Zentralbereich Geschäftsleitung

Institut für
Medizinische Genetik
und Angewandte
Genomik
Diagnostisches Next-Generation-Sequencing Panel
XLMR Sequenzierung bei mentaler Retardierung
Hintergrundinformation und Methodenbeschreibung
Version 4; Stand 28.06.2013; freigegeben von Peter Bauer
Prof. Dr. med. Olaf Riess (Direktor)
Kontaktinformationen
Klinische Fragestellungen, Einschlusskriterien
Dr. med. Andreas Tzschach
Tel: 07071 29 72288
Fax: 07071 29 5171
Email: andreas.tzschach@med.uni-tuebingen.de
Laborleitung
Prof. Dr. med. Peter Bauer
Tel: 07071 29 77692
Fax: 07071 29 5172
Email: peter.bauer@med.uni-tuebingen.de
Calwerstrasse 7
DE 72076 Tübingen
Prof. Dr. med. Peter Bauer
Leiter Molekulargenetik
Tel. 07071/29-77692
Fax 07071/29-5172
peter.bauer@med.uni-tuebingen.de
Kurzbeschreibung
Bei Patienten mit Verdacht auf X-chromosomale mentale Retardierung (XLMR)
werden 107 bekannte XLMR-Gene durch spezifische Anreicherung (Agilent X-Seq
SureSelect) und Next-Generation-Sequencing (Illumina GAIIx 2x 76 bp paired-end)
analysiert.
Einschlusskritierien / mitgeforderte Unterlagen
• Analysen dürfen nur durch Fachärzte für Humangenetik veranlasst werden
• Als Voruntersuchungen sind erforderlich:
o Klinisch-genetische Begutachtung (Ausschluss einer syndromalen
Erkrankung)
o Hochauflösende Chromosomenuntersuchung (SNP-Array oder Array-
CGH)
o Ausschluss Fragiles-X-Syndrom
• DNA (Blut) Proben des Patienten und der Mutter (mindestens 20 µg DNA bzw. 5
ml EDTA-Blut)
• Relevante klinische Angaben (z.B. Kopie des genet. bzw. pädiatrischen
Gutachtens)
• Fotografien des Indexpatienten
• GenDG konformes schriftliches Einverständnis
• Kostenübernahmeerklärung der Krankenkasse (ein Begründungsschreiben stellen
wir gerne zur Verfügung)
Analysedauer / Technischer Ablauf / Datenspeicherung / Resultate
Analysedauer: Sobald die Analyse im Labor begonnen werden kann (der Auftrag
vollständig vorliegt) benötigen wir etwa 8 Wochen für die Sequenzierung, 4 Wochen
für die Datenanalyse und ggfs. weitere 4-8 Wochen für Validierungssequenzierungen.
Insgesamt dauert die Analyse also 12-20 Wochen.
Universitätsklinikum Tübingen
Anstalt des öffentlichen Rechts
Sitz Tübingen
Geissweg 3 • 72076 Tübingen
Tel. 07071/29-0
www.medizin.uni-tuebingen.de
Steuer-Nr. 86156/09402
USt.-ID: DE 146 889 674
Aufsichtsrat
Hartmut Schrade (Vorsitzender)
Vorstand
Prof. Dr. Michael Bamberg (Vorsitzender)
Gabriele Sonntag (Stellv. Vorsitzende)
Prof. Dr. Karl Ulrich Bartz-Schmidt
Prof. Dr. Ingo B. Autenrieth
Jana Luntz
Baden-Württembergische Bank Stuttgart
BLZ 600 501 01 Konto-Nr. 7477 5037 93
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Institut für
Medizinische Genetik &
Angewandte Genomik
Technischer Ablauf: Die Sequenzierung umfasst die (1) Fragmentierung der DNA (Covaris) auf 200-500 bp Bibliotheken, (2)
die Ligation von Sequenzieradapter, die auch Molekulare Barcodes (MIDs) enthalten, (3) das Anreichern von X-
chromosomalen Exonen mittels Agilent SureSelect in-solution Technologie, (4) Qualitätskontrolle und Quantifizierung der X-
ome Bibliothek, (5) paired-end Sequenzierung der DNA-Bibliothek durch Illumina GAIIx Technologie (mindestens 2x 76 bp).
Die bioinformatische Analyse der Sequenzierdaten geschieht durch folgende Schritte:
• Mapping der Reads auf das hg19 Referenzgenom (Stampy)
• Detektion von Varianten: SNPs, SNVs, kleine Deletionen und Insertionen (SAMtools)
• Annotation der Varianten mit Daten aus den Datenbanken dbSNP und 1000 Genomes (Annovar).
• Extraktion aller Varianten, die in CCDS-Regionen der XLMR-Genliste liegen.
Neben der Suche nach kleinen intra-exonischen Deletionen wird mittels einer statistischen Analyse nach Deletionen von
kompletten Exons gesucht. Diese Analyse erfasst keine Duplikationen und ist auch bei Frauen nicht verlässlich anwendbar.
Resultate: Mit Abschluss der Analysen wird ein schriftlicher Befund erstellt.
Pathogene Mutationen sowie unklassifizierte Varianten in den benannten 102 Genen werden tabellarisch mitgeteilt und
hinsichtlich ihrer möglichen Pathogenität gewertet. Ebenso werden nicht-ausreichend analysierte Teilbereiche
(„Analyselücken“) exakt benannt. Alle plausibel pathogen gewerteten Varianten werden durch konventionelle
Sequenzierung bestätigt. In einigen Fällen wird es für die Beurteilung der Krankheitsrelevanz von Varianten notwendig sein,
molekulargenetische Tests auch bei Angehörigen durchzuführen (Ko-Segregations-Analysen).
Limitationen:
• Die NGS-Diagnostik ist nicht in der Lage, Repeat-Expansions-Mutationen (FMR1, AR, ARX) abzubilden.
• Potentielle Splice-Site Mutationen werden nur innerhalb der hochkonservierten Konsensus-Bereiche (+/- 5 Basen vom
Exon-Intron-Übergang) analysiert.
• Das publizierte XLMR-Gen ABCD1 kann wegen homologer Geninformationen nicht spezifisch sequenziert werden und
wurde deshalb von der Panel-Liste genommen.
• Bei Männern sind regelmäßig 2-4% aller kodierenden Basen mit weniger als 10 unabhängigen Sequenzierungen (Reads)
abgedeckt. Diese Regionen werden im Befund detailliert. Krankheitsverursachende Mutationen in diesen Regionen
können technisch nicht sicher gefunden werden. Insbesondere das ARX- und IKBKG-Gen (sehr GC-reich) können kaum
beurteilt werden. Für acht Gene (IKBKG, IQSEC2, ARX, MBTPS2, PCDH9, SLC16A9, SOX3 und ZNF81) können weniger als
80% des Leserahmens vollständig ausgewertet werden. Sie 2% der fehlenden Abdeckung aus und sollten bei gezieltem
Verdacht konventionell komplettiert werden.
• Das DMD-Gen wird nur in die Auswertung aufgenommen, wenn das Einverständnis die Möglichkeit einschließt, zufällig
Exon-Deletionen zu finden, die nicht zu einer mentalen Retardierung wohl aber zu einer Muskelerkrankung führen
können.
Genliste (107 publizierte XLMR Gene)
ACSL4, AFF2, AGTR2, AIFM1, AP1S2, ARHGEF6, ARHGEF9, ARX * , ATP6AP2, ATP7A, ATRX, BCOR, BRWD3, CASK, CDKL5, CLCN4,
CUL4B, DCX, DKC1, DLG3, DMD * , EIF2S3, FANCB, FGD1, FLNA, FMR1, FTSJ1, GDI1, GK, GPC3, GRIA3, HCCS, HCFC1, HDAC8,
HPRT1, HSD17B10, HUWE1, IDS, IGBP1, IKBKG * , IL1RAPL1, IQSEC2 * , KDM6A, KDM5C, KIAA2022, KLF8, L1CAM, LAMP2, LAS1L,
MAGT1, MAOA, MBTPS2, MECP2, MED12, MID1, MTM1, NAA10, NDP, NDUFA1, NHS * , NLGN3, NLGN4X, NSDHL, NXF5, OCRL, OFD1,
OPHN1, OTC, PAK3, PCDH19, PDHA1, PGK1, PHF6, PHF8, PLP1, PORCN, PQBP1, PRPS1, PTCHD1, RAB39B, RAB40AL, RBM10,
RPL10, RPS6KA3, SHROOM4, SLC6A8, SLC9A6, SLC16A2, SMC1A, SMS, SOX3, SRPX2, SYP, SYN1, THOC2, TIMM8A, TSPAN7,
UBE2A, UPF3B, WDR45, ZDHHC15, ZDHHC9, ZMYM3, ZNF41, ZNF674, ZNF711, ZNF81
* Siehe „Limitationen“
Referenzen
Lubs et al. (2012) Am J Hum Genet; 90: 579-590; Tarpey et al. (2009) Nat Genet; 41: 535-543. Rinaldi et al. (2012) Am J Hum Genet;
91:1095-1102.Haak et al (2012) Am J Hum Genet: 91: 1144-1149.
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