zur Positivkontrolle verringerte TNF-α-Sekretion
detektiert werden. Nur die mit 1 µM (283,11 ± 23,01 pg/ml TNF-α; n=12) Nanopartikel-
lösung behandelten Zellen zeigten einen signifikant inhibierten Wert (p < 0,05). Auch in
dieser Nanopartikelgruppe zeigte sich das für die LNC FITC ROLIRPAM beschriebene Bild
in der Konzentration von 10 µM (98,11 ± 81,29 pg/ml TNF-α; n=12, p< 0,001). Innerhalb der
Gruppe fanden sich höchst signifikante Unterschiede (p < 0,001) nur zu der TNF-α-
Konzentration der mit 10 µM LNC BLANK-Lösung behandelten Zellen (Abb.16).
Die LNC FITC-Gruppe zeigte ein ähnliches Bild, wobei in den Konzentrationen von 0,01 µM
(303,84 ± 32,76 pg/ml TNF-α; n=12), 0,1 µM (293,52 ± 28,25 pg/ml TNF-α; n=12) und 1 µM
LNC FITC (311,48 ± 33,57 pg/ml TNF-α; n=12) kein Unterschied zur Positivkontrolle
evident wurde (Abb. 15). Die höchst signifikante Verringerung der TNF-α-Konzentration in
der mit LNC FITC in der Konzentration von 10 µM behandelten Zellgruppe wiederholte die
in den anderen Nanopartikelgruppen ermittelte Charakteristik der zellmorphologischen
Veränderungen und der Kristallbildungen (p < 0,001, 146,90 ± 7,64 pg/ml TNF-α; n=12).
Innerhalb der Gruppe waren wiederum höchst signifikante Unterschiede (p < 0,001) nur zur
10 µM Konzentration zu verzeichnen (Abb.17).

Konzentration TNF - αα [pg/ml]
400
300
200
100
0
*** ***
ROLIPRAM 0,01 µM
ROLIPRAM 0,1 µM
*** ***
ROLIPRAM 1 µM
ROLIPRAM 10 µM
LNC FITC ROLIPRAM 0,01 µM
LNC FITC ROLIPRAM 0,1 µM
**
LNC FITC ROLIPRAM 1 µM
LNC FITC ROLIPRAM 10 µM
95
LNC BLANK 0,01 µM
LNC BLANK 0,1 µM
*
*** ***
LNC BLANK 1 µM
LNC BLANK 10 µM
Versuchsgruppe
Abb. 15: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM,
LNC BLANK und LNC FITC in verschiedenen Konzentrationen und anschließender Stimulation mit
LPS. Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten
(n=12 Wells pro Konzentration je Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen sind im Vergleich zur
Kontrollgruppe über den Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,001 = ***).
LNC FITC 0,01 µM
LNC FITC 0,1 µM
LNC FITC 1 µM
***
LNC FITC 10 µM
***
Vehikel (DMSO)
LPS

Konzentration TNF - α [pg/ml]
400
300
200
100
0
ROLIPRAM 0,01 µM
*
ROLIPRAM 0,1 µM
***
ROLIPRAM 1 µM
ROLIPRAM 10 µM
96
LNC FITC ROLIPRAM 0,1 µM
LNC FITC ROLIPRAM 0,01 µM
*** *** ***
**
Versuchsgruppe
**
LNC FITC ROLIPRAM 1 µM
LNC FITC ROLIPRAM 10 µM
Abb. 16: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von ROLIPRAM und LNC FITC
ROLIPRAM in verschiedenen Konzentrationen und anschließender Stimulation mit LPS. Die
dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten (n=12 Wells
pro Konzentration je Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen innerhalb einer Versuchsgruppe sind über
den Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,001 = ***).

Konzentration TNF - α [pg/ml]
300
200
100
0
LNC BLANK 0,01 µM
LNC BLANK 0,1 µM
LNC BLANK 1 µM
LNC BLANK 10 µM
97
400 *** *** *** *** *** ***
LNC FITC 0,01 µM
LNC FITC 0,1 µM
Versuchsgruppe
LNC FITC 1 µM
LNC FITC 10 µM
Abb. 17: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von LNC BLANK und LNC FITC in
verschiedenen Konzentrationen und anschließender Stimulation mit LPS. Die dargestellten Werte
zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten (n=12 Wells pro Konzentration je
Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen innerhalb einer Versuchsgruppe sind über den Säulen
dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **; p < 0,001 = ***).
5.2.2 Einfluss der Testsubstanzen in der Konzentration von 1 µM auf die T�F-α-
Sekretion
In der zu den dendritischen Zellen gegebenen Konzentration von 1 µM zeigte sich die
geringste TNF-α-Sekretion in der mit Rolipram behandelten Zellgruppe. Die über Rolipram
ausgeübte Hemmung der Zytokinsekretion war gegenüber allen anderen Gruppen höchst
signifikant erhöht (p < 0,001). Weiterhin zeigt die Nanopartikel-Rolipram-Kombination (LNC
FITC ROLIPRAM) eine hoch signifikant stärkere TNF-α-Hemmung gegenüber der LNC

98
BLANK-Gruppe (p < 0,01), wobei gegenüber der LNC FITC-Gruppe sogar ein höchst
signifikanter Unterschied zu erkennen war (p < 0,001). Ein weiterer signifikanter Unterschied
war zwischen den ermittelten Werten der LNC BLANK- und LNC FITC-Gruppe vorhanden,
wobei die TNF-α-Konzentration der mit LNC BLANK behandelten Zellen geringer war
(p < 0,05; Abb.18).
Konzentration TNF - α
α [pg/ml]
400 ** ***
*
300
200
100
0
ROLIPRAM 1µM
***
LNC FITC ROLIPRAM 1µM
***
LNC BLANK 1µM
Versuchsgruppe
***
LNC FITC 1µM
Abb. 18: TNF-α-Sekretion dendritischer Zellen unter Einfluss von ROLIPRAM, LNC FITC ROLIPRAM,
LNC BLANK und LNC FITC in der Konzentration von 1 µM und anschließender Stimulation mit LPS.
Die dargestellten Werte zeigen den Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Experimenten (n=12
Wells pro Konzentration je Gruppe). Die ermittelten Signifikanzen zwischen den Versuchsgruppen
sind über den Säulen mit Klammern dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0.01 = **; p < 0.001 = ***).

5.2.3 Ergebnisse der Vitalitätstestsbestimmung der dendritischen Zellen
99
Die mit 10 µM Nanopartikel-Lösung (LNC FITC Rolipram, LNC BLANK und LNC FITC)
behandelten Zellen zeigten zellmorphologische Veränderungen mit Granulierung des
Zytoplasmas im mikroskopischen Bild, weiterhin waren Kristallbildungen zu erkennen.
Trotz hoher Werte der photometrischen Auswertung bei LNC FITC ROLIPRAM 10 µM und
LNC FITC 10 µM (10.7) wurde in der visuellen Betrachtung keine Umfärbung des gelblichen
Methyltetrazoliums zu dem violetten Formazonfarbstoff festgestellt.
Die Ergebnisse der anderen Gruppen zeigten eine Umfärbung von gelb zu violett, was sich in
den hohen Werten der ermittelten optischen Dichten widerspiegelte (10.7).

5.3 Ergebnisse der In-vivo-Versuche
100
In der Tierversuchsstudie erfolgte die Untersuchung der spiralganglienzellprotektiven
Wirkung des Phosphodiesterase-Hemmers Rolipram sowie des in Lipidnanokapseln
inkorporierten Roliprams (LNC FITC ROLIPRAM). Des Weiteren wurde auch der Einfluss
von unbeladenen Lipidnanokapseln (LNC FITC) auf das Spiralganglienzellüberleben
untersucht. Eine letzte Tiergruppe wurde nur mit phosphate buffered saline (PBS) behandelt.
Für die Durchführung dieser Untersuchungen wurden die Tiere zunächst systemisch ertaubt
(Versuchstag 0), wonach die Injektion der jeweiligen Testsubstanzen in die Scala tympani der
linken Cochleae erfolgte (Versuchstag 7). Rechtsseitig wurden alle Tiere in entsprechender
Weise zur Kontrolle mit PBS behandelt. Am Tag 21 wurden die Cochleae gewonnen und zur
histologischen Aufarbeitung vorbereitet, um durch Auszählung der überlebenden
Spiralganglienzellen sowie der Ausmessung ihrer Somadiameter die Effekte der
Testsubstanzen zu evaluieren.
Für diese Studie wurden insgesamt 32 Tiere zu je acht Tieren pro Gruppe verwendet. In der
PBS-Gruppe kam es in zwei Fällen zu unzureichenden Ertaubungen, indem nicht genügend
Furosemid injiziert werden konnte. In den Gruppen LNC FITC und LNC FITC ROLIPRAM
kam es zu jeweils einem Todesfall, wobei in der ROLIPRAM-Gruppe zwei Tiere
intraoperativ verstorben sind. Somit wurden in die Auswertung der Ergebnisse in der LNC
FITC-Gruppe n=7 Tiere, in der LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe n=6 Tiere, in der
ROLIPRAM-Gruppe n=7 Tiere und in der PBS-Gruppe n=6 Tiere mit einbezogen. Alle Tiere
zeigten in der postoperativen Versuchszeit ein ungestörtes Allgemeinbefinden mit ungestörter
Futter- und Wasseraufnahme.
5.3.1 Ergebnisse der aABR-Messungen
Zur Bestimmung der Hörschwelle wurden die Tiere am Versuchstag 0, 7 und 21 der Studie
einer akustisch evozierten Hirnstammpotential (aABR)-Messung unterzogen (4.2.3.3).
Die Messung der Hörschwelle kurz vor der systemischen Ertaubung am Tag 0 diente zur
Bestimmung der Ausgangshörschwelle. Bei einer Frequenz von 8 kHz lag die niedrigste

101
Hörschwelle bei 20 dB SPL, während die höchste bei 40 dB SPL lag. Auch in den anderen
getesteten Frequenzen zeigte sich bei allen Tieren ein der Tierart entsprechendes
Hörvermögen (Abb. 19). Damit galten alle in der Studie verwendeten Tiere als normal hörend
und konnten in die Auswertung mit einbezogen werden (KANO u. STARR 1987,
MITCHELL et al. 1997).
Am Tag 7 und am Tag 21 wurde eine erneute aABR-Messung durchgeführt um den Erfolg
der systemischen Ertaubung zu überprüfen. Bei allen Tieren konnte nach der Ertaubung in
allen getesteten Frequenzen kein positives aABR-Signal bis zur Messgrenze von 90 dB SPL
ermittelt werden, was bei den Versuchstieren einem Hörschwellenanstieg von mindestens
50 dB SPL entsprach, womit die Tiere als ertaubt galten (AGTERBERG et al. 2009).
Hörschwelle [dB SPL]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Abb. 19: Darstellung der physiologischen Hörschwellen der rechten und linken Ohren am
Versuchstag 0 (n=26; Mittelwert ± Standardabweichung). Die unterbrochene rote Linie stellt die
ermittelten Daten des Versuchstages 7 und 21 dar. Hierbei konnte in keiner der gemessenen
Frequenzen weder links- noch rechtsseitig ein positives aABR-Signal bis zur Messgrenze von 90 dB
SPL beobachtet werden. Eine Messung höherer dB SPL-Werte war aufgrund der Systemkonfiguration
nicht durchführbar.
1 4 8 16 32 40
Frequenz [kHz]
links
rechts

102
5.3.2 Vergleich der Spiralganglienzelldichten zwischen rechten und linken ertaubten
Cochleae der Tiere einer Versuchsgruppe sowie der linken bzw. rechten Cochleae aller
Gruppen untereinander
Zur Evaluierung der Effekte der unterschiedlichen Interventionen wurden die ermittelten
Spiralganglienzelldichten der behandelten linken Cochleae mit denen der jeweiligen rechten
Kontrollgruppe verglichen. Hierüber ließ sich die Wirksamkeit der jeweiligen Intervention
erkennen, da der Spiralganglienzelldichtewert der rechten Kontrollseiten den Dichtewert nach
21 Tagen Ertaubung widerspiegelt. Der Unterschied zur linken Seite gibt dabei die Effizienz
der Testsubstanz hinsichtlich der Spiralganglienzelldichte an. Die statistische Auswertung
erfolgte in diesem Fall über den t-Test für abhängige Stichproben. Des Weiteren fand ein
Vergleich der linken behandelten Cochleae aller Gruppen untereinander statt, wobei mit den
rechten Seiten genauso verfahren wurde. Hierbei wurde die statistische Auswertung mittels
Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) und Student-Newman-Keuls-Test
durchgeführt.
Tendenziell wiesen alle Gruppen auf der rechten Kontrollseite eine höhere
Spiralganglienzelldichte auf, wobei nur in der PBS-Gruppe zwischen linker und rechter Seite
ein signifikanter Unterschied festgestellt wurde (4,14 SGZ ± 1,40/ 10.000 µm 2 ;
Mittelwert ± Standardabweichung versus 5,23 SGZ ± 1,67/ 10.000 µm 2 ; p < 0,05; Abb. 20).
Die Abweichungen der Spiralganglienzelldichten zwischen rechter und linker Seite zeigten
bei den übrigen Gruppen keine signifikanten Unterschiede. Die ermittelten Werte ergaben für
die LNC FITC-Gruppe auf der linken Seite eine mittlere Dichte von
3,13 ± 0,49 SGZ/ 10.000 µm 2 während die rechte Seite mit 3,25 ± 0,38 SGZ/ 10.000 µm 2
einen leicht erhöhten Dichtewert zeigte. Bei der LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe wurden
Werte von 3,28 ± 1,48 SGZ/ 10.000 µm 2 für die linke Seite sowie
3,36 ± 1,15 SGZ/ 10.000 µm 2 für die rechte Seite ermittelt. Ein ähnliches Bild zeigte sich in
der ROLIPRAM-Gruppe wobei auf der linken Seite ein Dichtewert von
3,31 ± 0,89 SGZ/ 10.000 µm 2 erreicht wurde, sich auf der Kontrollseite aber zur linken Seite
ein wiederum leicht erhöhter Wert von 3,74 ± 0,89 SGZ/ 10.000 µm 2 darstellte.

Durchschnittliche SGZ-Dichte
linker und rechter Cochleae
(SGZ-Zahl/10.000 µm 2 )
LNC FITC li
Kontrolle PBS re
LNC FITC ROLIPRAM li
Kontrolle PBS re
103
8 *
7
6
5
4
3
2
1
0
ROLIPRAM li
Kontrolle PBS re
Versuchsgruppe
PBS li
Kontrolle PBS re
Abb. 20: Durchschnittliche SGZ-Dichten (SGZ/ 10.000 µm 2 ; Mittelwert ± Standardabweichung) der
Cochleae ertaubter Meerschweinchen nach linksseitiger Behandlung mit LNC FITC, LNC FITC
ROLIPRAM, ROLIPRAM und PBS im Vergleich mit den jeweils rechtsseitigen, nur mit PBS
behandelten Cochleae. Nur in der PBS-Gruppe war ein signifikanter Unterschied zu erkennen
(p < 0,05 = *).
Der Vergleich der Spiralganglienzelldichten der linken Ohren untereinander ergab keine
signifikanten Unterschiede. So wurde das Dichtemaximum mit 4,14 ± 1,40 SGZ / 10.000 µm 2
in der PBS-Gruppe, das Minimum in der LNC FITC-Gruppe mit einem Wert von
3,13 ± 0,54 SGZ/ 10.000 µm 2 erreicht. Der Vergleich der Daten der rechten Cochleae
hingegen zeigte einen signifikant erhöhten Wert der Spiralganglienzelldichte für die PBS-
Gruppe mit 5,23 ± 1,67 SGZ/ 10.000 µm 2 (p < 0,05). Der niedrigste Wert zeigte sich auch auf
dieser Seite ebenfalls in der LNC FITC-Gruppe mit 3,25 ± 0,41 SGZ/ 10.000 µm 2 .

104
5.3.3 Vergleich der Spiralganglienzelldichten des unteren, mittleren und oberen
Abschnitts der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen
Für die Beurteilung der jeweiligen Interventionseffekte in den unterschiedlichen Abschnitten
der Cochlea wurden die ermittelten Spiralganglienzelldichten der einzelnen Anschnitte des
ROSENTHALschen Kanals in drei Gruppen unterteilt (4.2.3.10). So zeigte der Vergleich der
gewählten Abschnitte innerhalb einer Gruppe ob es abhängig von der Topographie in der
Cochlea zu verschieden stark ausgeprägten Effekten kommt. Die Unterschiede in den
Zelldichten der einzelnen Abschnitte können Rückschlüsse auf eine eventuelle Beeinflussung
der rechten Ohren durch die linksseitig behandelten Ohren zulassen. Zum Vergleich der
verschiedenen Abschnitte innerhalb einer Versuchsgruppe wurde der t-Test für abhängige
Stichproben angewendet. Der Vergleich der einzelnen Abschnitte zwischen den
verschiedenen Gruppen erfolgte mittels Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) und
nachfolgendem Student-Newman-Keuls-Test (Abb. 21).
Ein recht homogenes Bild war in der LNC FITC-Gruppe zu sehen, wobei zwischen den
verschiedenen Abschnitten der Cochlea kein signifikanter Unterschied evident wurde. So
konnten für den unteren Abschnitt ein mittlerer Wert von 3,14 ± 0,13 SGZ/ 10.000 µm 2
(Mittelwert ± Standardabweichung), für den mittleren Abschnitt
3,34 ± 0,80 SGZ/ 10.000 µm 2 ermittelt werden, während der obere Abschnitt einen mittleren
Spiralganglienzelldichtewert von 3,26 ± 0,52 SGZ/ 10.000 µm 2 erzielte. Auch in der LNC
FITC ROLIPRAM-Gruppe zeigte sich eine ähnlich homogene Verteilung der
Spiralganglienzelldichten zwischen den drei Abschnitten, wobei der mittlere Abschnitt einen
tendenziell höheren Wert zu dem unteren sowie oberen Abschnitt aufwies
(3,55 ± 1,76 SGZ/ 10.000 µm 2 versus 3,24 ± 0,92 SGZ/ 10.000 versus 3,28 ± 0,94 SGZ/
10.000 µm 2 )
Als einzige Gruppe zeigten die Kontrollcochleae der mit Rolipram behandelten Tiere einen
signifikanten Unterschied in der Spiralganglienzelldichte zwischen den einzelnen
Abschnitten. So wurde im oberen Abschnitt (4,91 ± 1,20 SGZ/ 10.000 µm 2 ) ein hoch
signifikant erhöhter (p < 0,01) Wert im Vergleich zum unteren Abschnitt
(2,95 ± 0,88 SGZ/ 10.000 µm 2 ) erreicht. Aber auch gegenüber des mittleren Abschnitts

105
(3,36 ± 1,08 SGZ/ 10.000 µm 2 ) zeigte sich ein zwar geringerer aber dennoch signifikanter
(p < 0,05) Unterschied zur Spiralganglienzelldichte des oberen Abschnitts.
In der PBS-Gruppe zeigte sich lediglich eine tendenzielle Zunahme der Zelldichten vom
unteren über den mittleren bis zum oberen Abschnitt. Signifikante Unterschiede konnten
hierbei jedoch auf Grund der höheren Streuung nicht beobachtet werden
(4,39 ± 1,70 SGZ/ 10.000 µm 2 versus 5,44 ± 2,13 SGZ/ 10.000 µm 2 versus
5,85 SGZ ± 1,84/ 10.000 µm 2 ).
Durchschnittliche SGZ-Dichte
rechter Cochleae (ohne Therapie)
(SGZ-Zahl/10.000 µm 2 )
8 **
7
*
6
5
4
3
2
1
0
LNC FITC 1
LNC FITC 2
LNC FITC 3
LNC FITC ROLIPRAM 1
LNC FITC ROLIPRAM 2
LNC FITC ROLIPRAM 3
ROLIPRAM 1
ROLIPRAM 2
ROLIPRAM 3
Versuchsgruppe (Kontrollseite)
PBS 1
PBS 2
PBS 3
Abb. 21: Darstellung der mittleren Spiralganglienzelldichten und der Standardabweichung des
unteren (1), mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie).
Das Diagramm zeigt den Vergleich der unterschiedlichen Abschnitte innerhalb der einzelnen Gruppen.
Die hier dargestellten Kontrollseiten wurden alle mit PBS behandelt. Signifikanzniveaus sind mittels
Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **).
Der Vergleich der einzelnen Abschnitte zwischen den Gruppen erbrachte für die unteren und
mittleren Abschnitte keinen signifikanten Unterschied. Nur der Vergleich der oberen
Abschnitte wies im Vergleich zwischen den einzelnen Gruppen signifikante Unterschiede auf.

106
So zeigte sich die Spiralganglienzelldichte des oberen Abschnittes der ROLIPRAM-Gruppe
(4,91 ± 1,20 SGZ/ 10.000 µm 2 ) einen signifikant (p < 0,05) höheren Wert als die
entsprechenden Windungen der Gruppen LNC FITC sowie LNC FITC ROLIPRAM
(3,26 ± 0,52 SGZ/ 10.000 µm 2 ; respektive 3,28 ± 0,94 SGZ/ 10.000 µm 2 ), während der
Spiralganglienzellwert des oberen Abschnitts der PBS-Gruppe
(5,85 ± 1,84 SGZ/ 10.000 µm 2 ) die Werte der beiden letztgenannten Gruppen sogar hoch
signifikant (p < 0,01) übertraf (Abb. 22).
Durchschnittliche SGZ-Dichte
rechter Cochleae (ohne Therapie)
(SGZ-Zahl/10.000 µm 2 )
8
7
6
5
4
3
2
1
0
LNC FITC 1
LNC FITC ROLIPRAM 1
ROLIPRAM 1
PBS 1
LNC FITC 2
LNC FITC ROLIPRAM 2
ROLIPRAM 2
PBS 2
Versuchsgruppe (Kontrollseite)
LNC FITC 3
LNC FITC ROLIPRAM 3
ROLIPRAM 3
PBS 3
Abb. 22: Darstellung der mittleren Spiralganglienzelldichten und der Standardbweichung des unteren
(1), mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie). Das
Diagramm zeigt den Vergleich der jeweiligen Abschnitte zwischen den unterschiedlichen Gruppen.
Die hier dargestellten Kontrollseiten wurden alle mit PBS behandelt. Signifikanzniveaus sind mittels
Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **).
*
**

107
5.3.4 Vergleich der Spiralganglienzelldichten des unteren, mittleren und oberen
Abschnitts der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den Versuchsgruppen
Zur vergleichenden Betrachtung der Einflüsse der Versuchssubstanzen auf das
Spiralganglienzellüberleben wurden auch die Spiralganglienzelldichten der linken Cochleae
in drei Abschnitte zusammengefasst. Hierbei ist nach dem gleichen Verfahren wie bei den
rechten Cochleae (5.3.3) vorgegangen worden um mögliche ortsspezifische Effekte der
benutzten Substanzen zu erkennen.
Die statistische Beurteilung zum Vergleich der verschiedenen Abschnitte innerhalb einer
Versuchsgruppe erfolgte durch den t-Test für abhängige Stichproben. Der Vergleich der
einzelnen Abschnitte zwischen den verschiedenen Gruppen wurde mittels Varianzanalyse
(analysis of variance, ANOVA) und nachfolgendem Student-Newman-Keuls-Test
durchgeführt (Abb. 23).
Die Auswertung der LNC FITC-Gruppe zeigte die signifikant höchste Spiralganglienzell-
dichte in dem obersten Abschnitt mit 3,55 ± 0,64 SGZ/ 10.000 µm 2 (Mittelwert ±
Standardabweichung). Wobei der Unterschied zum mittleren Abschnitt (p < 0,01;
2,77 ± 0,49 SGZ/ 10.000 µm 2 ) größer ist als zum unteren Abschnitt (p < 0,05;
3,07 ± 0,53 SGZ/ 10.000 µm 2 ).
Die Spiralganglienzelldichten in der LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe zeigten dahingegen
keinen signifikanten Unterschied. So lagen die Werte der unteren, mittleren und oberen
Cochleaanteile sehr dicht zusammen (3,63 ± 1,83 SGZ/ 10.000 µm 2 ; respektive
3,07 ± 1,26 SGZ/ 10.000 µm 2 ; respektive 3,16 ± 1,41 SGZ/ 10.000 µm 2 ).
Auch bei den mit Rolipram behandelten Tieren zeigte sich die Spiralganglienzelldichte der
mittleren Anteile als die Geringste (2,99 ± 0,92 SGZ/ 10.000 µm 2 ). So war im oberen
Abschnitt ein signifikant höherer Spiralganglienzelldichtewert zu verzeichnen (p < 0,05;
3,77 ± 1,33 SGZ/ 10.000 µm 2 ), während die Dichte der unteren Cochleaanteile einen nur
tendenziell höheren Wert zu erkennen gab (3,16 ± 0,64 SGZ/ 10.000 µm 2 ).
Mit den Zelldichtewerten von 3,83 ± 2,04 SGZ/ 10.000 µm 2 in dem unteren,
3,88 ± 1,29 SGZ/ 10.000 µm 2 in dem mittleren und 4,70 ± 1,15 SGZ/ 10.000 µm 2 in dem

108
oberen Abschnitt gab es auch in der PBS-Gruppe keine signifikanten Unterschiede zu
verzeichnen.
Durchschnittliche SGZ-Dichte
linker Cochleae (mit Therapie)
(SGZ-Zahl/10.000 µm 2 )
8
7
6
5
4
3
2
1
0
*
**
LNC FITC 1
LNC FITC 2
LNC FITC 3
LNC FITC ROLIPRAM 2
LNC FITC ROLIPRAM 3
LNC FITC ROLIPRAM 1
*
ROLIPRAM 1
ROLIPRAM 2
ROLIPRAM 3
Versuchsgruppe
PBS 1
PBS 2
PBS 3
Abb. 23: Darstellung der mittleren Spiralganglienzelldichten und der Standardabweichung des
unteren (1), mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten linken Cochleae (mit Therapie). Das
Diagramm zeigt den Vergleich der einzelnen Abschnitte innerhalb der einzelnen Gruppen. Die
Cochleae wurden mit LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und PBS behandelt.
Signifikanzniveaus sind mittels Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *;
p < 0,01 = **).
Die vergleichende Betrachtung der einzelnen Abschnitte zwischen den Gruppen erbrachte
keine signifikanten Unterschiede, wobei die Werte der PBS-Gruppe aber in jedem Abschnitt
das tendenzielle Maximum bildeten (Abb. 24).

Durchschnittliche SGZ-Dichte
linker Cochleae (mit Therapie)
(SGZ-Zahl/10.000 µm 2 )
8
7
6
5
4
3
2
1
0
LNC FITC 1
LNC FITC ROLIPRAM 1
ROLIPRAM 1
PBS 1
LNC FITC 2
LNC FITC ROLIPRAM 2
109
ROLIPRAM 2
PBS 2
Versuchsgruppe
LNC FITC 3
LNC FITC ROLIPRAM 3
ROLIPRAM 3
Abb. 24: Darstellung der mittleren Spiralganglienzelldichten und der Standardabweichung des
unteren (1), mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie). Das
Diagramm zeigt den Vergleich der jeweiligen Abschnitte zwischen den unterschiedlichen Gruppen.
Die Cochleae wurden mit LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und PBS behandelt. Es
ergaben sich keine signifikanten Unterschiede innerhalb der einzelnen Abschnitte.
5.3.5 Vergleich der Somadiameter der Spiralganglienzellen zwischen rechter und linker
ertaubter Cochleae der Tiere einer Versuchsgruppe sowie der linken bzw. rechten
Cochleae aller Gruppen untereinander
Neben der Spiralganglienzelldichte wurde als zweiter Parameter der Somadiameter der
Spiralganglienzellen vermessen. Es sollte ein etwaiger Effekt der jeweiligen Testsubstanzen
auf die Größe der Spiralganglienzellen untersucht werden. Hierfür erfolgte ein Vergleich der
rechten Kontrollseite mit der linken, mit der jeweiligen Testsubstanz behandelten Seite. Es
wurden pro Anschnitt des ROSENTHALschen Kanals acht Somadiameter ermittelt, wobei in
vier verschieden Feldern der Anschnittfläche je zwei Zellen ausgewählt wurden. Waren
PBS 3

110
weniger als acht Zellen vorhanden, wurden alle verbliebenen Zellen vermessen (4.2.3.10).
Der statistische Vergleich der Somadiameter innerhalb einer Gruppe wurde mittels des t-Test
für abhängige Stichproben durchgeführt, während der Vergleich der rechten bzw. linken
Cochleae der Gruppen untereinander mittels Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA)
und nachfolgendem Student-Newman-Keuls-Test durchgeführt wurde.
Der Vergleich der Somadiameter der linken, mit den jeweiligen Testsubstanzen behandelten
Cochleae, gegenüber den Zelldurchmessern, welche in den rechten Kontrollseiten ermittelt
wurden, ergab bei den mit LNC FITC behandelten Tieren einen signifikanten Unterschied
(Abb. 25). So war der Somadiameter der linken Seite signifikant gegen den Mittelwert der
rechten Seite erhöht (14,00 ± 0,76 µm versus 13,14 ± 0,52 µm; p < 0,05).
Die Behandlung mit LNC FITC ROLIPRAM hingegen zeigte nur einen tendenziell erhöhten
Somadiameter auf der linken Seite (13,91 ± 1,33 µm), während die rechte Seite mit einem
Mittelwert von 12,68 ± 0,72 µm keinen signifikant verringerten Wert darstellte.
In der ROLIPRAM-Gruppe setzte sich der linksseitige Wert der mittleren Somadiameter
deutlich signifikant von denen auf der rechten Seite ab (13,78 ± 0,26 µm versus
12,73 ± 0,32 µm ; p < 0,01).
Die PBS-Gruppe zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den Werten der rechten
und linken Seite (13,27 ± 0,56 µm versus 12,68 ± 0,79 µm).

Durchschnittlicher Somadiameter
der SGZ linker und rechter Cochleae [µm]
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
LNC FITC li
Kontrolle PBS re
LNC FITC ROLIPRAM li
Kontrolle PBS re
111
* **
ROLIPRAM li
Kontrolle PBS re
Versuchsgruppe
PBS li
Kontrolle PBS re
Abb. 25: Durchschnittliche Somadiameter (µm; Mittelwert ± Standardabweichung) der Cochleae
ertaubter Meerschweinchen nach linksseitiger Behandlung mit LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM,
ROLIPRAM und PBS im Vergleich mit den jeweils rechtsseitigen, nur mit PBS behandelten, Cochleae.
Signifikanzniveaus sind mittels Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *;
p < 0,01 = **).
Die Auswertung des Vergleichs der Somadiameter der linken Cochleae untereinander, sowie
auch der rechten Kontrollseiten untereinander, ergab keine statistisch signifikanten
Unterschiede.

112
5.3.6 Vergleich der ermittelten Somadiameter des unteren, mittleren und oberen
Abschnitts der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen
Um einen Einfluss der Testsubstanzen auf die verschiedenen Abschnitte der Cochlea von
basal nach apikal beurteilen zu können, wurden die ermittelten Somadiameter der ertaubten,
ansonsten nur mit PBS behandelten rechten Cochleae, in drei Abschnitte zusammengefasst
(4.2.3.10). Durch den Vergleich der Kontrollcochleae der verschiedenen Gruppen soll ein
Rückschluss auf eine mögliche Beeinflussung vom linksseitig behandelten Ohr ermöglicht
werden.
Die Werte der Somadiameter wurden innerhalb einer Gruppe mit dem t-Test für abhängige
Stichproben verglichen wobei die Auswertung der Gegenüberstellung unter den Gruppen
mittels Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) und Student-Newman-Keuls-Test
erfolgte (Abb. 26).
In der mit LNC FITC behandelten Gruppe, zeigten die Somadiameter der mit PBS
behandelten Kontrollcochleae eine deutliche Verringerung des Wertes von basal nach apikal.
So bestand ein signifikanter Unterschied zwischen dem mittleren Somadiameter des unteren
und oberen Abschnitts [13,69 ± 0,82 µm (Mittelwert ± Standardabweichung) versus
12,65 ± 0,45 µm; p < 0,05]. Der mittlere Abschnitt lag mit einem Somadiameter von
13,03 ± 0,58 µm zwischen den beiden anderen, zeigte aber keinen signifikanten Unterschied
zur Kontrollgruppe.
Bei den Kontrollinnenohren der LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe wurde kein signifikanter
Unterschied zwischen den einzelnen Abschnitten deutlich. Jedoch weisen die Werte der
Somadiameter des unteren, mittleren und oberen Abschnitts eine tendenzielle Abnahme des
Spiralganglienzelldurchmessers auf (13,24 ± 1,20 µm; respektive 12,46 ± 0,60 µm; respektive
12,51 ± 0,52 µm).
Auch die Somadiameter der rechtsseitig vermessenen Kontrollohren der ROLIPRAM-Gruppe
zeigten diese Verringerung des Durchmessers von basal nach apikal. Während der untere
Abschnitt mit 13,21 ± 0,28 µm einen signifikanten Unterschied zum mittleren Somadiameter
des apikalen Abschnitts aufwies (12,51 ± 0,60 µm; p < 0,05), zeigte er zum mittleren
Abschnitt sogar eine noch deutlichere Signifikanz (12,66 ± 0,42 µm; p < 0,01).

113
Die Auswertung der PBS-Gruppe zeigte wiederum keine Signifikanzen, jedoch ebenfalls eine
tendenzielle Abnahme des mittleren Somadiameters von basal nach apikal. So betrug der
Durchmesser des unteren Abschnitts 13,34 ± 1,26 µm, des mittleren Abschnitts
12,72 ± 0,84 µm wobei für den oberen Abschnitt ein Wert von 12,46 ± 0,55 µm ermittelt
wurde.
Durchschnittlicher Somadiameter
der SGZ rechter Cochleae
(ohne Therapie) [µm]
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
*
LNC FITC 1
LNC FITC 2
LNC FITC 3
LNC FITC ROLIPRAM 1
LNC FITC ROLIPRAM 2
LNC FITC ROLIPRAM 3
**
*
ROLIPRAM 1
ROLIPRAM 2
ROLIPRAM 3
Versuchsgruppe (Kontrollseite)
PBS 1
PBS 2
PBS 3
Abb. 26: Darstellung der mittleren Somadiameter und der Standardabweichung des unteren (1),
mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie). Das
Diagramm zeigt den Vergleich der einzelnen Abschnitte innerhalb der einzelnen Gruppen. Die hier
dargestellten Kontrollseiten wurden alle mit PBS behandelt. Signifikanzniveaus sind mittels Klammern
über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **).
Der Vergleich der Somadiameter der einzelnen Abschnitte der Kontrollohren untereinander
zeigte keine Signifikanzen (Abb. 27).

Durchschnittlicher Somadiameter
der SGZ rechter Cochleae
(ohne Therapie) [µm]
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
LNC FITC 1
LNC FITC ROLIPRAM 1
ROLIPRAM 1
PBS 1
LNC FITC 2
LNC FITC ROLIPRAM 2
114
ROLIPRAM 2
PBS 2
LNC FITC 3
LNC FITC ROLIPRAM 3
Versuchsgruppe (Kontrollseite)
ROLIPRAM 3
Abb. 27: Darstellung der mittleren Somadiameter und der Standardabweichung des unteren (1),
mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, rechten Cochleae (ohne Therapie). Das
Diagramm zeigt den Vergleich der jeweiligen Abschnitte zwischen den unterschiedlichen Gruppen.
Die hier dargestellten Kontrollseiten wurden alle mit PBS behandelt. Der Vergleich der jeweiligen
Abschnitte ergab untereinander keine Signifikanzen.
5.3.7 Vergleich der ermittelten Somadiameter des unteren, mittleren und oberen
Abschnitts der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie) innerhalb einer
Versuchsgruppe sowie zwischen den Versuchsgruppen
Durch den Vergleich der Somadiameter der einzelnen Abschnitte der Cochlea können
eventuell aufgetretene lokal verstärkte oder verminderte Effekte der Versuchssubstanzen
evaluiert werden (4.2.3.10). So zeigte der mit dem t-Test für abhängige Stichproben
durchgeführte Vergleich der Abschnitte innerhalb einer Gruppe den Unterschied des
Einflusses der Versuchssubstanz zwischen dem unteren, mittleren sowie oberen Abschnitt
(Abb. 28). Der mittels Varianzanalyse (analysis of variance, ANOVA) und nachfolgendem
PBS 3

115
Student-Newman-Keuls-Test durchgeführte Vergleich der einzelnen Abschnitte unter den
verschiedenen Gruppen gab Auskunft über den direkten Einfluss der Testsubstanzen auf den
Somadiameter (Abb. 29).
Der mittlere Somadiameter des unteren Abschnittes der mit LNC FITC behandelten Ohren
wies gegenüber den ermittelten Zelldurchmessern des oberen Abschnitts einen hoch
signifikant erhöhten Wert auf (14,80 ± 1,33 µm; Mittelwert ± Standardabweichung versus
13,02 ± 0,95 µm; p < 0,01). Aber auch zwischen dem mittleren Abschnitt und dem oberen
Abschnitt ist eine deutliche Signifikanz (13,92 ± 0,82 µm; p < 0,01) zu verzeichnen.
Die mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten Cochleae zeigten innerhalb der einzelnen
Abschnitte keinen signifikanten Unterschied wobei aber eine tendenzielle Abnahme des
Somadiameters vom unteren über den mittleren zum oberen Abschnitt zu erkennen war
(14,55 ± 2,43 µm; respektive 13,47 ± 1,25 µm; respektive 12,73 ± 0,93 µm).
Bei der mit Rolipram behandelten Gruppe zeigt sich ein höchst signifikanter Unterschied
(p < 0,001) zwischen dem mittleren und oberen Abschnitt (14,86 ± 0,53 µm;
13,24 ± 0,54 µm). Während der durchschnittliche Somadiameter der unteren Abteilung
(14,20 ± 0,54 µm) der Cochlea zu dem des mittleren Abschnitts keine Signifikanz zeigt, ist
die Verminderung der Zellgröße verglichen mit dem Wert des oberen Abschnittes wiederum
signifikant (p < 0,05).
Auch bei der mit PBS behandelten Gruppe zeigten sich deutliche Unterschiede zwischen den
einzelnen Abschnitten. So ist der untere Abschnitt mit dem Maximum von 14,02 ± 0,66 µm
gegenüber dem mittleren (13,16 ± 0,70 µm) sowie oberen Abschnitt (12,38 µm ± 0,41) höchst
signifikant erhöht (p < 0,001). Während zwischen dem mittleren und oberen Abschnitt auch
eine deutliche Signifikanz mit p < 0,01 vorliegt.

Durchschnittlicher
Somadiameter der SGZ linker Cochleae
(mit Therapie) [µm]
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
LNC FITC 1
**
LNC FITC 2
*
LNC FITC 3
LNC FITC ROLIPRAM 1
LNC FITC ROLIPRAM 2
LNC FITC ROLIPRAM 3
116
ROLIPRAM 1
ROLIPRAM 2
Versuchsgruppe
ROLIPRAM 3
Abb. 28: Darstellung der mittleren Somadiameter und der Standardabweichung des unteren (1),
mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie). Das Diagramm
zeigt den Vergleich der einzelnen Abschnitte innerhalb der einzelnen Gruppen. Die Cochleae wurden
mit LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und PBS behandelt. Signifikanzniveaus sind
mittels Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,05 = *; p < 0,01 = **;
p < 0,001 = ***).
Im Vergleich der einzelnen Abschnitte unter den Gruppen zeigte die Gegenüberstellung der
zweiten Abschnitte einen hoch signifikant (p < 0,01) erhöhten Somadiameter der mit
Rolipram behandelten Tiere gegenüber den mit PBS behandelten Tieren. Der Vergleich der
unteren sowie oberen Somadiameter ließ keine Signifikanzen evident werden (Abb. 29).
*
***
PBS 1
***
***
PBS 2
**
PBS 3

Durchschnittlicher
Somadiameter der SGZ linker Cochleae
(mit Therapie) [µm]
17.5
15.0
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
LNC FITC 1
LNC FITC ROLIPRAM 1
ROLIPRAM 1
PBS 1
LNC FITC 2
LNC FITC ROLIPRAM 2
117
**
ROLIPRAM 2
PBS 2
Versuchsgruppe
LNC FITC 3
LNC FITC ROLIPRAM 3
ROLIPRAM 3
PBS 3
Abb. 29: Darstellung der mittleren Somadiameter und der Standardabweichung des unteren (1),
mittleren (2) und oberen Abschnitts (3) der ertaubten, linken Cochleae (mit Therapie). Das Diagramm
zeigt den Vergleich der jeweiligen Abschnitte zwischen den unterschiedlichen Gruppen. Die Cochleae
wurden mit LNC FITC, LNC FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und PBS behandelt. Signifikanzniveaus
sind mittels Klammern über den entsprechenden Säulen dargestellt (p < 0,01 = **).
Abbildung 30 zeigt beispielhaft Anschnitte des ROSENTHALschen Kanals der
verschiedenen Versuchsgruppen.

118
1 2
3
Abb. 30: Beispielhafte Darstellung von Hämalaun-Eosin-gefärbten Anschnitten des
ROSENTHALschen Kanals von 21 Tage ertaubten Meerschweinchen. Die Einzelabbildungen 1-4
zeigen dabei ein charakteristisches Bild aus der jeweiligen Versuchsgruppe. Die Pfeile kennzeichnen
in jedem Bild eine repräsentative Spiralganglienzelle, welche als vital bewertet wurde. Um in die
Auswertung zur Dichtebestimmung mit einzufließen, war der Anschnitt des Nukleus erforderlich, damit
ein wiederholtes Zählen derselben Zelle im darauffolgenden Anschnitt ausgeschlossen werden
konnte. Die Aufnahmen zeigen ein relativ homogenes Bild zwischen allen Gruppen. Die
Zwischenräume zwischen den Zellen weisen auf eine fortgeschrittene Spiralganglienzelldegeneration
hin. Bild 1 zeigt den Anschnitt des ROSENTHALschen Kanals unter Behandlung mit LNC FITC in der
Verdünnung von 1:100 (Stammlösung 45 mg/ml LNC). Bild 2 zeigt den Einfluss von LNC FITC
ROLIPRAM in der Verdünnung von 1:100 (Stammlösung 45 mg/ml LNC, 19 µg/ml Rolipram), Bild 3
gibt ein repräsentatives Bild nach der Behandlung mit ROLIPRAM in der Verdünnung 1:100 wieder
(Stammlösung 19 µg/ml Rolipram). Bild 4 zeigt die Situation nach der Behandlung mit PBS.
Vergrößerung Bilder 1-4: 200-fach.
4

6 Diskussion
119
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss des Phosphodiesterase-Hemmers Rolipram, in
alleiniger Verabreichung sowie in einer Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination, auf das
Überleben von Spiralganglienzellen zu evaluieren. Bei diesem neuartigen Drug-Delivery-
System handelt es sich um Nanopartikel auf der Basis von Triglyceriden, in dessen Kern der
Wirkstoff zum Transport inkorporiert wurde.
Über die zunächst durchgeführten Zellkulturversuche wurde der Effekt des Roliprams, sowie
der Effekt der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination auf das Überleben, das
Neuritenauswachsverhalten sowie den Somadurchmesser von neonatal angezüchteten
Spiralganglienzellen evaluiert (MALGRANGE et al. 1996; HEGARTY et al. 1997). Der
Versuchsansatz erfolgte unter Durchführung einer Konzentrationsreihe, so dass eine
möglichst optimale Konzentration für die nachfolgenden Tierversuche ausgewählt werden
konnte und eventuell toxische Einflüsse ausgeschlossen werden konnten.
In einer weiteren In-vitro-Versuchsreihe wurden dendritische Zellen mit Rolipram sowie der
Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination behandelt. Um eine Aussage über die Freisetzung
des Arzneimittels zu treffen, wurden die behandelten Zellen mit Lipopolysacchariden zur
Sekretion von TNF-α stimuliert. Je nach Stärke der arzneimittelinduzierten Zytokinhemmung
ließ sich so eine Aussage über die Wirksamkeit des Roliprams sowie der Nanopartikel-
Arzneimittel-Kombination treffen. Aufgrund der Schlüsselstellung des TNF-α im
Entzündungsgeschehen können darüber hinaus auch Rückschlüsse auf eine
antiinflammatorische Wirksamkeit getroffen werden.
Die anschließenden In-vivo-Versuche sollten Auskunft über die spiralganglienzellprotektiven
Eigenschaften des Roliprams sowie der Nanopartikel-Rolipram-Kombination im ertaubten
Versuchstier geben. Hierbei wurde die zuvor in den Zellkulturstudien ermittelte Verdünnung
verwendet, welche sich als optimal für das Überleben der Spiralganglienzellen gezeigt hatte.
Zur Bewertung des biologischen Effekts der verwendeten Testsubstanzen wurde die
histologische Bestimmung der mittleren Spiralganglienzelldichte durchgeführt. Zusätzlich
sollte durch die Vermessung der Somadiameter der Einfluss der verwendeten Substanzen auf
die Zellgröße untersucht werden.

120
Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern dabei grundlegende Informationen über die Eignung von
Rolipram zum Erhalt von Spiralganglienzellen in Zellkultur sowie im ertaubten Organismus.
Weiterhin können Aussagen über die Effektivität des verwendeten Drug-Delivery-Systems
getroffen werden über welches durch noch durchzuführende Modifikationen ein gezielter
Transport und eine zeitlich kontrollierte Freisetzung des Arzneimittels in den Zielzellen
erreicht werden könnte.
6.1 Bewertung der In-vitro-Ergebnisse
6.1.1 Auswirkungen von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BD�F
auf das Überleben von vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen
Das signifikant beste Überleben wurde bei den mit BDNF (50 ng/ml) behandelten
Spiralganglienzellen beobachtet. Schon frühere Studien mit neonatal kultivierten
Spiralganglienzellen wiesen eine maximale Überlebensrate in der hier verwendeten BDNF-
Konzentration nach (HEGARTY et al. 1997; MARZELLA et al. 1999; WEFSTEDT 2006). In
der vorliegenden Arbeit sollte durch die Reproduktion der positiven Eigenschaften des BDNF
eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen den einzelnen Versuchen der weiteren
Testsubstanzen gesichert werden. Die mit BDNF behandelten Zellen dienten also als
Positivkontrolle, wobei die Untersuchung der einzelnen Spiralganglienzellüberlebensraten
zwischen den unterschiedlichen Konzentrationen der Testsubstanzen LNC FITC, LNC FITC
ROLIPRAM und ROLIPRAM den eigentlichen Kern dieser Versuchsreihe darstellte.
Die gewonnenen Ergebnisse zeigten, dass Rolipram in der alleinigen Applikation keinen
signifikant protektiven Effekt auf das Zellüberleben ausübt. Dennoch muss hinzugefügt
werden, dass die Betrachtung der Ergebnisse in allen verwendeten Konzentrationen ein
tendenziell erhöhtes Spiralganglienzellüberleben gegenüber der unbehandelten
Kontrollgruppe aufweist. Durch nahezu fehlende Schwankungen der ermittelten Werte kann
darüber hinaus aber keine weiterführende Aussage getroffen werden, ob eine mögliche
Erhöhung oder Erniedrigung der Arzneimittelkonzentration zu einer signifikanten
Spiralganglienzellprotektion führen könnte. Aufgrund des intrazellularen

121
Wirkungsmechanismus von Rolipram mögen die in dieser Gruppe beobachteten Ergebnisse
durch eine ungenügende Aufnahme des Arzneimittels in die Zellen erklärbar sein. So kann
sich ein neuroprotektiver Effekt nur nach Überwindung der Zellmembran entfalten. Durch die
Applikation des Arzneimittels über Lipidnanokapseln mag dieser Effekt positiv beeinflusst
werden.
Neben dem stark protektivem Effekt des BDNF zeigte sich bei der Nanopartikel-
Arzneimittel-Kombination (LNC FITC ROLIPRAM) in der Verdünnung 1:100
(Konzentration der Stammlösung: Lipidnanokapseln 45 mg/ml; 19 µg/ml Rolipram) ein
annähernd gleich gutes Spiralganglienzellüberleben. Innerhalb der Gruppe war die
Überlebensrate gegenüber den anderen verwendeten Konzentrationen (1:50; 1:200; 1:300)
signifikant erhöht, weshalb die Konzentration 1:100 für die nachfolgenden Tierversuche
ausgewählt wurde. Das geringe Überleben der Spiralganglienzellen in der 1:50 Verdünnung
kann durch die hohe Konzentration der Nanopartikel bedingt sein, welche einen negativen,
gar toxischen Einfluss auf die Zellen ausgeübt haben könnten. Durch welchen Mechanismus
diese Nanopartikel einen zytotoxischen Effekt in hohen Konzentrationen erreichen, ist bis
heute nur unzureichend geklärt. So stellte WOLF im Jahr 2009 die Vermutung an, dass die
phospholipidhaltige Hülle der Lipidnanokapseln nicht näher beschriebene Veränderungen in
der Zellmembran der Zielzellen bewirken. Dadurch ist eine Störung des Zellmetabolismus
denkbar, indem endo- und exozytotische Vorgänge beeinflusst werden. WOLF (2009) bezieht
bei dieser Überlegung die Beobachtungen von SANTINI et al. (1997) mit ein, welche
Versuche mit Polylysin-Partikeln durchgeführt haben und dabei zu ähnlichen Ergebnissen
kamen. Eine aktuelle Studie zeigt darüberhinaus eine gute Bioverträglichkeit der
Lipidnanokapseln auf Fibroblastenkulturen. Zytotoxische Effekte traten erst ab einer
Konzentration von 2,2 mg/ml auf (ZHANG et al. 2011). Die Beobachtungen der eigenen
Versuche zeigten aber bereits in der 1:50 Verdünnung (0,9 mg/ml) einen negativen Effekt auf
das Spiralganglienzellenüberleben, was für einen empfindlicheren Zellmetabolismus der
neuronalen Zellen spricht.
Die Beurteilung der Zellvitalität erfolgte in dieser Studie über die von MARZELLA et al.
(1999) beschriebene Methode, nach welcher nur Zellen als vital bezeichnet wurden, die einen
Neuritenausläufer von der Länge des dreifachen Somadurchmessers aufwiesen. Neben der
Auszählung der durch die beschriebene Methode als vital angesehenen Spiralganglienzellen

122
wäre eine zusätzliche Vitalfärbung denkbar gewesen, um den toxischen Effekt zu
untermauern. Jedoch hätte diese zusätzliche Methode keinen weiteren Erkenntnisgewinn
erbracht und war daher nicht notwendig. Verglichen mit der SGZ-Überlebensrate in den LNC
FITC Rolipram 1:50 behandelten Spiralganglienzellen erwiesen sich die Überlebensraten der
mit 1:200 und 1:300 Verdünnung behandelten Gruppen als signifikant erhöht. Die protektive
Wirkung konnte jedoch mit hoher Wahrscheinlichkeit auf Grund der geringen Konzentration
des Roliprams in diesen Verdünnungen im Vergleich zur 1:100 Verdünnung nicht voll
entfaltet werden.
Ein tendenziell ähnliches Bild zeigte sich bei den mit LNC FITC behandelten Zellen.
Ebenfalls in der 1:100 Verdünnung war ein gegenüber der unbehandelten Negativkontrolle
signifikant gesteigertes Spiralganglienzellüberleben zu verzeichnen, während die 1:50
Verdünnung wiederum den niedrigsten Wert ergab, die 1:200 Verdünnung gegenüber der
Negativkontrolle signifikant erhöht war und die 1:300 Verdünnung nur ein tendenziell
gesteigertes Spiralganglienzellüberleben zeigte. Hierfür mögen ähnliche Erklärungen wie für
die LNC FITC ROLIPRAM Gruppe gelten. Als Besonderheit ist anzumerken, dass die LNC
FITC-Nanopartikel als solche unbeladen sind, das heißt sie trugen kein Arzneimittel in sich,
welches protektiv hätte wirken können. Somit muss der auf das Spiralganglienzellüberleben
positiv wirkende Effekt durch die Nanopartikel bzw. einen ihrer Bestandteile ausgelöst
worden sein. Eine mögliche Erklärung könnte durch die mit Polyethylenglykol (PEG)
modifizierte Oberfläche der Nanopartikel gegeben werden. Hierbei dient PEG zur Maskierung
des Partikels gegenüber dem Komplementsystem des Körpers, was zu einer verminderten
Opsonisierung führt (VONARBOURG et al. 2009; KIM et al. 2010). Weiterhin dient PEG zur
kovalenten Bindung des Fluoreszenzmarkers Fluoreszein-5-isothiocyanat (FITC). LAVERTY
et al. (2004) konnten in einer Studie mit Hunden einen neuroprotektiven Effekt für dieses
Polymer nachweisen, wobei er den protektiven Effekt auf eine Stabilisierung der
Zellmembran zurückführte. Auch SHI und BORGENS konnten bereits im Jahre 1999 am
isolierten Meerschweinchenrückenmark Ähnliches feststellen. So wurde durch die
Applikation von PEG eine Aufnahme von Ethidiumbromid in das Zellinnere der zuvor durch
Kompression beschädigten neuronalen Zellen verhindert. Daraus wurde auf eine regelrechte
Versiegelung der geschädigten Zellmembranen geschlossen. KOOB et al. (2008) beschrieben
die Wirkung ebenfalls als mechanische Reparatur von beschädigten Zellmembranen im

123
spinal-cord injury-Modell. Weiterhin zeigten CHEN et al. (2009) zusätzlich einen positiven
Effekt auf die Membranstabilität von Mitochondrien. So ist es denkbar, dass PEG als
Bestandteil des Nanopartikels zu dem spiralganglienzellprotektiven Effekt der unbeladen
sowie auch der beladenen Nanopartikel geführt hat, indem die Vitalität der Zellen durch eine
länger intakt gehaltene Membran aufrecht erhalten werden konnte. Weiterhin kann aber auch
der Fluoreszenzmarker FITC als Auslöser des neuroprotektiven Effekts vermutet werden.
Eigene Zellkulturversuche konnten jedoch keinen signifikanten Unterschied auf das
Spiralganglienzellüberleben von LNC FITC-Nanopartikeln und unmarkierten LNC BLANK-
Nanopartikeln ermitteln (6.1.4.). Daher wird ein neuroprotektiver Einfluss des PEG als
ursächlich angenommen.
Der Vergleich der Überlebensraten der unbeladenen sowie der mit Rolipram inkorporierten
Nanopartikel lässt darüber hinaus einen signifikanten Unterschied in der Wirksamkeit
zugunsten der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination erkennen. Dieser Unterschied lässt
sich durch die Wirksamkeit des Roliprams erklären, da sich die Partikel nur in dieser
Charakteristik unterscheiden. Obwohl Rolipram in der alleinigen Verabreichung keinen
signifikanten Unterschied zur Negativkontrolle erbrachte, scheint es in der 1:100
Konzentration in Kombination mit den Nanopartikeln einen synergistischen Effekt auf das
Spiralganglienzellüberleben auszuüben. Denkbar wäre hierbei ein verbesserter Transport des
Arzneimittels über die Nanopartikel in das Zellinnere. Die nur tendenziellen Unterschiede der
1:200 und 1:300 Verdünnungen der arzneimittelbeladenen und -unbeladenen
Nanopartikelgruppen untereinander können durch eine zu geringe Konzentration des
Roliprams in diesen Verdünnungen erklärt werden.
Es kann zusammengefasst werden, dass Rolipram in den untersuchten Konzentrationen keine
Steigerung der Überlebensrate der in vitro angezüchteten Spiralganglienzellen hervorgerufen
hat. Dahingegen wurde in Kombination mit den Nanopartikeln ein positiver Effekt des
Roliprams auf das Spiralganglienzellüberleben beobachtet. Da Rolipram seine Wirkung im
Zytoplasma der Zelle entfaltet, kann hinsichtlich der alleinigen Applikation von Rolipram ein
gesteigerter Transport dieses Arzneimittels durch die Nanopartikel in das Zellinnere vermutet
werden.

124
6.1.2 Wirkungen von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BD�F auf
die �euritenlängen der vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen
Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigen bezüglich der Neuritenlängen ein
maximales Auswachsverhalten für die mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen. Die
Verdünnungen von 1:100 sowie 1:200 wiesen dabei einen signifikant erhöhten Wert
verglichen mit der unbehandelten Kontrollgruppe auf. Aber auch in der LNC FITC-Gruppe
war ein gesteigertes Neuritenauswachsverhalten in der Verdünnung 1:300 zu erkennen.
Rolipram zeigte als solitär gegebenes Arzneimittel neben der nicht signifikant erhöhten
Spiralganglienzellprotektivität auch in diesem Fall keinen positiven Effekt gegenüber der
Negativkontrolle, wobei aber, wie auch bei der Spiralganglienzellprotektivität, ein
tendenzieller Anstieg der Werte zu erkennen ist. So kann davon ausgegangen werden, dass es
durch die alleinige Applikation von Rolipram, eine zu geringe Aufnahme dieses Arzneimittels
in die Zellen stattgefunden hat.
BDNF zeigte in diesen Versuchen ein tendenzielles, jedoch nicht signifikant gesteigertes
Neuritenauswachsverhalten. Dieses Resultat steht entgegen der Ergebnisse von GILLESPIE
et al. (2001). Auch WEFSTAEDT konnte 2006 ein verlängertes Neuritenauswuchsverhalten
in der entsprechenden Versuchskondition nachweisen. Jedoch wurde von GILLESPIE et al.
(2001) und WEFSTAEDT (2006) zur Kultivierung der Spiralganglienzellen Dulbecco's
Modified Eagle's Medium (DMEM) verwendet, während die Spiralganglienzellen in der
eigenen Studie mit Panserin-Medium (10.2) kultiviert wurden. So ist es möglich, dass
hierdurch die Ergebnisse der Neuritenlängen beeinflusst wurden. Allerdings zeigten die
Ergebnisse eines weiteren eigenen Zellkulturversuchs (5.1.5) ebenfalls verlängerte
Neuritenlängen in der BDNF-Kondition, wobei auch hier Panserin verwendet wurde und
somit als Ursache ausgeschlossen werden kann.
Eine deutliche Verkürzung der Neuriten zeigen die mit hochkonzentrierter
Nanopartikellösung (1:50) behandelten Zellen. Sowohl die mit LNC FITC behandelten Zellen
als auch die mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen wiesen verkürzte Neuritenlängen
auf. Der Vergleich der Neuritenlängen dieser beiden Gruppen zeigt ein signifikant erhöhtes
Auswachsverhalten für die mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen. Hierbei lässt sich
der Unterschied wiederum durch das in den LNC FITC ROLIPRAM-Partikeln vorhandene

125
Rolipram erklären, welches solitär keinen signifikanten Effekt erzielt, in Kombination mit
dem Nanopartikel aber eine gesteigerte positive Wirkung auf das Neuritenauswachsverhalten
auszuüben vermag. So zeigt der Vergleich zwischen den mit LNC FITC ROLIPRAM
behandelten Zellen in den Konzentrationen 1:100 und 1:200 ein signifikant erhöhtes
Auswachsverhalten gegenüber der Negativkontrolle. Da die mit LNC FITC behandelten
Zellen in den entsprechenden Verdünnungen kein gesteigertes Neuritenauswachsverhalten zur
Negativkontrolle zeigen, kann angenommen werden, dass der positive Effekt durch das
Rolipram hervorgerufen wird, da es sich hierbei um den einzigen Unterschied zwischen den
beiden Experimentalgruppen handelt. Jedoch konnte zwischen den Neuritenlängen der
anderen Verdünnungsgruppen (1:50 und 1:300) kein signifikanter Unterschied festgestellt
werden, was gegen diese Überlegung spricht. Der grundlegende Mechanismus, welcher zu
einem gesteigerten Neuritenwachstum führt, ist letztlich nicht vollständig aufgeklärt. So soll
der Aufbau des Aktinzytoskeletts eine Schlüsselposition im Bezug auf das neuronale
Auswachsverhalten haben (GALLO u. LETOURNEAU 1999).
Für das Neurotrophins BDNF ist bekannt, dass seine Bindung an den p75-Rezeptor zu einer
Inaktivierung der guanosine triphosphate-(GTP)-ase ras homolog gene family, member A
(RhoA) führt, welche modulatorische Eigenschaften gegenüber dem Zytokinskelett aufweist.
So zeigten frühere Studien, dass eine Hemmung dieses Enzyms zu einem gesteigerten
Auswachsverhalten der Neuriten führt (YAMASHITA et al. 1999). Jedoch kann dieser
Mechanismus nicht auf die Wirkungsweise des Roliprams übertragen werden, da dieses im
Zellinneren wirkt und nicht wie BDNF an zellmembranständige Rezeptoren bindet. Neuere
Studien belegten jedoch ein verstärktes Neuritenauswachsverhalten kultivierter Motoneurone
durch die Applikation von Rolipram. Hierbei wird die cAMP-abhängige Aktivierung der
Proteinkinase A als ursächlich für ein nicht näher beschriebenes, gesteigertes
Neuritenauswachsverhalten angenommen (AGLAH et al. 2008).
Weiterhin mag die gesteigerte Vitalität der Zellen gleichzeitig zu einem positiv korrelierten
Auswachsverhalten führen. So ist anzunehmen, dass positive Effekte auf das Zellüberleben
über einen generell optimierten Zellmetabolismus auch in der Länge der Neuriten sichtbar
werden. So wurde für die LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe in der Verdünnung 1:100 die nach
der BDNF-Gruppe beste Überlebensrate sowie das längste Neuritenwachstum beobachtet,
was diese These untermauern könnte. Die vergleichsweise geringen Neuritenlängen der mit

126
BDNF behandelten Zellen mögen durch eine sehr hohe Spiralganglienzelldichte, welche bei
BDNF in allen Versuchsansätzen das Maximum bildete, beeinflusst worden sein. Die hohe
Überlebensrate könnte eine Minderversorgung von Nährstoffen nach sich gezogen haben,
weshalb es zu einer verkürzten Ausbildung der Neuriten gekommen sein könnte.
6.1.3 Effekte von L�C FITC, L�C FITC ROLIPRAM, ROLIPRAM und BD�F auf die
Somadiameter vereinzelt kultivierter Spiralganglienzellen
Durch die Vermessung der Somadiameter wurden im Vergleich zur Negativkontrolle nur in
der mit LNC FITC behandelten Zellgruppe in der Verdünnung 1:50 signifikant verkleinerte
Somadiameter festgestellt. Der verkleinerte Somadurchmesser lässt sich durch den negativen
Einfluss der hohen Nanopartikelkonzentration erklären, wobei analog in den mit LNC FITC
ROLIPRAM (1:50) behandelten Zellen kein signifikanter aber dennoch tendenziell
verringerter Somadiameter zu verzeichnen war. Hierbei ist wahrscheinlich, dass das Rolipram
den negativen Einfluss des LNC FITC kompensieren konnte und so zu einem vergleichsweise
größeren Somadurchmesser führte.
Entgegen anderen Studien zeigte auch BDNF in diesem Versuch keine signifikante
Vergrößerung des Somadiameters. SHEPHERD et al. konnten im Jahr 2005 eine
Vergrößerung des Somadiameters nach BDNF-Behandlung beobachten. Auch AGTERBERG
et al. zeigten im Jahre 2009 eine Vergrößerung der Somadiameter im Vergleich zur
Kontrollkondition. Andere Studien hingegen ermittelten nach BDNF-Therapie Somadiameter,
die denen der Versuchskontrolle ähnlich waren (MCGUINNES u. SHEPHERD 2005;
HAVENITH et al. 2011), was sich mit den Ergebnissen der eigenen Zellkulturexperimente
deckt.
Letztlich ist auch in diesem Fall der grundlegende Mechanismus, welcher zu einer
Vergrößerung des Somadurchmessers nach der Behandlung mit neurotrophen Faktoren führt,
nicht geklärt (SCHEPER et al. 2009a). Folglich ist eine endgültige Bewertung dieses
erhobenen Parameters momentan nicht möglich, dennoch erlaubt er Rückschlüsse auf die
Vitalität der Spiralganglienzellen, da eine Anschwellung oder Schrumpfung eine veränderte
biologische Funktion vermuten lässt.

127
6.1.4. Bewertung der Auswirkungen der �anopartikel-Komponenten auf das Überleben
von vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen durch die vergleichende Behandlung der
Spiralganglienzellen mit L�C FITC, L�C BLA�K sowie BD�F
In diesem Versuch sollte der in den vorhergehenden Versuchen ermittelte protektive Effekt
der unbeladenen Nanopartikel (LNC FITC) genauer untersucht werden. Hypothetisch
kommen für diesen Effekt zwei Komponenten der Lipidnanokapseln in Frage: der
Fluoreszenzmarker Fluoreszein-5-isothiocyanat (FITC) und das Polyethylenglycol (PEG).
Für diesen Zusatzversuch wurden die Auswirkungen der Arzneimittel-unbeladenen LNC
FITC-Nanopartikel mit den ebenfalls unbeladenen sowie auch nicht fluoreszenzmarkierten
LNC BLANK-Nanopartikeln auf das Spiralganglienzellüberleben verglichen. Da sich die
1:50 Verdünnung im ersten Zellkulturversuch negativ auf das Spiralganglienzellüberleben
ausgewirkt hatte, wurden jeweils nur die Verdünnungen 1:100, 1:200 und 1:300 verwendet.
Das höchste Spiralganglienzellüberleben bei der mit LNC FITC behandelten Zellgruppe
zeigte sich in der 1:100 Verdünnung. In der 1:200 sowie 1:300 Verdünnung war kein
signifikant erhöhtes Spiralganglienzellüberleben zu beobachten, wobei aber ein tendenzieller
Abwärtstrend analog zu den Ergebnissen des ersten Zellkulturversuches erkennbar war. Die
ermittelten Werte der mit LNC BLANK behandelten Zellen zeigten ein ähnliches Bild, wobei
auch hier in der 1:100 Verdünnung das signifikant höchste Spiralganglienzellüberleben zu
verzeichnen war. Das Überleben der mit 1:200 und 1:300 Konzentration behandelten Zellen
erwies sich hingegen als niedriger, aber dennoch signifikant erhöht gegenüber der Kontrolle.
Untereinander waren in Bezug auf das Spiralganglienzellüberleben keine signifikanten
Unterschiede hinsichtlich einer gesteigerten Protektion der LNC BLANK Partikel gegenüber
den mit FITC markierten Partikeln erkennbar. Tendenziell wurden durch die Verwendung der
unmarkierten Partikel sogar bessere Ergebnisse erzielt, was auf einen negativen Einfluss des
Fluoreszenzmarkers auf das Spiralganglienzellüberleben deuten kann, da sich die
Experimentalgruppen nur in dieser Eigenschaft unterschieden. So konnte in diversen Studien
die anaphylaktische Potenz des FITC nachgewiesen werden (KINSELLA u. MOONEY 1988,
GOMEZ-ULLA et al. 1991, EL HARRAR et al. 1996), was im Haptencharakter dieses
Fluoreszenzfarbstoffs begründet liegt (HVID et al. 2009). Ob sich jedoch dadurch ein
negativer Einfluss auf das Spiralganglienzellüberleben in vitro erklären ließe, ist durch die in

128
der Zellkultur fehlenden Immunzellen unwahrscheinlich. Weiterhin sind in der Literatur keine
Angaben zu einer FITC-vermittelten Toxizität zu finden.
Zusammenfassend kann vermutet werden, dass der spiralganglienzellprotektive Effekt durch
die Nanopartikel selber, bzw. durch einen ihrer Bestandteile vermittelt werden und nicht
durch den Fluoreszenzmarker FITC. Als eine mögliche Erklärung kann Polyethylenglykol
(PEG) als Bestandteil der Oberfläche der Nanopartikel in Betracht gezogen werden. So nahm
LAVERTY et al (2004) einen zellmembranstabilisierenden Effekt an, was den positiven
Einfluss auf die Spiralganglienzellen erwirkt haben könnte. Auch SHI und BORGENS (1999)
sowie KOOB et al. (2008) kamen zu entsprechenden Ergebnissen. Darüber hinaus wiesen
CHEN et al. im Jahre 2009 auch einen protektiven Effekt auf die Membranintegrität von
Mitochondrien nach (6.1.1).
6.1.5 Auswirkungen von L�C FITC, L�C BLA�K sowie BD�F auf das
�euritenauswachsverhalten sowie den Somadiameter von kultivierten
Spiralganglienzellen
In diesem Versuch zeigten sich signifikant erhöhte Neuritenlängen in allen
Versuchskonditionen im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Die Behandlung der
Zellen mit einer Verdünnung von 1:200 im Falle der LNC FITC- sowie der LNC BLANK-
Gruppe bewirkte das längste Neuritenauswachsverhalten. Im Gegensatz zu der LNC FITC-
Gruppe induzierte die Zugabe von unmarkierten Partikeln ein besseres Auswachsverhalten.
Da sich die Partikelgruppen, wie zuvor beschrieben, nur durch die Fluoreszenzmarkierung
unterschieden, besteht die Annahme, dass der negative Effekt durch den Fluoreszenzmarker
Fluoreszein-5-isothiocyanat (FITC) bedingt sein könnte. Eine ursächliche Erklärung erscheint
wie bei der Betrachtung des Spiralganglienzellüberlebens schwierig (6.1.4).
Alle anderen Verdünnungen führten zu geringeren aber dennoch signifikant erhöhten
Neuritenlängen verglichen mit der Kontrollkondition. Die Zugabe von BDNF (50 ng/ml)
verursachte ebenfalls ein signifikant erhöhtes Auswachsverhalten, wie es auch durch
GILLESPIE et al. (2001) nachgewiesen wurde.

129
Bei den ermittelten Somadiametern zeigten sich, ähnlich wie im ersten Zellversuch, bei der
vergleichenden Betrachtung, keine signifikanten Unterschiede. Von einer weiterführenden
Diskussion wird daher abgesehen und hierfür auf Kapitel 6.1.3 verwiesen.
6.1.6 Wirkung von ROLIPRAM, L�C FITC ROLIPRAM, L�C BLA�K und L�C
FITC auf die LPS-induzierte T�F-α-Sekretion dendritischer Zellen
Dieser Versuch sollte neben der Wirkung des Roliprams auf die dendritischen Zellen auch
eine Aussage zur Freisetzung des Roliprams aus der Nanopartikel-Rolipram-Kombination
liefern. Weiterhin können Rückschlüsse auf die Hemmung von entzündungsbedingten
Prozessen gezogen werden. So produzieren die dendritischen Zellen (DC) neben ihrer
Aufgabe als klassische Antigen-präsentierende Zellen, nach der Aktivierung auch eine Reihe
von Zytokinen, welche eine zentrale Rolle im Entzündungsprozess spielen. Über die
Sekretion des Zytokins TNF-α kommt es dabei zu einer Vielzahl von entzündungsrelevanten
Prozessen, wobei TNF-α im Rahmen von lokalen und systemischen Entzündungsreaktionen
eine zentrale Funktion als pleiotropes, proinflammatorisches Zytokin aufweist. Neben
weiteren Zytokinen wie IL-1α, IL-1ß und Interferon-γ stellt TNF-α einen wichtigen Mediator
der nicht-adaptiven Immunantwort dar (ABBAS et al. 2005). TNF-α dient als Signalmolekül,
um die Aktivität unterschiedlichster Immunzellen zu modulieren. Des Weiteren führt die
Sekretion von TNF-α zu einer Neubildung von Adhäsionsmolekülen wie dem Inter-Cellular
Adhesion Molecule-1 (ICAM-I), wodurch die Diapedese von Granulozyten und Monozyten
aus dem Blutstrom in die betroffenen Gewebe ermöglicht wird (WUNG et al. 2005). Letztlich
sollen diese Mechanismen zur Eliminierung der auslösenden Noxe führen, wobei parallel aber
die klassischen Entzündungssymptome auftreten. Weiterhin zeigt sich auch ein
proliferationsverstärkender Effekt auf Fibroblasten (POSTLETHWAITE u. KANG 1983).
Neben Makrophagen und Monozyten, welche als Hauptproduzenten dieses Zytokins gelten,
können auch andere Zellen, wie beispielsweise dendritische Zellen, neutrophile Granulozyten
oder Endothelzellen TNF-α freisetzen (HIGUCHI et al. 1990).
Die in dieser Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigten, dass durch die Inkubation mit Rolipram
die LPS-induzierte TNF-α-Bildung in allen verwendeten Konzentrationen (0,01 µM, 0,1 µM;

130
1 µM; 10 µM) signifikant zur Kontrollgruppe verringert werden konnte. Hierbei war ein
dosisabhängiger Abfall der TNF-α-Produktion zu erkennen. Die ermittelten Ergebnisse stehen
im Einklang mit den Resultaten von HEYSTEK und Kollegen (2003), welche in Versuchen
mit LPS-stimulierten humanen DC nach Rolipram-Behandlung ebenfalls einen
dosisabhängigen Abfall der TNF-α-Konzentration beobachten konnten. Somit konnten die in
der vorliegenden Studie ermittelten Ergebnisse neben der detektierten neuronalen
Protektivität des Roliprams auch einen Einfluss des Arzneimittels auf den Ablauf des
Entzündungsgeschehens belegen. Durch die Verringerung der TNF-α-Konzentration können
die Symptome der Entzündung abgeschwächt werden. In Kombination mit Cochlea-
Implantaten könnte Rolipram somit zu einer Verringerung oder sogar Hemmung des
entzündungsbedingten, postoperativen Bindegewebswachstums führen.
Die mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen wiesen eine insgesamt tendenziell
abfallend zu bewertende TNF-α-Konzentration auf, wobei sich im Gegensatz zu den mit
0,01 µM und 0,1 µM LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen durch die Inkubation mit
1 µM LNC FITC ROLIPRAM ein signifikanter Abfall der Zytokinproduktion verzeichnen
ließ. Die mit 10 µM Nanopartikel-Lösung (LNC FITC Rolipram, LNC BLANK und LNC
FITC) behandelten Zellen zeigten zellmorphologische Veränderungen im mikroskopischen
Bild sowie im Vitalitätstest eine deutlich verminderte Lebensfähigkeit. Dies erklärt den bei
Anwendung dieser Nanopartikelkonzentrationen ermittelten signifikant erniedrigten
Zytokinwert. Hinzuzufügen ist, dass die hohen Werte der photometrischen Auswertung bei
LNC FITC ROLIPRAM 10 µM und LNC FITC 10 µM (10.7) nicht auf eine Umfärbung des
gelblichen Methyltetrazoliums zu dem violetten Formazonfarbstoff zurückzuführen waren,
sondern durch die hohe Konzentration des an den Nanopartikel gebundenen
Fluoreszenzmarkers beeinflusst wurden. Das mikroskopische Bild zeigte abgestorbene Zellen
und Kristallbildungen, des Weiteren fand kein Farbumschlag statt, welcher das
Vorhandensein von vitalen Zellen signalisierte. Dennoch konnte gezeigt werden, dass durch
die Inkubation mit 1 µM LNC FITC ROLIPRAM genug Rolipram freigesetzt wird, um eine
signifikante Hemmung der TNF-α-Produktion zu erreichen, ohne dabei zelltoxische Effekte
auszulösen. Zudem ähnelt das Gesamtbild der mit LNC FITC ROLIPRAM behandelten
Zellen durch den dosisabhängigen Abfall der TNF-α-Konzentration stark dem Bild der mit
ROLIPRAM behandelten Zellen. Hierbei ist aber eine deutlich schwächere Wirkung zu

131
erkennen, was auf eine geringe Freisetzung des Roliprams aus den Nanopartikeln schließen
lässt.
Durch die Inkubation mit Arzneimittel-unbeladenen und unmarkierten LNC BLANK
Nanopartikeln konnte in der 1 µM Konzentration eine signifikante, wenn auch relativ geringe
inhibitorische Wirkung auf die TNF-α-Produktion erkannt werden, während die niedrigeren
Konzentrationen (0,01 µM; 0,1 µM) keinen hemmenden Effekt erzielten. Die entsprechenden
Parameter des Vitalitätstests gaben im Fall der 1 µM Konzentration keinen Hinweis auf eine
herabgesetzte Lebensfähigkeit der DC, und auch kein inkorporiertes Arzneimittel kann
ursächlich für die Hemmung der TNF-α-Produktion in Frage kommen. Als mögliche
Erklärung kann eine durch Streuung gegebene Abweichung der Messwerte nicht
ausgeschlossen werden. Trotz der statistischen Signifikanz ist die biologische Signifikanz
fraglich (etwa 16 % Inhibition im Vergleich zur Positivkontrolle). Weiterhin wurde auch für
diese Nanopartikelgruppe im Vitalitätstest ein deutlich toxischer Effekt in der 10 µM
Konzentration nachgewiesen, wodurch der hierbei gemessene signifikant erniedrigte TNF-α-
Wert erklärt werden kann.
Ein ähnliches Bild zeigt auch die Behandlung der DC mit den Arzneimittel-unbeladenen,
fluoreszenzmarkierten LNC FITC Nanopartikeln. Hierbei trat ebenfalls eine aufgrund
zytotoxischer Effekte hervorgerufene signifikante Erniedrigung der TNF-α-Konzentration in
der mit 10 µM LNC FITC behandelten Zellgruppe auf, wobei die Inkubation mit den übrigen
Konzentrationen (0,01 µM; 0,1 µM; 1 µM) keine Signifikanzen im Vergleich zu den nur mit
LPS-behandelten Zellen lieferten.
Zur Beurteilung der Wirksamkeit der Arzneimittel-Nanopartikel Kombination LNC FITC
ROLIPRAM eignet sich die gesonderte Betrachtung der in den 1 µM Konzentrationen
ermittelten TNF-α-Werte. Begründet wird dies in der Feststellung, dass die verwendeten
Nanopartikel in keiner Gruppe (LNC FITC ROLIPRAM, LNC BLANK, LNC FITC) eine
signifikante Hemmung der TNF-α-Konzentration durch die Behandlung mit den
Konzentrationen von 0,01 µM und 0,1 µM erzielten, was durch eine zu geringe Dosierung
begründet werden kann. Die ermittelten TNF-α-Werte der mit 10 µM Nanopartikellösungen
behandelten Zellen eignen sich für diesen Vergleich aufgrund der beobachteten zytotoxischen
Effekte ebenfalls nicht. In der Konzentration 1 µM konnte die ROLIPRAM-Gruppe die
signifikant beste Hemmung der TNF-α-Produktion erzielen. Die mit LNC FITC ROLIPRAM

132
behandelten Zellen zeigten ebenfalls eine deutliche Inhibierung der TNF-α-Sekretion. Diese
Wirkung kann nur durch eine Freisetzung des Roliprams aus den Partikeln erklärt werden, da
im Vergleich zu den Arzneimittel-unbeladenen Nanopartikeln (LNC BLANK, LNC FITC)
eine deutliche Erniedrigung des TNF-α-Wertes erkennbar war. Dennoch konnte die
Verwendung der LNC FITC ROLIPRAM-Nanopartikel nicht die Effizienz der ROLIPRAM-
Behandlung erreichen, obwohl die verwendete Konzentration des Roliprams in beiden
Gruppen identisch war. Daraus kann auf eine Freisetzung des Arzneimittels aus den
Nanopartikeln geschlossen werden, die nicht der Rolipramkonzentration entsprach, die als
freies Arzneimittel zu den Zellen gegeben wurde.
Die Überlegung, dass die Nanopartikel an sich eine verstärkte Stimulation der DC und in der
Folge eine erhöhte TNF-α-Sekretion erzeugen und darüber die geringere TNF-α-Inhibition im
Vergleich zur ROLIPRAM-Gruppe erklärt werden könnte, kann durch die Betrachtung der
ermittelten TNF-α-Werte der Arzneimittel-unbeladenen Nanopartikel (LNC BLANK, LNC
FITC) widerlegt werden. Die dort ermittelten TNF-α-Konzentrationen wiesen gegenüber der
unbehandelten LPS-stimulierten Kontrolle sogar tendenziell geringere Werte auf. Durch die
unbeladenen Nanopartikel wurde in den hier verwendeten Konzentrationen keine gesteigerte
Aktivität der DC festgestellt. Diese Beobachtung liefert eine wichtige Erkenntnis für den
Einsatz im lebenden Organismus, da Entzündungsprozesse gerade im Zusammenhang mit
Cochlea-Implantaten zu erheblichen Nachteilen führen. Weiterhin zeigte sich, dass die
unbeladenen Partikel keine Hemmung der TNF-α Bildung bewirkten und somit auch hier ein
Einfluss durch die Nanopartikel selbst ausgeschlossen werden kann. Eine Ausnahme bildet
der für die mit 1 µM LNC BLANK behandelten Zellen ermittelte Wert, wobei die ermittelte
Signifikanz weder durch eine herabgesetzte Vitalität der Zellen noch durch ein inkorporiertes
Arzneimittel hervorgerufen sein konnte. Dennoch weist diese Beobachtung aber gegenüber
der TNF-α-Konzentration für die mit 1 µM LNC FITC ROLIPRAM behandelten Zellen einen
hoch signifikant erhöhten Wert auf. Auch die mit 1 µM LNC BLANK behandelten Zellen
zeigten eine deutlich signifikant höhere TNF-α-Produktion. Damit zeigt sich für die LNC
FITC ROLIPRAM-Kombination eine signifikant bessere Hemmung der TNF-α-Produktion
verglichen mit den unbeladenen Nanopartikeln, wobei dieser Effekt auf eine biologisch
wirksame Freisetzung des Roliprams zurückgeführt werden kann.

133
Des Weiteren konnte über den durchgeführten Vitalitätstest gezeigt werden, dass alle zuvor
beschriebenen Effekte der Testsubstanzen auf die TNF-α-Produktion nicht durch eine
verminderte Zellvitalität beeinflusst wurden. Davon ausgenommen sind jedoch die
Beobachtungen, welche durch die 10 µM Nanopartikellösungen (LNC FITC ROLIPRAM,
LNC BLANK, LNC FITC) hervorgerufen wurden (10.7).
Die in dem Versuch mit dendritischen Zellen ermittelten Ergebnisse belegen, dass sich der
Phosphodiesterase-Inhibitor Rolipram zur Hemmung der TNF-α- Produktion eignet, wodurch
vorherige Ergebnisse unter Verwendung von humanen DC bestätigt wurden (HEYSTECK et
al. 2003). Zusätzlich bestätigen die Ergebnisse die Hypothese, dass sich Lipidnanokapseln als
Applikationssystem für diesen Arzneistoff eignen, da sie das Rolipram in einer biologisch
wirksamen Konzentration freisetzen, wenngleich die Effizienz der direkten Applikation nicht
erreicht werden konnte.
Wie eingangs dargestellt (3.4.3), wird angenommen, dass Phosphodiesterase-4-Inhibitoren die
Aktivierung des Transkriptionsfaktors nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated
B-cells (NF-κB) hemmen, indem die Phosphorylierung des nuclear factor of kappa light
polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor alpha (IκBα) durch cAMP-abhängige
Proteinkinasen verhindert wird (DEREE et al 2008). Durch die Hemmung des NF-κB wird
die Transkription von proinflammatorischen Zytokinen wie TNF-α verhindert. Aber auch eine
cAMP-induzierte Aktivierung des Transkriptionsfaktors cAMP responsive element binding
protein (CREB) wird als weitere Ursache für den antiinflammatorischen Effekt von
Phosphodiesterase-4-Hemmern zugrundegelegt. So wird eine kompetetive Hemmung des NF-
κB über die Konkurrenz zu dem Kostimulator CREB binding protein (CBP) vermutet, an
welchen auch CREB bindet (DEREE et al. 2008). Darüber hinaus spielt auch der Einfluss von
Phosphodiesterase-4-Hemmern auf das mitogen activated protein (MAP)-Kinasesystem eine
Rolle, welches zentrale Bedeutung in der Expression von Zytokinen hat (KWAK et al. 2005).

6.2 Bewertung der In-vivo-Ergebnisse
134
6.2.1 Bewertung der Auswirkungen der unterschiedlichen Testsubstanzen auf das
Überleben von Spiralganglienzellen in ertaubten Cochleae
Hinsichtlich des Vergleichs zwischen den ermittelten Spiralganglienzelldichten der linken
und rechten Cochleae ergab sich in den mit den Nanopartikeln (LNC FITC, LNC FITC
ROLIPRAM) sowie in der mit Rolipram behandelten Tiergruppe kein signifikanter
Unterschied. Nur die beidseitig mit PBS behandelten Tiere zeigten im Mittel einen signifikant
erhöhten Dichtewert der rechtsseitigen Cochleae. Bei allen Tieren wurde die linke Seite mit
der jeweiligen Testsubstanz behandelt, während rechtsseitig lediglich PBS als Kontrolle
injiziert wurde. Der Wert der Kontrollseite spiegelt die vorhandene Spiralganglienanzahl nach
21 Tagen Ertaubung wider, wobei der Unterschied zur behandelten linken Seite die
Effektivität der jeweiligen Testsubstanz auf die Erhaltung der Spiralganglienzellen erkennen
ließ. Auch im Vergleich der Spiralganglienzelldichten der linken Ohren untereinander war
kein Unterschied zwischen den Gruppen ersichtlich. Dies steht im Gegensatz zu der eingangs
formulierten Hypothese mittels Rolipram oder in Nanopartikeln inkorporiertem Rolipram eine
neuroprotektive Wirkung gegenüber einer nach initialem Haarzellverlust eintretenden
Spiralganglienzelldegeneration zu erwirken.
Die Ergebnisse der eigenen Zellversuche zeigten positive Eigenschaften der Nanopartikel-
Rolipram-Kombination LNC FITC ROLIPRAM sowie auch der Arzneimittel-unbeladenen
Nanopartikel LNC FITC auf die Überlebensrate der neuronalen Zellen und bildeten die
Grundlage der genannten Hypothese. Im In-vitro-Versuch schien die alleinige Gabe von
Rolipram zumindest zu einer tendenziellen Verbesserung der Überlebensrate zu führen. Diese
positiven, in den Zellversuchen erzielten Ergebnisse, konnten innerhalb der
Tierversuchsstudie nicht reproduziert werden.
Möglicher Grund für diese Ergebnisse kann eine zu geringe Konzentration der verwendeten
Substanzen sein. So zeigte sich im Zellversuch die stärkste protektive Wirkung der LNC
FITC- und LNC FITC ROLIPRAM-Nanopartikel bei einer Verdünnung der Stammlösung
von 1:100, in welcher 0,19 µg/ml Rolipram enthalten war. Um mögliche toxische Effekte auf
die Zellen des Innenohres auszuschließen, welche sich im Zellversuch in der 1:50

135
Verdünnung gezeigt haben, wurde die Verwendung einer höheren Konzentration im
Tiermodell vermieden. Trotzdem können die im Organismus vorherrschenden Gegebenheiten
nicht direkt mit den Beschaffenheiten in der Zellkultur verglichen werden. Vor allem durch
die Perilymphe in der Scala tympani könnte es zu einer weiteren Verdünnung gekommen
sein, was das im Zellversuch ermittelte Wirkpotenzial der Testsubstanzen verringert haben
könnte. Auch ein Abtransport der injizierten Substanzen über den Perilymphgang (Ductus
perilymphaticus), der die Scala tympani mit dem Liquorraum verbindet, könnte eine zu
geringe Konzentration der wirksamen Substanzen zur Folge gehabt haben.
Eine weitere mögliche Erklärung für die Diskrepanz der durch die Zellkultur und die
Tierversuche ermittelten Daten könnte die Verwendung unterschiedlicher Tierarten sein. So
wurden die Spiralganglienzellen der Zellkulturexperimente aus neugeborenen Ratten
gewonnen. Diese Methode ist für die hier bearbeiteten Fragestellungen etabliert und in der
Literatur vielfach beschrieben (LEFEBVRE et al. 1991, ALETSEE et al. 2000, WEFSTEDT
2006, WARNECKE et al. 2010). Für die Tierversuche wurden hingegen Meerschweinchen
verwendet, die ebenfalls als anerkanntes Modell für die Untersuchung von hypothetischen
spiralganglienzellprotektiven Substanzen verwendet wurden (KANZAKI et al. 2002,
GILLESPIE et al. 2003, YAMAGATA et al. 2004, WARNECKE et al. 2010). Zudem sind
unterschiedliche trophische Bedürfnisse sowie eine Veränderung in der Rezeptorenexpression
zwischen neonatalen und adulten Spiralganglienzellen wahrscheinlich (GILLESPIE et al.
2003), sodass die Zusammensetzung der Testsubstanzen im Organismus unter Umständen
nicht mehr adäquat gewesen sein könnte.
Eine andere Erklärung für den nicht signifikanten Unterschied zwischen behandelter und
unbehandelter Seite, mag hinsichtlich der LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe eine zu geringe
Freisetzung des Arzneimittels Rolipram gewesen sein. Im Rahmen der Versuche mit
dendritischen Zellen konnte eine Freisetzung des Arzneimittels aus den Partikeln
nachgewiesen werden, die aber geringer war als die Applikation von reinem Rolipram in der
mit den Partikeln verwendeten analogen Konzentration. Das alleinig applizierte Rolipram
erzielte hierbei eine stärkere Hemmung der TNF-α-Sekretion. Somit könnte ein auf die
Spiralganglienzellen potenziell wirksamer Effekt aufgrund einer zu geringen Dosis
unterblieben sein. Gegen diese Überlegung spricht, dass die Nanopartikel als solches auch
einen neuroprotektiven Effekt in Zellkultur gezeigt haben. Dieser ist vermutlich auf den

136
Bestandteil Polyethylenglykol (LAVERTY et al. 2004) zurückzuführen und auch bei einer
verminderten Freisetzung des Roliprams hätte ein Effekt durch die Nanopartikel selber
detektierbar sein müssen.
Letztlich spielt auch die Applikationsdauer eine wesentliche Rolle. Die Versuchsansätze der
dendritischen Zellen betrugen nur 24 Stunden. Der Zeitabstand zwischen der Behandlung der
ertaubten Tiere und dem Ende jedes In-vivo-Experiments betrug 14 Tage. Es sind keine Daten
über die intrazelluläre Freisetzungskinetik des Roliprams aus den Lipidnanokapseln bekannt,
sodass eine Aussage über eine vollständige Freisetzung des Arzneimittels nach 14 Tagen
nicht möglich ist. WOLF (2009) konnte zeigen, dass LNC FITC-Nanopartikel noch vier
Wochen nach intracochleärer Applikation in den Zellen der Cochlea nachzuweisen waren.
Die verwendeten Partikel waren in diesem Fall aber mit keinem Transportgut ausgestattet,
weshalb über einen beginnenden Abbau der Nanopartikel und einer damit einsetzenden
Freisetzung des Transportguts keine Aussagen getroffen werden konnten.
Die Verwendung von osmotischen Pumpen zur dauerhaften Applikation der verwendeten
Testsubstanzen wurde bewusst nicht gewählt. So sollte ein Vergleich zwischen der
einmaligen Applikation des alleinig gegebenen Roliprams im Vergleich zu dem einmalig, im
Nanopartikel inkorporiertem Rolipram durchgeführt werden. So wäre ein positiver Effekt
durch eine längerfristige Abgabe aus dem Nanopartikel gegensätzlich zur alleinigen
Applikation des Roliprams denkbar gewesen. Die Verwendung osmotischer Pumpen hätte
diesen Vergleich nicht zugelassen. Die einmalige Applikation der Testsubstanzen könnte
einen, den protektiven Effekt des Roliprams aufhebenden Mechanismus in Gang gesetzt
haben. GILLESPIE et al. (2003) konnten nachweisen, dass sich die Spiralganglienzelldichte
nach dem Aussetzen einer neuroprotektiven Behandlung mit BDNF bereits nach zwei
Wochen der Spiralganglienzellanzahl der über einen Zeitraum von sechs Wochen
unbehandelten Kontrollseite angepasst hat. Die Beobachtungen zeigten also eine wesentlich
beschleunigte Spiralganglienzelldegeneration der zuvor behandelten Seite. Die
zugrundeliegenden Ursachen für diesen Effekt sind letztlich nicht geklärt. So vermuten
MILLER et al. (1997) einen indirekt protektiven Effekte von BDNF über die Einwirkung auf
Bindegewebszellen. Diese werden über den neurotrophen Faktor angeregt und setzen dadurch
wiederum nicht näher beschriebene neuroprotektive Substanzen frei. Hierüber kommt es
neben der direkten Wirkung von BDNF auf die Spiralganglienzellen zu einer zusätzlichen

137
Protektion, was aufgrund einer vermehrten Dichte von Bindegewebszellen in mit BDNF
behandelten Cochleae angenommen wurde. Bei einem Therapieabbruch kommt es durch den
Verlust des direkt wirkenden BDNF sowie durch den zusätzlichen Verlust der von den
Bindegewebszellen sezernierten Faktoren zu einer deutlich gesteigerten
Spiralganglienzelldegeneration, so die Hypothese. Geht man nun davon aus, dass die in dieser
Arbeit verwendeten Testsubstanzen zunächst einen protektiven Effekt gezeigt haben, so
könnte man auf eine schnellere Degeneration der Spiralganglienzellen im Anschluss daran
schließen, da die Therapie nach der einmaligen Behandlung, wie bei GILLESPIE et al.
(2003), als beendet angesehen werden kann. Studien von AGTERBERG et al. 2009 hingegen
konnten den von GILLESPIE et al. (2003) beschriebenen Effekt nicht nachweisen. So wurde
hierbei für den Zeitraum der Studie von zwei Wochen eine anhaltende Protektion
nachgewiesen, wobei dieser Effekt laut AGTERBERG et al. (2009) möglicherweise auf eine
zweimal wöchentlich durchgeführte elektrische Stimulation zur Messung der Hörschwellen
zurückzuführen sein könnte, welche von GILLESPIE et al. (2003) nicht durchgeführt wurde.
Diese Erklärung stützt er auf Beobachtungen weiterer Studien, in denen eine
Spiralganglienzellprotektion durch wiederholte electrically evoked auditory brainstem
response (eABR)-Messungen vermutet wurde. So stellten CHIKAR et al. (2008) nach der
einmaligen Injektion von Adenoviren und dadurch vermittelter endogener BDNF-Produktion
noch nach 12 Wochen einen protektiven Effekt auf die Spiralganglienzellen fest. Hier wurden
die 14-tägig durchgeführten eABR-Messungen als auslösend diskutiert. Aber auch die
alleinige Messung von eABRs ohne zusätzliche Behandlung mit neuroprotektiven Substanzen
scheint einen positiven Effekt auf das Überleben von Spiralganglienzellen zu haben
(MITCHELL et al. 1997).
Weiterhin kann vermutet werden, dass positive Effekte der Testsubstanzen im basalen
Bereich der Cochlea denkbar wären, welche aber durch die hier zusammengefasste
Darstellung aller Cochleaabschnitte nicht zu erkennen sind. So könnten auch negative
Ergebnisse in dem mittleren und oberen Abschnitt einen eventuell positiven Effekt im basalen
Bereich der Applikation maskieren. Die Betrachtung der einzelnen Abschnitte konnte diese
Annahme jedoch nicht bestätigen (6.2.2).
Der anfangs erwähnte Unterschied zwischen der linken und rechten Seite der PBS-Gruppe
erscheint schwer erklärbar. Diese Gruppe diente als Kontrolle. Etwaige Beeinflussungen

138
zwischen linkem und rechtem Ohr, wie die Diffusion der Testsubstanzen über den
Cochlearaquädukt zur kontralateralen Seite, sollten mit Hilfe dieser Gruppe untersucht
werden. Die ermittelten Werte sollten sich aufgrund des beidseits applizierten PBS nicht
unterscheiden. Eine Erklärungsmöglichkeit für die signifikant besseren Werte der rechten
Seite könnte in der unterschiedlichen Beeinflussung der Spiralganglienzelldichten durch
intraoperativ erfolgte Traumen gegeben werden, wobei der Einfluss von äußeren
mechanischen Manipulationen auf die im Inneren des Modiolus vorhandenen Zellen fraglich
erscheint.
6.2.2 Bewertung der Auswirkungen der unterschiedlichen Testsubstanzen auf das
Überleben von Spiralganglienzellen hinsichtlich der apikalen, mittleren und basalen
Abschnitte der ertaubten Cochleae
Durch den Vergleich der Spiralganglienzelldichten in den unterschiedlichen Abschnitten der
Cochlea lässt sich eine Aussage über eine tendenziell lokal oder generell über die gesamte
Cochlea verteilte Wirksamkeit der verwendeten Substanzen treffen. So wäre die lokale
Wirksamkeit einer Behandlung hinsichtlich der Therapie vollständiger Taubheit in allen
Frequenzbereichen mittels Cochlea-Implantaten von Nachteil. Wären beispielsweise nur die
basalen Abschnitte von der Effektivität einer Behandlung beeinflusst, so könnten die mittleren
und apikalen Strukturen der Cochlea nicht mehr optimal durch ein Cochlea-Implantat genutzt
werden. Die in der Literatur angegeben Daten zur Verteilung der
Spiralganglienzelldichtewerte geben im Wesentlichen keinen signifikanten Unterschied
zwischen basalen und apikalen Anteilen wieder. Die Angaben von AGTERBERG et al.
(2008) beziehen sich dabei auf normal hörende und unbehandelte Meerschweinchen des
Stammes Dunkin Hartley. Bei ertaubten Tieren konnte ebenfalls kein Unterschied festgestellt
werden (AGTERBERG et al. 2009), was auf eine gleichmäßige Degeneration der
Spiralganglienzellen in den verschiedenen Abschnitten der Cochlea schließen lässt. Des
Weiteren konnten die Beobachtungen von YAGI et al. (2000) auch keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Abschnitten nachweisen, wobei die Meerschweinchen 4 Tage
nach der Ertaubung mit artifizieller Perilymphe (AP) behandelt wurden und der Versuch

139
4 Wochen nach der Ertaubung beendet wurde. Auch nach einer Ertaubungszeit von 48 Tagen
wurde kein signifikanter Unterschied zwischen unterer und oberer Abteilung der Cochlea
erkennbar, wobei die Tiere in diesem Fall an Tag 21 mit AP als Kontrolle zu dem dort
verwendeten GDNF behandelt wurden (SCHEPER et al. 2009a). Damit wird gezeigt, dass
sich die Dichtewerte sowohl in normal hörenden als auch in ertaubten Tieren von der basalen
bis zur apikalen Lokalisation nicht unterscheiden. Dies bedeutet, dass Unterschiede in den
ermittelten Spiralganglienzelldichten der verschiedenen Abschnitte nach Substanzapplikation
durch die Wirkung der jeweiligen Testsubstanzen hervorgerufen sein müssen. Darüber hinaus
kann damit auch auf eine dementsprechende Verteilung der Testsubstanzen geschlossen
werden.
Für die vorliegende Arbeit wurden die Dichtewerte der einzelnen Anschnitte des
Rosenthalschen Kanals in drei Abschnitte unterteilt. Hierfür wurden für den ersten Abschnitt
die Dichtewerte des unteren und oberen basalen Anschnitts gemittelt, wobei mit dem 1. und 2.
mittleren Anschnitt in gleicher Weise verfahren wurde und der 3. und 4. mittlere und apikale
Anschnitt als dritter Abschnitt zusammengefasst wurden.
Die in der vorliegenden Arbeit ermittelten Ergebnisse zeigen für die rechtsseitig miteinander
verglichenen Abschnitte innerhalb einer Gruppe für die mit LNC FITC, LNC FITC
ROLIPRAM sowie mit PBS behandelten Tiere keine signifikanten Unterschiede. Nur in der
mit Rolipram behandelten Gruppe zeigt sich kontralateral eine signifikant erhöhte
Spiralganglienzelldichte im oberen Bereich der Cochlea. Nun könne man spekulieren, dass
diese erhöhte Spiralganglienzelldichte auf eine eventuelle Wirksamkeit des Roliprams
zurückzuführen ist, da der Übertritt von unilateral cochleär applizierten Substanzen auf die
kontralaterale Seite nachgewiesen werden konnte (STÖVER et al. 1999), doch wäre ein
Effekt des Arzneimittels zunächst in den basalen Bereichen anzunehmen, da dort die höchste
Konzentration des Roliprams aufgrund der Einmündung des Ductus perilymphaticus zu
erwarten wäre.
Vergleicht man die beobachteten Dichtewerte der einzelnen Abschnitte nun untereinander, so
zeigen sich für die rechten Cochleae bei den unteren und mittleren Abschnitten keine
signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen. Nur in dem apikalen Abschnitt
waren Differenzen bezüglich eines signifikant erhöhten Dichtewertes in der Rolipram sowie
der PBS-Gruppe erkennbar. Da die PBS-Gruppe als Kontrolle dient, kann ein erhöhter Wert

140
in dieser Versuchsgruppe auf eine insgesamt negative Wirkung der Nanopartikel auf das
Spiralganglienzellüberleben schließen lassen, wobei Rolipram keinen negativen Effekt erzielt.
Aufgrund der oben beschriebenen, eher unwahrscheinlichen Diffusion des Roliprams von der
linken Seite in die oberen Abschnitte der rechten Cochlea, erscheint diese Erklärung
fragwürdig.
Auf der therapierten Seite zeigten die mit den jeweiligen Testsubstanzen behandelten
Cochleae in der LNC FITC-Gruppe signifikante Unterschiede bezüglich der ermittelten
Dichtewerte. So weist der basale und der mittlere Abschnitt eine signifikant verringerte
Dichte bezüglich des apikal gemessenen Wertes auf. Hieraus kann auf eine eventuell negative
Beeinflussung von Seiten des Nanopartikels ausgegangen werden. Vergleicht man aber die
beiden unteren Abschnitte mit den entsprechenden Werten der nur mit PBS behandelten
Tiere, so zeigt sich kein signifikanter Unterschied, was wiederum auf keinen toxischen aber
auch keinen protektiven Wert der Partikel schließen lässt. Gleiches gilt für den in der
ROLIPRAM-Gruppe ermittelten Spiralganglienzelldichtewert des oberen Abschnitts. Dieser
ist im Vergleich zum mittleren Abschnitt signifikant erhöht, kann aber im Vergleich zur PBS-
Gruppe keinen signifikanten Unterschied erkennen lassen.
Die ermittelten Daten der anderen Gruppen weisen keine signifikanten Unterschiede auf, was
auf keine toxische aber auch auf keine protektive Wirkung schließen lässt. Auch der
Vergleich der einzelnen Abschnitte untereinander zeigte keine Signifikanzen. Mögliche
Gründe für die nicht vorhandene Wirkung der LNC FITC ROLIPRAM-Nanopartikel wurden
bereits im vorigen Kapitel erörtert (6.2.1).
6.2.3 Bewertung der Auswirkung der Testsubstanzen auf den ermittelten Somadiameter
Als zweiter Parameter wurde neben der Spiralganglienzelldichte der Somadiameter der
verbliebenen Spiralganglienzellen verglichen. So zeigten eine Reihe von Beobachtungen, dass
sich der Zelldurchmesser der Spiralganglienzellen durch die Behandlung mit neurotrophen
Faktoren wie BDNF (MCGUINESS u. SHEPHERD 2005; GLÜCKERT et al. 2008) oder
GDNF (ANAND et al. 2006; ZHOU u. WU 2006) in ertaubten Cochleae vergrößert. Welcher
Mechanismus für diese Vergrößerung verantwortlich ist, bleibt momentan unklar. In

141
Anlehnung an diese Ergebnisse sollte der Vergleich der in dieser Arbeit erhobenen Daten
einen Hinweis darauf geben, ob sich die Somadiameter der linksseitig mit den Testsubstanzen
behandelten Ohren, von denen der rechtsseitig als Kontrolle mit PBS behandelten Seiten
unterscheidet. Die Gegenüberstellung der links- und rechtsseitigen Somadiameter in den
einzelnen Gruppen ergab nur in der LNC FITC- sowie ROLIPRAM-Gruppe einen signifikant
erhöhten Wert der linken Seite. Es kann angenommen werden, dass auch diese Substanzen
ähnlich wie neurotrophe Faktoren zu einer Vergrößerung des Somadiameters geführt haben.
Doch ist die Bewertung eines etwaigen Benefits oder Nachteils dieser Somavergrößerung
aufgrund der unverstandenen Prozesse nicht möglich.
Auch in Bezug auf den Somadiameter wurden die ermittelten Daten entsprechend den
Dichtewerten in drei Abschnitte unterteilt um lokal erzeugte Effekte zu ermitteln (4.2.3.10).
SHEPHERD et al. (2005) konnten für die Größe der Spiralganglienzellen ein zum Dichtewert
analoges Bild aufzeigen. So zeigen sich auch beim Vergleich der Zellgrößen zwischen den
verschiedenen Abschnitten der Cochlea keine signifikanten Unterschiede. Auch findet im
Verlauf der nach initialem Haarzellverlust einsetzenden Spiralganglienzelldegeneration eine
gleichmäßige Abnahme der Zellgröße statt (GLÜCKERT et al. 2008). Somit würden
mögliche Einflüsse der Testsubstanzen durch ermittelte Unterschiede zwischen den einzelnen
Abschnitten erkennbar. Die Daten der mit LNC FITC-Nanopartikel behandelten rechtsseitig
ermittelten Somadiameter zeigen einen signifikant größeren Somadiameter der basal
vermessenen Spiralganglienzellen im Vergleich zu den apikal beobachteten Daten. Die
Behandlung der ROLIPRAM-Gruppe lieferte ein ähnliches Bild. So könnte durch den
Übertritt dieser Substanzen durch den Perilymphatischen Gang eine Beeinträchtigung der
unteren Abschnitte der rechten Seite eingetreten sein. Die Betrachtung der anderen beiden
Gruppen weist ein tendenziell ähnliches Bild auf, wobei aber keine Signifikanzen zu erkennen
sind. Aber gerade die Ähnlichkeit zu den Werten der PBS-Gruppe machen einen Einfluss der
LNC FITC-Nanopartikel sowie des Roliprams unwahrscheinlich, vielmehr lässt sich die
Vermutung äußern, dass die unteren Abschnitte auch im normal hörenden, unbehandelten
Tier, tendenziell größere Somadiameter aufweisen. Des Weiteren spricht auch der Vergleich
der einzelnen Abschnitte unter den Gruppen gegen eine Auswirkung der Testsubstanzen auf
den Somadiameter. So ergeben sich in keinem Fall signifikante Unterschiede, wobei sich aber
ein tendenzieller Abfall der Somadiameter von basal nach apikal beobachten lässt.

142
Linksseitig zeigt sich dahingegen eine deutlichere Signifikanz zwischen den einzelnen Werten
der LNC FITC-Gruppe, was im Zusammenhang mit den rechtsseitigen Ergebnissen für einen
Einfluss der Testsubstanzen auf die Zellgröße spricht. Wiederum zeigt sich auch in der PBS-
Gruppe eine signifikant abnehmende Somagröße, wobei hier keine unterschiedliche
Auswirkung durch die Substanz zu erwarten war, was wiederum für eine normale
Größenabnahme im apikalen Bereich spricht. Die Behandlung mit Rolipram zeigt dagegen
den signifikant höchsten Wert im mittleren Abschnitt. Im basalen Bereich lassen sich jedoch
auch hier größere Zellen als im apikalen Bereich beobachten, was ebenfalls auf eine Abnahme
des Somadiameters von basal nach apikal hindeutet. Auch in der Gegenüberstellung der
einzelnen Abschnitte untereinander zeigt sich die signifikante Erhöhung des mittleren Wertes.
Da ansonsten keine signifikanten Unterschiede zu sehen sind, wird die Vermutung einer
falsch positiven Somavergrößerung angenommen.
Letztlich sind die hier ermittelten Ergebnisse der Somadiameter im Vergleich zur
Überlebensrate der Spiralganglienzellen als weniger aussagekräftig anzusehen. Es ist
anzunehmen, dass die geringen Schwankungen der beobachteten Zellgrößen kaum mit dem
Effekt einer erhöhten Zelldichte in Relation zu setzen sind.
6.3 Zusammenfassende Bewertung der durchgeführten In-vitro- und In-
vivo-Versuche
Mit dieser Arbeit sollten im Wesentlichen zwei Fragestellungen bearbeitet werden. Zum einen
wurde der neuroprotektive Einfluss von Rolipram auf Spiralganglienzellen überprüft. Zum
anderen wurde dieser Phosphodiesterase-Hemmer in Lipidnanokapseln inkorporiert, um die
Eignung dieses neuartigen Drug-Delivery-Systems zur Arzneimittelapplikation im Innenohr
zu untersuchen. Rolipram wurde zunächst auf seine neuroprotektiven Eigenschaften
gegenüber in vitro angezüchteten Spiralganglienzellen bewertet. Nach der Evaluierung der
optimalen Konzentration sollte dieser Effekt im Tiermodell mittels ertaubter
Meerschweinchen reproduziert werden. Hierbei wurde der Effekt Rolipram beladener
Lipidnanokaspeln (LNC FITC ROLIPRAM) mit der Wirkung von alleinig verabreichtem

143
Rolipram verglichen um einen eventuellen Vorteil des Arzneimitteltransports über dieses
neuartige Drug-Delivery-System zu bewerten.
Die Zellkulturversuche zeigten für Rolipram in allen verwendeten Konzentrationen
(1:50= 1:100 = 0,19 µg/ml, 1:200 = 0,095 µg/ml, 1:300 = 0,063 µg/ml) nur einen tendenziell
protektiven Effekt auf das Spiralganglienzellüberleben, während sich in der 1:100
Verdünnung der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination (LNC FITC ROLIPRAM,
0,19 µg/ml Rolipram) eine deutlich gesteigerte Spiralganglienzelldichte zeigte. Ebenso konnte
für den unbeladenen Nanopartikel (LNC FITC) ein signifikant gesteigertes
Spiralganglienzellüberleben gezeigt werden, wobei wahrscheinlich der Bestandteil
Polyethylenglykol (LAVERTY et al. 2004) für diesen Effekt verantwortlich ist. Auch der
Einfluss des Roliprams scheint in der Nanopartikel-Arzneimittel-Kombination einen
wesentlichen Einfluss auf die Spiralganglienzellprotektion zu haben. Da sich durch die direkte
Rolipramapplikation kein gesteigertes Zellüberleben nachweisen ließ, kann vermutet werden,
dass ein durch den Nanopartikel verbesserter Transport des Arzneimittels in die Zelle erreicht
wurde.
Die im Tierversuch ermittelten Spiralganglienzelldichten konnten die Ergebnisse des
Zellkulturversuchs nicht reproduzieren. Die applizierten Testsubstanzen werden durch die in
der Scala tympani vorhandene Perilymphe um einen weiteren Faktor verdünnt, wodurch die
in den Zellversuchen beobachteten Effekte nicht erreicht werden konnten. Das Volumen der
Scala tympani ist zwar bekannt, doch handelt es sich hierbei um kein statisches System
sondern um einen mit dem Liquorraum verbundenen Bereich, wobei sogar Substanzen zur
kontralateralen Seite diffundieren können (STÖVER et al. 1999). Hierdurch ist eine vorherige
Kalkulation der letztlich wirkenden Konzentration erschwert. Eine höher dosierte Applikation
birgt dabei die Risiken von zytotoxischen Effekten. Nach einer basalen Applikation der
Testsubstanzen besteht die Annahme, dass eine vergleichsweise hohe Konzentration von den
Zellen dieses Abschnitts aufgenommen wird, bevor sich die Nanopartikellösung in dem
Lumen der Scala tympani zur gewünschten Konzentration verdünnt hätte. Dennoch wäre die
Untersuchung der Applikation höherer Konzentrationen ein denkbarer Ansatz, um den
positiven Effekt der Zellkulturversuche im Tiermodell zu reproduzieren.
Ein weiterer Zellkulturversuch zeigte unter der Verwendung von dendritischen Zellen eine
vergleichsweise geringe Freisetzung des Roliprams aus den Nanopartikeln. Auch diese

144
Beobachtung lässt eine höher dosierte Applikation im Tiermodell sinnvoll erscheinen, um die
geringe Freisetzung zu kompensieren.
Die Ergebnisse belegen, dass eine Modifikation der Nanopartikel hinsichtlich der Freisetzung
ihres Ladungsgutes anzustreben ist. Eine weitere Optimierung durch die Steigerung der
Ladungsmenge wäre ebenfalls vorteilhaft. Dadurch könnte eine höhere Konzentration von
Arzneimitteln transportiert werden, um gleichzeitig toxische Effekte der Partikel zu
minimieren. Letztlich soll über eine Modifikation der Nanopartikeloberfläche mittels
spezieller Liganden eine Gewebespezifität erreicht werden, die einen Wirkstofftransport zu
dem jeweiligen zu therapierenden Zelltyp ermöglichen soll.
Diese Arbeit liefert wertvolle Grundlageninformationen, die zur Optimierung dieses viel
versprechenden Drug-Carrier-Sytems beitragen können. Weiterhin ist durch das verwendete
Arzneimittel Rolipram neben neuroprotektiven Eigenschaften auch ein positiver Effekt
hinsichtlich eines postoperativ einsetzenden Bindegewebswachstums zu erwarten. Hierdurch
könnte bei Cochlea-Implantaten die Interaktion zwischen Nerven und Elektrode effizienter
genutzt werden. Letztlich sind neben der kombinierten Therapie mit Cochlea-Implantaten
nicht nur Einsatzgebiete im Innenohr denkbar. Auch in anderen Organsystemen könnten die
Vorteile von Nanopartikeln verstärkt genutzt werden. So soll ein gezielter Transport der
Arzneimittel erreicht werden, wobei das Ladungsgut solange geschützt ist, bis es die
Zielzellen erreicht hat und damit zu einer erheblichen Reduktion von Nebenwirkungen führen
kann.

7 Zusammenfassung
Hartwig Meyer (2011):
145
„Untersuchungen zum biologischen Effekt von Rolipram sowie in Lipidnanokapseln
eingeschlossenem Rolipram auf Spiralganglienzellen und dendritische Zellen in vitro
und Spiralganglienzellen in vivo“
Sensorineuraler Hörverlust stellt ein weit verbreitetes Krankheitsbild in den industrialisierten
Nationen dar. Mittlerweile ist es möglich, betroffenen Patienten mittels eines Cochlea-
Implantates ein erneutes Hörempfinden zu verschaffen, was Ihnen die sprachliche
Kommunikation mit der Umwelt ermöglicht und ihnen neben einer verbesserten
gesellschaftlichen Integration eine wesentlich gesteigerte Lebensqualität bietet. Neben dem
Schutz neuronaler Spiralganglienzellen ist ein möglichst enger Nerv-Elektrodenkontakt
anzustreben um die funktionelle Effizienz der Cochlea-Implantate und damit den Grad des
Therapieerfolges zu erhöhen.
In dieser Arbeit wurde der Phosphodiesterase-Hemmer Rolipram auf seine
spiralganglienzellprotektiven Eigenschaften getestet. Des Weiteren wurde der Einfluss dieses
Arzneimittels auf die Spiralganglienzellen über die Applikation mittels eines neuartigen
Drug-Delivery-Systems untersucht. Hierfür wurde das Rolipram in Lipidnanokapseln
inkorporiert, was einen optimierten Transport in die Zelle ermöglichen sollte. Zunächst
wurden Zellkulturversuche mit vereinzelt kultivierten Spiralganglienzellen 3-5 Tage alter
Sprague-Dawley-Ratten durchgeführt. Unter Einfluss der Testsubstanzen wurden diese Zellen
für 48 Stunden kultiviert und anschließend über eine immunozytochemische Markierung
quantitativ bewertet. Hintergrund dieses Versuchs war neben der Beurteilung der durch
Rolipram und der Arzneimittel-Nanopartikel-Kombination erreichten Spiralganglien-
zellprotektivität die Ermittlung einer optimalen Wirkstoffkonzentration für die anschließend
durchgeführten In-vivo-Versuche. Alle Testsubstanzen wurden in den Verdünnungen 1:50,
1:100, 1:200 und 1:300 der Stammlösung (Lipidnanokapseln 45 mg /ml; 19 µg/ml Rolipram)
im Hinblick auf das Spiralganglienzellüberleben untersucht. Die ermittelten Ergebnisse

146
belegten kein signifikant erhöhtes Spiralganglienzellüberleben für das alleinig applizierte
Rolipram. Die Kombination mit den Nanopartikeln zeigte hingegen einen stark positiven
Effekt auf die Überlebensrate der kultivierten Spiralganglienzellen in der Verdünnung 1:100,
welche auch in den anschließenden Tierversuchen verwendet wurde. Auch die unbeladenen
Nanopartikel führten in der 1:100 Verdünnung zu einer gesteigerten Spiralganglienzelldichte,
was auf die neuroprotektiven Eigenschaften des Partikelbestandteils Polyethylenglykol
zurückgeführt werden kann. Der Vergleich zwischen diesen beiden Gruppen lässt darüber
hinaus einen Einfluss des im Nanopartikel inkorporierten Roliprams erkennen, da im
Vergleich die Arzneimittel-Nanopartikel-Kombination ein signifikant höheres Zellüberleben
aufzeigte.
Zusätzlich wurde ein Zellkulturversuch mit dendritischen Zellen (DC), welche nach einer
Aktivierung mit Lipopolysacchariden TNF-α produzieren, durchgeführt. Die Hemmung der
Zytokinproduktion ließ Rückschlüsse auf die Freisetzung des zu testenden Arzneimittels zu.
So konnte eine Aussage über die Freisetzung und die Effektivität der Arzneimittel-
Nanopartikel-Kombination im Vergleich zu dem direkt applizierten Rolipram getroffen
werden. Darüber hinaus geben diese Versuche Auskunft auf die entzündungshemmenden
Eigenschaften des Roliprams, da dendritische Zellen eine Schlüsselrolle im
Entzündungsgeschehen einnehmen. Für diese Versuchsreihe wurden DC aus dem
Knochenmark von BALB/c-Mäusen gewonnen und nach einer neuntägigen Kultivierung mit
den Testsubstanzen behandelt. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde erfolgte die
Zugabe von Lipopolysacchariden, worüber die Zellen zur Maturation und TNF-α-Sekretion
angeregt wurden. Die nach 24 Stunden per ELISA ermittelten Ergebnisse belegen eine
konzentrationsabhängige Hemmung der Zytokinproduktion für das direkt applizierte
Rolipram (1 µM), was auf einen entzündungshemmenden Effekt schließen lässt und Vorteile
gegenüber dem Auftreten fremdkörperbedingter Bindegewebsbildung im Zusammenhang mit
Cochlea-Implantaten bietet. Die Nanopartikel-Rolipram-Kombination bewirkte ebenfalls eine
signifikant gehemmte Zytokinproduktion in der Konzentration von 1 µM, wobei diese im
Vergleich zum direkt applizierten Rolipram aber wesentlich schwächer war. Diese
Beobachtungen lassen auf eine, wenn auch geringe, Freisetzung des Roliprams aus den
Nanopartikeln schließen, da die Applikation von purem Rolipram in den gleichen
Konzentrationen eine stärkere TNF-α-Hemmung erzielte.

147
Für die In-vivo-Studien wurden unpigmentiere Meerschweinchen des Typs Dunkin Hartley
verwendet. In die Studie wurden nur Tiere einbezogen, welche ein physiologisch normales
Hörvermögen zeigten, welches am Tag null der Versuche durch eine aABR-Messung
verifiziert wurde. Am gleichen Tag erfolgte die systemische Ertaubung der Tiere mit einer
kombinierten Gabe von Kanamycin und Furosemid, welche durch eine wiederholte aABR-
Messung an Tag sieben kontrolliert wurde. Die Testsubstanzen wurden im Anschluss über
eine Cochleostomie zu je 5 µl in die Scala tympani der jeweils linken Ohren eingebracht,
wohingegen rechtsseitig, zur Kontrolle, nur PBS injiziert wurde. Nach zwei weiteren Wochen
wurden die Cochleae gewonnen. Durch die histologische Aufarbeitung konnte der Einfluss
der Testsubstanzen auf die ermittelten Spiralganglienzelldichten ausgewertet werden. Hierbei
wurden die im Zellversuch ermittelten Ergebnisse nicht reproduziert, da die Ergebnisse
keinen spiralgangliezellprotektiven Effekt erkennen ließen. Als Hauptursache hierfür wird
eine zu geringe Konzentration der Testsubstanzen angenommen. Durch die in der Cochlea
vorhandenen Flüssigkeitsvolumina kommt es zu einer Verdünnung der injizierten
Testsubstanz, welche im Voraus nur schwer kalkulierbar ist.
Zusammenfassend zeigten die In-vitro-Studien vielversprechende Ergebnisse. Diese könnten
möglicherweise durch eine Modifikation der Tierversuche auch in vivo erfolgreich
reproduziert werden. So wäre die Durchführung von tierexperimentellen Studien unter der
Verwendung von höheren Konzentrationen oder kontinuierlichen Applikationsformen, wie
osmotischen Pumpen, denkbar.
Die mit dieser Arbeit gewonnenen Grundlageninformationen liefern wertvolle Anhaltspunkte
für eine weitere Optimierung dieses viel versprechenden Drug-Delivery-Sytems. So wäre
neben einer verbesserten Freisetzung auch eine höhere Transportkapazität wünschenswert.
Letztlich soll durch die Modifikation der Partikeloberfläche eine Gewebespezifität erreicht
werden, wodurch ein gezielter Einsatz der in den Nanopartikeln inkorporierten Substanzen
bewirkt werden könnte.

8 Summary
Hartwig Meyer (2011):
148
“Investigations concerning the biological effect of rolipram and in lipid nanocapsules
encapsulated rolipram on spiral ganglion cells and dendritic cells in vitro and spiral
ganglion cells in vivo”
Sensorineural hearing loss is a widespread disease in industrialized nations. The treatment of
deaf patients with cochlear implants gains a renewed sense of hearing, allowing linguistic
communication with the environment, which leads to a better social integration and increases
quality of life. For the optimal function of cochlear implants, spiral ganglion cell protection
and a close nerve-electrode contact is desirable.
In this study, the phosphodiesterase inhibitor rolipram was tested on its efficiency to protect
spiral ganglion cells. Moreover, the effect of this drug was investigated by application of a
novel drug-delivery system. For this purpose, rolipram was incorporated in lipidic nano-
capsule nanoparticles, which leads to an optimized transport into the cell by releasing the drug
only inside.
First, in-vitro-experiments with isolated cultured spiral ganglion cells of 3-5 days old Sprague
Dawley rats were performed. Under the influence of the test substances, these cells were
cultured for 48 hours and then evaluated quantitatively by a immunocytochemical marker.
Reasons for this experiment were the evaluation of the neuroprotecive properties of rolipram
and the drug-nanoparticle combination as well as the determination of an optimal drug
concentration for the subsequently performed in-vivo-experiments. For all test substances
dilutions of 1:50, 1:100, 1:200 and 1:300 of stock solution (lipid nanocapsules 45 mg / ml, 19
mg / ml rolipram) were examined on the spiral ganglion cell survival. The calculated results
showed no significantly increased spiral ganglion cell survival for the pure administered
rolipram. The combination with the nanoparticles was found to have a strong positive effect
on the survival of cultured spiral ganglion cells in the dilution of 1:100, which was used in
subsequent animal experiments. The unloaded nanoparticles in the 1:100 dilution showed an
increased spiral ganglion cell survival as well, which may be caused by the neuroprotective

149
properties of the particle component polyethylene glycol. The comparison between these two
groups also reveals an effect of rolipram incorporated in the nanoparticles. Compared with the
unloaded nanoparticles the drug-nanoparticle-combination led to a significantly higher cell
survival.
In addition, a cell culture experiment with dendritic cells (DC) was performed to evaluate the
effectiveness of the TNF-α inhibition of the drug-nanoparticle combination compared to the
directly administered rolipram. Furthermore, these experiments give information on the anti-
inflammatory properties of rolipram, since dendritic cells play a key role in inflammatory
processes. For these experiments bone marrow derived DC of BALB/c mice were treated after
a 9-day cultivation with the test substances. Following an incubation period of one hour, DC
were stimulated by the addition of lipopolysaccharides to obtain maturation and TNF-α
secretion. The following day, ELISA obtained results showed a concentration-dependent
inhibition of cytokine production for the directly administered rolipram, suggesting an anti-
inflammatory effect, offering advantages over the occurrence of foreign body-related
connective tissue growth associated with cochlear implants. The drug-rolipram-combination
also showed a significantly inhibited cytokine production at a concentration of 1 µM. But
compared to the directly administered rolipram this effect was less pronounced. These
observations suggest a reduced release of rolipram from the nanoparticles, hence pure
administered rolipram showed higher TNF-α-inhibition in the same concentrations.
For the in-vivo-studies unpigmented Dunkin Hartley guinea pigs were used. In the study, only
animals were included, which showed a physiologically normal hearing, which was verified
on day 0 of experiments by aABR measurement. On the same day, the animals were
systemically deafened with a combined administration of kanamycin and furosemide, which
was controlled by repeated aABR measurement on day seven. The test substances were then
injected by cochleostomy. A volume of 5 µl was applied in the scala tympani of the left ears,
while the right control side was treated PBS. After two more weeks, the cochleae were
harvested. The influence of the test substances was evaluated on the determined spiral
ganglion cell densities. The experimental results obtained in the in-vitro-studies has not been
reproduced, no spiral ganglion cell protection was evident. The reasons for this might be
caused by an insufficient concentration of the test substances. Due to the cochlear fluid
volumes a further dilution occurs, which is difficult to calculate in advance.

150
In summary, the in-vitro-studies showed promising results, which could possibly be
reproduced by a modification of the animal experiments by using higher concentrations or
continuous application forms, e. g. by means of osmotic pumps.
The collected data provides basic information for further optimization of this promising drug-
delivery system. In addition to an improved release a higher transport capacity would be
desirable. Finally, further modifications of the particle surface should achieve tissue
specificity, which leads to a targeted application of the incorporated substances.

9 Literaturverzeichnis
151
ABBAS, A. K., A. H. LICHTMANN u. J. S. POBER (2005):
Cellular and Molecular Immunology.
5 th Edition, W.B. Saunders Company, Philadelphia, Pennsylvania, USA
ABDEL-MOTTALEB, M. M., D. NEUMANN u. A. LAMPRECHT (2010):
In vitro drug release mechanism from lipid nanocapsules (LNC).
Int J Pharm 390 (2), 208 - 213
ANAND, U., W. R. OTTO, M. A. CASULA, N. C. DAY, J. B. DAVIS, C. BOUNTRA, R.
BIRCH u. P. ANAND (2006):
The effect of neurotrophic factors on morphology, TRPV1 expression and capsaicin responses
of cultured human DRG sensory neurons.
Neurosc Lett 399, 51 - 56
AGLAH, C., T. GORDON u. E. I. POSSE DE CHAVES (2008):
cAMP promotes neurite outgrowth and extension through protein kinase A but independently
of Erk activation in cultured rat motoneurons.
Neuropharmacology 55 (1), 8 - 17
AGTERBERG, M. J. H., H. VERSNEL, J. C. M. J. DE GROT, G. F. SMOORENBURG, F.
W. ALBERS u. S. F. KLIS (2008):
Morphological changes in spiral ganglion cells after intracochleär application of brain-derived
neurotrophic factor in deafened guinea pigs.
Hear Res 244 (1-2), 25 - 34
AGTERBERG, M. J. H., H. VERSNEL, L. M. VAN DIJK, J. C. M. J. DE GROT u. S. F. L.
KLIS (2009):
Enhenced survival of spiral ganglion cells after cessation of treatment with brain-derived
neurotrophic factor in deafened guinea pigs.
JARO 10, 355 - 367
ALETSEE, C., C. VOLTER, D. BRORS, A. F. RYAN u. S. DAZERT (2000):
Die Wirkung von Fibroblastenwachstumsfaktor-1 (FGF-1) auf Spiralganglienzellen der
Säugetiercochlea.
HNO 48, 457 - 461
ALEXIS, F., E. PRIDGEN, L. K. MOLNAR u. O. C. FAROKHZAD (2008):
Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.
Mol Pharm 5 (4), 505 - 515
ALLEN, J. B. (1980):
Cochlear micromechanics - a physical model of transduction.
J Acoust Soc Am 68, 1660 – 1670

152
ALTSCHULER, R. A., Y. CHO, J. YLIKOSKI, U. PIRVOLA, E. MAGAL u. J. M. MILLER
(1999):
Rescue and regrowth of sensory nerves following deafferentation by neurotrophic factors.
Ann. N. Y. Acad. Sci. 884, 305 - 311
BANERJEE, A. u. L. S. PARNES (2004):
The biology of intratympanic drug administration and pharmacodynamics of round window
drug absorption.
Otolaryngol Clin North Am 37, 1035 - 1051
BARAD, M., R. BOURTCHOULADZE, D. G. WINDER, H. GOLAN u. E. KANDEL
(1998):
Rolipram, a type IV-specific phosphodiesterase inhibitor, facilitates the establishment of longlasting
long-term potentiation and improves memory.
Proc Natl Acad Sci U S A 95 (25), 15020 - 15025
BARRON, L. G., K. B. MEYER u. F. C. SZOKA (1998):
Effects of complement depletion on the pharmacokinetics and gene delivery mediated by
cationic lipid-DNA complexes.
Hum Gene Ther 9 (3), 315 - 323
BEDUNEAU A., F. HINDRE, A. CLAVREUL, J. C. LEROUX, P. SAULNIER, u. J. P.
BENOIT (2008):
Brain targeting using novel lipid nanovectors.
J Control Release 126 (1), 44 - 49
BEDUNEAU, A., P. SAULNIER, N. ANTON, F. HINDRE, C. PASSIRANI, H.
RAJERISON, N. NOIRET u. J. P. BENOIT (2006):
Pegylated nanocapsules produced by an organic solvent-free method: Evaluation of their
stealth properties.
Pharm Res 23, 2190 - 2199
BICHLER, E. (1984):
Some morphological features of neurons in the rat spinal ganglion.
Arch Otorhinolaryngol 240, 243 - 248
BLOCK, F., W. SCHMIDT, M. NOLDEN-KOCH u. M. SCHWARZ (2001):
Rolipram reduces excitotoxic neuronal damage.
Neuroreport 12 (7), 1507 - 1511.
BOENNINGHAUS, H.-G. u. T. LENARZ (2007):
Hals-Nasen-Ohrenheilkunde.
Springer-Verlag, Berlin
BOSWELL-SMITH, V., D. SPINA u. C. PAGE (2006):
Phosphodiesterase inhibitors.
Br J Pharmacol 147 (Suppl 1), 252 - 257

153
BRADLEY, J, P. BIRD, P. MONTEATH u. J. E. WELLS (2010):
Improved speech discrimination after cochlear implantation in the southern cochlear implant
adult programme.
N Z Med J 27 (1321), 34 - 44
BROWN, J. N., J. M. MILLER, R. A. ALTSCHULER u. A. L. NUTTALL (1993):
Osmotic pump implant for chronic infusion of drugs into the inner ear.
Hear Res 70, 167 - 72
CHEN, H., E. QUICK, G. LEUNG, K. HAMANN, Y. FU, J. X. CHENG u. R. SHI (2009):
Polyethylene glycol protects injured neuronal mitochondria.
Pathobiology, 76(3), 117 - 128
CHIKAR, J. A., D. J. COLESA, D. L. SWIDERSKI, A. DI POLO, Y. RAPHAEL u. B. E.
PFINGST (2008):
Over-expression of BDNF by adenovirus with concurrent electrical stimulation improves
cochlear implant thresholds and survival of auditory neurons.
Hear Res 245 (1-2), 24 - 34
COLLINS, P. G. (2000):
Nanotubes for electronics.
Sci Am 283(6), 62 - 69
COOPER, G. u. A. L. SCHILLER (1975):
Anatomy of the guinea pig.
Harvard Univ. Press, Cambridge, Mass.
DAZERT, S., D. KIM, L. LUO, C. ALETSEE, S. GARFUNKEL, T. MACIAG, A. BAIRD u.
A. F. RYAN (1998):
Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion
neurite targeting in vitro.
J Cell Physiol 177, 123 - 129
DE MARCH, Z., C. GIAMPA, S. PATASSINI, A. MARTORANA, G. BERNARDI u. F. R.
FUSCO (2007):
Beneficial effects of rolipram in a quinolinic acid model of striatal excitotoxicity.
Neurobiol Dis 25 (2), 266 - 73
DEREE, J., J. O. MARTINS, H. MELBOSTAD, W. H. LOOMIS u. R. COIMBRA (2008):
Insights into the regulation of TNF-α production in human mononuclear cells: the effects of
non-specific phosphodiesterase inhibition.
Clinics 63 (3), 321 - 328.
DODSON, H. C. (1997):
Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion
with aminoglycosides.
J Neurocytol 26, 541 - 556

154
DUAN, M., F. VENAIL, N. SPENCER u. M. MEZZINA (2004):
Treatment of peripheral sensorineural hearing loss: gene therapy.
Gene Ther 11 Suppl 1, 51 - 56
EL HARRAR, N., B. IDALI, S. MOUTAOUAKKIL, M. EL BELHADJI, K. ZAGHLOUL,
A. AMRAOUI, u. M. BENAGUIDA (1996):
[Anaphylactic shock caused by application of fluorescein on the ocular conjunctiva].
Presse Med 25 (32), 1546 - 1547
ENGELHARDT, W. V. u. G. BREVES (2004):
Physiologie der Haustiere.
Enke im Hippokrates Verlag GmbH, Stuttgart
FAY, R. R. (1988):
Hearing in Vertebrates: a psychophysics databook.
Hill-Fay Verlag, Winnetka, Il., USA
FERTEL, R. u. B. WEISS (1976):
Properties and drug responsiveness of cyclic nucleotide phosphodiesterases of rat lung.
Mol Pharmacol 12, 678 - 687
FORTH W., D. HENSCHLER, W. RUMMEL (2002):
Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie.
Urban & Fischer Verlag , München
FUHRMANN, M., H. U. JAHN, J, SEYBOLD, C. NEUROHR, P. J. BARNES, S.
HIPPENSTIEL, H. J. KRÄMER u. N. SUTTORP (1999):
Identification and function of cyclic nucleotide phosphodiesterase isoenzymes in airway
epitheliail cells.
Am J Respir Cell Mol Biol 20, 292 - 302
GALLO, G. u. P. C. LETOURNEAU (1999):
Axon guidance: a balance of signals sets axons on the right track.
Curr Biol 9 (13), 490 - 492
GAMBLE E., D. C. GROOTENDORST, C. E. BRIGHTLING, S. TROY, Y. QIU, J. ZHU,
D. PARKER, D. MARTIN, S. MAJADUMAR, A. M. VIGNOLA, C. KROEGEL, F.
MORELL, T. T. HANSEL, S. I. RENNARD, C. COMPTON, O. AMIT, T. TAT, J.
EDELSON, I. D. PAVORD, K. F. RABE, N. C. BRNES u. P. K. JEFFERY (2003):
Antiinflammatory effects of the Phosphodiesterase-4-inhibitor Cilomilast (Ariflo) in chronic
obstructive pulmonary disease.
Am J Respir Crit Care Med, 168, 976 - 982
GANTZ, B. J., G. G. WOODWORTH, J. F. KNUTSON, P. J. ABBAS u. R. S. TYLER
(1993):
Multivariate predictors of audiological success with multichannel cochlear implants.
Ann Otol Rhinol Laryngol 102, 909 - 916

155
GE, X., R. L. JACKSON, J. LIU, E. A. HARPER, M. E. HOFFER, R. A. WESSEL, K. J.
DORMER, R. D. KOPKE u. B. J. BALOUGH (2007):
Distribution of PLGA Nanoparticles in chinchilla cochleae.
Otolaryngol Head Neck Surg 137, 619 - 623
GEIGY, C. A., S. HEID, F. STEFFEN, K. DANIELSON, A. JAGGY u. C. GAILLARD
(2007):
does pleiotropic gene explain deafness and blue irises in white cats?
Vet J 173, 548 - 553
GILLESPIE, L. N., G. M. CLARK, P. F. BARTLETT u. P. L. MARZELLA (2001):
LIF is more potent than BDNF in promoting neurite outgrowth of mammalian auditory
neurons in vitro.
Neuroreport 12, 275 - 279
GILLESPIE, L. N., G. M. CLARK, P. F. BARTLETT u. P. L. MARZELLA (2003):
BDNF-induced survival of auditory neurons in vivo: Cessation of treatment leads to
accelerated loss of survival effects.
J Neurosci Res 71, 785 - 790
GILLESPIE, L. N., G. M. CLARK u. P. L. MARZELLA (2004):
Delayed neurotrophin treatment supports auditory neuron survival in deaf guinea pigs.
Neuroreport 15, 1121 - 1125
GILLESPIE, L. N., u. R. K. SHEPHERD (2005):
Clinical application of neurotrophic factors: the potential for primary auditory neuron
protection.
Eur J Neurosci 22, 2123 - 2133
GLÜCKERT, R., M. BITSCHE, J. M. MILLER, Y. ZHU, D. M. PRIESKORN, R. A.
ALTSCHULER u. A. SCHROTT-FISCHER (2008):
Deafferentation-associated changes in afferent and efferent processes in the guinea pig
chochlea and afferent regeneration with chronic intrascalar brain-derived neurotrophic factor
and acidic fibroblast growth factor.
J Comp Neurol 507, 1602 - 1621
GOMEZ-ULLA, F., C. GUTIERREZ u. I. SEOANE (1991) :
Severe anaphylactic reaction to orally administered fluorescein.
Am J Ophthalmol 112 (1), 94
GUZMAN-LENIS, M. S., X. NAVARRO u. C. CASAS (2009):
Drug screening of neuroprotective agents on an organotypic-based model of spinal cord
excitotoxic damage.
Restor Neurol Neurosci 27 (4), 335 - 49

156
HAN, J. J., A. N. MHATRE, M. WAREING, R. PETTIS, W. Q. GAO, R. N. ZUFFEREY, D.
TRONO u. A. K. LALWANI (1999):
Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer
vector.
Hum Gene Ther 10, 1867 - 1873
HANNILA, S. S. u. M. T. FILBIN (2008):
The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury.
Exp Neurol 209 (2), 321 - 332
HARDINGHAM, G. E., Y. FUKUNAGA u. H. BADING (2002):
Extrasynaptic NMDARs oppose synaptic NMDARs by triggering CREB shut-off and cell
death pathways.
Nat Neurosci 5 (5), 405 - 414
HARISINGHANI, M. G., J, BARENTSZ, P. F. HAHN, W. M. DESERNO, S.
TABATABAEI, C. H. VAN DE KAA, J. DE LA ROSETTE u.R. WEISSLEDER (2003):
Noninvasive detection of clinically occult lymph-node metastases in prostate cancer.
N Engl J Med 348, 2491 - 2499
HARTNICK, C. J., H. STAECKER, B. MALGRANGE, P. P. LEFEBVRE, W. LIU, G.
MOONEN u. T. R. VAN DE WATER (1996):
Neurotrophic effects of BDNF and CNTF, alone and in combination, on postnatal day 5 rat
acoustic ganglion neurons.
J. Neurobiol. 30, 246 - 254
HARTSHORN, D. O., J. M. MILLER u. R. A. ALTSCHULER (1991):
Protective effect of electrical stimulation in the deafened guinea pig cochlea.
Otolaryngol Head Neck Surg 104, 311 - 319
HAVENITH, S., H. VERSNEL, M. J. AGTERBERG, J. C. DE GROOT, R. J. SEDEE, W.
GROLMAN u. S. F. KLIS (2011):
Spiral ganglion cell survival after round window membrane application of brain-derived
neurotrophic factor using gelfoam as carrier.
Hear Res 272 (1-2), 168 - 177
HEGARTY, J. L., A. R. KAY u. S. H. GREEN (1997):
Trophic support of cultured spiral ganglion neurons by depolarization exceeds and is additive
with that by neurotrophins or cAMP and requires elevation of [Ca2+]i within a set range.
J Neurosci 17, 1959 - 1970
HELMS, J., u. J. MÜLLER (1999):
Selection of a cochlear implant and results of implantation.
Laryngorhinootologie 78, 12 – 13

157
HEURTAULT, B., P. SAULNIER, B. PECH, J. E. PROUST u. J. P. BENOIT (2002):
A novel phase inversion-based process for the preparation of lipid nanocarriers.
Pharm Res 19, 875 - 880
HEMPSTEAD, B. L. (2006):
Dissecting the diverse actions of pro- and mature neurotrophins.
Curr Alzheimer Res, 3 (1), 19 - 24
HEURTAULT, B., B. FRISCH u. F. PONS (2010):
Liposomes as delivery systems for nasal vaccination: strategies and outcomes.
Expert Opin Drug Deliv 7 (7), 829 - 844
HEYSTEK, H. C., A. THIERRY, P. SOULARD u. C. MOULON (2003):
Phosphodiesterase 4 inhibitors reduce human dendritic cell inflammatory cytokine production
and Th1-polarizing capacity.
Int Immunol 15, 827 - 835
HIGUCHI, M., N. HIGASHI, H. TAKI u. T. OSAWA (1990):
Cytolytic mechanisms of activated macrophages. Tumor necrosis factor and L-argininedependent
mechanisms act synergistically as the major cytolytic mechanisms of activated
macrophages.
J Immunol 144 (4), 1425 - 1431
HIRSCH, L. R., R. J. STAFFORD, J. A. BANKSON, S. R. SERSHEN, B. RIVERA, R. E.
PRICE, J. D. HAZLE, N. J. HALAS u. J. L. WEST (2003):
Nanoshell-mediated near-infrared thermal therapy of tumors under magnetic resonance
guidance.
Proc Natl Acad Sci U S A 100 (23), 13549 - 13554
HOBBS, S. K., W. L. MONSKY, F. YUAN, W. G. ROBERTS, L. GRIFFITH, V. P.
TORCHILIN u. R. K. JAIN (1998):
Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment.
Proc Natl Acad Sci U S A 95, 4607 - 4612
HOTH, S. u. T. LENARZ (1994):
Elektrische Reaktionsaudiometrie.
Springer-Verlag, Berlin
HOTH, S. u. T. LENARZ (1997):
Otoakustische Emissionen.
Thieme Verlag, Stuttgart
HSU, S. M., L. RAINE u. H. FANGER (1981):
Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a
comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures.
J Histochem Cytochem 29, 577 - 580

158
HUANG, E. J., u. L. F. REICHARDT (2001):
Neurotrophins: roles in neuronal development and function.
Annu Rev Neurosci 24, 677 - 736
HUANG, E. J., u. R. K. SHEPHERD (2000):
Reduction in excitability of the auditory nerve following electrical stimulation at high
stimulus rates: V effects of electrode surface area.
Hear Res 146, 57 - 71
HUYNH, N. T., C. PASSIRANI, P. SAULNIER u. J. P. BENOIT (2009):
Lipid nanocapsules: a new platform for nanomedicine.
Int J Pharm 379 (2), 201 - 209
HUSSEMAN, J. u. Y. RAPHAEL (2009):
Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors.
Adv Otolaryngol 66, 37 - 51
HVID, M., H. K. JENSEN, B. DELEURAN, K. KEMP, C. ANDERSSON, M. DELEURAN
u. C. VESTERGAARD (2009):
Evaluation of FITC-induced atopic dermatitis-like disease in NC/Nga mice and BALB/c mice
using computer-assisted stereological toolbox, a computer-aided morphometric system.
Int Arch Allergy Immunol 149 (3), 188 - 94.
IMRAN, M., A. M. REVOL-JUNELLES, A. MARTYN, E. A. TEHRANY, M. JACQUOT,
M. LINDER u. S. DESOBRY (2010):
Active food packaging evolution: transformation from micro- to nanotechnology.
Crit Rev Food Sci Nutr 50 (9), 799 - 821
INABA, K., M. INABA, N. ROMANI, H. AYA, M. DEGUCHI, S. IKEHARA, S.
MURAMATSU u. R. M. STEINMAN (1992):
Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures
supplemented with granulocyte-macrophage colony stimulating factor.
J Exp Med 176, 1693
INCESULU, A. u. J. B. NADOL, JR. (1998):
Correlation of acoustic threshold measures and spiral ganglion cell survival in severe to
profound sensorineural hearing loss: implications for cochlear implantation.
Ann Otol Rhinol Laryngol 107, 906 - 911
IZUMIKAWA, M., R. MINODA, K. KAWAMOTO, K. A. ABRASHKIN, D. L.
SWIDERSKI, D. F. DOLAN, D. E. BROUGH u. Y. RAPHAEL (2005):
Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf
mammals.
Nat Med 11, 271 – 276

159
JANSSEN, R., L. SCHWEITZER u. K. F. JENSEN (1991):
Glutamate neurotoxicity in the developing rat cochlea: physiological and morphological
approaches.
Brain Res 552, 255 - 264
JIANG, M., Y. Q. ZHANG, G. X. HE u. H. SUN (2007):
[Protective effect of NT-3 gene mediated by hydroxyapatite nanoparticle on the cochlea of
guinea pigs injured by excitotoxicity].
Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 32, 563 - 567
KANES, S. J., J. TOKARCZYK, S. J. SIEGEL, W. BILKER, T. ABEL u. M. P. KELLY
(2006):
Rolipram: A specific phosphodiesterase 4 inhibitor with potential antipsychotic activity.
Neuroscience 144 (1), 239 - 246
KANO, Y. u. A. STARR (1987):
Temporal relationship between single unit activity in superior olivary complex and
scalp-derived auditory brainstem response in guinea pig.
Brain Res 419, 262 - 271
KANZAKI, S., T. STÖVER, K. KAWAMOTO, D. M. PRIESKORN, R. A. ALTSCHULER,
J. M. MILLER u. Y. RAPHAEL (2002):
Glial cell line-derived neurotrophic factor and chronic electrical stimulation prevent VIII
cranial nerve degeneration following denervation.
J Comp Neurol 454, 350 - 360
KARPPANEN, H., P. PAAKKARI, A. L. ORMA u. I. PAAKKARI (1979):
Central hypotensive effects of imidazole acetic acid and rolipram (ZK 62 711) in rats.
Agents Actions 9 (1), 84 - 86
KAWAMOTO, K., S. ISHIMOTO, R. MINODA, D. E. BROUGH u. Y. RAPHAEL (2003):
Math1 gene transfer generates new cochlear hair cells in mature guinea pigs in vivo.
J Neurosci 23, 4395 - 4400
KHO, S. T., R. M. PETTIS, A. N. MHATRE u. A. K. LALWANI (2000):
Safety of adeno-associated virus as cochlear gene transfer vector: analysis of distant spread
beyond injected cochleae.
Mol Ther 2, 368 - 373
KIM, B. Y. S., J. T. RUTKA u. W. CHAN (2010):
Nanomedicine.
N Engl J Med 363, 2434 - 2443
KINSELLA, F. P. u. D. J. MOONEY (1988):
Anaphylaxis following oral fluorescein angiography.
Am J Ophthalmol 106 (6), 745 - 746

160
KOOB, A. O., J. M. COLBY u. R. B. BORGENS (2008):
Behavioral recovery from traumatic brain injury after membrane reconstruction using
polyethylene glycol.
J Biol Eng 2, 9
KOPKE, R., K. A. ALLEN, D. HENDERSON, M. HOFFER, D. FRENZ u. W. T. VAN DE
(1999):
A radical demise. Toxins and trauma share common pathways in hair cell death.
Ann N Y Acad Sci 884, 171 - 191
KWAK, H. J., J. S. SONG, J. Y. HEO, S. D. YANG, J. NAM u. H. G. CHEON (2005):
Roflumilast inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory mediators via suppression of
Nuclear Factor-κB, p38 mitogen-activated protein kinase, and c-Jun NH2-terminal kinase
activation.
J Pharmacol Exp Ther 315, 1188 - 1198
LAMPRECHT, A., P. SAULNIER, F. BOURY, C. PASSIRANI, J. E. PROUST u. J. P.
BENOIT (2002):
A quantitative method fort he determination of amphiphilic drug release kinetics from
nanoparticles using a Langmuir balance.
Anal Cem 74 (14), 3416 - 3420
LAVERTY, P. H., A. LESKOVAR, G. J. BREUR, J. R. COATES, R. L. BERGMAN, W. R.
WIDMER, J. P. TOOMBS, S. SHAPIRO u. B. BORGENS (2004):
A preliminary study of intravenous surfactants in paraplegic dogs: polymer therapy in canine
clinical SCI.
J Neurotrauma 21, 1767 - 1777
LEE, J., S. MAHENDRA u. P. J. J. ALVAREZ (2010):
Nanomaterials in the construction industry: a review of their applications and rnvironmental
health and safety considerations.
ACS Nano 4 (7), 3580 - 3590
LEGOUIX, J. P. u. A. PIERSON (1977):
Increased fatigue of cochlear potentials after injection of KCL solution in the perilymph.
Audiology 16 (6), 453 - 461
LEHNHARDT, E., R.D. BATTMER, K. NAKAHODO u. R. LASZIG (1986):
Cochlear Implants.
HNO 34 (7), 271 - 279
LENARZ, T. (1997):
Cochlear implants: what can be achieved?
Am J Otol 18, 2 – 3

161
LEONHARDT, H. (1990):
Histologie, Zytologie und Mikroanatomie des Menschen.
Verlag Thieme, Stuttgart, New York,
S. 317 - 327
LEFEBVRE, P. P., B. MALGRANGE, H. STAECKER, M. MOGHADASS, T. R. VAN DE
WATER u. G. MOONEN (1994):
Neurotrophins affect survival and neuritogenesis by adult injured auditory neurons in vitro.
Neuroreport 5, 865 - 868
LEFEBVRE, P. P. u. T. R. VAN DE WATER (2000):
Connexins, hearing and deafness: clinical aspects of mutations in the connexin 26 gene.
Brain Res Brain Res Rev 32, 159 - 162
LEFEBVRE, P. P., T. R. VAN DE WATER, T. WEBER, B. ROGISTER u. G. MOONEN
(1991):
Growth factor interactions in cultures of dissociated adult acoustic ganglia: neuronotrophic
effects.
Brain Res 567, 306 - 312
LINSS, V., W. LINSS, E. EMMERICH u. F. RICHTER (2007):
The cochleogram of the guinea pig.
Eur Arch Otorhinolaryngol 264, 369 - 375
LIU, D. u. N. GU (2009):
Nanomaterials for fresh-keeping and sterilization in food preservation.
Rescent Pat Food Nutr Agric 1 (2), 149 - 54
LIU, X. Z., Y. YUAN, D. YAN, E. H. DING, X. M. OUYANG, Y. FEI, W. TANG, H.
YUAN, Q. CHANG, L. L. DU, X. ZHANG, G. WANG, S. AHMAD, D. Y. KANG, X. LIN
u. P. DAI (2009):
Digenic inheritance of non-syndromic deafness caused by mutations at the gap junction
proteins Cx26 and Cx31.
Hum Genet 125, 53 - 62
LOMBARD, C. W., O. JÖNS u. C. M. BUSSADORI (2006):
Clinical efficacy of pimobendan versus benazepril for the treatment of acquired
atrioventricular valvular disease in dogs.
J Am Anim Hosp Assoc 42 (4), 249 - 61.
LOUSTEAU, R. J. (1987):
Increased spiral ganglion cell survival in electrically stimulated, deafened guinea pig
cochleae.
Laryngoscope 97, 836 – 842

162
LUTZ, M. B., N. KUKUTSCH, A. L. J. OGILVIE, S. RÖßNER, F. KOCH, N. ROMANI
u. G. SCHULER (1999):
An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic
cells from mouse bone marrow.
J Immunol Meth 223, 77 - 92
MACKENZIE, S. J. u. M. D. HOUSLEY (2000):
Action of rolipram on specific PDE4 cAMP phosphodiesterase isoforms and on the
phosphorylation of cAMP-response-element-binding protein (CREB) and p38 mitogenactivated
protein (MAP) kinase in U937 monocytic cells.
Biochem J 347, 571 - 578
MAGDESIAN, K. G., D. C. WILLIAMS, M. ALEMAN, R. A. LECOUTEUR u. J. E.
MAGIDAN (2009):
Evaluation of deafness in American Paint horses by phenotype, brainstem auditory-evoked
responses, and endothelian receptor B genotype.
J Am Vet Med Assoc 235, 1204 - 2011
MALGRANGE, B., P. LEFEBVRE, T. R. VAN DE WATER, H. STAECKER u. G.
MOONEN (1996):
Effects of neurotrophins on early auditory neurones in cell culture.
Neuroreport 7, 913 - 917
MATSCHKE, R. G. u. P. PLATH (1988):
[Cochlear implant for children? Possibilities--risks--prerequisites].
Laryngol Rhinol Otol (Stuttg) 67, 84 - 87
MATSAMURA, Y. u. H. MAEDA (1986):
A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of
tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.
Cancer Res 46 (12), 6387 - 6392
MARZELLA, P. L., L. N. GILLESPIE, G. M. CLARK, P. F. BARTLETT u.
T. J. KILPATRICK (1999):
The neurotrophins act synergistically with LIF and members of the TGF-beta superfamily
to promote the survival of spiral ganglia neurons in vitro.
Hear Res 138, 73 - 80
MAXWELL, C. R., S. J. KANES, T. ABEL u. S. J. SIEGEL (2004):
Phosphodiesterase inhibitors: a novel mechanism for receptor-independent antipsychotic
medications.
Neuroscience 129 (1), 101 – 107
MCGUINNESS, S. L. u. R. K. SHEPHERD (2005):
Exogenous BDNF rescues rat spiral ganglion neurons in vivo.
Otol Neurotol 26, 1064 - 1072

163
MILLER, J. M., D. H. CHI, L. J. O’KEEFFE, P. KRUSZKA, Y. RAPHAEL u.
R. A. ALTSCHULER (1997):
Neurotrophins can enhance spiral ganglion cell survival after inner hair cell loss.
Int J Dev Neurosci 15, 631 - 643
MINAMI, S. B., D. YAMASHITA, K. OGAWA, J. SCHACHT u. J. M. MILLER (2007):
Creatine and tempol attenuate noise-induced hearing loss.
Brain Res 1148, 83 - 89
MITCHELL, A., J. M. MILLER, P. A. FINGER, J. W. HELLER, Y. RAPHAEL u.
R. A. ALTSCHULER (1997):
Effects of chronic high-rate electrical stimulation on the cochlea and eighth nerve in the
deafened guinea pig.
Hear Res 105, 30 - 43
MORILLE, M., C. PASSIRANI, S. DUFORT, G. BASTIAT, B. PITARD, J. L. COLL u. J. P.
BENOIT (2010):
Tumor transfection after systemic injection of DNA lipid nanocapsules.
Biomaterials 32 (9), 2327 - 2333
MULDOON, L. L., P. G. TRATNYEK, P. M. JACOBS, N. D. DOOLITTLE, G. A.
CHRISTOFORIDIS, J. A. FRANK, M. LINDAU, P. R. LOCKMAN, S. P: MANNINGER,
Y. QIANG, A. M. SPENCE, S. I. STUPP, M. ZHANG u. E. A. NEUWELT (2006):
Imaging and nanomedicine for diagnosis and therapy in the central nervous system: report of
the eleventh annual blood-brain barrier disruption consortium meeting.
AJNR Am J Neuroradiol 27 (3), 715 - 721
NADOL, J. B., JR. (1988):
Comparative anatomy of the cochlea and auditory nerve in mammals.
Hear Res 34, 253 - 266
NAM, J. M., C. S. THAXTON u. C. A. MIRKIN (2003):
Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins.
Science 301 (5641), 1884 - 1886
NARDUCCI, D. (2007):
An introduction to Nanotechnologies: What’s in it for us?
Vet Res Commun 31 Suppl 1, 131 - 137.
NEWBOLD, C., R. RICHARDSON, C. Q. HUANG, D. MILOJEVIC, R. COWAN u. R.
SHEPHERD (2004):
An in vitro model for investigation impedance changes with cell growth and electrical
stimulation: implications for cochlear implants.
J Neural Eng 1, 218 – 227

164
NICKEL, R., A. SCHUMMER u. E. SEIFERLE (2004):
Lehrbuch der Anatomie der Haustiere.
Parey Verlag
OHLEMILLER, K. K. (2009):
Mechanisms and genes in human strial presbycusis from animal models.
Brain Res 1277, 70 - 83
OTTE, J., H. F. SCHUNKNECHT u. A. G. KERR (1978):
Ganglion cell populations in normal and pathological human cochleae. Implications for
cochlear implantation.
Laryngoscope 88, 1231 - 1246
PAASCHE, G., F. BOCKEL, C. TASCHE, A. LESINSKI-SCHIEDAT u. T. LENARZ
(2006):
Changes of postoperative impedances in cochlear implant patients: the short-term effects of
modified electrode surfaces and intracochlear corticosteroids.
Otol Neurotol 27, 639 - 647
PAASCHE, G., P. GIBSON, T. AVERBECK, H. BECKER, T. LENARZ u. T. STÖVER
(2003):
Technical report: modification of a cochlear implant electrode for drug delivery to the inner
ear.
Otol Neurotol 24, 222 - 227
PAASCHE, G., C. TASCHE, T. STÖVER, A. LESINSKI-SCHIEDAT u. T. LENARZ
(2009):
The long-term effects of modified electrode surfaces and intrachochlear corticosteroids on
postoperative impedances in cochlear implantat patiens.
Otol Neurotol 30, 592 - 598
PAUTLER, M. u. S. BRENNER (2010):
Nanomedicine: promises and challenges fort he future of public health.
Int J Nanomedicine 5, 803 - 809
PENZLIN, H. (1991):
Informationsaufnahme und Verarbeitung.
In: Lehrbuch der Tierphysiologie
Fischer Verlag, Jena, S. 429 - 449
PERRIER, T., P. SAULNIER, F. FOUCHET, N. LAUTRAM u. J. P. BENOIT (2010):
Post-insertion into lipidic nanocapsules (LNCs): From experimental aspects to mechanisms.
Int J Pharm, 396 (1-2), 204 - 209
PHILPOTT, C. M., S. GANE u. D. MCKIERNAN (2011):
Nanomedicine in otorhinolaryngology: what does the future hold?
Eur Arch Otorhinolaryngol 268 (4), 489 - 496

165
PLATT, S., J. FREEMAN, A. DI STEFANI, I. WIECZOTEK u. W. HENLY (2006):
Prevalence of unilateral and bilateral deafness in border collies and association with
phenotype.
J Vet Intern Med 20, 1355 - 1362
POSTLETHWAITE, A. E. u. A. H. KANG (1983):
Induction of fibroblast proliferation by human mononuclear leukocyte-derived proteins.
Arthritis Rheum 26 (1), 22 - 27
PRENCIPE, G., S. M. TABAKMAN, K. WELSHER, Z. LIU, A. P. GOODWIN, L. ZHANG,
J. HENRY u. H. DAI (2009):
PEG branched polymer for functionalization of nanomaterials with ultralong blood
circulation.
L Am Chem Soc 131 (13), 4783 - 4787
PRIUSKA, E. M. u. J. SCHACHT (1995):
Formation of free radicals by gentamicin and iron and evidence for an iron/gentamicin
complex.
Biochem Pharmacol 50, 1749 - 1752
PURVES, D. (2007):
Neuroscience.
Sinauer Associates, Inc., Hampshire, S. 170 - 176
RABE, K. F., S. HURD, A. ANZUETO, P. J. BARNES, S. A. BUIST, P. CALVERLEY, Y.
FUKUSHI, C. JENKINS, R. RODRIGUEZ-ROISIN, C. VANWEEL u. J. ZIELINSKI
(2001):
Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive
pulmonary disease: GOLD executive summary.
Am J Respir Crit Care Med 163 (5), 1256 - 1276
RAU, T. S., O. MAJDANI, A. HUSSONG, T. LENARZ u. M. LEINUNG (2010):
Determination of the curling behaviour of a preformed cochlear implant electrode array.
Int J Comput Assist Radiol Surg, DOI 10.1007/s11548-010-0520-x
REICH, U. , P. P. MÜLLER, E. FADEEVA, B. N. CHICHKOV, T. STÖVER, T. FABIAN,
T. LENARZ u. G. REUTER (2008):
Differential fine-tuning of cochlear implant material-cell interactions by femtosecond laser
microstructuring.
J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 87B, 146 - 153
REICHARDT, L. F. (2006):
Neurotrophin-regulated signalling pathways.
Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 361 (1473), 1545 - 1564

REISS, M. (2009):
Facharztwissen HNO-Heilkunde.
Springer-Verlag, Berlin
166
REJALI, D., V. A. LEE, K. A. ABRASHKIN, N. HUMAYUN, D. L. SWIDERSKI u. Y.
RAPHAEL (2007):
Cochlear implants and ex vivo BDNF gene therapy protect spiral ganglion neurons.
Hear Res 228, 180 - 187
RIVIERE, J. E. (2007):
The future of veterinary therapeutics: A glimpse towards 2030.
Vet J 174 (3), 462 - 471
ROMAND, M. R., u. R. ROMAND (1987):
The ultrastructure of spiral ganglion cells in the mouse.
Acta Otolaryngol. 104, 29 - 39
RUBEL, E. W., u. B. FRITZSCH (2002):
Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.
Annu. Rev. Neurosci. 25, 51 - 101
SANTINI, M. T., C. CAMETTI, P. L. INDOVINA, G. MORELLI u. G. DONELLI (1997):
Polylysine induces changes in membrane electrical properties of K562 cells.
J Biomed Mater Res 35, 165 - 174
SCHEPER, V. (2007):
Elektrophysiologische und histologische Untersuchungen zum protektiven Effekt von Glial
cell line-derived neurotrophic factor, Brain-derived neurotrophic factor, Dexamethason und
Elektrostimulation auf Spiralganglienzellen ertaubter Meerschweinchen.
Hannover, tierärztl. Hochschule/med. Hochschule, Diss
SCHEPER, V. , G. PAASCHE, J. M. MILLER, A. WARNECKE, N. BERKINGALI, T.
LENARZ u. T. STÖVER (2009a):
Effects of delayed treatment with combined GDNF and continuous electrical stimulation on
spiral ganglion cell survival in deafened guinea pigs.
J Neurosci Res 87 (6), 1389 - 1399
SCHEPER, V., WOLF, M., Z. KADLECOVA, T. PERRIER, H. A. KLOK, P. SAULNIER,
T. LENARZ u. T. STÖVER (2009b):
Potential novel drug carriers for inner ear treatment: hyperbranched polylysine and lipid
nanocapsules.
Nanomedicine 4 (6), 623 - 35.
SCHIERHOLZ, J. M., L. J. LUCAS, A. RUMP u. G. PULVERER (1998):
Efficacy of silver-coated medical devices.
J Hosp Infect 40 (4), 257 - 262

167
SCHMIDT-NIELSEN, K. (1999):
Information und Sinne.
In: Physiologie der Tiere
Akademischer Verlag Spektrum, Heidelberg, Berlin, S. 462 - 466
SCOTT, N. R. (2007):
Nanomedicine in veterinary medicine.
Vet Res Commun 31 Suppl 1, 139 - 144.
SELIMOGLU, E. (2007):
Aminoglycoside-induced Ototoxicity.
Curr Pharm Des 13, 119 - 126
SHEPHERD, R. K., A. COCO, S. B. EPP u. J. M. CROOK (2005):
Chronic depolarization enhances the trophic effects of brain-derived neurotrophic factor in
rescuing auditory neurons following a sensorineural hearing loss.
J Comp Neurol 486, 145 - 158
SHEPHERD, R. K., S. HATSUSHIKA u. G. M. CLARK (1993):
Electrical stimulation of the auditory nerve: the effect of electrode position on neural
excitation.
Hear Res 66, 108 - 120
SHI, R. u. B. BORGENS (1999):
Acute repair of crushed guinea pig spinal cord by pollyethylene glycol.
J Neurophysiol 81, 2406 - 2414
SHINOMORI, Y., D. S. SPACK, D. D. JONES u. R. S. KIMURA (2001):
Volumetric and dimensional analysis of the guinea pig inner ear.
Ann Otol Rhinol Laryngol 110, 91 - 98
SIEGEL, G. J., B. W. AGRANOFF, R.W. ALBERS, S. K. FISCHER u. M. D. UHLER
(1999):
Basic Neurochemistry Molecular, Cellular and Medical Aspects.
Academic Press, New York, London
SMITH, D. L., J. POZUETA, B. GONG, O. ARANCIO u. M. SHELANSKI (2009):
Reversal of long-term dendritic spine alterations in Alzheimer disease models.
Proc Natl Acad Sci U S A 106 (39), 16877 - 16882
SOHN, W. (2001):
„Schwerhörigkeit in Deutschland", Repräsentative Hörscreening-Untersuchung bei 2000
Probanden in 11 Allgemeinpraxen.
Z Allg Med 77, 143 – 147

SOLDINI, M. (1999):
[Bioethical aspects of Viagra].
Clin Ter 150(1), 33 - 36
168
SPOENDLIN, H. (1984):
Factors inducing retrograde degeneration of the cochlear nerve.
Ann Otol Rhinol Laryngol, Suppl 112, 76 - 82
STAECKER, H., R. KOPKE, B. MALGRANGE, P. LEFEBVRE u.
T. R. VAN DE WATER (1996):
NT-3 and/or BDNF therapy prevents loss of auditory neurons following loss of hair
cells.
Neuroreport 7, 889 - 894
STAVROVSKAYA, I. G. u. B. S. KRISTAL (2005):
The powerhouse takes control of the cell: is the mitochondrial permeability transition a viable
therapeutic target against neuronal dysfunction and death?
Free Radic Biol Med 38 (6), 687 - 697
STEEL, K. P. u. C. BARKWAY (1989):
Another role for melanocytes: Their importance for normal stria vascularis development in
the mammalian inner ear.
Development 107, 453 - 463
STÖVER, T., M. YAGI u. Y. RAPHAEL (1999):
Cochlear gene transfer: round window versus cochleostomy inoculation.
Hear Res 136, 124 - 130
STÖVER, T., M. YAGI u. Y. RAPHAEL (2000):
Transduction of the contralateral ear after adenovirus-mediated cochlear gene transfer.
Gene Ther 7, 377 - 383
STRAIN, G. M. (2004):
Deafness prevalence and pigmentation and gender associations in dog breeds at risk.
Vet J 167, 24 - 32
SUMER, B. u. J. GAO (2008):
Theranostic nanomedicine for cancer.
Nanomedicine (Lond) 3 (2), 137 - 140
SUZUKI, M., T. YAMASOBA, K. SUZUKAWA u. K. KAGA (2003):
Adenoviral vector gene delivery via the round window membrane in guinea pigs.
Neuroreport 14, 1951 – 1955

169
SWAN, E. E. L., M. J. MESCHER, W. F. SEWELL, S. L. TAO u. J. T. BORENSTEIN
(2008):
Inner ear drug delivery for auditory applications.
Adv Drug Deliv Rev 60 (15), 1583 - 1599
TAKUMIDA, M., R. POPA u. M. ANNIKO (1999):
Free radicals in the guinea pig inner ear following gentamicin exposure.
ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 61, 63 - 70
TAMURA, T., T. KITA, T. NAKAGAWA, T. ENDO, T. KIM, T. ISHIHARA, Y.
MIZUSHIMA, M. HIGAKI u. J. ITO (2005):
Drug delivery to the cochlea using PLGA Nanoparticles.
Laryngoscope 115, 2000 - 2005
TYKOCINSKI, M., Y. DUAN, B. TABOR u. R. S. COWAN (2001):
Chronic electrical stimulation of the auditory nerve using high surface area (HiQ) platinum
electrodes.
Hear Res 159, 53 - 68
UZUNOV, P. u. B. WEISS (1972):
Separation of multiple molecular forms of cyclic adenosine 3', 5'-monophosphate
phosphodiesterase in rat cerebellum by polyacrylamide gel electrophoresis.
Biochim Biophys Acta 284, 220 - 226
VALERA, E., F. J. SANCHEZ-MARTIN, A. V. FERRER-MONTIEL, A. MESSEGUER u.
J. M. MERINO (2008):
NMDA-induced neuroprotection in hippocampal neurons is mediated through the protein
kinase A and CREB (cAMP-response element-binding protein) pathway.
Neurochem Int 53 (5), 148 - 154
VENUGOPAL, J., M. P. PRABHAKARAN, S. LOW, A. T. CHOON, Y. Z. ZHANG, G.
DEEPIKA u. S. RAMAKRISHNA (2008):
Nanotechnology for nanomedicine and delivery of drugs.
Curr Pharm Des 14, 2184 - 2200
VERSNEL, H., M. J. AGTERBERG, J. C. DE GROOT, G. F. SMOORENBURG u. S. F.
KLIS (2007):
Time course of cochlear electrophysiology and morphology after combined administration of
kanamycin and furosemid.
Hear Res 231 (1-2), 1 - 12
VISARIA, R., R. GRIFFIN, S. HUI, B. WILLIAMS, E. EBBINI, G. PACIOTTI, C. SONG u.
J. BISCHOF (2006):
Efficacy and biodistribution of gold nanoparticles.
J Biomech 39 (Suppl 1), 381

170
VIVERO, R. J., D. E. JOSEPH, S. ANGELI, J. HE, S. CHEN, A. A. ESHRAGI, T. J.
BALKANY u. T. R. VAN DE WATER (2008):
Dexamethasone base conserves hearing from electrode trauma-induced hearing loss.
Laryngoscope 118, 2028 - 2035
VONARBOURG, A., C. PASSIRANI, L. DESIGAUX, E. ALLARD, P. SAULNIER, O.
LAMBERT, J. P. BENOIT u. B. PITARD (2009):
The encapsulation of DNA molecules within biomimetic lipid nanocapsules.
Biomaterials 30, 3197 - 3204
WACHTEL, H. (1982):
Characteristiv behavioural alterations in rats induced by Rolipram and other selective
adenosine cyclic 3’, 5’-monophosphate Phosphodiesterase inhibitors.
Psychopharmocology 77 (4), 309 - 316
WARNECKE, A., V. SCHEPER, I: BUHR, G. I. WENZEL, K. WISSEL, G. PAASCHE, N.
BERKINGALI, J. R. JORGENSEN, T. LENARZ u. T. STÖVER (2010):
Artemin improves survival of spiral ganglion neurons in vivo and in vitro.
Neuroreport 21, 517 - 521
WEBB, A. A. u. C. L. CULLEN (2010):
Coat color and coat color pattern-related neurologic and neuro-ophthalmic diseases.
Can Vet J 51 (6), 653 - 657.
WEBSTER, M. u. D. B. WEBSTER (1981):
Spiral ganglion neuron loss following organ of Corti loss: a quantitative study.
Brain Res 212, 17 - 30
WEFSTAEDT, P. (2006):
Untersuchungen zu trophischen und protektiven Effekten neurotropher Faktoren
(Brain-derived neurotrophic factor, Glial cell line-derived neurotrophic factor), des
Glukocorticoids Dexamethason sowie elektrischer Stimulation auf kultivierte
Spiralganglienzellen der Ratte.
Hannover, tierärztl. Hochschule/med. Hochschule, Diss.
WEHNER, R. u. W. GEHRING (1995):
Zoologie.
Thieme Verlag, Stuttgart
WEISS, B. (1975):
Differential activation and inhibition of the multiple forms of cyclic nucleotide
phosphodiesterase.
Adv Cycl Nucl Res 5,195 - 211
WEST, B. A., R. E. BRUMMETT u. D. L. HIMES (1973):
Interaction of kanamycin and ethacrynic acid. Severe cochlear damage in guinea pigs.
Arch Otolaryngol 98, 32 - 37

171
WESTON, M. C., N. ANDERSON u. P. T. PEACHELL (1997):
Effects of Phosphodiesterase inhibitors on human lung mast cell and basophil function.
Br J Pharmacol 121, 287 - 295
WHITAKER, C. M., E. BEAUMONT, M. J. WELLS, D. S. MAGNUSON, M. HETMAN u.
S. M. ONIFER (2008):
Rolipram attenuates acute ologodendrocyte death in the adult rat ventrolateral funiculus
following contusive cervical spinal cord injury.
Neurosci Lett 438 (2), 200 - 204
WOLF, M. (2009):
Untersuchungen zu 3g-Nanotechnologien als Basis für ein gezieltes Drug-Delivery-System
am Modell des Meerschweinchen-Innenohres
Hannover, tierärztl. Hochschule/med. Hochschule, Diss
WU, W. J., S. H. SHA u. J. SCHACHT (2002):
Recent advances in understanding aminoglycoside ototoxicity and its prevention.
Audiol Neurootol 7, 171 - 174
YAGI, M., S. KANZAKI, K. KAWAMOTO, B. SHIN, P. P. SHAH, E. MAGAL, J. SHENG
u. Y. RAPHAEL (2000):
Spiral ganglion neurons are protected from degeneration by GDNF gene therapy.
J Assoc Res Otolaryngol 1, 315 - 325
YAMAGATA, T., J. M. MILLER, M. ULFENDAHL, N. P. OLIVIUS, R. A.
ALTSCHULER, I. PYYKKO u. G. BREDBERG (2004):
Delayed neurotrophic treatment preserves nerve survival and electrophysiological
responsiveness in neomycin-deafened guinea pigs.
J Neurosci Res 78, 75 - 86
YAMANE, H., Y. NAKAI u. K. KONISHI (1988):
Furosemide-induced alteration of drug pathway to cochlea.
Acta Otolaryngol Suppl, 447, 28 - 35
YAMASHITA, T., K. L. TUCKER u. Y. A. BARDE (1999):
Neurotrophin binding to the p75 receptor modulates Rho activity and axonal outgrowth.
Neuron 24 (3), 585 - 593
YLIKOSKI, J., U. PIRVOLA, J. VIRKKALA, P. SUVANTO, X. Q. LIANG, E. MAGAL, R.
ALTSCHULER, J. M. MILLER u. M. SAARMA (1998):
Guinea pig auditory neurons are protected by glial cell line-derived growth factor from
degeneration after noise trauma.
Hear Res 124, 17 – 26

172
ZENNER, H.P. (1994):
Physiologische und biochemische Grundlagen des normalen und gestörten Gehörs.
In: H. H. Naumann, J. Helms, C. Herberhold u. E. Kastenbauer (Hrsg.):
Oto-Rhino-Laryngologie in Klinik und Praxis.
Verlag Thieme, Stuttgart, S. 81 - 231
ZHANG, M., S. FANG, A. A. ZAKHIDOV, S. B. LEE, A. E. ALIEV, C. D. WILLIAMS, K.
R. AKTINSON u. R. H. BAUGHMAN (2005):
Strong, transparent, multifunctional, carbon nanotube sheets.
Science 309 (5738), 1215 - 1219
ZHANG, Y., W. ZHANG, M. LÖBLER, K. SCHMITZ, P. SAULNIER, T. PERRIER, I.
PYYKKÖ u. J. ZOU (2011):
Inner ear biocompatability of lipid nanocapsules after round window membrane application.
Int J Pharm 404(1-2), 211 - 219
ZHENG, J. L., R. R. STEWART u. W. Q. GAO (1995):
Neurotrophin-4/5 enhances survival of cultured spiral ganglion neurons and protects them
from cisplatin neurotoxicity.
J. Neurosci. 15, 5079 - 5087
ZHOU, L. u. W. WU (2006):
Survival of injured spinal motoneurons in adult rat upon treatment with glial cell line-derived
neurotrophic factor at 2 weeks but not at 4 weeks after root avulsion.
J Neurotrauma 6, 920 - 927
ZHU, J., E. MIX u. B. WINBALD (2001):
The antidepressant and antiinflammatory effects of rolipram in the central nervous system.
CNS Drug Rev 7 (4), 387 - 398
ZHU, S., K. ZHOU, S. HUANG, F. LIU, Y. LI, Z. XUE u. Z. LONG (2005):
[Hydroxyapatite nanoparticles: a novel material of gene carrier].
Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi 22, 980-984
ZOU, J., P. SAULNIER, T. PERRIER, Y. ZHANG, T. MANNINEN, E. TOPPILA u. I.
PYYKKÖ (2008):
Distribution of lipid nanocapsules in different cochlear cell populations after round window
membrane permeation.
J Biomed Mater Res B Appl Biomater 87 (1), 10 - 18
ZUR MÜHLEN, A., C. SCHWARZ, W. MEHNERT (1998):
Solid lipid nanocapsules (SLN) for controlled drug delivery--drug release and release
mechanism.
Eur J Pharm Biopharm 45 (2), 149 - 155

10 Anhang
173
10.1 Herstellung von Lösungen und Medien
• Spiralganglienzell-Medium (SGZ-Medium)
- 30 ml Panserin (10.2)
- 750 µl 1 M HEPES (10.2)
- 550 µl D-PBS (10.2)
- 450 µl Penizillin (600 iE/ml D-PBS, 10.2)
- 165 µl Glukose-Lösung (30 % in D-PBS, 10.2)
- 30 µl N2-Supplement (100X, 10.2)
- 70 µl Insulin (4 mg/ml, 10.2)
• Enzymatische Verdauungslösung zur Spiralganglienzell-Vereinzelung
- 100 ml Hank´s gepufferte Salzlösung (HBSS) ohne Ca 2+ und Mg 2+ (10.2)
- 0,1 g Trypsin (10.2)
- 0,1 g DNase I (10.2)
- 0,01 g Collagenase (10.2)
• Dendritische Zellen-Medium (DC-Medium)
- RPMI 1640 (10.2)
- 10 % FBS (10.2)
- 50 µmol/l β-Mercaptoethanol (10.2)
• Hämolyse Puffer pH 7,3
- 8,29 g NH4CL (10.2)
- 0,037 g Na2 EDTA (10.2)
- 0,839 g NaHCO3 (10.2)
- Aqua bidest ad 1000 ml (10.2)

• Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
174
Die phosphatgepufferten Kochsalzlösung (0,14 M NaCl, 0,01 M PO4-Puffer, 0,0003
M KCl; pH 7,45) wird durch lösen einer Tablette PBS (10.2) in 500 ml VE-Wasser
(9.3) hergestellt. Anschließend wird die Lösung filtriert (10.4).
• 20%ige EDTA Lösung
Zunächst werden 200 g EDTA Pulver (10.2) abgewogen und in ein Gefäß mit einem
Liter VE-Wasser (10.6) überführt. Nachdem sich das Pulver gelöst hat, wird der stark
alkalische pH-Wert mit 25%iger Salzsäure (10.2) neutralisiert. Das Lösen des Pulvers
kann durch Hinzufügen eines Rührfisches auf einem Magnetrührer beschleunigt
werden.
• Paraformaldehyd 4% (PFA)
Zur Herstellung von einem Liter 4%iger PFA-Lösung benötigt man zunächst 40 g
PFA-Pulver (10.2). Dieses wird in einem Glasgefäß (10.4) mittels Rührfisch auf einem
Magnetrührer (10.6) in 500 ml VE- Wasser gelöst und dabei auf 60 °C erwärmt. Ist die
Temperatur erreicht, so wird die Lösung durch Zugabe von einigen µl Natronlauge
geklärt. Der leicht alkalische pH-Wert wird anschließend mit Salzsäure (10.2)
neutralisiert und in einem weiteren Schritt wird die Lösung filtriert (10.4).
Abschließend werden 500 ml 200%ige PBS Lösung hinzugegeben. Zur Herstellung
dieser Lösung werden auf 500 ml VE-Wasser (10.2) zwei Tabletten PBS (10.1) gelöst.
Die fertige 4%ige PFA-Lösung wird im Kühlschrank (10.6) bei 4°C gelagert.
10.2 Lösungen und Reagenzien
Aceton Baker, Deventer, Holland 8003
Alexa Fluor ® 488 phalloidin Invitrogen, Molecular
Probes ® , Eugene, Oregon,
USA
A 12379
Alexa Fluor ® 568 phalloidin Invitrogen, Molecular A 12380

175
Probes ® , Eugene,Oregon,
USA
Ammoniumchlorid (NH4CL) Merck, Darmstadt -
BDNF, recombinant human R&D Systems, Wiesbaden 248-BD
bovines Insulin Biochrom AG, Berlin 3510
CellTiter 96 AQueos One
solution cell proliferation Assay
Deoxyribonuclease I (DNase I)
Amplification Grade; 10 x
DNase-Reaktions-Puffer;
25 mM EDTA (pH 8,0)
Promega, USA -
Invitrogen, Karlsruhe 18068-015
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck, Darmstadt -
Ethylendiamintetraessigsäure,
EDTA, ~ 95 %
Sigma Aldrich Chemie
GmbH, Steinheim
CAS 13235-30-4
Eosin G Merck, Darmstadt 1.15935.0100
Ethanol, vergällt 99 % BÜFA Chemikalien,
Hude/Altmoorhausen
Eukitt ® , Schnelleinschlussmittel Sigma Aldrich, Steinheim 0001432837
Granulocyte macrophagecolony
stimulating factor (GM-CSF)
Fötales Rinderserum, FBS,
hitzeinaktiviert Invitrogen,
R&D System,
Minneapolis, USA
Karlsruhe GIBCO TM 10108-157
Hämalaun nach Mayer Merck, Darmstadt 1.09249.2500
Hanks' gepufferte Salzlösung
(HBSS)
ohne Ca 2+ und Mg 2+
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-
piperazinyl)-ethansulfonsäure-
Puffer (HEPES)
Invitrogen, GIBCO TM ,
Karlsruhe
Sigma, Steinheim -
-
-
REF 14170-070
Karboxylatzement Durelon ® ESPE Dental AG, Seefeld Flüssigkeit: 44000725596/01

176
Laminin, Natural Mouse Invitrogen, Karlsruhe 23017-015
Lipidnanokapseln (LNC) Universität von Angers,
Frankreich
Lipopolysaccharid (LPS) Merck, Darmstadt -
Mercaptoethanol Sigma, Steinheim -
Pulver: 44000725620/01
UA4_50
Methanol Baker, Deventer, Holland 9070-03
UA39_50 (mit Rolipram)
Methylbenzoat, reinst Merck, Darmstadt 1.06059.1000
N-2 Supplement, (100X), 5 ml Invitrogen, GIBCO TM ,
Natriumhydrogencarbonat
(NaHCO3)
Natronlauge min. 10 % (1,11)
zur Analyse
Neurofilament 200 kD,
monoklonaler Maus-Antikörper
Karlsruhe
Merck, Darmstadt -
17502-048
Merck, Darmstadt 1.05588.1000
novocastra TM , Newcastle,
UK
NCL-NF 200
Panserin 401 Biotech GmbH, Berlin Cat. No.: P04-710401
Paraffin Pastillen für die
Histologie
Merck, Darmstadt 1.07164.2500
Paraformaldehyd (PFA) Merck, Darmstadt 1.04005.1000
Penicillin (10.000 IE/ml)/
Streptomycin
Biochrom AG, Berlin A2210
Peroxidase Substrat Kit DAB Vector Lab., Burlingame,
Phosphatgepufferte
Kochsalzlösung
(PBS), Tabletten
USA
Invitrogen Cooperation,
GIBCO, Karlsruhe
SK-4100
Poly-DL-Ornithin Sigma, St. Louis, USA P-8638
ProLong ® Gold antifade reagent
with DAPI
Invitrogen, Molecular
Probes ® , Eugene, Oregon,
USA
Cat.No 18912-014
P 136931

Rhodamin Phalloidin
177
Invitrogen, Molecular
Probes ® , Eugene, Oregon,
USA
Rolipram TOCRIS, bioscience,
Roswell Park Memorial Institute
(RPMI)1640 Medium
Ellisville, Missouri, USA
Biochrom AG, Berlin -
R 415
Cat. No : 0905
Salzsäure, 25 % Merck, Darmstadt 1.00316.1011
t-Octylphenoxypolyethoxy-
ethanol (Triton X-100)
Sigma Aldrich Chemie
GmbH, Steinheim
Trypanblau 0,5 % Biochrom AG, Berlin -
Trypsin
Vectastain ABC Kit ELITE
Mouse IgG
SERVA, Heidelberg 37290
Vector Lab., Burlingame,
USA
CAS 9002-93-1
PK-6102
Xylol Merck, Darmstadt 1.08685.2500
10.3 Verwendete Arzneimittel
Atropinsulfat (0,5 mg/ml), 1 ml B. Braun Melsungen AG,
Atipamezolhydrochlorid
(5 mg/ml), Antisedan ® , 10 ml
Carprofen (50 mg/ml),
Rimadyl ® , 20 ml
Dexpanthenol (5 %) Bepanthen ®
Augen- und Nasensalbe
Enrofloxacin (25 mg/ml),
Baytril ® 2,5 %, Lösung zum
Melsungen
Zul.Nr. 5899.98.98
Pfizer, Berlin Zul.Nr. 23554.00.00
Pfizer GmbH, Karlsruhe Zul.Nr. 400684.00.00
Bayer, Leverkusen Zul.Nr. 6029009.00.00
Bayer, Leverkusen Zul.Nr. 13113.01.02

Eingeben
Enrofloxacin (25 mg/ml),
Baytril ® 2,5 % Injektionslösung,
50 ml
Furosemid (10 mg/ml),
Furosemid-ratiopharm ® ,
5 x 4 ml
178
Glucose-Lösung 5 % Delta Select GmbH,
Isotone Natriumchlorid-Lösung
0,9 %, 10 ml
Kanamycin (333 mg/ml),
3 ml
Ketaminhydrochlorid (100
mg/ml), Ketamin 10 %, 10 ml
Kodan ® , alkoholisches
Hautantiseptikum
Lactobacillen (L. fermentum, L.
casei, L. plantarum, L.
acidophilus, je 60 mg/g),
Pediococcus acidilacti
(60 mg/g), Enterococcus
faecium (60 mg/g), Bene-Bac ® ,
1g Tube
Medetomidin (1mg/ml),
Domitor ® , 10 ml
Penicillin (10.000 IE/ml)/
Streptomycin
Bayer, Leverkusen Zul.Nr. 400614.00.00
ratiopharm, Ulm Zul.Nr. 36544.00.00
Dreieich
B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
Abraxis Pharmacy
Products, Schaumburg,
IL, USA
Zul.Nr. 4999.99.99
Zul.Nr. 6697366.00.00
NDC 63323-359-03
WDT, Garbsen Zul.Nr. 9089.01.00
Schülke & Mayr GmbH,
Norderstedt
A. Albrecht GmbH &
Co., Aulendorf
23584-A, PZN-7830495
Pfizer, Berlin Zul.Nr. 32457.00.00
Biochrom AG Berlin A2210
Povidon-Iod, Braunol ® 1000 ml B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
-
Zul.Nr. 6182894.00.00

Prilocainhydrochlorid
(20 mg/ml), Xylonest ® %, 10 ml
Ringer Acetat Infusionslösung,
1000 ml
179
AstraZeneca GmbH,
Plankstadt
B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
Rolipram Elbion AG, Dresden -
10.4 Laborbedarf und Verbrauchsmaterialien
Abdecktücher Barrier,
75 cm x 90 cm
Deckgläser 24 x 60 mm Menzel-Gläser,
Zul.Nr. 6461252.00.00
Zul.Nr. 1829.99.99
WDT, Garbsen REF 800530-07
Braunschweig
Einbettform Eigenanfertigung aus
Einmalhandschuhe, Peha-Soft ® ,
puderfrei, Größe M
Einmalkanülen Sterican®,
27 G x 11/2´´, 0,4 mm x 12 mm
Einmalkanülen, 23 G x 1´´, 0,6
mm x 25 mm, Nr. 16 LUER
Einmalspritze, Injekt ® 1 ml,
25 G x 5/8’’ (0,5mm x 16mm)
Einmalspritze, Injekt ® 10 ml,
steril
Einmalspritze, Injekt ® 2 ml,
steril
Einmalspritze, Injekt ® 5 ml,
steril
Silikon
Hartmann AG,
Heidenheim
B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
Terumo ® Europe,
Leuven, Belgien
B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
B. Braun Melsungen AG,
Melsungen
Art. No J 1800 AMZ
-
REF 942162
-
-
REF 9166033 V
REF 4606108 V
REF 4606027 V
REF 4606051 V

Einweg Skalpellklingen Nr. 11
Aesculap
Eppendorfgefäße, Safe Lock
Tubes, 1,5 ml
180
Produkte für die Medizin
AG, pfm,
Köln
Eppendorf AG, Hamburg 0030 120.086
Färbegestelle und Färbebehälter Omnilab, Gerden -
Filterpapier, gefaltet, 289 Sartorius GmbH,
Göttingen
Gewebekleber, Epiglu ® Meyer-Haake Medical
Infusionsgerät BD R 87 P, 150
cm
Kanüle, 23 G x 1 ¼’’
(0,6 mm x 30 mm)
Laborglaswaren
(Erlenmeyerkolben,
Bechergläser, Flaschen, etc.)
Laborglaswaren
(Erlenmeyerkolben, Flaschen,
Bechergläser, etc.)
Innovatons, Wherheim
Becton Dickinson GmbH,
Heidelberg
Becton Dickinson GmbH,
Heidelberg
Omnilab, Gehrden/
VWR, Darmstadt
Omnilab, Gehrden/
VWR, Darmstadt
-
Best. Nr. FT-4-202-320
ArtikelNr. EPIGLU04
REF 396351
REF 300700
Mikrotommesser R 35 pfm GmbH, Köln 501348P
Mullkompressen, 5 cm x 5 cm Lohmann & Rauscher,
Rengsdorf
Multiwell-Zellkulturplatte 96 Nunc A/S, Roskilde,
Multiwell-Zellkulturplatte 96,
Polystyrol-Nunc-Immuno_platte
Dänemark
Nunc GmbH, Wiesbaden -
Mundschutz zum Binden WDT, Garbsen -
Nahtmaterial nicht resorbierbar,
Seralon®, 3/0
Serag Wiessner, Naila -
-
-
-
Cat No. 161093

Nahtmaterial resorbierbar,
Vicryl ®
rapide, USP 3/0, RB-1
181
Ethicon GmbH,
Norderstedt
Objektträger Superfrost ® Plus Menzel-Gläser,
Operationshandschuhe
sempermed ®
supreme, Gr. 7 ½
Pasteurpipetten, 22,5 mm aus
Glas
Petrischalen 100mm/ 20mm
Petrischalen 60mm/ 15mm
Braunschweig
Semperit Technische
Produkte, Wien,
Österreich
-
Art. No. J 1800AMNZ
REF 8227 51721
Brand, Wertheim Cat.No. 7477 20
Sarstedt Inc., Newton,
NC, USA
Greiner Bio-One GmbH,
Kremsmünster, Öster-
reich
pH-Indikatorpapier, pH-Box Merck, Darmstadt
Pipette zum Einmalgebrauch,
serologisch, 2 ml
Pipette zum Einmalgebrauch,
serologisch, 10 ml
Pipette zum Einmalgebrauch,
serologisch, 25 ml
Pipettenaufsatz, Combitips plus
5 ml
Sarstedt AG & Co.,
Nümbrecht
Sarstedt AG & Co.,
Nümbrecht
Sarstedt AG & Co.,
Nümbrecht
Pipettenspitzen, 1-10 µl, TipOne, Starlab,
83.1802.003
ArtikelNr. 628102
1.09565.0001
No./REF 86.1252.001
No./REF 86.1254.001
No./REF 86.1685.001
Eppendorf AG, Hamburg 0030 069.250
Ahrensburg
Pipettenspitzen,101-1000 µl TipOne, Starlab,
Ahrensburg
Pipettenspitzen,1-200 µl, TipOne, Starlab,
Ahrensburg
Cat. No. S1120-3810
Cat. No. S1126-7810
Cat. No. S1120-8810

182
Polyimidschlauch Micro Lumen Inc.,
Tampa, Florida, USA
049-I
Precision Tips, 27 GP GLT, Pforzheim ZC 5127-B
Puderfreie
Untersuchungshandschuhe,
Purple Nitrile
Rührstäbchenset
Schwesternhaube, grün, mit
Gummizug
Silikonschlauch Fluidflex,
Innendurchmesser 0,3 mm,
Außendurchmesser 0,7 mm
Wattestäbchen mit Holzstab,
15 cm
Zentrifugenröhrchen, 50 ml,
konisch
10.5 Operationsbesteck
Kimberley & Clark,
Roswell, GA, USA
IKA ® -Werke GmbH und
Co. KG, Stauben
WDT, Garbsen -
LiquidScan GmbH & Co.
KG, Überlingen
WDT, Garbsen -
Techno Plastic Products
AG, Trasadingen,
Schweiz
Chirurgische Pinzette Fine Science Tools,
Metzenbaumschere gebogen,
14,5 cm
Heidelberg
Fine Science Tools,
Heidelberg
Mikroliterspritze, 10 µl Fa. Hamilton Bonaduz
AG, Bonaduz, Schweiz
Nadelhalter Halsey, 13 cm Aesculap, Tuttlingen -
REF 52003 M
1358600
400 100 2HGH
-
11021-14
-
-

183
Pinzette Dumont Nr. 3, gerade Carl Roth GmbH & Co.
KG, Karlsruhe
Pinzette Dumont Nr. 5, gerade Carl Roth GmbH & Co.
Pinzette Dumont Nr. 7,
gebogen
Pinzette nach Adson, 1 x 2
Zähne, 12 cm
Rongeur nach Pearson
Schere chirurgisch, spitz-
stumpf, gebogen
Schere chirurgisch, spitz-
stumpf, gerade
KG, Karlsruhe
Carl Roth GmbH & Co.
KG, Karlsruhe
Fine Science Tools,
Heidelberg
Fine Science Tools,
Heidelberg
WDT, Garbsen -
WDT, Garbsen -
Skalpellgriff Aesculap, klein WDT, Garbsen -
Sonde, gerade, spitz, 15,5 cm Fine Science Tools,
Verbandsschere nach Lister,
20 cm
Wundspreizer modifiziert nach
Alm
10.6 Geräte
Absaugpumpe mit Schlauch für
Flüssigkeiten,Typ EKF 56 ex-4
Auflichtstereomikroskop Leica
MZ6
Heidelberg
WDT, Garbsen -
Fine Science Tools,
Heidelberg
Greifenberger
Antriebstechnik,
Marktredwitz
Leica, Wetzlar -
-
-
-
-
16015-17
-
-
-

Autoklav Typ 23 Melag oHG
184
Medizintechnik, Berlin
Typ 23
Autoklav, Type DE-65 Systec GmbH, Wettenberg DE-65
CCD Kamera ColorView III Olympus Soft Imaging
Solutions GmbH, Münster
CO2-Flasche Linde, Höllriegelskreuth
CO2-Inkubator, Typ B 5060
EK-CO2
Computereinheit mit Software:
cellP, MS Excel, MS Word,
Graph Pad Prism 4
Durchlichtmikroskop, Nikon
Eclipse 80i
Heraeus Instruments,
Hanau
Olympus, Hamburg -
Nikon Instruments Inc.,
USA
IEEE 1394 A
26136000
Eismaschine, Typ ZBE 70-35 Ziegra, Isernhagen ZBE 70-35
Haarschneidemaschine
Contura, Typ HS61
Inverses Materialmikroskop
Axiovert 25C
Kühlgefrierkombination, Typ
56134, 4 °C, -20°C
Wella, Darmstadt -
Carl Zeiss AG,
Oberkochen
Liebherr, Bieberach -
Laborabzug, TA 1500 S Bense GmbH, Hardegsen -
Laborwaage, Typ 440-49 N Kern & Sohn GmbH,
Magnetrührer mit Heizplatte,
K-RET basic
Magnetrührer mit Heizplatte,
MR-Hei-Standard
Mehrkanalpipette,
Transferpette ® S-8, 30-300 µl
Mikroliterpipette pipetman ® ,
10 µl
Balingen
IKA-Werke GmbH & Co.
KG, Staufen
Heidolph, Schwabach -
BRAND GmbH + Co KG,
Wertheim
-
451205
Gilson Inc., Frankreich U72427C
-
-

Mikroliterpipette pipetman ® ,
1000 µl
Mikroliterpipette pipetman ® ,
200 µl
Multifunktionsprozessor RX6
Lautsprechertreibereinheit
(ED 1)
Freifeld-Lautsprecher (ES 1)
Niedrig-Impedanz-Headstage
(RA4LI)
RA4PA 4-channel Medusa
preamp
Mikrophonverstärker 1 MA 3
185
Gilson Inc., Frankreich S50646B
Gilson Inc., Frankreich T69871N
Tucker-Davis
Technologies (TDT),
Alachua, FL, USA
multipette ® plus Eppendorf AG, Hamburg -
Nadelelektroden, 12 mm Medtronic Xomed,
Jacksonville, FL,
USA
Neubauer-Zählkammer Omnilab, Bremen -
Olympus inverses Mikroskop,
Typ CKX 41
Olymps Europa GmbH,
Hamburg
-
939125
pH-Meter, Sartorius PB-20 Omnilab, Gehrden PB-20
Photometer MicoplateReader
MRX
Pipettierhelfer pipetus ® -
Standard
Reagenzglasschüttler, REAX
2000
Reinstwasseraufbereitung:
Milli-Q
Biocel System Gard 2
Dynatech Laboratories
Inc., Chantilly, VA, USA
Hirschmann ® Laborgeräte,
Eberstadt
Heidolph, Schwabach -
Millipore GmbH,
Schwalbach
Rotationsmikrotom Slee, Mainz -
-
SZ27
-

Cut 6062
Schallschutzkammer,
maßangefertigt
Sicherheitswerkbank CA/REV
4
186
Industrial Acoustics
Company GmbH,
Niederkrüchten
Stativmikroskop OPMI-6-M Carl Zeiss AG,
Stereomikroskop Nikon SMZ
1000
Clean Air, Haan CA/REV 4
Oberkochen
Nikon Instruments Inc.,
USA
Streckbad Typ 1052 GFL, Burgwedel -
Temperaturregler TC-1000 und
Wärmematte
Wärmebad Type B 465 Büchi Labortechnik
Wärmeinkubator HERA cell
150
Wärmematte Hico-Aquatherm
660 mit Polyurethan
Wassermatte 50 cm x 30
CWE, Inc., PA, USA Seriennummer 273190
GmbH, Flawil, Schweiz
Heraeus Instruments,
Hanau
Fa. Hirtz, Köln -
Wärmeschrank Typ B 6 Heraeus Instruments,
Wärmeschrank, Thermo
Scientific, Typ 12P
Hanau
Heraeus Instruments,
Hanau
Zentrifuge, Centrifuge 5804R EPPENDORF-
NETHELER-HINZ
GmbH, Hamburg
-
-
08-13015
-
-
Best.Nr. 50042301
Best.Nr. 50042304
-

187
10.7 Einfluss der Testsubstanzen auf die Vitalität dendritischer Zellen
Vitalitätswerte der dendritischen Zellen nach Inkubation mit den jeweiligen Testsubstanzen und LPS-
Stimulation. Die Werte sind als Zahlenwerte einheitslose Relativwerte und geben die optische Dichte
wieder. Hohe Werte korrelieren mit einer ungestörten Vitalität der Zellen. Die Werte der LNC FITC-
und LNC FITC ROLIPRAM-Gruppe sind durch den Fluoreszenzmarker FITC beeinflusst und zeigen
eine falsch positive Erhöhung (6.1.6); n=3.
ROLIPRAM 0,01 µmol 0,414 0,399 0,391
ROLIPRAM 0,1 µmol 0,406 0,419 0,417
ROLIPRAM 1 µmol 0,4 0,413 0,423
ROLIPRAM 10 µmol 0,421 0,367 0,433
LNC FITC ROLIPRAM 0.01 µmol 0,502 0,399 0,416
LNC FITC ROLIPRAM 0,1 µmol 0,411 0,374 0,438
LNC FITC ROLIPRAM 1 µmol 0,446 0,499 0,455
LNC FITC ROLIPRAM 10 µmol 0,922 0,84 0,784
LNC BLANK 0,01 µmol 0,497 0,482 0,476
LNC BLANK 0,1 µmol 0,42 0,431 0,418
LNC BLANK 1 µmol 0,493 0,451 0,463
LNC BLANK 10 µmol 0,172 0,249 0,186
LNC FITC 0,01 µmol 0,497 0,422 0,396
LNC FITC 0,1 µmol 0,429 0,42 0,359
LNC FITC 1 µmol 0,519 0,474 0,446
LNC FITC 10 µmol 0,67 0,654 0,619
DMSO (Vehikelkontrolle) 0,32 0,319 0,322
LPS (Positivkontrolle) 0,518 0,465 0,444

Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation
188
„Untersuchungen zum biologischen Effekt von Rolipram sowie in Lipidnanokapseln
eingeschlossenem Rolipram auf Spiralganglienzellen und dendritische Zellen in vitro
und Spiralganglienzellen in vivo“
selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch
genommen:
1. Die Materialien und Geräte wurden von der Klinik für Hals-Nasen-Ohren-
Heilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover (Leiter: Prof. Prof. Dr. Th. Lenarz)
zur Verfügung gestellt.
2. Die verwendeten Nanopartikel wurden von den Mitarbeitern des „Laboratoire d’Ingénierie
de la Vectorisation Particulaire, INSERM U646 University of Angers, Angers, Frankreich“
hergestellt und zur Verfügung gestellt.
3. Die Präparation der Spiralganglien zur Gewinnung der Spiralganglienzellen wurde
dankenswerter Weise von Frau Heike Bürger übernommen.
4. Die statistische Auswertung erfolgte unter Anleitung von Frau Annika Müller-Heine,
Biometrie der Medizinischen Hochschule Hannover.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- oder Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir
unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im
Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation bei folgenden Institutionen angefertigt:
Klinik für Hals- Nasenund Ohrenheilkunde der Medizinischen Hochschule Hannover.
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tiermedizinischen Hochschule
Hannover
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen und der Wahrheit
entsprechend gemacht habe.
Hannover, den 14.04.2011

Danksagung
189
Als erstes möchte ich Herrn Prof. T. Stöver für die Überlassung dieses höchstinteressanten
Dissertationsthemas danken. Durch seine unkomplizierte und sympathische Art konnte er mir
in aufgetretenen Problemsituationen stets weiterhelfen. Seine außerordentlich beeindruckende
Arbeits- und Berufsauffassung haben mir in hohem Maße imponiert und werden mir
weiterhin ein großes Vorbild sein.
Herrn Prof. W. Bäumer, meinem Doktorvater an der Tierärztlichen Hochschule Hannover,
möchte ich ganz herzlich für die wunderbare Zusammenarbeit und die Betreuung meiner
Doktorarbeit danken. Sein unermüdliches Engagement und seine ausgesprochen freundliche
Art haben mich in besonderem Maße beeindruckt. Die Betreuung hätte ich mir nicht besser
vorstellen können.
Herrn Prof. Prof. Dr. T. Lenarz, dem Leiter der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde der
Medizinischen Hochschule Hannover, möchte ich ganz herzlich für die Bereitstellung des
Arbeitsplatzes sowie der Arbeitsmittel danken.
Frau Dr. Verena Scheper möchte ich in ganz besonderem Maße für die wissenschaftliche
Betreuung und Unterstützung während meiner Zeit an der MHH danken. Sie hat es stets
verstanden mich in schwierigen Momenten zu motivieren. Weiterhin konnte sie durch ihren
beispiellosen Einsatz so manches Problem lösen, welches zunächst ausweglos erschien.
Den Mitarbeitern Florian Fouchet, Guillaume Bastiat und Patrick Saulnier des „Laboratoire
d’Ingénierie de la Vectorisation Particulaire, INSERM U646 University of Angers, Angers,
Frankreich“, danke ich für die Herstellung und Bereitstellung der in dieser Studie
verwendeten Nanopartikel.

190
Herrn Dr. Henning Voigt danke ich zuallererst für seine ausgesprochen humorvolle
Kollegialität. Es war mir stets eine ganz besondere Freude seinen Sinn für Humor teilen zu
dürfen. Aber nicht weniger möchte ich ihm für seine schier grenzenlose Geduld und
Hilfsbereitschaft in diversen Fragestellungen danken.
Für die besonders liebevolle Betreuung meiner Meerschweinchen möchte ich mich bei Nicki
und Claudia bedanken, die immer zur Stelle waren, wenn ich nicht dazu die Möglichkeit
hatte.
Heike und Darja möchte ich für die unendliche Geduld und die vielen Erklärungen danken.
Ich konnte in so vielen Dingen von ihren Erfahrungen lernen, wofür ich mich nochmals
bedanken möchte.
Frau Dr. Athanasia Warnecke, Frau Dr. Kirsten Wissel, Frau Alexandra Gellert, Herrn Dr.
Gerrit Paasche und Herrn Thilo Rode danke ich dafür mir wichtige Ideen und Denkanstöße
gegeben zu haben, und dass sie immer spontan bereit waren mir in wichtigen Fragestellungen
weiterzuhelfen.
Herrn Peter Erfurt danke ich für die unkomplizierte Art mir in praktischen Fragestellungen
immer ein guter Ratgeber gewesen zu sein.
Frau Annika Müller-Heine danke ich für die Beratung bei der Auswahl geeigneter
statistischer Auswertungsmethoden.
Weiterhin danke ich meinen lieben Kollegen und Mitdoktoranden aus dem dritten Stock für
ihre Hilfsbereitschaft und Gesellschaft. Es war mir immer eine Freude mit Tanja, Piera,
Antonina, Mareike, Annett, Odett, Alice, Feli, Nadine, Alexander, Ronnie und Werner neben
der Arbeit auch über Persönliches reden zu können.

191
Auch die Mitarbeiter und Doktoranden des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie der Tiermedizinischen Hochschule Hannover sollen nicht vergessen werden,
wobei mein besonderer Dank für zeitraubenden Anleitungen und Erklärungen an Katrin und
Viktoria geht. Aber auch allen anderen Mitarbeitern sei gedankt, die mir bei Fragen immer
sofort Auskunft geben konnten.
Meiner Familie danke ich für die Unterstützung und den Halt, ohne die ich mein Studium und
auch die Zeit meiner Doktorarbeit nur schwer hätte meistern können.
Zu allerletzt gilt mein ganz besonderer Dank Nicole. Ohne ihre Unterstützung und ihren Rat
wären die letzten Jahre nicht vorstellbar gewesen. Aus tiefem Herzen möchte ich mich für
ihre bedingslose Unterstützung und vor allem für ihre Geduld bedanken. Der für diese Arbeit
entscheidende Abend in der Küche wird uns immer in Erinnerung bleiben. Ich habe durch sie
die nötige Kraft und Motivation gewonnen, meine eigenen Ziele sogar zu übertreffen.