Rekombinante Expression des IL-4-induzierenden Schistosomen-Ei ...
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Aus dem Forschungszentrum Borstel<br />
Leibniz-Zentrum für Medizin und Biowissenschaften<br />
Abteilung Klinische Medizin<br />
Direktor: Prof. Dr. P. Zabel<br />
<strong>Rekombinante</strong> <strong>Expression</strong> <strong>des</strong> <strong>IL</strong>-4-<strong>induzierenden</strong><br />
<strong>Schistosomen</strong>-<strong>Ei</strong>-Proteins IPSE zur Untersuchung eines<br />
neuartigen Mechanismus der Basophilenaktivierung<br />
Inauguraldissertation<br />
zur Erlangung der Doktorwürde<br />
der Universität zu Lübeck<br />
- Technisch-Naturwissenschaftliche Fakultät -<br />
vorgelegt von<br />
Maren Wodrich<br />
aus Hamburg<br />
Lübeck 2006
Diese Arbeit wurde in der Laborgruppe<br />
Zelluläre Allergologie<br />
(Leiter: PD Dr. med. H. Haas)<br />
am Forschungszentrum Borstel angefertigt<br />
1. Berichterstatter: Prof. Dr. K.-O. Holst<br />
2. Berichterstatter: PD Dr. H. Haas<br />
Tag der mündlichen Prüfung: 5. Juli 2006
Inhaltsverzeichnis<br />
Inhaltsverzeichnis<br />
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................................................ 6<br />
Zusammenfassung................................................................................................................................................. 8<br />
1 <strong>Ei</strong>nleitung..................................................................................................................................................... 10<br />
1.1 Das Th1/Th2-Konzept .......................................................................................................................... 11<br />
1.2 Induktion einer differenzierten Th-Antwort.......................................................................................... 12<br />
1.3 Basophile Granulozyten....................................................................................................................... 13<br />
1.4 Helminthen induzieren eine Th2-Immunantwort.................................................................................. 14<br />
1.5 Schistosoma mansoni als Modellorganismus zur Untersuchung der Th2-Induktion ........................... 16<br />
1.6 IPSE - ein sekretiertes Schistosoma mansoni-Protein setzt <strong>IL</strong>-4 aus humanen Basophilen frei .......... 17<br />
1.7 Ziel dieser Arbeit.................................................................................................................................. 19<br />
2 Materialien................................................................................................................................................... 20<br />
2.1 Reagenzien ........................................................................................................................................... 20<br />
2.2 Häufig verwendete Puffer und Nährmedien......................................................................................... 23<br />
2.2.1 Puffer ........................................................................................................................................ 23<br />
2.2.2 Nährmedien............................................................................................................................... 24<br />
2.3 Antibiotika............................................................................................................................................ 25<br />
2.4 Antikörper ............................................................................................................................................ 25<br />
2.5 Synthetische Oligonukleotide ............................................................................................................... 26<br />
2.6 Plasmidvektoren................................................................................................................................... 28<br />
2.7 Zelllinien .............................................................................................................................................. 29<br />
2.7.1 Bakterienstämme ...................................................................................................................... 29<br />
2.7.2 Eukaryotische Zelllinien ........................................................................................................... 29<br />
1
Inhaltsverzeichnis<br />
3 Methoden ..................................................................................................................................................... 30<br />
3.1 Allgemeine molekularbiologische Arbeiten.......................................................................................... 30<br />
3.1.1 Kultur und Lagerung von E. coli .............................................................................................. 30<br />
3.1.2 Transformation von E. coli-Zellen............................................................................................ 30<br />
3.1.2.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen ........................................................... 30<br />
3.1.2.2 Elektroporation von E. coli-Zellen.............................................................................. 31<br />
3.1.3 Präparation von Plasmid-DNA ................................................................................................. 31<br />
3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese....................................................................................................... 32<br />
3.1.5 Bestimmung der DNA-Konzentration ...................................................................................... 32<br />
3.1.6 Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction, PCR) ............................................. 33<br />
3.1.7 Reinigung von DNA-Fragmenten aus PCR-Ansätzen .............................................................. 33<br />
3.1.8 Zwischenklonierung in einen TA-Klonierungsvektor............................................................... 34<br />
3.1.9 Fällung von DNA...................................................................................................................... 34<br />
3.1.10 DNA-Sequenzierung................................................................................................................. 34<br />
3.1.11 Restriktion von DNA ................................................................................................................ 35<br />
3.1.12 Isolierung von DNA-Fragmenten durch Gelelution.................................................................. 35<br />
3.1.13 Ligation von geschnittenen DNA-Fragmenten ......................................................................... 35<br />
3.1.14 Klonierung der verwendeten Plasmid-Vektoren....................................................................... 36<br />
3.2 <strong>Expression</strong> von IPSE in E. coli............................................................................................................. 37<br />
3.2.1 <strong>Expression</strong> von rekombinantem IPSE in E. coli im kleinen Maßstab (20 ml).......................... 37<br />
3.2.2 <strong>Expression</strong> von rekombinantem IPSE in E. coli im großen Maßstab (2000 ml)....................... 37<br />
3.3 Reinigung von rekombinantem IPSE aus E. coli.................................................................................. 38<br />
3.3.1 Reinigung von MBP-IPSE........................................................................................................ 38<br />
3.3.1.1 Reinigung von MBP-IPSE über Amylose-Affinitätschromatographie ....................... 38<br />
3.3.1.2 Reinigung von MBP-IPSE über Gelfiltration ............................................................. 38<br />
3.3.2 Reinigung von IPSE aus E. coli Origami-Zellen ...................................................................... 39<br />
3.4 293 HEK-Zellen ................................................................................................................................... 40<br />
3.4.1 Kultur und Lagerung von 293 HEK-Zellen .............................................................................. 40<br />
3.4.2 Transfektion von 293 HEK-Zellen ........................................................................................... 40<br />
3.4.3 <strong>Expression</strong> von rekombinantem IPSE in 293 HEK-Zellen ....................................................... 41<br />
3.5 Insektenzellen ....................................................................................................................................... 42<br />
3.5.1 Kultur und Lagerung von Insektenzellen.................................................................................. 42<br />
3.5.2 Transfektion von Insektenzellen ............................................................................................... 42<br />
3.5.3 <strong>Expression</strong> von rekombinantem IPSE in Insektenzellen........................................................... 43<br />
2
Inhaltsverzeichnis<br />
3.6 Reinigung von rekombinantem IPSE aus eurkaryotischen Zellen........................................................ 44<br />
3.6.1 Immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC)......................................................... 44<br />
3.6.2 Immunoaffinitätschromatographie............................................................................................ 44<br />
3.6.2.1 Herstellung einer anti-IPSE-Säule .............................................................................. 44<br />
3.6.2.2 Proteinreinigung von IPSE über eine anti-IPSE-Säule ............................................... 45<br />
3.6.3 Reinigung von HEK-IPSE über Gelfiltration ........................................................................... 45<br />
3.7 Allgemeine proteinchemische Methoden.............................................................................................. 46<br />
3.7.1 Bestimmung der Proteinkonzentration...................................................................................... 46<br />
3.7.1.1 Bestimmung der Proteinkonzentration über spektralphotometrische<br />
Absorptionsmessung................................................................................................... 46<br />
3.7.1.2 Proteinbestimmung mit der BCA-Methode (Smith et al. 1985) ................................. 46<br />
3.7.2 Dialyse von Proteinlösungen .................................................................................................... 47<br />
3.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli (1970) .......................... 47<br />
3.7.4 Färbung von Polyacrylamidgelen ............................................................................................. 49<br />
3.7.4.1 Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick (1988)............................................... 49<br />
3.7.4.2 Coomassie-Färbung nach Neuhoff et al. (1988) ......................................................... 50<br />
3.7.5 Westernblot............................................................................................................................... 50<br />
3.7.5.1 Proteinnachweis im Westernblot über India Ink-Färbung<br />
(Hancock und Tsang, 1983)........................................................................................ 51<br />
3.7.5.2 Spezifischer Proteinnachweis und Antikörperbindung im Westernblot ..................... 51<br />
3.7.6 Biotinylierung von Proteinen.................................................................................................... 52<br />
3.8 Methoden zur Untersuchung von IPSE ................................................................................................ 53<br />
3.8.1 Doppelimmunodiffusionsassay nach Ouchterlony.................................................................... 53<br />
3.8.2 Deglycosylierung von Proteinen............................................................................................... 54<br />
3.8.3 Massenspektrometrische Untersuchung mit MALDI-TOF-MS................................................ 54<br />
3.8.4 Kristallisation............................................................................................................................ 55<br />
3.9 Methoden zur Untersuchung der Wirkung von IPSE auf basophile Granulozyten .............................. 57<br />
3.9.1 Aufreinigung humaner basophiler Granulozyten...................................................................... 57<br />
3.9.1.1 Ficoll/Percoll Dichtegradienten-Zentrifugation .......................................................... 57<br />
3.9.1.2 Gegenstrom-Elutriation .............................................................................................. 57<br />
3.9.1.3 Bestimmung von Zellzahl und Basophilenreinheit ..................................................... 58<br />
3.9.1.4 Negative Selektion mit immunomagnetischen Beads................................................. 58<br />
3.9.2 Stimulation der Basophilen zur <strong>IL</strong>-4-Freisetzung..................................................................... 58<br />
3.9.3 Stripping und Resensibilisierung von Basophilen .................................................................... 59<br />
3.9.4 <strong>IL</strong>-4-ELISA............................................................................................................................... 59<br />
3.9.5 Anfertigung von Zytospinpräparaten ........................................................................................ 60<br />
3.9.6 Durchflusszytometrie (FACS) .................................................................................................. 60<br />
3.9.6.1 Nachweis der Bindung von IPSE an Basophile .......................................................... 60<br />
3.9.6.2 Nachweis von CD203c an der Oberfläche von Basophilen ........................................ 61<br />
3
Inhaltsverzeichnis<br />
4 Ergebnisse.................................................................................................................................................... 62<br />
4.1 <strong>Expression</strong> von IPSE in E. coli............................................................................................................. 62<br />
4.1.1 Klonierung der Sequenz von IPSE in unterschiedliche <strong>Expression</strong>svektoren .......................... 62<br />
4.1.1.1 pET26-IPSE................................................................................................................ 62<br />
4.1.1.2 pBM1.1-IPSE.............................................................................................................. 63<br />
4.1.1.3 pMalC-IPSE und pMalP-IPSE.................................................................................... 64<br />
4.1.2 Optimierung der <strong>Expression</strong> von IPSE in E. coli durch Variation der <strong>Expression</strong>sparameter.. 65<br />
4.1.2.1 Periplasmatische <strong>Expression</strong> von IPSE....................................................................... 65<br />
4.1.2.2 <strong>Ei</strong>nfluss der Temperatur auf die IPSE-<strong>Expression</strong>...................................................... 65<br />
4.1.2.3 <strong>Ei</strong>nfluss von Salzstress auf die IPSE-<strong>Expression</strong>........................................................ 66<br />
4.1.2.4 <strong>Ei</strong>nfluss der IPTG-Konzentration auf die IPSE-<strong>Expression</strong> ....................................... 67<br />
4.1.3 Optimierung der <strong>Expression</strong> von IPSE in E. coli durch <strong>Expression</strong> als Fusionsprotein ........... 68<br />
4.1.3.1 <strong>Expression</strong> von IPSE als MBP-Fusionsprotein........................................................... 68<br />
4.1.3.2 <strong>Expression</strong> von IPSE als Thioredoxin-Fusionsprotein................................................ 71<br />
4.2 <strong>Expression</strong> von IPSE in eukaryotischen Zellen.................................................................................... 73<br />
4.2.1 <strong>Expression</strong> und Reinigung von IPSE aus 293 HEK-Zellen (HEK-IPSE)................................. 73<br />
4.2.1.1 IPSE wird von 293 HEK-Zellen exprimiert und ins Medium sekretiert..................... 73<br />
4.2.1.2 Das <strong>Expression</strong>soptimum für HEK-IPSE liegt bei 10 bis 11 Tagen........................... 74<br />
4.2.1.3 HEK-IPSE kann über zwei Schritte aus dem <strong>Expression</strong>smedium<br />
aufgereinigt werden .................................................................................................... 75<br />
4.2.1.4 Bilanzierung der Aufreinigung von HEK-IPSE.......................................................... 78<br />
4.2.2 Strukturelle Untersuchungen von HEK-IPSE........................................................................... 79<br />
4.2.2.1 HEK-IPSE ist ein Dimer............................................................................................. 79<br />
4.2.2.2 Auftrennung von gereinigtem HEK-IPSE in der Gelfiltration.................................... 79<br />
4.2.2.3 Molekulargewichtsbestimmung von HEK-IPSE über MALDI-TOF-MS .................. 81<br />
4.2.2.4 HEK-IPSE ist glycosyliert .......................................................................................... 82<br />
4.2.2.5 Kristallisation von HEK-IPSE .................................................................................... 84<br />
4.2.3 <strong>Expression</strong> und Reinigung von IPSE aus High Five-Zellen (High Five-IPSE) ........................ 86<br />
4.2.3.1 IPSE wird von High Five-Zellen exprimiert und ins Medium sekretiert .................... 86<br />
4.2.3.2 Das <strong>Expression</strong>soptimum für High Five-IPSE liegt bei 8 Tagen................................ 87<br />
4.2.3.3 High Five-IPSE kann über zwei Schritte aufgereinigt werden ................................... 88<br />
4.2.3.4 High Five-IPSE ist ein Dimer ..................................................................................... 91<br />
4.3 Funktionelle Untersuchungen von rekombinantem IPSE..................................................................... 92<br />
4.3.1 HEK-IPSE und High Five-IPSE führen zur <strong>IL</strong>-4-Freisetzung aus Basophilen......................... 92<br />
4.3.2 Die <strong>IL</strong>-4-Freisetzung der Basophilen nach Stimulation mit HEK-IPSE ist IgE-abhängig ....... 93<br />
4.3.3 Basophile degranulieren nach Stimulation mit HEK-IPSE und High Five-IPSE ..................... 94<br />
4.3.4 Inkubation mit HEK-IPSE führt zu einer allgemeinen Aktivierung der Basophilen ................ 96<br />
4.3.5 HEK-IPSE und High Five-IPSE binden Immunglobuline........................................................ 97<br />
4.3.6 HEK-IPSE führt nicht zu einer Quervernetzung von Immunglobulinen .................................. 99<br />
4
Inhaltsverzeichnis<br />
5 Diskussion .................................................................................................................................................. 101<br />
5.1 <strong>Expression</strong> von IPSE in E. coli........................................................................................................... 101<br />
5.1.1 Proteingewinnung über in vitro-Rückfaltung.......................................................................... 101<br />
5.1.2 Strategien zur Gewinnung von löslichem IPSE in E. coli....................................................... 103<br />
5.1.2.1 Variation der <strong>Expression</strong>stemperatur........................................................................ 103<br />
5.1.2.2 Periplasmatische <strong>Expression</strong>..................................................................................... 103<br />
5.1.2.3 Erniedrigung der Induktorkonzentration................................................................... 105<br />
5.1.2.4 <strong>Expression</strong> von IPSE als Fusionsprotein .................................................................. 106<br />
5.2 <strong>Expression</strong> von IPSE in eukaryotischen Zellen.................................................................................. 108<br />
5.2.1 <strong>Expression</strong> von IPSE in 293 HEK-Zellen............................................................................... 108<br />
5.2.1.1 <strong>Expression</strong>................................................................................................................. 108<br />
5.2.1.2 Reinigung.................................................................................................................. 108<br />
5.2.1.3 Ausbeute ................................................................................................................... 109<br />
5.2.1.4 Dimerisierung ........................................................................................................... 110<br />
5.2.1.5 Molekulargewicht ..................................................................................................... 110<br />
5.2.1.6 Glycosylierung.......................................................................................................... 111<br />
5.2.1.7 Kristallisation............................................................................................................ 113<br />
5.3.1 <strong>Expression</strong> von IPSE in High Five-Zellen .............................................................................. 114<br />
5.3.1.1 <strong>Expression</strong>................................................................................................................. 114<br />
5.3.1.2 Aufreinigung............................................................................................................. 115<br />
5.3.1.3 Ausbeute ................................................................................................................... 115<br />
5.3.1.4 Struktur ..................................................................................................................... 116<br />
5.4 Funktionelle Charakterisierung ......................................................................................................... 116<br />
5.5 Vergleich der <strong>Expression</strong>ssysteme ..................................................................................................... 119<br />
6 Literatur..................................................................................................................................................... 121<br />
6.1 Literaturquellen ................................................................................................................................. 121<br />
6.2 Zitierte Internetseiten ......................................................................................................................... 132<br />
7 Veröffentlichungen.................................................................................................................................... 133<br />
8 Danksagung ............................................................................................................................................... 134<br />
9 Lebenslauf.................................................................................................................................................. 136<br />
5
Abkürzungsverzeichnis<br />
Abkürzungsverzeichnis<br />
Neben den SI-<strong>Ei</strong>nheiten wurden folgende Abkürzungen verwendet:<br />
AAA Aleuria aurantia Agglutinin<br />
AP<br />
Alkalische Phosphatase<br />
APS Ammoniumperoxodisulfat<br />
aqua <strong>des</strong>t. <strong>des</strong>tilliertes Wasser<br />
BCA Bicinchoninsäure<br />
BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat<br />
bio<br />
biotinyliert<br />
bp<br />
Basenpaare<br />
BSA Rinderserumalbumin (englisch „bovine serum albumin“)<br />
cDNA komplementäre DNA (englisch „complementary DNA“)<br />
DMSO Dimethylsulfoxid<br />
DTT 1,4-Dithioerytriol<br />
E. coli Escherichia coli<br />
EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure<br />
ELISA englisch „enzyme linked immunosorbent assay“<br />
EtOH Ethanol<br />
FACS englisch „fluorescence activated cell sorter“<br />
FBS fötales Rinderserum (englisch „fetal bovine serum”)<br />
FcεRI Fcε-Rezeptor I<br />
FITC Fluoresceinisothiocyanat<br />
h<br />
Stunde (englisch „hour”)<br />
HBSS englisch „Hank´s balanced Salt Solution“<br />
HRP Meerrettichperoxidase (englisch „horseradish peroxidase”)<br />
IFN Interferon<br />
Ig<br />
Immunglobulin<br />
<strong>IL</strong><br />
Interleukin<br />
IMAC immobilisierte Metallaffinitäts-Chromatographie<br />
IMDM englisch „Iscove´s modified Dulbecco´s medium”<br />
IPSE Interleukin-4-induzieren<strong>des</strong> Prinzip aus Schistosoma mansoni-<strong>Ei</strong>ern<br />
IPTG Isopropylthiogalactosid<br />
kD<br />
Kilodalton<br />
6
Abkürzungsverzeichnis<br />
LB<br />
Luria-Broth<br />
LG<br />
Laborgruppe<br />
MALDI englisch „matrix assisted laser <strong>des</strong>orption/ionisation“<br />
MBP Maltosebindeprotein<br />
min Minute<br />
MS Massenspektroskopie<br />
n<br />
natürlich<br />
NBT 4-Nitroblautetrazoliumchlorid<br />
NTA N-Nitrilo-tri-essigsäure<br />
OD optische Dichte<br />
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese<br />
PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (englisch „phosphate-buffered saline“)<br />
PE<br />
Phycoerythrin<br />
Phl p Allergen <strong>des</strong> Wiesenlieschgrases Phleum pratense<br />
rpm Umdrehungen pro Minute (englisch „rounds per minute“)<br />
SavAP Streptavidin, das mit Alkalischer Phosphatase markiert ist<br />
SDS Natriumdodecylsulfat (englisch „sodium dodecyl sulfate“)<br />
S. mansoni Schistosoma mansoni<br />
SmEA Schistosoma mansoni-<strong>Ei</strong>-Antigen<br />
TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung (englisch „Tris-buffered saline“)<br />
TBST TBS mit Tween 20<br />
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin<br />
Th1 T-Helferzelle Typ 1<br />
Th2 T-Helferzelle Typ 2<br />
Th-Zelle T-Helferzelle<br />
TNF Tumornekrosefaktor<br />
TGF englisch „transforming growth factor”<br />
TOF englisch „time of flight”<br />
Tris Tris-(hydroxymethyl-)aminomethan<br />
TRX Thioredoxin<br />
v/v<br />
englisch „volume per volume”<br />
w/v englisch „weight per volume“<br />
x g<br />
Vielfaches der Erdbeschleunigung<br />
7
Zusammenfassung<br />
Zusammenfassung<br />
Typ-I-Allergien sind durch eine Th2-Immunantwort mit gesteigerter IgE-Synthese gekennzeichnet,<br />
wobei der Mechanismus der Entstehung einer Allergie immer noch nicht vollständig geklärt ist.<br />
Infektionen mit parasitären Würmern manifestieren sich ebenfalls in einer Th2-Immunantwort. Im<br />
Gegensatz zur Allergie, die nur einen Teil der Bevölkerung betrifft, führen Infektionen mit parasitären<br />
Würmern, wie z. B. Schistosoma mansoni sehr zuverlässig zu einer Th2-Immunantwort und stellen<br />
daher ein geeignetes Modell dar, den Mechanismus der Th2-Induktion zu untersuchen. Das<br />
Schlüsselzytokin für die Th2-Induktion ist Interleukin-(<strong>IL</strong>-)4, für welches basophile Granulozyten eine<br />
mögliche Primärquelle darstellen. In Tat wurde gefunden, dass Basophile nach Inkubation mit<br />
wässrigen Extrakten von S. mansoni-<strong>Ei</strong>ern (SmEA), dem für die Th2-Induktion verantwortliche<br />
Entwicklungsstadium dieses Wurms, sehr schnell große Mengen <strong>IL</strong>-4 freisetzen. Der für diesen Effekt<br />
verantwortliche Faktor konnte aus dem Gesamtextrakt isoliert werden und wurde IPSE (<strong>IL</strong>-4-<br />
induzieren<strong>des</strong> Prinzip aus Schistosoma mansoni <strong>Ei</strong>ern) genannt. IPSE ist ein sekretiertes<br />
Glycoprotein, das Immunglobuline bindet und Basophile zwar durch die Bindung an FcεRIgebundenem<br />
IgΕ allerdings nach bisherigen Befunden ohne Quervernetzung über einen neuartigen<br />
Mechanismus aktiviert. Für die weitere Untersuchung <strong>des</strong> Mechanismus der Wirkung von IPSE<br />
werden Mengen benötigt, die durch natürliches IPSE (nIPSE) nicht realisiert werden können, da<br />
nIPSE im SmEA nur in sehr geringer Konzentration vorliegt. Für weitere Untersuchungen muss IPSE<br />
in rekombinanter Form hergestellt werden. <strong>Rekombinante</strong>s in E. coli-Zellen exprimiertes IPSE<br />
(E. coli-IPSE) wird unlöslich in inclusion bodies abgelegt und muss chemisch zurückgefaltet werden.<br />
E. coli-IPSE ist zwar funktionell aktiv, jedoch zum Teil auch aufgrund der fehlenden Glycosylierung<br />
sehr schlecht löslich.<br />
Aus diesem Grund war es Ziel dieser Arbeit, ein geeignetes <strong>Expression</strong>ssystem zu finden, in dem<br />
IPSE löslich und in ausreichender Menge exprimiert wird. Dafür wurden unterschiedliche<br />
<strong>Expression</strong>svektoren und -bedingungen in E. coli ausgetestet und humane 293 HEK-Zellen und<br />
Insektenzellen, in denen das Protein glycosyliert wird, als <strong>Expression</strong>ssysteme untersucht.<br />
In E. coli-Zellen konnte weder durch periplasmatische <strong>Expression</strong> noch durch Temperaturabsenkung,<br />
Herabsetzung der Induktorkonzentration und Salzstressbedingungen lösliches IPSE gewonnen werden.<br />
Lediglich die <strong>Expression</strong> als Maltosebindeprotein-(MBP)-Fusionsprotein oder Thioredoxin-(TRX)-<br />
Fusionsprotein führt zu löslichem Protein, welches jedoch bei der weiteren Aufarbeitung Aggregate<br />
bildet oder aus der Lösung präzipitiert.<br />
Im Gegensatz dazu lässt sich IPSE sowohl in 293 HEK-Zellen wie auch in Insektenzellen löslich<br />
exprimieren (HEK- bzw. High Five-IPSE). Dieses wird von den Zellen in den Kulturüberstand<br />
sekretiert und ließ sich aus diesem über ein zweistufiges Reinigungsverfahren bis zu einer sehr guten<br />
8
Zusammenfassung<br />
Reinheit aufreinigen. Dabei zeigten HEK-Zellen eine deutlich bessere <strong>Expression</strong>sleistung. Analog zu<br />
nIPSE, einem Homodimer, sind auch die beiden rekombinanten IPSE-Proteine dimerisiert, wobei<br />
High Five-IPSE auch noch eine gewisse Menge an Monomer aufweist. Beide rekombinanten IPSE-<br />
Proteine sind wie auch nIPSE glycosyliert, wobei nIPSE zwei, HEK-IPSE vier und High Five-IPSE<br />
drei Glycoformen nach Auftrennung in der SDS-PAGE zeigt. Das Molekulargewicht von HEK-IPSE<br />
wurde über MALDI-TOF-MS bestimmt und ist mit 34 bis 39 kD vergleichbar mit dem <strong>des</strong> nIPSE .<br />
HEK-IPSE ist sehr gut löslich und lässt sich auf min<strong>des</strong>tens 22 mg/ml konzentrieren. Dadurch war es<br />
mit diesem Material erstmals möglich ein Kristallisationsexperiment anzusetzen.<br />
Sowohl HEK-IPSE als auch High Five-IPSE sind funktionell aktiv, d. h. sie binden Immunglobuline,<br />
bewirken eine Degranulation der Basophilen und induzieren die Freisetzung von <strong>IL</strong>-4. Dabei zeigt<br />
sich, dass HEK-IPSE die gleiche <strong>IL</strong>-4-Freisetzungskapazität besitzt wie nIPSE, die von High Five-<br />
IPSE ist etwas schwächer. Des Weiteren konnte in FACS-Experimenten gezeigt werden, dass HEK-<br />
IPSE IgE-abhängig an die Basophilen bindet und dass dabei der Basophilenaktivierungsmarker<br />
CD203c hochreguliert wird. Bezüglich <strong>des</strong> Aktivierungsmechanismus konnte auch mit HEK-IPSE,<br />
wie zuvor mit dem weniger löslichen E. coli-IPSE, keine Quervernetzung der Immunglobuline<br />
nachgewiesen werden, was die bisherige Hypothese eines neuartigen Aktivierungsmechanismus<br />
untermauert.<br />
Mit den 293 HEK-Zellen konnte in dieser Arbeit ein geeignetes <strong>Expression</strong>ssystem gefunden und<br />
etabliert werden, mit dem größere Mengen an rekombinantem, funktionell aktivem und löslichem<br />
IPSE gewonnen werden können. Mit diesem Material ist es nun möglich, Versuche zur Aufklärung<br />
<strong>des</strong> Mechanismus der Basophilenaktivierung durchzuführen, bei denen höhere Proteinkonzentrationen<br />
unerlässlich sind.<br />
9
<strong>Ei</strong>nleitung<br />
1 <strong>Ei</strong>nleitung<br />
Allergien haben in den letzten Jahrzehnten weltweit stark zugenommen und stellen mittlerweile die<br />
häufigste durch Umweltfaktoren ausgelöste Erkrankung dar. 20 bis 30 % der Weltbevölkerung leiden<br />
unter einer Allergie (Ring et al. 2001) und nach Schätzungen der WHO könnte die Zahl bis zum Jahr<br />
2010 auf 40 bis 50 % angestiegen sein [1]. Es gibt mehrere Formen der Allergie (Typ I bis Typ IV<br />
nach Coombs und Gell, 1963). Die häufigste Form stellt die Allergie vom Typ I (im Folgenden als<br />
Allergie bezeichnet) dar. Darunter versteht man eine Hyperreaktivität <strong>des</strong> Immunsystems gegenüber<br />
harmlosen Antigenen (Proteine aus Pollenkörnern, Katzenhaaren, etc.) unter Schädigung <strong>des</strong><br />
körpereigenen Gewebes. Typ-I-Allergien werden auch Allergien vom Soforttyp genannt, da die<br />
Symptome bei sensibilisierten Personen bereits wenige Minuten nach Allergenkontakt auftreten. Das<br />
Symptomspektrum reicht von allergischer Rhinitis („Heuschnupfen“), atopischem Ekzem, Urtikaria<br />
bis zum bronchialen Asthma. In seltenen Fällen kann die Allergie durch einen anaphylaktischen<br />
Schock zum Tode führen. Die Faktoren, die zu der Entstehung einer Allergie führen, sind<br />
vielschichtig. Neben genetischer Prädisposition haben auch Infektionen, Umwelteinflüsse und der<br />
psycho-soziale Status einer Person einen <strong>Ei</strong>nfluss. Über den <strong>Ei</strong>nsatz von anti-Histaminika und<br />
Kortison lassen sich die Symptome der Allergie bei einigen Patienten in den Griff bekommen, jedoch<br />
wären kausale Therapiekonzepte, die die Ursache der Allergie bekämpfen, den symptomatischen<br />
Therapien vorzuziehen. Hierfür steht zurzeit nur die Hyposensibilisierungstherapie, die nur bei einigen<br />
wenigen Allergenen zum Erfolg führt, zur Verfügung.<br />
Charakteristisch für eine Allergie ist die gesteigerte Synthese <strong>des</strong> Immunglobulin E (IgE). Der<br />
Klassenwechsel von IgG zu IgE wird durch T-Helferzellen vom Typ 2 (Th2-Zellen) vermittelt. Diese<br />
schütten u. a. das Zytokin Interleukin (<strong>IL</strong>)-4 aus, welches nachfolgend den Klassenwechsel in<br />
B-Zellen auslöst. Die Induktion <strong>des</strong> Klassenwechsels ist recht gut untersucht. Die Faktoren bei einer<br />
Allergie, die eine Differenzierung von Th0-Zellen zu Th2-Zellen auslösen, sind jedoch weitgehend<br />
unklar. Daher wäre es für die Allergieforschung von Bedeutung den Mechanismus dieser Reaktion<br />
weiter aufzuklären. Bedingt durch den multifaktoriellen Charakter einer Allergie ist die Aufklärung<br />
dieses Mechanismus über die Untersuchung <strong>des</strong> Effektes von Allergenen jedoch schwierig.<br />
Infektionen mit helminthischen Parasiten sind wie auch die Allergie vom Typ I durch eine gesteigerte<br />
IgE-Synthese und Eosinophilie gekennzeichnet, die durch Th2-Zellen vermittelt wird (Maizels und<br />
Yazdanbaksh 2003). Im Gegensatz zur Allergie wird diese Reaktion nicht von vielschichtigen<br />
exogenen und endogenen Faktoren beeinflusst, sondern führt zuverlässig bei jedem Menschen zu einer<br />
Th2-Induktion. Aus diesem Grund erscheint es sinnvoll, diesen Reaktionsweg der Immunantwort in<br />
dem weniger komplexen Wurmmodell zu untersuchen, um bessere Kenntnis über die Induktion der<br />
IgE-Synthese bei der Typ-I-Allergie zu erlangen.<br />
10
<strong>Ei</strong>nleitung<br />
Bei dem Pärchenegel Schistosoma mansoni ist es das <strong>Ei</strong>-Stadium, welches zu einer Th2-Induktion<br />
führt (Grzych et al. 1991). Der wasserlösliche Extrakt aus diesen <strong>Ei</strong>ern (SmEA = Schistosoma<br />
mansoni <strong>Ei</strong> Antigen) bewirkt bei humanen basophilen Granulozyten eine potente <strong>IL</strong>-4-Freisetzung<br />
(Falcone et al. 1996). Das für diesen Effekt verantwortliche aktive Prinzip konnte aus SmEA isoliert<br />
und charakterisiert werden und wurde IPSE („<strong>IL</strong>-4-inducing principle from Schistosoma mansoni<br />
eggs“) genannt (Schramm et al. 2003). IPSE ist das einzige Protein aus SmEA, das zu solch einer<br />
<strong>IL</strong>-4-Freisetzung fähig ist und ist daher ein geeignetes Werkzeug, den Mechanismus der<br />
Basophilenaktivierung und der Th2-Induktion zu untersuchen.<br />
Die immunologischen und immunparasitologischen Grundlagen, auf denen die vorliegende Arbeit<br />
aufbaut, werden im Folgenden detailliert erläutert.<br />
1.1 Das Th1/Th2-Konzept<br />
Das Immunsystem hat verschiedene Strategien auf eindringende Organismen und andere Antigene zu<br />
reagieren. Die erste Verteidigungslinie - und auch die evolutiv ältere Strategie - stellt die angeborene<br />
Immunität dar, die schnell auf eine Vielzahl von Pathogenen reagieren kann. Wird diese<br />
Verteidigungslinie von den Pathogenen überwunden, wird die Abwehr von der antigenspezifischen,<br />
erworbenen Immunität übernommen.<br />
Für die Koordination der antigenspezifischen Immunantwort sind die T-Helferzellen (Th-Zellen)<br />
verantwortlich. Mosman et al. (1986) konnten erstmals im Mausmodell zeigen, dass sich diese Th-<br />
Zellen in zwei Subtypen einteilen lassen, die sich durch das von ihnen sezernierte Zytokinprofil<br />
unterscheiden. Th1-Zellen produzieren vorwiegend die Zytokine <strong>IL</strong>-2, Interferon (IFN)-γ und den<br />
Tumornekrosefaktor (TNF)-β, wohingegen Th2-Zellen die Zytokine <strong>IL</strong>-4, <strong>IL</strong>-5, <strong>IL</strong>-6, <strong>IL</strong>-10 und <strong>IL</strong>-13<br />
freisetzen. Diese Dichotomie der Zytokinproduktion konnte später auch vom murinen System auf das<br />
humane System übertragen werden (Romangnani 1991). Die Art <strong>des</strong> Zytokinprofils hat Auswirkungen<br />
auf die nachfolgende Immunantwort. So aktivieren Th1-Zellen mit ihren Zytokinen eher die zelluläre<br />
Immunität während Th2-Zellen die humorale Immunität stimulieren.<br />
Das Konzept von Mosman mit einer strengen Th1-Th2-Dichotomie ist jedoch lediglich als<br />
Modellvorstellung zu verstehen, da es mit einigen <strong>Ei</strong>nschränkungen behaftet ist. So gibt es<br />
beispielsweise auch Th-Zellen, die sowohl Th1-artige als auch Th2-artige Zytokine produzieren, die so<br />
genannten Th0-Zellen. <strong>Ei</strong>ne strenge <strong>Ei</strong>nteilung in eine der beiden Zellpopulationen ist somit nicht<br />
möglich und jegliche Übergangsformen im Zytokinprofil einer Th-Zelle sind beobachtet worden<br />
(Kelso 1995). Ging Mosman noch davon aus, dass die Gene von Th1- bzw. Th2-Zytokinen<br />
gleichzeitig transkribiert werden, so zeigt sich heute, dass je<strong>des</strong> Zytokin auf genetischer Ebene<br />
unabhängig von den anderen Zytokinen reguliert wird (Kim et al. 1999; Szabo et al. 2000).<br />
11
<strong>Ei</strong>nleitung<br />
Th1- bzw. Th2-Immunantworten sind für den Organismus jedoch nicht immer protektiv, sondern<br />
können bei überschießenden Immunantworten zu pathologischen Reaktionen führen. Bei einer<br />
dominanten Th1-Reaktion können das beispielsweise Autoimmunerkrankungen (Diabetes mellitus,<br />
Morbus Crohn, Multiple Sklerose etc.), Transplantatabstoßungsreaktionen oder Kontaktdermatitis<br />
sein. Überschießende Th2-Immunantworten führen dagegen zu Typ-I-Allergien.<br />
Es exisitiert noch eine weitere Th-Zellpopulation, die in der Lage ist, diese pathologischen<br />
Immunantworten zu supprimieren: die regulatorischen T-Zellen (T reg ) (Mills 2004). T reg -Zellen<br />
hemmen die Immunantwort vornehmlich durch die Ausschüttung der Zytokine <strong>IL</strong>-10 und<br />
transforming growth factor (TGF)-β, indem die Differenzierung von naiven Th-Zellen inhibiert wird.<br />
Diese Suppression <strong>des</strong> Immunsystems scheint ein wichtiger Mechanismus gegen überschießende<br />
Immunantworten zu sein, wie dies bei Allergien und Autoimmunkrankheiten der Fall ist.<br />
Dies zeigt, dass es sich bei der Immunantwort durch Th-Zellen um ein komplexes System handelt,<br />
welches nicht durch zwei distinkt voneinander getrennte Zellpopulationen beschrieben werden kann.<br />
Im Folgenden werden jedoch die Begriffe „Th1-Antwort“ bzw. „Th2-Antwort“ aufgrund ihres<br />
plakativen Charakters verwendet, auch wenn darunter eher „Th1-artige“ bzw. „Th2-artige“<br />
Immunantworten unter den genannten <strong>Ei</strong>nschränkungen zu verstehen sind.<br />
1.2 Induktion einer differenzierten Th-Antwort<br />
Wird ein Pathogen nicht über die geeignete Th-Immunantwort bekämpft, so kann das schwerwiegende<br />
Folgen für den Organismus haben. <strong>Ei</strong>n Beispiel dafür bietet die Lepra. <strong>Ei</strong>ne zelluläre Th1-vermittelte<br />
Immunantwort führt zu einer milden Verlaufsform der Krankheit (Lepra tuberculosa), die zur Heilung<br />
und Eliminierung der Bakterien aus dem Körper führt. <strong>Ei</strong>ne humorale Th2-vermittelte Immunantwort<br />
führt dagegen zur Ausbreitung der Bakterien im Körper und nimmt einen schwerwiegenden Verlauf<br />
(Lepra lepromatosa) (Review in Modlin 1994).<br />
Welche Immunantwort zur Bekämpfung <strong>des</strong> jeweiligen Pathogens zum <strong>Ei</strong>nsatz kommt, hängt unter<br />
anderem von der Art der Antigenpräsentation, der Konzentration <strong>des</strong> Antigens, dem Ort der<br />
Antigenaufnahme, genetischen Faktoren aber vor allem dem umgebenden Zytokinmilieu ab. <strong>IL</strong>-12<br />
stellt das Schlüsselzytokin für eine Weichenstellung in Richtung Th1-Differenzierung dar. Die<br />
zelluläre Quelle <strong>des</strong> <strong>IL</strong>-12 sind vor allem dendritische Zellen. Diese werden mit einigen Ausnahmen<br />
vornehmlich durch virale, bakterielle oder protozoische Pathogene aktiviert.<br />
Das Schlüsselzytokin für die Th2-Differenzierung ist <strong>IL</strong>-4. Um dieses <strong>IL</strong>-4, das für die Induktion der<br />
Th2-Differenzierung verantwortlich ist, von dem <strong>IL</strong>-4, welches später von Th2-Zellen selbst sezerniert<br />
wird, abzugrenzen, spricht man hier von dem so genannten „frühen <strong>IL</strong>-4“. Allergene und parasitäre<br />
Würmer sind die wichtigsten Auslöser der frühen <strong>IL</strong>-4-Synthese, jedoch ist hier die zelluläre Quelle<br />
12
<strong>Ei</strong>nleitung<br />
<strong>des</strong> Zytokins noch nicht eindeutig bestimmt. Neben Th2-Zellen sind Mastzellen, eosinophile und<br />
basophile Granulozyten in der Lage <strong>IL</strong>-4 freizusetzen. T-Zellen sind als Quelle <strong>des</strong> frühen <strong>IL</strong>-4<br />
unwahrscheinlich, da zum Zeitpunkt einer ersten polarisierenden Immunreaktion noch keine<br />
spezifischen T-Zellen vorhanden sind. Des Weiteren konnte in Arbeiten von Sabin und Pearce (1995)<br />
gezeigt werden, dass selbst CD4 + -depletierte C57BL/6-Mäuse, die mit Schistosoma mansoni-<strong>Ei</strong>ern<br />
infiziert wurden, mit einer „frühen-<strong>IL</strong>-4“-Antwort auf die Infektion reagieren. Mastzellen sind als<br />
gewebsständige Zellen nicht mobil und eosinophile Granulozyten können lediglich geringe Mengen an<br />
<strong>IL</strong>-4 sezernieren. Basophile hingegen sind in der Lage große Mengen <strong>IL</strong>-4 freizusetzen und sind als<br />
Blutzellen auch mobil. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass Basophile die zelluläre Quelle <strong>des</strong><br />
frühen <strong>IL</strong>-4 sind.<br />
Die Induktion der Th-Differenzierung ist ein komplexes System bei dem <strong>IL</strong>-4 und <strong>IL</strong>-12 als<br />
Gegenspieler fungieren und sich gegenseitig inhibieren können. Szabo et al. (1997) konnten zeigen,<br />
das in der Maus naive Th-Zellen nach Aktivierung über den T-Zell-Rezeptor die β-Untereinheit <strong>des</strong><br />
<strong>IL</strong>-12-Rezeptors exprimieren. Ist <strong>IL</strong>-4 bei der Th-Zell-Aktivierung anwesend, so wird diese<br />
<strong>Expression</strong> inhibiert und <strong>IL</strong>-12 ist für die Differenzierung der Th-Zelle wirkungslos und es kann keine<br />
Th1-Antwort erfolgen. Umgekehrt verhindert IFN-γ die Wirkung von <strong>IL</strong>-4 auf die Th-Zell-<br />
Differenzierung.<br />
1.3 Basophile Granulozyten<br />
Neben den neutrophilen und eosinophilen Granulozyten stellen die basophilen Granulozyten mit<br />
0,5 - 1 % der Gesamtleukozyten eine sehr kleine Zellpopulation dar. Ihr Name leitet sich von der<br />
Anfärbbarkeit ihrer Granula mit basischen Farbstoffen wie z. B. Methylenblau ab. Die anfärbbaren<br />
Granula enthalten vor allem präformiertes Histamin, Heparin und Leukotriene. Aufgrund ihrer<br />
geringen Anzahl, der schlechten Nachweisbarkeit und fehlenden Aufreinigungsmethoden wurden sie<br />
lange Zeit nicht beachtet und galten lediglich als „Mastzellen <strong>des</strong> Blutes“ (Gibbs 2005). Mittlerweile<br />
geht man jedoch davon aus, dass im humanen System eher die Basophilen als die Mastzellen für die<br />
Initiation der Th2-Antwort über Ausschüttung der Zytokine <strong>IL</strong>-4 und <strong>IL</strong>-13 verantwortlich sind. Im<br />
Mausmodell konnte die Quelle für frühes <strong>IL</strong>-4 auf eine myeloide Zelle eingegrenzt werden, die IgE +<br />
aber Kit - und I-A/I-E - ist. Die Autoren schlossen daraus, dass es sich dabei nur um Basophile handeln<br />
kann (Luccioli et al. 2002). Weiterhin konnten Mukai et al. (2005) zeigen, dass Basophile eine<br />
wichtige Rolle bei der Entstehung einer chronischen allergischen Entzündung spielen unabhängig von<br />
Mastzellen und T-Zellen. MacGlashan et al. (1994) fanden eine Korrelation zwischen der mRNA für<br />
<strong>IL</strong>-4 und dem Anteil an Basophilen in den peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC). Insofern<br />
scheinen die Basophilen auch im humanen System eine wichtige Quelle für frühes <strong>IL</strong>-4 zu sein.<br />
13
<strong>Ei</strong>nleitung<br />
Auf ihrer Oberfläche exprimieren die Basophilen wie auch die Mastzellen den FcεRI-Rezeptor über<br />
den sie freies IgE aus dem Blut binden. Bei einer Allergie werden die Basophilen durch<br />
Quervernetzung dieses FcεRI-ständigen IgEs über ein Allergen antigenspezifisch aktiviert und setzen<br />
die Mediatoren Histamin, Leukotrien und <strong>IL</strong>-4 frei (Metzger 1992). Histamin liegt dabei präformiert<br />
in den Granula vor und kann über Degranulation sehr schnell freigesetzt werden (Kagey-Sobotka et al.<br />
1981). Leukotriene und <strong>IL</strong>-4 werden nach Aktivierung größtenteils de novo synthetisiert und werden<br />
somit verzögert abgegeben (Hart 2001). Für die Symptome einer Allergie sind das Histamin und<br />
Leukotrien C4 verantwortlich, da es sich bei diesen Mediatoren um potente Vasodilatatoren handelt.<br />
Zusätzlich wirkt Leukotrien C4 noch schleimfördernd und brochokonstriktorisch. Jedoch können nicht<br />
nur Allergene Basophile aktivieren, auch Lektine (Haas et al. 1999) und B-Zellsuperantigene wie z. B.<br />
Protein L von Peptostreptococcus magnus (Patella et al. 1990) und das Hüllprotein gp120 <strong>des</strong> HI-<br />
Virus (Florio et al. 2000) sind dazu in der Lage. Lektine binden an die Zuckerseitenketten <strong>des</strong> IgEs<br />
und vermögen es somit querzuvernetzen. B-Zell-Superantigene binden antigenunspezifisch an<br />
Immunglobuline, wie z. B. das gp120, welches an die VH3-Domäne binden kann und über diese<br />
Bindung Immunglobuline querzuvernetzen vermag.<br />
Für die Etablierung einer Allergie ist die Produktion Antigen-spezifischer IgE´s essentiell. Für den<br />
Isotypwechsel von IgM zu IgE in B-Zellen bedarf es zum einen einer Interaktion zwischen CD40, das<br />
auf B-Zellen exprimiert wird, und CD40-Ligand auf Th2-Zellen und zum anderen muss <strong>IL</strong>-4<br />
vorliegen. Jedoch exprimieren nicht nur Th2-Zellen den CD40-Liganden, sondern auch Basophile und<br />
Mastzellen. Diese können ebenfalls T-Zell-unabhängig über die Interaktion zwischen CD40 und<br />
CD40-Ligand sowie <strong>IL</strong>-4 in B-Zellen einen Isotypwechsel zur IgE-Synthese induzieren (Gauchat et al.<br />
1993).<br />
Dies zeigt, dass Basophile auf mehreren Ebenen die Entstehung und den Verlauf einer Allergie<br />
beeinflussen können und somit eine zentrale Rolle einnehmen.<br />
1.4 Helminthen induzieren eine Th2-Immunantwort<br />
Helminthische Parasitosen können sehr unterschiedliche Krankheitsbilder hervorrufen, jedoch zeigt<br />
sich primär bei allen diesen Infektionen eine gesteigerte IgE-Synthese, Eosinophilie und Mastozytose.<br />
Diese drei Symptome sind auch typisch für eine Th2-Immunantwort und werden wie schon<br />
beschrieben maßgeblich über <strong>IL</strong>-4 kontrolliert. Erste direkte Nachweise dafür, dass Helminthen beim<br />
Menschen eine Th2-Antwort generieren, erhielt Del Prete et al. (1991) indem er aus humanen<br />
peripheren Blutleukozyten eine Reihe von spezifischen T-Zellklonen herstellen konnte. T-Zellklone,<br />
die spezifisch für ein exkretorisch/sekretorisches Antigen aus Toxocara canis waren, führten nach<br />
14
<strong>Ei</strong>nleitung<br />
antigenspezifischer und antigenunspezifischer Stimulation zu einer Th2-Immunantwort mit <strong>IL</strong>-4- und<br />
<strong>IL</strong>-5-Freisetzung. Dagegen setzten T-Zellklone, die spezifisch für ein Protein aus Mycobacterium<br />
tuberculosis waren, die Th1-Zytokine <strong>IL</strong>-2 und IFN-γ frei. <strong>IL</strong>-4 konnte auch in G4-Mäusen<br />
nachgewiesen werden, die mit Nippostrongylus brasiliensis infiziert waren. Bei G4-Mäusen ist das<br />
erste Exon <strong>des</strong> <strong>IL</strong>-4-Gens durch das enhanced green fluorescent protein (EGFP) ersetzt, so dass<br />
Zellen, die <strong>IL</strong>-4 exprimieren grün leuchten. Nur infizierte Mäuse zeigten grün leuchtende Zellen. Bei<br />
diesen Zellen handelte es sich um basophile Granulozyten. Dies ist ein weiteres Indiz für die Rolle der<br />
Basophilen als Quelle <strong>des</strong> „frühen <strong>IL</strong>-4“ (Min et al. 2004).<br />
Nicht nur die Th2-Zytokine werden durch Infektionen mit parasitären Würmern freigesetzt, sondern es<br />
kommt auch zu einer gesteigerten IgE-Synthese. Dabei werden neben wurmspezifischem IgE auch<br />
große Mengen an unspezifischem IgE synthetisiert. Schon 1969 beschrieben Orr und Blair die<br />
„potenzierte Reaginantwort“ (Reagin = IgE) in Mäusen, die mit Nippostrongylus brasiliensis infiziert<br />
waren. Sie zeigten, dass durch die Infektion eine bestehende IgE-Antwort auf Ovalbumin deutlich<br />
gesteigert werden konnte. Diese Beobachtung konnte auch für weitere Wurminfektionen, gereinigte<br />
Wurmantigene und exkretorisch/sekretorische Produkte von Würmern nachgewiesen werden (Jarret<br />
und Miller 1982; Lee und McGibbon 1993).<br />
Die Th2-Antwort <strong>des</strong> Immunsystems auf die Infektion mit Helminthen dient der Entfernung <strong>des</strong><br />
Parasiten aus dem Körper. Bei suszeptiblen B10.BR- und AKR-Mäusen führt eine Infektion mit<br />
Trichuris muris zu einer chronischen Erkrankung wohingegen BALB/K-Mäuse resistent gegen eine<br />
Infektion sind und die Würmer erfolgreich bekämpfen können. Es zeigte sich, dass die chronisch<br />
infizierten Mäuse mit einer Th1-Antwort reagierten und die Th2-Antwort der BALB/K-Mäuse<br />
protektiv wirkt (Else et al. 1992). Die Entfernung parasitärer intestinaler Würmer aus dem Darm durch<br />
eine Th2-Antwort erfolgt nach Maizels und Holland (1998) auf zwei Ebenen. Zum einen wirken die<br />
Th-2-Zytokine <strong>IL</strong>-4 und <strong>IL</strong>-13 direkt auf Zellen der Darmschleimwand und bewirken eine erhöhte<br />
Mucussekretion und Peristaltik, wodurch die Würmer ausgeschleust werden. Zum anderen kommt es<br />
zu einer Degranulation der Mastzellen. Die dabei freigesetzten Mediatoren <strong>IL</strong>-4, <strong>IL</strong>-13, Histamin und<br />
Leukotriene intensivieren diese Wirkung noch.<br />
Würmer haben jedoch in Millionen von Jahren währender Co-Evolution mit ihrem jeweiligen Wirt<br />
sehr effektive Strategien entwickelt, <strong>des</strong>sen Immunantwort zu entfliehen, um so ein Überleben im Wirt<br />
auf lange Zeit zu sichern. Zu diesen Strategien zählen u.a. die Sekretion von immunmodulatorischen<br />
Molekülen, der <strong>Ei</strong>nbau von Wirtsantigenen in das Tegument (molekulare Mimikry), die enzymatische<br />
Spaltung von Antikörpern und der schnelle Austausch ihrer Oberflächenmembran durch vorgeformte<br />
Membranvesikel (Pearce und Sher 1987; Damian 1997, Maizels et al. 1993). Für <strong>Schistosomen</strong> konnte<br />
im Menschen eine Verweildauer von über 30 Jahren festgestellt werden (Chabasse et al. 1985). Dies<br />
verdeutlicht beispielhaft das ausgewogene Kräfteverhältnis in der Wirt-Parasit-Beziehung in diesem<br />
speziellen Fall.<br />
15
<strong>Ei</strong>nleitung<br />
1.5 Schistosoma mansoni als Modellorganismus zur Untersuchung der<br />
Th2-Induktion<br />
Der Trematode Schistosoma mansoni (Sambon 1907) ist der Erreger der Darmbilharziose. Weltweit<br />
sind ca. 200 Millionen Menschen von Schistosomiasis betroffen und mehr als 300.000 Menschen<br />
sterben pro Jahr alleine in Afrika in der Sub-Sahara-Zone - dem Hauptverbreitungsgebiet von<br />
Schistosoma mansoni - an der Infektion (van der Werf 2003). Die Hauptinfektionsquelle sind stehende<br />
Süßgewässer in den Tropen, da diese der Lebensraum <strong>des</strong> Zwischenwirtes - Schnecken der Gattung<br />
Biomphalaria - sind. Die Schnecken scheiden in das Wasser große Mengen an Zerkarien<br />
(Gabelschwanzlarven) aus, die sich durch die Haut exponierter Menschen einbohren. Bei diesem<br />
Prozess verlieren sie ihre Glycokalyx und den Gabelschwanz und entwickeln sich zum<br />
Schistosomulum. Die Schistosomula durchwandern den Körper über das Blutsystem, bis sie<br />
schließlich an ihrem Bestimmungsort - dem Pfortadersystem - angelangt sind. Dort entwickeln sie sich<br />
zu geschlechtsreifen Würmern und wandern anschließend in die Mesenterialgefäße <strong>des</strong> Darmes. Das<br />
Weibchen lebt in einer Dauerkopula in der ventralen Bauchfalte <strong>des</strong> Männchens und kann am Tag bis<br />
zu 1000 <strong>Ei</strong>er legen. Die <strong>Ei</strong>er gelangen über Blutgefäße mit Hilfe von proteolytischen Enzymen in den<br />
Darm und werden mit dem Stuhl ausgeschieden. Bei Kontakt der <strong>Ei</strong>er mit Süßwasser schlüpfen durch<br />
den hypotonischen Reiz aus den <strong>Ei</strong>ern Mirazidien (Flimmerlarven), die den Zwischenwirt<br />
chemotaktisch aufsuchen und sich in ihn einbohren. Dort vermehren sie sich parthenogenetisch über<br />
Sporozysten zu Zerkarien und der komplexe Lebenszyklus ist geschlossen.<br />
Für das Immunsystem <strong>des</strong> Wirtes stellt solch eine Infektion eine große Herausforderung dar, da der<br />
Parasit in drei verschiedenen Entwicklungsstadien (<strong>Ei</strong>, Schistosomulum, adulter Wurm) mit<br />
unterschiedlichen Oberflächen und Antigenen im Körper auftritt. Tatsächlich reagiert das<br />
Immunsystem auf eine Schistosoma mansoni-Infektion mit unterschiedlichen Immunantworten auf die<br />
Infektion. Nach <strong>Ei</strong>ndringen der Zerkarien und während der Wanderung der Schistosomula ist die<br />
Immunantwort durch Th1-Zytokine geprägt. Erst sechs Wochen nach der Infektion, wenn die ersten<br />
<strong>Ei</strong>er nachweisbar sind, entwickelt sich eine starke Th2-Antwort (Pearce und MacDonald 2002). Diese<br />
Th2-Antwort wird begleitet von einer erhöhten Anzahl an Eosinophilen, Basophilen und Mastzellen<br />
und einem hohen IgE-Titer. Ab Woche neun nach der Infektion wird auch die Th2-Reaktion<br />
supprimiert und es kommt zu einer regulatorischen T-Zellreaktion mit Ausschüttung der Zytokine<br />
<strong>IL</strong>-10 und TGF-β. Dass tatsächlich die <strong>Ei</strong>er das für die Th2-Induktion verantwortliche<br />
Entwicklungsstadium sind, zeigen Untersuchungen von Grzych et al. (1991). Bei normalen<br />
<strong>Schistosomen</strong>-Infektionen werden zunächst die Th1-Zytokine IFN-γ und <strong>IL</strong>-2 gemessen. Nach sechs<br />
Wochen Infektion wird diese Immunantwort von einer Th2-Antwort abgelöst mit Ausschüttung der<br />
Zytokine <strong>IL</strong>-5 und <strong>IL</strong>-4. Im Gegensatz dazu hält bei eingeschlechtlichen Infektionen, bei denen keine<br />
<strong>Ei</strong>er abgelegt werden können, die anfängliche Th1-Antwort dauerhaft an.<br />
16
<strong>Ei</strong>nleitung<br />
Die <strong>Ei</strong>er sind auch das Stadium, das die meisten pathologischen Veränderungen im Wirt hervorruft<br />
und für das Krankheitsbild verantwortlich ist. Die Hälfte der produzierten <strong>Ei</strong>er gelangt nicht über den<br />
Darm nach außen, sondern verbleibt im Körper. Diese <strong>Ei</strong>er werden in kollagenhaltigen Granulomen<br />
von Immunzellen (Makrophagen, Eosinophile und CD4 + -T-Zellen) eingeschlossen (Pearce und<br />
MacDonald 2002) und stimulieren über lösliche <strong>Ei</strong>-Antigene die Fibroblastenproliferation und<br />
Kollagensynthese (Prakash und Wyler 1992), so dass es zur Leberfibrose kommt. Die Granulome<br />
können durch Raumforderung und damit Druck von außen die Gefäße einengen und so zu<br />
Hepatosplenomegalie und Ascites führen. Über weitere sekretierte Proteine können <strong>Schistosomen</strong> die<br />
Immunantwort modulieren und über Proteasen ihre Wanderung durch das Endothel und Darmepithel<br />
vollziehen. Diese Proteine werden vor allem in einem Bereich mit hoher Proteinsyntheserate zwischen<br />
dem Mirazidium und der <strong>Ei</strong>schale - dem Reynold´s layer und dem von Lichtenberg´schen envelope -<br />
gebildet und über Poren in der <strong>Ei</strong>schale in die Umgebung sekretiert (Ashton et al. 2001). Von<br />
besonderer Bedeutung sind die sekretierten immunmodulatorischen Proteine, vor allem auch dadurch,<br />
dass sie eine Quelle für potentielle neue Arzneimittel gegen eine Vielzahl von Krankheiten darstellen<br />
können (Smith et al. 2005).<br />
1.6 IPSE - ein sekretiertes Schistosoma mansoni-Protein setzt <strong>IL</strong>-4 aus<br />
humanen Basophilen frei<br />
Wie bereits beschrieben sind wässrige Extrakte von Schistosoma mansoni-<strong>Ei</strong>ern starke Th2-<br />
Induktoren. Werden humane Basophile in vitro mit SmEA inkubiert, so lassen sich im<br />
Kulturüberstand die Th2-Mediatoren <strong>IL</strong>-4, <strong>IL</strong>-13 und Histamin nachweisen (Falcone et al. 1996,<br />
Schramm et al. 2003). Aus diesen wässrigen Extrakten konnten Schramm et al. (2003) ein Protein<br />
isolieren und charakterisieren, welches als einziges Protein aus dem Extrakt für die<br />
Basophilenaktivierung und Mediatorfreisetzung ist. Dieses Protein erhielt den Namen IPSE als<br />
Abkürzung für „<strong>IL</strong>-4 inducing principle from Schistosoma mansoni eggs“. IPSE wurde erstmals von<br />
Dunne et al. (1991) unter dem Namen alpha-1 als kationisches <strong>Schistosomen</strong>-<strong>Ei</strong>-Antigen beschrieben,<br />
welches möglicherweise in der Serodiagnostik einsetzbar ist. Spätere Untersuchungen zeigten, dass<br />
IPSE mit alpha-1 identisch ist (Schramm et al. 2006). Kürzlich wurde von Smith et al. (2005) ein<br />
Chemokin-binden<strong>des</strong> Protein aus Schistosoma mansoni-<strong>Ei</strong>ern (SmCKBP) beschrieben, welches mit<br />
IPSE identisch ist. Dieses Protein bindet an die Chemokine <strong>IL</strong>-8 und MIP-1α und zeigt in vivo<br />
antiinflammatorische Aktivität. Auch Williams et al. (2005) beschreiben ein Protein aus SmEA,<br />
welches identisch ist mit IPSE. Dieses SmEP25 stimuliert CD4 + Th-Zellen zur Proliferation in BL/6-<br />
und CBA-Mäusen.<br />
17
<strong>Ei</strong>nleitung<br />
Im Folgenden wird aufgeführt, was zu Beginn dieser Arbeit bereits über IPSE bekannt war.<br />
Natürliches IPSE (nIPSE) ist ein Homodimer und hat ein Molekulargewicht von 40 kD. Ungefähr ein<br />
Drittel <strong>des</strong> Molekulargewichtes nehmen dabei die Glycosylierungen ein. IPSE wird von dem <strong>Ei</strong> in<br />
dem von Lichtenberg´s envelope, einem Gewebe, das sich durch eine sehr hohe Proteinsyntheserate<br />
auszeichnet, synthetisiert und in das Gewebe sekretiert. Immunhistologische Untersuchungen konnten<br />
nachweisen, dass IPSE von den umgebenden Immunzellen <strong>des</strong> Wirtes aufgenommen wird.<br />
Über N-terminale Sequenzierung <strong>des</strong> aufgereinigten Proteins und Screening einer cDNA-Bank konnte<br />
über Datenbankrecherche ein expressed sequence tag (EST) gefunden werden (GenBank accession<br />
number AI820476) und die DNA-Sequenz von IPSE aufgeklärt werden (GenBank accession number<br />
AY028436). Die Sequenz <strong>des</strong> Präproteins besitzt 134 Aminosäuren, wobei ein Signalpeptid von<br />
20 Aminosäuren bei der Sekretion abgespalten wird. Monomeres IPSE weist sieben Cysteinreste und<br />
zwei potentielle N-Glycosylierungstellen auf. Es bestehen keinerlei Homologien zu bereits bekannten<br />
Proteinen; IPSE ist somit ein bisher einzigartiges Protein. Über Klonierung in einen <strong>Expression</strong>svektor<br />
konnte IPSE in E. coli erfolgreich als His-getaggtes Fusionsprotein exprimiert werden. Bei dieser<br />
<strong>Expression</strong> wird IPSE allerdings unlöslich in inclusion bodies abgelegt. Aus diesen inclusion bodies<br />
kann jedoch über eine Rückfaltungsstrategie aktives IPSE generiert werden. Dieses sogenannte<br />
E. coli-IPSE wurde zur weiteren Charakterisierung eingesetzt. Da in E. coli keine Glycosylierungen<br />
stattfinden, ist es offensichtlich, dass tatsächlich der Proteinanteil dieses Moleküls für die <strong>IL</strong>-4-<br />
Freisetzung verantwortlich ist.<br />
Humane Basophile nicht-infizierter Spender degranulieren bereits nach Inkubation mit geringen<br />
Mengen (20-100 ng/ml) IPSE unter Freisetzung von <strong>IL</strong>-4, <strong>IL</strong>-13 und Histamin. In<br />
Strippingexperimenten, bei denen FcεRI-gebundenes IgE von der Oberfläche der Basophilen entfernt<br />
wird, konnte nachgewiesen werden, dass die Basophilenaktivierung IgE-abhängig ist. Weiterhin<br />
konnte gezeigt werden, dass IPSE nicht nur an IgE sondern auch speziesübergreifend an die<br />
Immunglobuline IgM, IgA und IgG bindet. Es handelt sich bei dem Protein also um einen allgemeinen<br />
Immunglobulin-bindenden Faktor (Blindow 2004). Dabei scheint IPSE die Basophilen nicht wie<br />
Allergene, B-Zellsuperantigene (Florio et al. 2000) oder Lektine (Haas et al. 1999) über eine<br />
Quervernetzung zu aktivieren. Vielmehr wird hier ein neuartiger Mechanismus der<br />
Basophilenaktivierung ohne Crosslinking angenommen.<br />
18
<strong>Ei</strong>nleitung<br />
1.7 Ziel dieser Arbeit<br />
Triggerfaktoren der frühen <strong>IL</strong>-4-Synthese aus Basophilen sind wichtige Faktoren zur Untersuchung<br />
der Th2-Induktion und der Basophilenaktivierung und nehmen eine zentrale Position bei der<br />
Entstehung einer Allergie ein. Mit IPSE konnte ein solcher Triggerfaktor identifiziert und<br />
charakterisiert werden. Da dieses Molekül im SmEA jedoch nur in sehr geringen Konzentrationen<br />
vorliegt, ist es notwendig, IPSE rekombinant herzustellen, um seinen Wirkungsmechanismus weiter<br />
aufklären zu können. Im bakteriellen <strong>Expression</strong>ssystem erreicht man zwar hohe Ausbeuten an<br />
rekombinantem Protein, jedoch wird dieses in unlöslicher Form in inclusion bodies abgelegt. Wie<br />
beschrieben kann über eine Rückfaltungsprozedur lösliches und aktives E. coli-IPSE gewonnen<br />
werden, welches sich allerdings nur bis 0,15 mg/ml konzentrieren lässt. Für einige Anwendungen zur<br />
Untersuchung <strong>des</strong> Wirkungsmechanismus auf den Basophilen sind jedoch höhere<br />
Proteinkonzentrationen von korrekt gefaltetem IPSE notwendig. Dies gilt auch für Untersuchungen<br />
zur Aufklärung der Struktur wie z. B. über Kristallisation.<br />
Aus diesem Grund sollten in der vorliegenden Arbeit folgende Punkte bearbeitet werden:<br />
- Klonierung von IPSE in verschiedene bakterielle <strong>Expression</strong>svektoren zur Austestung<br />
unterschiedlicher <strong>Expression</strong>ssysteme und Optimierung der <strong>Expression</strong>sbedingungen;<br />
- Klonierung von IPSE in humane und Insekten-<strong>Expression</strong>svektoren zur Austestung und<br />
Etablierung von eukaryotischen <strong>Expression</strong>ssystemen;<br />
- Optimierung der Aufreinigung der erhaltenen rekombinanten IPSE-Proteine;<br />
- Nachweis der Aktivität der rekombinanten IPSE-Proteine in Bezug auf <strong>IL</strong>-4-induzierende<br />
Aktivität auf Basophilen und Immunglobulin-Bindung;<br />
- falls möglich Ansetzen eines Kristallisationsexperimentes.<br />
19
Materialien<br />
2 Materialien<br />
2.1 Reagenzien<br />
Für die Arbeit wurden nachstehende Chemikalien und Reagenzien verwendet, die min<strong>des</strong>tens den<br />
Reinheitsgrad p. a. aufwiesen.<br />
Produkt<br />
Acrylamidlösung (Rotiphorese Gel 30)<br />
Agar-Agar<br />
Agarose<br />
Aktivkohle<br />
6-Aminohexansäure<br />
Ammoniumperoxodisulfat (APS)<br />
Aqua <strong>des</strong>tillata<br />
Basophil Isolation Kit<br />
BCA Protein Assay Reagent Kit<br />
(+)-Biotin-N-hydroxysuccinimi<strong>des</strong>ter<br />
5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)<br />
Bromphenolblau<br />
BugBuster ®<br />
Cellfectin<br />
Coomassie Brilliant Blue R-250<br />
5,5-Diethylbarbitursäure<br />
5,5-Diethylbarbitursäure-Natriumsalz<br />
Dimethylsulfoxid (DMSO)<br />
Dinatriumhydrogenphosphat<br />
1,4-Dithioerythriol (DTT)<br />
EDTA (Titrierkomplex III)<br />
<strong>Ei</strong>sessig<br />
Endo H<br />
Ethanol, absolut<br />
Ethanol, 96 %, vergällt<br />
Ethanolamin<br />
Ethidiumbromid<br />
Express-Five ® SFM<br />
Ficoll („Pancoll“)<br />
Firma<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Invitrogen, Carlsbad, USA<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Braun, Melsungen, D<br />
Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, D<br />
Pierce Biotechnology, Rockford, USA<br />
Sigma, München, D<br />
Serva, Heidelberg, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Novagen, Madison, USA<br />
Invitrogen, Carlsbad, USA<br />
Serva, Heidelberg, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Merck, Darmstadt<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Roche Applied Science, Mannheim, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Invitrogen, Carlsbad, USA<br />
PAN Biotech, Aidenbach, D<br />
20
Materialien<br />
Produkt<br />
Fötales Rinderserum (FBS)<br />
Formaldehyd<br />
Glucose<br />
Glutamin<br />
Glutardialdehyd<br />
Glycerin<br />
Glycin<br />
Glycogen<br />
Hank´s balanced Salt Solution (HBSS)<br />
Hefeextrakt<br />
<strong>IL</strong>-3<br />
<strong>IL</strong>-4 Eli-pair (<strong>IL</strong>-4 ELISA)<br />
Imidazol<br />
Ionomycin<br />
Isopropylgalactosid (IPTG)<br />
Isopropanol<br />
Kaliumchlorid<br />
Kaliumdihydrogenphosphat<br />
Kochsalzlösung, isotonische<br />
Low Molecular Weight Marker (LMW)<br />
Magnesiumchlorid<br />
Maltose<br />
May-Grünwald-Färbelösung (Accustain )<br />
β-Mercaptoethanol<br />
Merthiolat<br />
Methanol<br />
Milchsäure<br />
Natriumacetat<br />
Natriumazid<br />
Natriumcarbonat<br />
Natriumchlorid<br />
Natriumdihydrogenphosphat<br />
Natriumdodeylsulfat (SDS)<br />
Natriumhydrogencarbonat<br />
Natriumhydroxid<br />
Natriumthiosulfat<br />
Firma<br />
Invitrogen, Carlsbad, USA<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Invitrogen, Carlsbad, USA<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Roche Applied Science, Mannheim, D<br />
PAA, Pasching, A<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Kirin Brewery, Takasaki-shi, Gunma, J<br />
Diaclone, Besancon, F<br />
Sigma, München, D<br />
Sigma, München, D<br />
Roth, Karlruhe, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Braun, Melsungen, D<br />
Bio-Rad, München, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Sigma Diagnostics, St. Louis, USA<br />
Sigma, München, D<br />
Sigma, München, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Sigma, München, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
ICN, Eschwege, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
21
Materialien<br />
Produkt<br />
Firma<br />
Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT)<br />
Serva, Heidelberg, D<br />
2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure-Monohydrat (MES)Roth, Karlsruhe, D<br />
Pepton aus Casein<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Percoll <br />
Amersham Biosciences, Uppsala, S<br />
PNGase F<br />
Roche Applied Science, Mannheim, D<br />
Protectomed basal Iscoves Medium (IMDM) PAA, Pasching, A<br />
Protein L<br />
Sigma, München, D<br />
Pyronin G<br />
Serva, Heidelberg, D<br />
Rinderserumalbumin (BSA)<br />
PAA, Pasching, A<br />
RPMI 1640<br />
PAA, Pasching, A<br />
Salzsäure<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Silbernitrat<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Streptavidin-PE<br />
BD Pharmingen, San Diego, USA<br />
Taq-Polymerase<br />
Peqlab, Erlangen, D<br />
N, N, N´, N´-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Merck, Darmstadt, D<br />
Trypanblaulösung<br />
Sigma, München, D<br />
Transfast<br />
Promega, Madison, USA<br />
Transferrin, human<br />
Sigma, München, D<br />
Tris<br />
Roth, Karlsruhe, D<br />
Tween ® 20<br />
Merck, Darmstadt, D<br />
Xylenxyanol<br />
Serva, Heidelberg, D<br />
22
Materialien<br />
2.2 Häufig verwendete Puffer und Nährmedien<br />
Zum Ansetzen von Lösungen und Medien wird <strong>des</strong>tilliertes entionisiertes Wasser verwendet. Medien<br />
für die Bakterienzellkultur werden 20 min bei 200 kPa autoklaviert. Medien für die humane oder<br />
Insektenzellkultur werden sterilfiltriert (0,2 µm Spitzenfilter, Firma Sarstedt). Puffer, die in der<br />
Chromatographie eingesetzt werden, werden filtriert (0,2 µm Membranfilter, Firma Millipore) und<br />
entgast. Spezielle Puffer, Lösungen oder Medien sind am Ende jeweiligen Methode aufgeführt.<br />
2.2.1 Puffer<br />
10x PBS-Stammlösung<br />
1,37 M NaCl<br />
27 mM KCl<br />
100 mM Na 2 HPO 4 x 2H 2 O<br />
20 mM KH 2 PO 4<br />
Für die Gebrauchslösung wird die Stammlösung 1:10 verdünnt und der pH-Wert auf 7,4 eingestellt.<br />
10x TBS-Stammlösung (pH 7,5)<br />
1 M Tris-HCl<br />
1 M NaCl<br />
25 mM MgCl 2<br />
Für die Gebrauchslösung wird die Stammlösung 1:10 verdünnt und der pH-Wert auf 7,5 eingestellt.<br />
TBST<br />
Entspricht 1x TBS-Lösung (pH 7,5) mit Zusatz von 0,05 % (v/v) Tween.<br />
50x TAE-Stammlösung<br />
2 M Tris-HCl<br />
50 mM EDTA<br />
5,71 (v/v) <strong>Ei</strong>sessig<br />
100 ml einer 0,5 M EDTA-Lösung (pH 8,0) werden zu 242 g Tris-HCl und 57,1 ml <strong>Ei</strong>sessig gegeben<br />
und auf 1000 ml mit aqua <strong>des</strong>t. aufgefüllt.<br />
23
Materialien<br />
2.2.2 Nährmedien<br />
LB-Medium<br />
1 % (w/v) Pepton<br />
0,5 % (w/v) Hefeextrakt<br />
0,5 % (w/v) NaCl<br />
ad 1000 ml aqua <strong>des</strong>t.<br />
LB-Agar<br />
LB-Medium mit Zusatz von 1,5 % (w/v) Agar. Nach Autoklavierung und Abkühlung werden ggf.<br />
Antibiotika zugesetzt.<br />
50x Kaliumphosphatpuffer für TB-Medium<br />
170 mM KH 2 PO 4<br />
720 mM K 2 HPO 4<br />
TB-Medium<br />
1,2 % (w/v) Pepton<br />
2,4 % (w/v) Hefeextrakt<br />
0,4 % (v/v) Glycerin<br />
ad 1000 ml aqua <strong>des</strong>t. Vor Gebrauch werden 20 ml 50x Kaliumphosphatpuffer zugesetzt.<br />
24
Materialien<br />
2.3 Antibiotika<br />
Folgende in Tabelle 2.1 aufgeführte Antibiotika wurden in den angegebenen Konzentrationen<br />
eingesetzt.<br />
Tabelle 2.1: Liste der verwendeten Antibiotika.<br />
Antibiotikum Konzentration gelöst in<br />
Endkonzentration<br />
Stammlösung<br />
Ampicillin 100 mg/ml aqua <strong>des</strong>t. 100 µg/ml<br />
Blasticidin 10 mg/ml aqua <strong>des</strong>t. 10-80 µg/ml<br />
Chloramphenicol 34 mg/ml in EtOH 34 µg/ml<br />
Gentamicin 10 mg/ml aqua <strong>des</strong>t. 10 µg/ml<br />
Kanamycin 15 mg/ml aqua <strong>des</strong>t. 15 µg/ml<br />
Penicillin 10000 U/ml aqua <strong>des</strong>t. 100 U/ml<br />
Streptomycin 10 mg/ml aqua <strong>des</strong>t. 100 µg/ml<br />
Tetracyclin 12,5 mg/ml in EtOH 12,5 mg/ml<br />
Zeocin 100 mg/ml aqua <strong>des</strong>t. 100 µg/ml<br />
2.4 Antikörper<br />
Tabelle 2.2: Liste der verwendeten Antikörper<br />
Bezeichnung Konjugation Firma eingesetzte<br />
Verdünnung<br />
IgG (human, polyklonal, “Octagam”) - Octapharma unterschiedlich<br />
IgE (human, polyklonal) - Acris unterschiedlich<br />
IgE (human, monoklonal, Klon HE1) - Diatec unterschiedlich<br />
anti-IPSE (monoklonal, Klon 74-4B7) - Labsoft 1:50<br />
anti-Maus IgG (aus Ziege) AP Dianova 1:10.000<br />
anti-human IgG-Fc (aus Ziege) AP Dianova 1:30.000<br />
anti-human IgE (aus Ziege) AP Tago 1:2.000<br />
anti-human IgE (aus Ziege) Bio Tago 1:2.000<br />
anti-human IgE (aus Ziege) FITC Serotec 1:75<br />
anti-human CD203c (monoklonal, Klon 97A6) PE Beckman 1:20<br />
Coulter<br />
25
Materialien<br />
2.5 Synthetische Oligonukleotide<br />
Alle in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide (Primer) wurden von MWG Biotech synthetisiert<br />
und einer HPSF-Reinigung unterzogen. Zur Lagerung wurden sie in 100 µl sterilem aqua <strong>des</strong>t.<br />
aufgenommen und für die PCR-Reaktion 20 µM Gebrauchslösungen angesetzt. Folgende Primer<br />
wurden in dieser Arbeit verwendet (Restriktionsschnittstellen kursiv gedruckt).<br />
Klonierungsprimer<br />
• IPSEMALpsense 5´-ATATATGGATCCGATTCATGCAAATATTGTC-3´<br />
Sense-Primer mit BamHI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pMalP<br />
• P IPSE Mal anti 5´-ATATAAGCTTACATCAGTTCATATGC-3´<br />
Antisense-Primer mit HindIII-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pMalP<br />
• pET26BamHI sense 5´-ATATATGGATCCGATTCATGCAAATATTGTC<br />
Sense-Primer mit BamHI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pET26(+)<br />
• pETHindIII anti 5´-ATATATAAGCTTGAATCGACAGTATGTCCTTC<br />
Antisense-Primer mit HindIII-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pET26(+)<br />
• pBM1.1HindIII sense 5´-ATATATAAGCTTGATTCATGCAAATATTGTC-3´<br />
Sense-Primer mit HindIII-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pBM1.1<br />
• pBM1.1EcoRI anti 5´-ATATATGAATTCTCATCATTAGAATCGACAGTATGTCCTTC-3´<br />
Antisense-Primer mit EcoRI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pBM1.1<br />
• Sfi MS-IPSE sense 5´-ATATATGGCCCAGCCGGCCGATTCATGCAAATATTGTC-3´<br />
Sense-Primer mit SfiI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pMSII<br />
• CelII MS-IPSE rev 5´-ATATATGCTCAGCGAATCGACAGTATGTCCTTC-3´<br />
Antisense-Primer mit CelII-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pMSII<br />
• pIB sense HindIII 5´-ATATATAAGCTTGCCACCATGTTTCTTATTGCCGTATTG-3´<br />
Sense-Primer mit HindIII-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE in pIB/V5-His<br />
26
Materialien<br />
• pIB anti XhoI 5´ATATATCTCGAGTTATTATGAGAATCGACAGTATGTCCTTC-3´<br />
Antisense-Primer mit XhoI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE ohne His-Tag in pIB/V5-His<br />
• pIB-His anti XhoI 5´-ATATATCTCGAGAATCGACAGTATGTCCTTC-3´<br />
Antisense-Primer mit XhoI-Schnittstelle zur Klonierung von IPSE mit His-Tag in pIB/V5-His<br />
Sequenzierungsprimer<br />
• pBM11.seqs1 5´-CGACTCACTATAGGGGAA-3´<br />
Sequenzierungsprimer für den Vektor pBM1.1 in sense-Orientierung<br />
• pBM11.seqas2 5´-ACGGGTGAAAGTCTCCA-3´<br />
Sequenzierungsprimer für den Vektor pBM1.1 in antisense-Orientierung<br />
• pMS-KON-fo 5´-ATAGGGAGACCCAAGCTGGC-3´<br />
Sequenzierungsprimer für pMSII in sense-Orientierung<br />
• pMS-KON-re 5´-GAGAATTCGTGCTCAAAACT-3´<br />
Sequenzierungsprimer für pMSII in antisense-Orientierung<br />
• OpIE2 Forward 5´-CGCAACGATCTGGTAAACAC-3´<br />
Sequenzierungsprimer für pIB/V5-His in sense-Orientierung<br />
• OpIE2 Reverse 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´<br />
Sequenzierungsprimer für pIB/V5-His in antisense-Orientierung<br />
27
Materialien<br />
2.6 Plasmidvektoren<br />
In der vorliegenden Arbeit wurden die in der Tabelle 2.3 angegebenen Plasmidvektoren verwendet.<br />
Tabelle 2.3: Verwendete Plasmidvektoren<br />
Vektor<br />
pPROEX <br />
Htb<br />
pMalC<br />
bzw.<br />
pMalP<br />
Größe<br />
[bp]<br />
Pro-<br />
motor<br />
Resistenz<br />
<strong>Expression</strong>s-<br />
system<br />
Verwendung und<br />
<strong>Ei</strong>genschaften<br />
4778 Trc Ampicillin E. coli - zytoplasmatische<br />
<strong>Expression</strong><br />
- N-terminaler His 6 -Tag<br />
- TEV-Schnittstelle<br />
6723 tac Ampicillin E. coli - Protein wird als MBP-<br />
Fusionsprotein exprimiert<br />
- Factor Xa-Schnittstelle-<br />
malE-Signalpeptid für<br />
Transport in Periplasma<br />
(nur bei pMalP)<br />
pET26(+) 5360 T7 Kanamycin E. coli - pelB-Signalpeptid für<br />
Transport in Periplasma<br />
- C-terminaler His 6 -Tag<br />
pBM1.1 1) 5595 T7 Kanamycin E. coli - pelB-Signalpeptid für<br />
Transport in Periplasma<br />
- N-terminaler His 10 -Tag<br />
- Enterokinase-Schnittstelle<br />
pET32 5900 T7 Ampicillin E. coli - Protein wird als TRX-<br />
pMSII 1) 7099 CMV Ampicillin<br />
Zeocin<br />
pIB/V5- 3521 OpIE2 Ampicillin<br />
His 2) Blasticidin<br />
Fusionsprotein exprimiert<br />
- N- und C-terminaler<br />
His 6 -Tag<br />
- Enterokinase-Schnittstelle<br />
293 HEK - Igκ-Signalsequenz für<br />
Insekten-<br />
zellen<br />
Sekretion<br />
- C-terminaler<br />
His 6 /cMyc-Tag<br />
- bicistronische mRNA<br />
für EGFP<br />
- C-terminales V5-Epitop<br />
- C-terminaler His 6 -Tag<br />
Referenz<br />
Gibco<br />
New England<br />
Biolabs<br />
Novagen<br />
Matthey et. al<br />
(2003)<br />
Novagen<br />
Stöcker et. al<br />
(2003)<br />
Invitrogen<br />
1) von Dr. D. Wicklein (LG Molekulare und klinische Allergologie, Forschungszentrum Borstel) zur Verfügung gestellt.<br />
2) von Dr. P. Ziegelmüller (Abteilung Biochemie und Molekularbiologie, Universität Hamburg) zur Verfügung gestellt.<br />
28
Materialien<br />
2.7 Zelllinien<br />
2.7.1 Bakterienstämme<br />
BL21(DE3) F - ompT hsdS B (r - B m - B ) gal dcm (DE3)<br />
(Studier et al. 1986)<br />
DH5α<br />
supE44 ∆lacU169 (Φ80 lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1<br />
(Hanahan 1983)<br />
JM109<br />
recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi ∆(lac-proAB)<br />
(Yanisch-Perron et al. 1985)<br />
Origami(DE3) ∆(ara-leu)7697 ∆lacX74 ∆phoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL<br />
F’[lac + lac q pro] (DE3) gor522::Tn 10 trxB (Kan R , Str R , Tet R )<br />
(Prinz et al. 1997)<br />
2.7.2 Eukaryotische Zelllinien<br />
293 HEK-Zellen humane embryonale Nierenzelllinie, ATCC Nr. CRL-1573<br />
(Graham et al. 1977)<br />
Von Dr. D. Wicklein (LG Molekulare und klinische Allergologie,<br />
Forschungszentrum Borstel) zur Verfügung gestellt.<br />
High Five -Zellen Insektenzelllinie von Trichoplusia ni <strong>Ei</strong>zellen, BTI-Tn-5B1-4<br />
(Invitrogen)<br />
Von Dr. P. Ziegelmüller (Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie,<br />
Universität Hamburg) zur Verfügung gestellt.<br />
29
Methoden<br />
3 Methoden<br />
3.1 Allgemeine molekularbiologische Arbeiten<br />
3.1.1 Kultur und Lagerung von E. coli<br />
Kurzzeitkultur<br />
Für eine Kurzzeitkultur werden E. coli-Zellen auf LB-Agarplatten (eventuell mit Antibiotikazusatz)<br />
ausgestrichen und über Nacht im Brutraum bei 37 °C inkubiert. Danach lassen sich die Platten<br />
4 Wochen bei 4 °C lagern, bevor sie erneut ausgestrichen werden müssen.<br />
Übernachtkultur<br />
Für eine Übernachtkultur werden 5 ml LB-Medium (eventuell mit Antibiotikumszusatz) mit einer<br />
Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37 °C im Brutraum unter Schütteln (225 rpm)<br />
inkubiert.<br />
Langzeitkultur<br />
E. coli-Zellen können bei -80 °C über lange Zeit eingefroren werden. Dafür werden 850 µl einer<br />
Übernachtkultur mit 150 µl sterilem Glycerin versetzt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und<br />
anschließend in -80 °C überführt. Durch leichtes Antauen können die so gelagerten Zellen wieder<br />
ausgestrichen werden.<br />
3.1.2 Transformation von E. coli-Zellen<br />
Die am häufigsten angewendeten Methoden zum <strong>Ei</strong>nbringen von DNA in Bakterienzellen sind die<br />
Hitzeschocktransformation und Elektroporation. In der vorliegenden Arbeit wurde die Elektroporation<br />
verwendet, da hier die Transformationseffizienz mit 10 9 bis 10 10 Transformanten pro µg DNA<br />
ungefähr um den Faktor 10 3 höher liegt gegenüber der Hitzeschocktransformation (Sambrook et al.<br />
1989). Bei der Elektroporation wird durch einen Elektroschock die Zytoplasmamembran kurzfristig<br />
permeabilisiert, so dass DNA aus der Umgebung aufgenommen werden kann.<br />
3.1.2.1 Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen<br />
Da bei der Elektroporation hohe Stromspannungen eingesetzt werden, müssen die Bakterienzellen in<br />
ein salzfreies Medium überführt werden. Dafür werden 350 ml LB-Medium (ggf. mit Antibiotikum)<br />
mit einer 1:50-Verdünnung einer frischen E. coli-Übernachtkultur angeimpft, bei 37 °C auf einem<br />
Schüttler bis zu einer OD 600 von 1,0 inkubiert und anschließend auf <strong>Ei</strong>s für 20 Minuten abgekühlt. Alle<br />
30
Methoden<br />
folgenden Zentrifugationsschritte finden bei 4 °C in sterilen Zentrifugationsgefäßen und bei<br />
ausgeschalteter Bremse statt. Die Zellen werden für 10 Minuten bei 12.000 x g zentrifugiert. Der<br />
Überstand wird mit einer Pipette vollständig abgenommen und verworfen. Das Bakterienpellet wird<br />
drei Mal mit 80 ml sterilem, eiskalten aqua <strong>des</strong>t. gewaschen und zentrifugiert (12.000 x g, 20 min).<br />
Die Zellen werden in 10 %igem (v/v) kalten Glycerin aufgenommen und noch mal bei 12.000 x g für<br />
10 Minuten zentrifugiert. Abschließend wird das Pellet in 500 bis 1000 µl 10 %iger (v/v)<br />
Glycerinlösung aufgenommen, in Portionen à 50 µl in Cryoröhrchen aliquotiert, in flüssigem<br />
Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert.<br />
3.1.2.2 Elektroporation von E. coli-Zellen<br />
Für die Transformation werden 50 µl elektrokompetente E. coli-Zellen mit ca. 1 µl Plasmid-DNA<br />
bzw. 5 µl Ligationsansatz für eine Minute auf <strong>Ei</strong>s inkubiert und anschließend in eine gekühlte<br />
Elektroporationsküvette mit einer Schichtdicke von 0,2 cm gefüllt. Die Elektroporation erfolgte mit<br />
dem Gene Pulser II der Firma BioRad bei 25 µF, 2,5 kV und 200 Ω. Die elektroporierten Zellen<br />
werden sofort in 1 ml LB-Medium aufgenommen und zur Regeneration für eine Stunde bei 37 °C<br />
unter Schütteln inkubiert. Anschließend werden 100 µl und 900 µl der Zellsuspension auf selektiven<br />
LB-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.<br />
3.1.3 Präparation von Plasmid-DNA<br />
Alle Präparationen von Plasmid-DNA aus E. coli wurden mit dem „QIAprep Spin Miniprep Kit“<br />
(Firma Qiagen) nach Angaben <strong>des</strong> Herstellers durchgeführt. Die Methode beruht auf der alkalischen<br />
Lyse von Bakterienzellen nach Birnboim und Doly (1979) und der anschließenden Adsorption der<br />
DNA an eine Silicamembran unter Hochsalzbedingungen. Alle Zentrifugationsschritte werden soweit<br />
nicht anders angegeben bei 18.000 x g für eine Minute bei 4 °C in einer Tischzentrifuge durchgeführt.<br />
Um größere Mengen hochreine DNA für die Transfektion von Insektenzellen oder 293 HEK-Zellen zu<br />
isolieren, werden Plasmidpräparationen in größerem Maßstab (100 µg bzw. 500 µg) vorgenommen.<br />
Für die Transfektion von Insektenzellen wurde das „QIAGEN Plasmid Midi Kit“ und für die<br />
Transfektion von 293 HEK-Zellen das „EndoFree Plasmid Maxi Kit“ (beide von der Firma Qiagen)<br />
nach Herstellerangaben verwendet. Dabei werden die Zellen aus 25 ml bzw. 100 ml E. coli-<br />
Übernachtkultur wie oben angegeben lysiert. <strong>Ei</strong>ne zusätzliche Reinigung erfolgt, indem die Plasmid-<br />
DNA unter Niedrigsalzbedingungen bei niedrigem pH-Wert an ein Anionenaustauscherharz gebunden<br />
wird. Dabei werden Verunreinigungen, wie z.B. Proteine, bei mittleren Salzkonzentrationen entfernt.<br />
Unter Hochsalzbedingungen wird die Plasmid-DNA eluiert und durch eine Isopropanolfällung<br />
entsalzt. Nach einer weiteren Ethanolfällung wird die reine DNA in 200 µl aqua <strong>des</strong>t. aufgenommen.<br />
31
Methoden<br />
3.1.4 Agarose-Gelelektrophorese<br />
Mit der Agarose-Gelelektrophorese können DNA-Moleküle ihrer Größe nach aufgetrennt werden und<br />
im Bereich von 500 bis 8000 bp dargestellt werden. Die Wanderungsgeschwindigkeit linearer DNA-<br />
Moleküle ist dabei umgekehrt proportional zum Logarithmus ihres Molekulargewichtes. Bei<br />
ringförmiger DNA können auch coiled und supercoiled-Strukturen auftreten, die aufgrund ihrer<br />
höheren Kompaktheit im Gel schneller laufen und so ein apparent kleineres Molekulargewicht<br />
aufweisen als linearisierte DNA. Agarose-Gelelektrophoresen finden Anwendung bei der<br />
Größenbestimmung von DNA-Fragmenten nach einem Restriktionsverdau, bei der Isolierung von<br />
DNA-Fragmenten und bei der Überprüfung einer PCR oder Gelelution.<br />
Die elektrophoretische Auftrennung erfolgt in 1 %igen (w/v) Agarosegelen. Die Agarose wird durch<br />
Kochen in TAE-Puffer gelöst, nach kurzem Abkühlen wird 0,1 % (v/v) Ethidiumbromid zugesetzt und<br />
die Lösung in einen Gelschlitten mit dem entsprechenden Kamm gegossen. Nach dem Erstarren der<br />
Agarose wird das Gel in eine mit TAE-Puffer gefüllte Elektrophoresekammer überführt. Die Proben<br />
werden mit 1/10 Volumen Probenpuffer versetzt und auf das Gel aufgetragen. Als Größenstandard<br />
werden 2,5 µl <strong>des</strong> MassRuler (100 bis 10.000 bp, Firma MBI Fermentas) mit aufgetragen. Die<br />
Elektrophorese wird anschließend bei 0,5 V/cm 2 durchgeführt, bis der Farbmarker die gewünschte<br />
Laufstrecke zurückgelegt hat. Die im Agarosegel aufgetrennten DNA-Banden können unter UV-Licht<br />
sichtbar gemacht und mit einer Polaroid-Kamera dokumentiert werden.<br />
10x Probenpuffer<br />
60 % (v/v) Glycerin<br />
100 mM EDTA<br />
Spatelspitze Bromphenolblau<br />
Spatelspitze Xylenxyanol<br />
ad 10 ml mit aqua <strong>des</strong>t.<br />
3.1.5 Bestimmung der DNA-Konzentration<br />
Die Bestimmung der DNA-Konzentration erfolgte über die spektralphotometrische<br />
Absorptionsmessung bei 260 nm. Dabei entspricht ein Extinktionswert von 1,0 ungefähr 50 µg<br />
doppelsträngiger DNA in 1 ml Lösung. Wird gleichzeitig die Absorption bei 280 nm - dem<br />
Absorptionsmaximum von Proteinen - gemessen, kann aus dem Verhältnis von 260 nm zu 280 nm die<br />
Reinheit der DNA-Probe bestimmt werden. Bei reiner DNA liegt dieser Quotient bei 1,8 bis 2,0.<br />
32
Methoden<br />
3.1.6 Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction, PCR)<br />
Neben der schlichten Amplifikation von DNA-Fragmenten dient die Methode z. B. der <strong>Ei</strong>nführung<br />
von Restriktionsschnittstellen oder anderen Modifikationen (z. B. Mutation in der DNA). Zur<br />
Vervielfältigung der DNA benötigt man neben spezifischen Oligonukleotiden (Primern), welche<br />
homolog zu Sequenzen der Matrizen-DNA sind und diese am 5´-Ende und 3´-Ende flankieren, die<br />
spezifische hitzestabile DNA-abhängige DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Taq-DNA-<br />
Polymerase). Über die zyklische Wiederholung von Denaturierung, Primeranlagerung (Annealing)<br />
und Primerverlängerung (Elongation) können Vervielfältigungsraten von ca. 10 6 erreicht werden.<br />
Für eine PCR wurde der folgende PCR-Ansatz und PCR-Programm verwendet.<br />
PCR-Ansatz<br />
70 µl steriles aqua <strong>des</strong>t.<br />
10 µl 10x Polymerasepuffer<br />
5 µl sense-Primer (20 µM)<br />
5 µl anti-sense Primer (20 µM)<br />
8 µl dNTP-Mix (dATP, dCTP, d GTP, dTTP, jeweils 10 µM)<br />
1 µl template DNA (aus DNA-Minipräparation)<br />
0,5 µl Taq-Polymerase<br />
100 µl Öl<br />
PCR-Programm<br />
<br />
<br />
<br />
<br />
Denaturierung bei 95 °C für 30 sec<br />
Annealing bei 48 °C für 30 sec<br />
Elongation bei 72 °C für 1 min<br />
30 Zyklen<br />
3.1.7 Reinigung von DNA-Fragmenten aus PCR-Ansätzen<br />
PCR-Ansätze enthalten neben den Amplifikaten noch die zugesetzten Nukleotide, Primer und<br />
Enzyme. Um diese für folgende Anwendungen zu entfernen werden die PCR-Ansätze über eine Silica-<br />
Matrix gereinigt. Dafür wurde das „QIAquick PCR Purification Kit“ (Firma Qiagen) eingesetzt.<br />
Während die PCR-Produkte unter Hochsalzbedingungen an die Silica-Matrix binden, können alle<br />
unerwünschten Kontaminanten ausgewaschen werden. Die gebundene DNA wird mit 30 µl aqua <strong>des</strong>t.<br />
eluiert.<br />
33
Methoden<br />
3.1.8 Zwischenklonierung in einen TA-Klonierungsvektor<br />
Restriktionsenzyme können DNA effektiver schneiden, wenn sie nicht am Ende eines DNA-Stranges<br />
schneiden müssen, wie dies bei PCR-Produkten der Fall ist. Aus diesem Grund wird die<br />
Zwischenklonierung in einen TA-Klonierungsvektor angewendet. Dabei wird das PCR-Produkt, das<br />
am 3´-Ende ein Desoxyadenosin besitzt, in einen linearisierten Vektor mit 5´-Desoxythymidin-<br />
Überhang ligiert. Die Ligation <strong>des</strong> PCR-Produktes in den eigentlichen Vektor kann so erheblich<br />
gesteigert werden. Als TA-Klonierungsvektor wurde das pGEM-T Easy Kit der Firma Promega nach<br />
Herstellerangaben verwendet. Für die Ligation wird die DNA-Konzentration <strong>des</strong> PCR-Produktes<br />
ermittelt und der folgende Ligationsansatz erstellt. Die Ligation erfolgt über Nacht bei 14 °C.<br />
Ligationsansatz<br />
5 µl 2x Rapid Ligation Buffer<br />
1 µl pGEM ® -T Easy Vektor (entspricht 50 ng)<br />
x µl PCR-Produkt (20 ng)<br />
1 µl T4 DNA Ligase<br />
ad 20 µl mit sterilem aqua <strong>des</strong>t.<br />
3.1.9 Fällung von DNA<br />
Für die Transformation von Bakterien darf nur reine, salzfreie DNA eingesetzt werden. Deshalb wird<br />
nach einer Ligation eine Fällung der DNA vorgenommen. Der Ligationsansatz wird mit 100 µl<br />
sterilem aqua <strong>des</strong>t., 1 µl Glycogen und 250 µl absolutem, eiskalten Ethanol versetzt und 2 h bei -70 °C<br />
inkubiert. Anschließend wird der Ansatz bei 4 °C für 15 Minuten bei 18.000 x g zentrifugiert. Das<br />
Pellet wird 10 Minuten bei 37 °C getrocknet und in 5 µl sterilem aqua <strong>des</strong>t. aufgenommen.<br />
3.1.10 DNA-Sequenzierung<br />
Die Überprüfung der DNA-Sequenz wurde bei der Firma MWG Biotech nach der Di<strong>des</strong>oxy-<br />
Kettenabbruchmethode nach Sanger (1977) durchgeführt. Für die Sequenzierung wird pro Reaktion<br />
1 µg gereinigte Plasmid-DNA in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und in der speedvac<br />
(SPD12P, Firma Thermo Savant) bis zur vollständigen Trockenheit eingeengt. Nach der Verifizierung<br />
der Sequenz werden die Klone zur weiteren Klonierung eingesetzt.<br />
34
Methoden<br />
3.1.11 Restriktion von DNA<br />
Restriktionsendonukleasen erkennen spezifische palindrome DNA-Sequenzen von meist 4 bis 8 bp<br />
und führen in doppelsträngige DNA Strangbrüche ein, wobei überhängende 3’- bzw. 5’-Enden (sticky<br />
ends) oder glatte Enden (blunt ends) entstehen können. Die DNA-Restriktion wird zur Analyse,<br />
Klonierung und Fragmentisolierung angewendet. Die Restriktion wird nach Herstellerangaben mit den<br />
mitgelieferten Puffern bei 37 °C für 2 h im Doppelrestriktionsansatz durchgeführt. Da SfiI eine von<br />
anderen Restriktionsenzymen abweichende optimale Reaktionstemperatur von 50 °C aufweist, werden<br />
die Restriktionen hier nacheinander durchgeführt. Pro µg DNA werden ungefähr 2 bis 4 U Enzym<br />
eingesetzt. Der Erfolg der Restriktion wird anschließend in der Agarosegelelektrophorese überprüft.<br />
3.1.12 Isolierung von DNA-Fragmenten durch Gelelution<br />
Zur Isolierung der DNA aus Agarosegelen, werden die Banden mit einem Skalpell ausgeschnitten und<br />
gewogen. Die Extraktion erfolgt mit dem „QIAquick Gel Extraction Kit“ (Firma Qiagen) in einem<br />
Eppendorf-Reaktionsgefäß. Die Agarose wird mit 3 Volumenteilen <strong>des</strong> im Kit enthaltenen Puffers QG<br />
versetzt und bei 50 °C inkubiert bis sich die Agarose aufgelöst hat. In der anschließenden<br />
säulenbasierten Reinigung wird die DNA an eine Silicamembran gebunden und von kontaminierenden<br />
Salzen, Proteinen und Nukleotiden befreit. Die Elution erfolgt in 30 µl sterilem aqua <strong>des</strong>t.<br />
3.1.13 Ligation von geschnittenen DNA-Fragmenten<br />
Die Verknüpfung von DNA-Fragmenten mit Hilfe der Ligase wird als Ligation bezeichnet. Bei der<br />
Standardligation wird durch Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen benachbarten<br />
3’-Hydroxyl- und 5’-Phosphatgruppen linearisierter Vektor mit isolierten DNA-Fragmenten<br />
verknüpft, die zuvor durch Restriktionsspaltung und Agarosegelelektrophorese mit anschließender<br />
Gelelution gewonnen wurden. Für die Ligation wird ungefähr ein Vektor-Insert-Verhältnis von 1:3<br />
eingesetzt. Die Quantifizierung erfolgt dabei grob über Abschätzung der Bandenintensität nach der<br />
Agarosegelelektrophorese. Der Ligationsansatz (siehe unten) wird in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß<br />
pipettiert und über Nacht bei 14 °C in einem Wasserbad inkubiert.<br />
Ligationsansatz<br />
x µl Vektor<br />
y µl Insert<br />
2 µl 10x Ligationspuffer<br />
0,5 µl Ligase<br />
ad 20 µl aqua <strong>des</strong>t. (steril)<br />
35
Methoden<br />
3.1.14 Klonierung der verwendeten Plasmid-Vektoren<br />
Mit den oben aufgeführten Methoden wurde die Sequenz von IPSE in die folgenden Vektoren<br />
kloniert.<br />
pET26-IPSE<br />
IPSE wurde über BamHI und HindIII in den Vektor kloniert. Der Vektor dient der periplasmatischen<br />
<strong>Expression</strong> von rekombinantem Protein in E. coli.<br />
pBM1.1-IPSE<br />
Der Vektor wurde von Dr. D. Wicklein (LG Molekulare und klinische Allergologie,<br />
Forschungszentrum Borstel) zur Verfügung gestellt. <strong>Rekombinante</strong> Proteine werden in E. coli in das<br />
Periplasma transportiert. IPSE wurde über HindIII und EcoRI in den Vektor kloniert.<br />
pMalC-IPSE und pMalP-IPSE<br />
Bei den Vektoren pMalC und pMalP der Firma New Engand Biolabs werden rekombinante Proteine in<br />
E. coli als Maltosebindeprotein-Fusionsproteine exprimiert und bei dem pMalP-Vektor zusätzlich in<br />
das Periplasma transportiert. IPSE wurde über BamHI und HindIII in beide Vektor kloniert.<br />
pMSII-IPSE<br />
Der Vektor pMSII dient der <strong>Expression</strong> von rekombinantem Protein in 293 HEK-Zellen. IPSE wurde<br />
über SfiI und CelII in den Vektor kloniert.<br />
pIB/V5-His-IPSE<br />
Der Insektenzellexpressionsvektor pIB/V5-His stammt von der Firma Invitrogen und wurde von Dr. P.<br />
Ziegelmüller (Abteilung Biochemie und Molekularbiologie, Universität Hamburg) zur Verfügung<br />
gestellt. Die IPSE-Sequenz wurde über HindIII und XhoI in den Vektor kloniert. Dabei wurde ein<br />
Vektor mit dem V5-His-Tag konstruiert und ein Vektor bei dem dieses Tag fehlt.<br />
Des Weiteren wurden für die bakterielle zytoplasmatische <strong>Expression</strong> der Vektor pPROEX Htb-IPSE<br />
und der Vektor pET32-IPSE eingesetzt. Diese Vektoren wurden von Dr. G. Schramm (LG Zelluläre<br />
Allergologie, Forschungszentrum Borstel) kloniert und zur Verfügung gestellt.<br />
36
Methoden<br />
3.2 <strong>Expression</strong> von IPSE in E. coli<br />
3.2.1 <strong>Expression</strong> von rekombinantem IPSE in E. coli im kleinen Maßstab (20 ml)<br />
Für die <strong>Expression</strong> wird eine Übernachtkultur angelegt und am nächsten Tag als Inokulum in einer<br />
1:50-Verdünnung in 20 ml Medium eingesetzt. Die Bakterien werden auf einem Schüttler bei 225 rpm<br />
und 37 °C für ca. 3 bis 4 h inkubiert bis eine OD 600 von 0,8 erreicht ist. Die <strong>Expression</strong> wird soweit<br />
nicht anders angegeben durch Zugabe von 300 µM IPTG induziert. Die Bakterienzellen werden dabei<br />
weiter unter den oben angegebenen Bedingungen für 18 h inkubiert. Zur Überprüfung der Zeitkinetik<br />
der <strong>Expression</strong> in der SDS-PAGE wird nach 0 h, 2 h, 4 h und 18 h 1 ml der <strong>Expression</strong> abgenommen,<br />
bei 18.000 x g pelletiert und in 100 µl 1x reduzierendem Probenpuffer aufgenommen. Nach<br />
Beendigung der <strong>Expression</strong> werden die Zellen pelletiert (3.000 x g, 10 min) und in 1 ml PBS<br />
aufgenommen. Durch Zusatz von 100 µl BugBuster werden die Zellen chemisch über Detergentien<br />
aufgeschlossen. Die lösliche Proteinfraktion wird durch Zentrifugation (12.000 x g, 15 min) von den<br />
unlöslichen Bestandteilen abgetrennt. Das Pellet wird wieder in 1 ml PBS aufgenommen und<br />
zusammen mit dem Überstand ebenfalls mit der Zeitkinetik in der SDS-PAGE unter reduzierenden<br />
Bedingungen untersucht.<br />
3.2.2 <strong>Expression</strong> von rekombinantem IPSE in E. coli im großen Maßstab (2000 ml)<br />
Für die <strong>Expression</strong> im großen Maßstab (2000 ml) wurden die Bedingungen der kleinen <strong>Expression</strong><br />
(20 ml) übernommen und die eingesetzten Mengen proportional vergrößert. Die <strong>Expression</strong> erfolgt<br />
auf einem Schüttler bei 225 rpm in zwei 2 L-Schikanenerlenmyerkolben zur besseren Belüftung der<br />
Kultur. Der anschließende Zellaufschluss erfolgt nicht chemisch sondern physikalisch über eine 30 ml<br />
French Press-Druckzelle. Die abzentrifugierten Zellen werden in 30 ml Puffer (Säulenpuffer für MBP-<br />
IPSE, Lysispuffer für Origami-IPSE; für genaue Pufferzusammensetzung siehe 3.3.1.1 bzw. 3.3.2)<br />
aufgenommen und mit 8 µl Benzonase versetzt, um alle Nukleinsäuren zu verdauen. Die Zellen<br />
werden 3 Mal bei einem Druck von 1000 bar durch die Druckzellen gepresst und in einem<br />
eisgekühlten Behälter aufgefangen. Anschließend wird die Bakteriensuspension abzentrifugiert<br />
(12.000 x g, 30 min), um die lösliche Proteinlösung von unlöslichen Zellfragmenten zu trennen. Der<br />
Überstand wird dekantiert und zur weiteren Proteinreinigung eingesetzt. <strong>Expression</strong>en im großen<br />
Maßstab wurden mit Origami(DE3)-Zellen und dem Vektor pET32-IPSE sowie JM109-Zellen und<br />
dem Vektor pMalC-IPSE durchgeführt.<br />
37
Methoden<br />
3.3 Reinigung von rekombinantem IPSE aus E. coli<br />
3.3.1 Reinigung von MBP-IPSE<br />
3.3.1.1 Reinigung von MBP-IPSE über Amylose-Affinitätschromatographie<br />
Das Maltosebindeprotein besitzt eine hohe Affinität zu Amylose. Diese Affinität wird bei der<br />
Aufreinigung ausgenutzt. Die Amylose ist dabei an ein Harz gekoppelt und bindet das MBP-<br />
Fusionsprotein während kontaminierende Proteine von der Säule gewaschen werden können. Die<br />
Elution <strong>des</strong> gebundenen Proteins erfolgt durch freie Maltose im Säulenpuffer.<br />
Das Amyloseharz wird in eine 15 ml Leersäule gefüllt und mit dem zehnfachen Säulenvolumen mit<br />
Säulenpuffer äquilibriert. Der Überstand <strong>des</strong> Bakterienaufschlusses wird 1:2 mit Säulenpuffer<br />
verdünnt und auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min aufgetragen.<br />
Kontaminierende Proteine werden mit 5 Säulenvolumen von der Säule entfernt und das gebundene<br />
Protein anschließend mit 30 ml Elutionspuffer eluiert. Dabei werden Fraktionen à 3 ml gesammelt.<br />
Die erhaltenen Fraktionen werden in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen untersucht.<br />
Die MBP-IPSE enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und die Proteinkonzentration über<br />
spektralphotometrische Bestimmung ermittelt.<br />
Säulenpuffer (pH 7,4)<br />
Elutionspuffer<br />
20 mM Tris-HCl Säulenpuffer mit 10 mM Maltose<br />
200 mM NaCl<br />
1 mM EDTA<br />
3.3.1.2 Reinigung von MBP-IPSE über Gelfiltration<br />
Die gereinigten MBP-IPSE-Fraktionen wurden über eine Gelfiltration weiter aufgereinigt. Bei der<br />
Gelfiltration (auch Größenauschlusschromatographie genannt) werden die Proteine ihrer Größe nach<br />
aufgetrennt. Die poröse Säulenmatrix besteht aus quervernetzter Agarose mit Dextran. Kleinere<br />
Moleküle können in die Poren hineindiffundieren und haben somit ein größeres Volumen zu<br />
durchlaufen als größere Moleküle, die nur die Zwischenräume durchwandern können. Größere<br />
Moleküle eluieren daher eher von der Säule als kleinere Moleküle.<br />
Die Gelfiltration wurde von Dr. U. Mamat (LG Medizinische und biochemische Mikrobiologie,<br />
Forschungszentrum Borstel) mit einer Superdex 200-Säule (HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade,<br />
Firma Amersham Biosciences) unter folgenden Bedingungen durchgeführt:<br />
38
Methoden<br />
Probe:<br />
1 ml MBP-IPSE (11,7 mg/ml)<br />
Laufpuffer: 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 8,0)<br />
Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min<br />
Fraktionsgröße: 2 ml<br />
3.3.2 Reinigung von IPSE aus E. coli Origami-Zellen<br />
IPSE wird in Origami-Zellen als His-getaggtes Fusionsprotein exprimiert. Aus diesem Grund lässt es<br />
sich über immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) mit Ni-NTA aufreinigen.<br />
7 ml äquilibrierte Ni-NTA-Matrix werden mit dem Überstand aus dem Bakterienaufschluss vermischt<br />
und 1 h auf einem Rollenmischer inkubiert. Die Mischung wird in eine 15 ml Leersäule gefüllt und<br />
das Effluent gesammelt. Nicht gebundene Proteine werden mit 2 x 30 ml Waschpuffer entfernt und die<br />
gebundenen Proteine mit 3 x 10 ml Elutionspuffer eluiert. Die einzelnen Fraktionen werden in der<br />
SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen untersucht.<br />
Lysispuffer (pH 8,0)<br />
50 mM NaH 2 PO 4<br />
300 mM NaCl<br />
10 mM Imidazol<br />
Waschpuffer (pH 8,0)<br />
entspricht Lysispuffer mit 20 mM Imidazol<br />
Elutionspuffer (pH 8,0)<br />
entspricht Lysispuffer mit 250 mM Imidazol<br />
39
Methoden<br />
3.4 293 HEK-Zellen<br />
3.4.1 Kultur und Lagerung von 293 HEK-Zellen<br />
Bei der Zelllinie 293 HEK handelt es sich um adhärent wachsende embryonale Nierenzellen (human<br />
embryonic kidney cells). Sie werden bei 37 °C und 6 % CO 2 in wasserdampfgesättigter Atmosphäre<br />
im Brutschrank in HEK-Medium kultiviert und alle 3 bis 4 Tage im Verhältnis 1:5 geteilt. Dabei<br />
lassen sich die Zellen durch einfaches Spülen mit der Pipette von dem Kulturflaschenboden lösen.<br />
293 HEK-Zellen können in flüssigem Stickstoff eingefroren und gelagert werden. Dafür werden die<br />
Zellen als Monolayer angezogen bis sie zu 80-90 % konfluent sind. Abgespülte Zellen werden bei<br />
600 x g für 10 min abzentrifugiert und mit einer Dichte von 3 x 10 6 Zellen/ml in <strong>Ei</strong>nfriermedium<br />
resuspendiert. Je 1 ml der Zellsuspension wird in Gefriergefäßen mit 1 °C pro Minute langsam auf<br />
-80 °C abgekühlt und anschließend in flüssigen Stickstoff überführt. <strong>Ei</strong>ngefrorene Zellen können<br />
wieder in Kultur genommen werden, indem sie bei 37 °C schnell aufgetaut, in Medium resuspendiert<br />
und in eine 75 cm 2 -Kulturflasche ausgesät werden.<br />
HEK-Medium<br />
<strong>Ei</strong>nfriermedium für 293 HEK-Zellkultur<br />
500 ml RPMI 1640 Medium 10 % (v/v) RPMI 1640<br />
2 mM Glutamin 80 % (v/v) FBS<br />
100 U/ml Penicillin 10 % (v/v) DMSO<br />
100 µg/ml Streptomycin<br />
10 % (v/v) FBS<br />
Die Zusätze werden über einen 0,2 µm Spitzenfilter (Filtropour, Firma Sarstedt) in das Medium<br />
filtriert.<br />
3.4.2 Transfektion von 293 HEK-Zellen<br />
Die Transfektion der 293 HEK-Zellen mit dem klonierten <strong>Expression</strong>svektor pMSII-IPSE wurde mit<br />
dem kationischen Lipotransfektionsreagenz TransFast durchgeführt. Dafür werden in einer 24-Loch-<br />
Platte pro Loch 5 x 10 4 Zellen ausgesät und in 1 ml HEK-Medium über Nacht inkubiert. Am nächsten<br />
Tag weisen die Zellen normalerweise eine Konfluenz von 80 % auf. 0,5 µg der gereinigten Vektor-<br />
DNA werden mit 200 µl HEK-Medium ohne FBS-Zusatz und 1,5 µl TransFast-Reagenz gemischt und<br />
10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Von den ausgesäten Zellen wird das Medium abgezogen und<br />
durch die Transfektionsmischung ersetzt. Nach einer Stunde Inkubation im Brutschrank wird jeder<br />
Probe 1 ml HEK-Medium mit FCS zugefügt. Nach drei Tagen wird der Kulturüberstand abgenommen<br />
und über eine Proteinaufreinigung im kleinen Maßstab (siehe 3.6.1) auf Anwesenheit <strong>des</strong><br />
rekombinanten Proteins untersucht. Zur Selektion von stabil transfizierten Zellen werden die Zellen<br />
40
Methoden<br />
mit HEK-Medium mit 100 µg/ml Zeocin versetzt. Stabil transfizierte 293 HEK-Zellen werden<br />
kontinuierlich bei 100 µg/ml Zeocin gehalten und wie unter 3.4.1 beschrieben alle 3 bis 4 Tage im<br />
Verhältnis 1:5 geteilt.<br />
3.4.3 <strong>Expression</strong> von rekombinantem IPSE in 293 HEK-Zellen<br />
Da der Vektor pMSII-IPSE einen Igκ-Leader am N-Terminus besitzt, wird das rekombinante Protein<br />
fortlaufend von den Zellen ins Medium sekretiert. Zur Bestimmung <strong>des</strong> optimalen Zeitpunktes zum<br />
Ernten <strong>des</strong> Kulturüberstan<strong>des</strong> mit einer möglichst hohen HEK-IPSE-Konzentration wurde eine<br />
<strong>Expression</strong>szeitkinetik durchgeführt.<br />
Um die optimale <strong>Expression</strong>sdauer mit einer möglichst hohen IPSE-Konzentration zu ermitteln, wurde<br />
einer Kultur mehrmals im Laufe von 14 Tagen eine 100 µl-Probe entnommen. Die erhaltenen Proben<br />
wurden zur Ermittlung einer Zeitkinetik im Basophilenstimulationsassay (siehe 3.9.2) eingesetzt. Die<br />
Menge der <strong>IL</strong>-4-Freisetzung ist dabei ein Maß für die in der Probe enthaltene IPSE-Konzentration.<br />
41
Methoden<br />
3.5 Insektenzellen<br />
3.5.1 Kultur und Lagerung von Insektenzellen<br />
Zur <strong>Expression</strong> von rekombinantem Protein in Insektenzellen wurde die Zelllinie High Five TM der<br />
Firma Invitrogen verwendet. Diese Zellen können sowohl adhärent als auch in Suspensionskultur<br />
kultiviert werden. In dieser Arbeit wurden nur adhärent wachsende Insektenzellen eingesetzt.<br />
Die Zellen werden in Insektenzellmedium im Brutschrank bei 27 °C gehalten und alle 3 bis 4 Tage im<br />
Verhältnis 1:5 geteilt. Zur Langzeitkonservierung können die Zellen in DMSO-haltigem<br />
<strong>Ei</strong>nfriermedium in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Dafür werden die Zellen als Monolayer<br />
angezogen bis sie 80-90 % Konfluenz erreicht haben. Aus dem Kulturüberstand wird das<br />
<strong>Ei</strong>nfriermedium angesetzt. Die Zellen werden für 10 min bei 600 x g abzentrifugiert und in<br />
<strong>Ei</strong>nfriermedium resuspendiert, so dass eine Zelldichte von 3 x 10 6 Zellen/ml erreicht wird. Die<br />
Zellsuspension wird zu je 1 ml in Gefriergefäße aliquotiert und langsam mit einer<br />
Temperaturabsenkung von 1 °C pro Minute auf -80 °C eingefroren. Anschließend können die Zellen<br />
in flüssigen Stickstoff überführt werden. <strong>Ei</strong>ngefrorene Zellen können wieder in Kultur genommen<br />
werden, indem sie bei 27 °C aufgetaut, in Insektenzellmedium resuspendiert und in eine<br />
75 cm 2 -Kulturflasche ausgesät werden. Sobald die Zellen adhärent sind, erfolgt ein Mediumwechsel,<br />
um toxisches DMSO zu entfernen.<br />
Insektenzellmedium<br />
<strong>Ei</strong>nfriermedium für Insektenzellkultur<br />
1000 ml Express-Five ® SFM 42,5 % (v/v) Insektenzellmedium<br />
10 µg/ml Gentamicin 42,5 % (v/v) Kulturüberstand<br />
18 mM Glutamin 10 % (v/v) DMSO<br />
5 % (v/v) FCS<br />
Die Zusätze werden über einen 0,2 µm Spitzenfilter (Filtropour, Firma Sarstedt) in das Medium<br />
filtriert.<br />
3.5.2 Transfektion von Insektenzellen<br />
Zur Transfektion der Insektenzellen mit den gereinigten Vektoren pIB-V5-His-IPSE bzw. pIB-IPSE<br />
wurde das kationische Lipotransfektionsreagenz Cellfectin eingesetzt. Für die Transfektion werden<br />
nur Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase mit einer Viabilität von mehr als 95 % verwendet.<br />
Von diesen Zellen werden 0,8 x 10 6 Zellen in einer 6-Lochplatte mit 2 ml Insektenzellmedium<br />
ausgesät. Für die Transfektionsmischung werden 1 ml Insektenzellmedium mit 10 µg gereinigter<br />
Vektor-DNA und 6 µl Cellfectin vermischt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Sobald die<br />
Zellen adhärent sind, wird das Medium abgenommen und langsam die Transfektionsmischung<br />
42
Methoden<br />
zugegeben. Für 4 h werden die Zellen im Brutschrank unter gelegentlichen Bewegungen inkubiert.<br />
Mit zusätzlichen 2 ml Insektenzellmedium wird der Transfektionsansatz für 48 h bei 27 °C kultiviert.<br />
Zur Selektion wird den Zellen 80 µg/ml Blasticidin zugesetzt. Der Kulturüberstand wird im<br />
Basophilenstimulationsansatz auf Anwesenheit von rekombinantem High Five-IPSE überprüft. Sobald<br />
die Kultur aus stabil transfizierten Zellen besteht, wird die Blasticidinkonzentration auf 10 µg/ml<br />
abgesenkt.<br />
3.5.3 <strong>Expression</strong> von rekombinantem IPSE in Insektenzellen<br />
Über den OpIE2-Promotor <strong>des</strong> transfizierten pIB/V5-His-Vektors wird das in den Vektor klonierte<br />
Protein kontinuierlich exprimiert. Des Weiteren besitzt der transfizierte Vektor neben der IPSE-<br />
Sequenz auch die IPSE-Signalsequenz mit Hilfe derer das exprimierte Protein in das umgebende<br />
Medium sekretiert werden kann.<br />
Um die optimale <strong>Expression</strong>sdauer zu ermitteln, wurde eine <strong>Expression</strong>skinetik durchgeführt wie<br />
unter 3.4.3 beschrieben. Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse, wurden die Überstände der<br />
Insektenzellkultur nach 8 bis 9 Tagen abgenommen und weiter aufgereinigt. Durch bestimmte<br />
Komponenten in dem serumfreien Medium, die von dem Hersteller nicht genauer spezifiziert werden,<br />
müssen die Überstände vor der IMAC dialysiert werden, da sonst Ni 2+ -Ionen von der Matrix<br />
gewaschen werden.<br />
43
Methoden<br />
3.6 Reinigung von rekombinantem IPSE aus eurkaryotischen Zellen<br />
3.6.1 Immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC)<br />
Die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie ist eine säulenchromatographische<br />
Reinigungsmethode bei der an Agarose gebundene N-Nitrilo-tri-essigsäure (NTA) zweiwertige Ionen<br />
wie z.B. Ni 2+ über vier Bindungsstellen chelatiert. Diese zweiwertigen Ionen haben eine hohe Affinität<br />
zu Histidin, welches als His 6 -Tag an den rekombinant exprimierten Proteinen vorliegt. Während die<br />
His-getaggten Proteine an die Ni-NTA-Agarose binden, können kontaminierende Proteine durch<br />
Waschen entfernt werden. Die Elution erfolgt durch Zugabe von hohen Konzentrationen <strong>des</strong><br />
Histidinanalogons Imidazol, welches das gebundene Protein kompetitiv verdrängt.<br />
Das Protokoll zur Proteinpräparation basiert auf den Herstellerangaben der Ni-NTA-Matrix. Dabei<br />
werden 1 l abzentrifugierter Kulturüberstand mit 333 ml 4x Inkubationspuffer und 2 ml in<br />
Inkubationspuffer äquilibrierter Ni-NTA versetzt und zur Bindung der Proteine an die Matrix für<br />
min<strong>des</strong>tens 90 min auf dem Rollenmischer inkubiert. Die Mischung wird über Gravitationskraft in<br />
eine Chromatographiesäule gefüllt und das Effluent gesammelt. Schwach an die Ni-NTA gebundene<br />
Proteine werden durch Waschen mit 3 mal 15 ml 1x Inkubationspuffer entfernt. Die Elution erfolgt<br />
mit Elutionspuffer (250 mM Imidazol) in 13 Fraktionen à 1,5 ml.<br />
4x Inkubationspuffer<br />
Elutionspuffer<br />
200 mM NaH 2 PO 4 50 mM NaH 2 PO 4<br />
1,2 M NaCl 300 mM NaCl<br />
50 mM Imidazol 250 mM Imidazol<br />
pH-<strong>Ei</strong>nstellung mit 10 M NaOH auf 8,0 pH-<strong>Ei</strong>nstellung mit 1 M NaOH auf 8,0<br />
3.6.2 Immunoaffinitätschromatographie<br />
Bei der Immunoaffinitätschromatographie werden Antikörper gegen das zu reinigende Antigen<br />
kovalent an eine Säulenmatrix gekoppelt. Das Antigen wird auf der Säule zurückgehalten, während<br />
kontaminierende Proteine im Effluent zu finden sind. Die Elution <strong>des</strong> gebundenen Antigens kann<br />
durch Absenkung <strong>des</strong> pH-Wertes oder durch Erhöhung der Salzkonzentration geschehen.<br />
3.6.2.1 Herstellung einer anti-IPSE-Säule<br />
Die Kopplung der gereinigten monoklonalen anti-IPSE Antikörper an eine 5 ml NHS-aktivierte<br />
HiTrap Sepharose-Säule (Firma Amersham Biosciences) wurde nach Herstellerangaben durchgeführt.<br />
44
Methoden<br />
Anschließend wird die Säule mit 20 ml PBS mit Azid (0,01 % w/v) zur Konservierung gespült und bei<br />
4 °C gelagert. Die Kopplungseffizienz wurde nach Herstellerangaben über spektralphotometrische<br />
Absorptionsmessung bei 280 nm nach Auftrennung <strong>des</strong> Effluents über eine PD-10 Säule (Firma<br />
Amersham Biosciences) bestimmt und lag bei 94 %.<br />
Kopplungspuffer (pH 4,0) Puffer A (pH 8,3) PufferB (pH 4,0)<br />
200 mM NaHCO 3 500 mM Ethanolamin 100 mM Na-Acetat<br />
500 mM NaCl 500 mM NaCl 500 mM NaCl<br />
3.6.2.2 Proteinreinigung von IPSE über eine anti-IPSE-Säule<br />
Zur weiteren Aufreinigung werden die Elutionsfraktionen aus der IMAC immunoaffinitätschromatographisch<br />
aufgetrennt. <strong>Ei</strong>ne 5 ml anti-IPSE-Säule wird dafür an eine ÄktaPurifier Anlage<br />
(Firma Amersham Biosciences) angeschlossen. Während <strong>des</strong> gesamten Laufs wird über einen<br />
UV-Monitor das Proteinprofil bei 280 nm aufgezeichnet. Die vereinigten Elutionsfraktionen werden<br />
gegen PBS-Puffer (pH 7,4) dialysiert und filtriert (0,2 µm Filtropour Spitzenfilter, Firma Sarstedt).<br />
Über einen 50 ml Superloop wird die Probe bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min auf eine 5 ml<br />
anti-IPSE-Säule aufgetragen. Dabei werden Fraktionen à 15 ml gesammelt. Anschließend wird die<br />
Säule mit 2 Säulenvolumen PBS gewaschen. Die Elution erfolgt durch Absenkung <strong>des</strong> pH-Wertes auf<br />
pH 2,7 mit 100 mM Glycin-HCl bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min. Es werden Fraktionen à<br />
1 ml gesammelt, die anschließend sofort mit 50 µl 1 M Tris-HCl pH 9,0 neutralisiert werden.<br />
Peakfraktionen werden gegen PBS-Puffer dialysiert und in Centricon Plus-20 Filtern (Firma<br />
Millipore) konzentriert. Die Proteinkonzentration wird wie unter 3.7.1.2 beschrieben ermittelt.<br />
3.6.3 Reinigung von HEK-IPSE über Gelfiltration<br />
Die Gelfiltration wird häufig als letzter Reinigungsschritt eingesetzt, um letzte Kontaminationen zu<br />
entfernen. Dabei werden die Proteine ihrer Größe nach aufgetrennt, wobei wie schon unter 3.3.1.2<br />
erwähnt, größere Moleküle eher eluieren als kleinere Moleküle. Die Gelfiltration von HEK-IPSE<br />
wurde eingesetzt, um letzte Reste <strong>des</strong> Monomers bzw. Kontaminationen, die sich in der<br />
silbergefärbten SDS-PAGE eventuell nicht darstellen lassen, zu entfernen.<br />
Die Gelfiltration wurde mit einer Superdex 75-Säule (Superdex 75 10/300 GL von Amersham<br />
Biosciences) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:<br />
Probe:<br />
50 µl HEK-IPSE 1,8 mg/ml (entspricht 90 µg)<br />
Laufpuffer: PBS pH 7,4<br />
Fließgeschwindigkeit: 0,05 ml/min<br />
Fraktionsgröße: 500 µl<br />
45
Methoden<br />
3.7 Allgemeine proteinchemische Methoden<br />
3.7.1 Bestimmung der Proteinkonzentration<br />
3.7.1.1 Bestimmung der Proteinkonzentration über spektralphotometrische Absorptionsmessung<br />
Proteinkonzentrationen können über spektralphotometrische Absorptionsmessung bei 280 nm ermittelt<br />
werden. Das Absorptionsmaximum von Proteinen bei 280 nm ergibt sich durch die aromatischen<br />
Aminosäuren Tryptophan (Trp) und Tyrosin (Tyr), sowie zu einem geringen Teil den Disulfidbrücken.<br />
Der spezifische Extinktionskoeffizient (ε S ) für HEK-IPSE wurde über das Programm ProtParam [2]<br />
ermittelt und liegt bei 1,27. Nach dem Lambert-Beerschen-Gesetz lässt sich über den spezifischen<br />
Extinktionskoeffizienten und die Absorption die Proteinkonzentration einer Lösung bestimmen.<br />
A 280 nm = ε S x c x d → c = A 280 nm x ε S<br />
-1<br />
ε S = molarer Extinktionskoeffizient [l x mol -1 x cm -1 ],<br />
c = Konzentration [g x l -1 ],<br />
d = Schichtdicke der Küvette [cm] = 1 cm<br />
Zur Messung werden 80 µl der Probe in eine Kunststoff-<strong>Ei</strong>nmalküvette (UVette, Firma Eppendorf),<br />
die für Messungen im UV-Bereich geeignet ist, gefüllt und im Photometer (BioPhotometer, Firma<br />
Eppendorf) bei 280 nm vermessen. Als Leerwert dient das Lösungsmittel der Probe ohne Protein.<br />
3.7.1.2 Proteinbestimmung mit der BCA-Methode (Smith et al. 1985)<br />
Die Proteinquantifizierung mit Hilfe der BCA-Methode beruht darauf, dass Kupferionen im<br />
alkalischen Milieu durch Proteine reduziert werden (Cu 2+ → Cu + ). Das einwertige Kupfer bildet<br />
anschließend mit 2,2´-Bichinoninsäure (BCA) einen violetten Chelatkomplex, der bei 570 nm nahezu<br />
linear zur Proteinkonzentration im Bereich von 20 bis 2000 µg/ml absorbiert.<br />
Die BCA-Methode wurde mit dem „BCA TM Protein Assay Reagent Kit“ (Firma Pierce) nach<br />
Herstellerangaben durchgeführt. Für Proteinkonzentrationen unter 200 µg/ml wurde der sensitivere<br />
„Micro BCA TM Protein Assay Reagent Kit“ (Nachweisgrenze: 0,5 µg/ml) verwendet.<br />
46
Methoden<br />
3.7.2 Dialyse von Proteinlösungen<br />
Die Dialyse dient zur Umpufferung von Lösungen und zum Entfernen von niedermolekularen<br />
Bestandteilen aus einer Lösung. Dabei diffundieren kleine Moleküle durch eine semipermeable<br />
Membran längs eines Konzentrationsgradienten, bis sich zwischen beiden Seiten der Membran ein<br />
Gleichgewicht eingestellt hat.<br />
Die Dialysemembranen werden vor Gebrauch 20 min in aqua <strong>des</strong>t. gewaschen. Die Wahl der<br />
Dialysemembran ist abhängig von dem Molekulargewicht <strong>des</strong> zu dialysierenden Proteins. Für die<br />
Dialyse von IPSE-haltigen Lösungung werden Dialysemembranen mit einem MWCO von höchstens<br />
10.000 kD eingesetzt. Die Probe wird in den Dialyseschlauch gefüllt, der Dialyseschlauch wird<br />
verschlossen und in das 100-1000fache Volumen Dialyselösung gegeben. Die Dialyse findet über 24 h<br />
bei 4 °C unter Rühren statt, wobei die Dialyselösung nach 2 und nach 4 Stunden ausgetauscht wird.<br />
3.7.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) nach Laemmli (1970)<br />
Die SDS-PAGE dient dazu, Proteine aus einem Gemisch nach ihrem Molekulargewicht aufzutrennen<br />
sowie die Reinheit einer Probe bzw. das Molekulargewicht der Proteine zu bestimmen. Das anionische<br />
Detergenz SDS im Probenpuffer lagert sich im theoretischen Verhältnis von 1,4 : 1 an die Proteine<br />
(Guttman, 1996). Hierdurch verleiht es jedem Protein-SDS-Komplex eine negative Nettoladung, die<br />
proportional zum Molekulargewicht <strong>des</strong> Proteins ist und unterbindet gleichzeitig alle nicht-kovalenten<br />
Bindungen. Wird dem Probenpuffer β-Mercaptoethanol zugesetzt, bewirkt dies zusätzlich eine<br />
Reduktion der Disulfidbrücken. Unter diesen Bedingungen sind die Proteine vollständig denaturiert<br />
und ihre Beweglichkeit im Gel ist proportional zum dekadischen Logarithmus ihrer Masse.<br />
Bei der diskontinuierlichen Gelelektrophorese wird ein System aus zwei Gelen, einem Trenngel und<br />
einem Sammelgel, verwendet. Das großporige Sammelgel dient der Fokussierung der Proteine, damit<br />
sie als scharf abgegrenzte Banden durch das Trenngel laufen. Die Fokussierung wird dadurch erreicht,<br />
dass das Sammelgel einen sauren pH-Wert aufweist, bei dem das im Laufpuffer enthaltene Zwitterion<br />
Glycin nur zu einem geringen Teil als Anion vorliegt. Wird ein elektrisches Feld angelegt, baut sich<br />
durch den Mangel an Anionen ein starkes lokales elektrisches Feld zwischen den sich schnell<br />
bewegenden Chloridionen und den langsameren Glycinationen auf, in dem die Proteine beschleunigt<br />
werden. Beim Übergang in das alkalischere Trenngel wird der Mangel an Anionen aufgehoben und es<br />
herrscht ein gleichmäßiges elektrisches Feld, in dem die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine nur<br />
von ihrem Molekulargewicht abhängt.<br />
Die Proben werden zu gleichen Teilen mit 2x Probenpuffer (reduzierend oder nicht-reduzierend)<br />
versetzt, für 3 Minuten bei 95 °C gekocht (gilt nur für reduzierenden Probenpuffer) und auf das Gel<br />
aufgetragen. Die Zusammensetzung für das Sammelgel und Trenngel ist in Tabelle 3.1 aufgeführt. Zur<br />
Abschätzung <strong>des</strong> Molekulargewichtes wird zusätzlich ein Molekulargewichtsmarker aufgetragen (Low<br />
Molecular Weight Marker, Firma Biorad). Die Auftrennung der Proteine erfolgt in einer<br />
47
Methoden<br />
Elektrophoresekammer der Firma Phase bei zunächst bei 50 V bis die Lauffront das Trenngel erreicht<br />
hat, dann wird die Spannung auf 100 bis 120 V erhöht. Die Elektrophorese wird beendet, wenn die<br />
Lauffront das Gelende erreicht hat.<br />
4x Sammelgelpuffer (pH 6,8) 4x Trenngelpuffer (pH 8,8)<br />
0,5 M Tris-HCl 1,5 M Tris-HCl<br />
2x Probenpuffer (pH 6,8; nicht-reduzierend) Elektrodenpuffer<br />
0,12 M Tris-HCl 50 mM Tris-HCl<br />
20 % (v/v) Glycerin 384 mM Glycin<br />
4 % (w/v) SDS 0,1 % (w/v) SDS<br />
0,01 % (w/v) Bromphenolblau<br />
2x Probenpuffer (pH 6,8; reduzierend)<br />
Für den reduzierenden Probenpuffer wird dem nicht-reduzierendem Probenpuffer 1 % (w/v) DTT<br />
zugesetzt.<br />
Tabelle 3.1: Zusammensetzung von Sammelgel und Trenngel für die SDS-PAGE<br />
Sammelgel<br />
Trenngel<br />
T = 4 % T = 7,5 % T = 12 % T = 15 %<br />
Aqua <strong>des</strong>t. 2,9 ml 8 ml 5,5 ml 3,9 ml<br />
Acrylamid 850 µl 4 ml 6,5 ml 8,1 ml<br />
4x Sammelgelpuffer 1,3 ml -<br />
4x Trenngelpuffer - 4 ml<br />
Pyronin G 16 µl -<br />
SDS (10 % (w/v) 51 µl 163 µl<br />
TEMED 5 µl 16 µl<br />
APS (10 % (w/v) 30 µl 100 µl<br />
48
Methoden<br />
3.7.4 Färbung von Polyacrylamidgelen<br />
3.7.4.1 Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick (1988)<br />
Die empfindlichste Nachweismethode von Proteinen in Polyacrylamid-Gelen ist die Silberfärbung, die<br />
nach der Methode von Heukeshoven und Dernick eine Nachweisgrenze von 50 bis 100 pg pro Bande<br />
aufweisen kann. Diese Empfindlichkeit wird jedoch nur selten erreicht, da nicht je<strong>des</strong> Protein<br />
gleichermaßen mit dieser Methode angefärbt werden kann. Bei der Silberfärbung bilden Ag + -Ionen<br />
mit Glutamat-, Aspartat- und Cysteinresten Komplexe. Alkalisches Formaldehyd reduziert das Ag + der<br />
Komplexe zu metallischem Silber, das sichtbar ist.<br />
Die Proteine im Gel werden zunächst 15 Minuten in Fixierlösung fixiert und dann für eine Stunde in<br />
thiosulfathaltige Inkubationslösung überführt. Das Gel wird 4 Mal für 5 min in aqua <strong>des</strong>t. gewaschen<br />
und dann eine halbe Stunde in Silberlösung inkubiert. Nach kurzem Waschen <strong>des</strong> Gels in aqua <strong>des</strong>t.<br />
werden die Banden durch Entwicklerlösung bis zur gewünschten Intensität angefärbt. Die Reaktion<br />
wird durch Inkubation in Stopplösung beendet. Zur Konservierung wird das Gel für eine Stunde in<br />
Glycerinlösung überführt und anschließend zwischen zwei Lagen eingeweichter <strong>Ei</strong>nmachhaut auf<br />
einer Glasscheibe getrocknet.<br />
Fixierlösung<br />
30 % (v/v) Ethanol<br />
10 % (v/v) <strong>Ei</strong>sessig<br />
Inkubationslösung<br />
30 % (v/v) Ethanol<br />
500 mM Natriumacetat<br />
0,5 % (v/v) Glutardialdehyd<br />
0,3 % (w/v) Natriumthiosulfat<br />
Glutardialdehyd und Natriumthiosulfat werden erst direkt vor Gebrauch zugefügt.<br />
Silberlösung<br />
0,1 % (w/v) Silbernitrat<br />
0,05 % (v/v) Formaldehyd<br />
Die Lösung wird direkt vor Gebrauch frisch angesetzt.<br />
Entwickler<br />
230 mM Natriumcarbonat<br />
0,05 % (v/v) Formaldehyd<br />
Das Formaldehyd wird erst direkt vor Gebrauch zugesetzt.<br />
49
Methoden<br />
Stopplösung<br />
50 mM EDTA<br />
Glycerinlösung<br />
1,5 % (v/v) Glycerin<br />
3.7.4.2 Coomassie-Färbung nach Neuhoff et al. (1988)<br />
Der Triphenylmethanfarbstoff Coomassie bildet mit den fixierten Proteinen im Gel einen stabilen<br />
Protein-Farbstoff-Komplex. Die Coomassie-Färbung ist weniger sensitiv als die Silberfärbung. Wie<br />
auch bei der Silberfärbung ist die Sensitivität abhängig vom Protein und kann bei 200 bis 400 ng pro<br />
Bande liegen.<br />
Zur Färbung werden die Gele direkt in Coomassie-Färbelösung für min<strong>des</strong>tens 2 h inkubiert und<br />
anschließend in Entfärbelösung überführt. Die Entfärbelösung wird so oft erneuert, bis nur noch eine<br />
möglichst geringe Hintergrundfärbung zu sehen ist. Nach Inkubation für 1 h in Glycerinlösung können<br />
die Gele zwischen zwei Lagen eingeweichter <strong>Ei</strong>nmachhaut konserviert werden. Die Entfärbelösung<br />
wird über Aktivkohle regeneriert.<br />
Coomassie-Färbelösung<br />
Coomassie-Entfärbelösung<br />
0,5 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250 18 % (v/v) Isopropanol<br />
40 % (v/v) Ethanol 9 % (v/v) <strong>Ei</strong>sessig<br />
10 % (v/v) <strong>Ei</strong>sessig<br />
Glycerinlösung<br />
2 % (v/v) Glycerin<br />
7 % (v/v) <strong>Ei</strong>sessig<br />
3.7.5 Westernblot<br />
Beim Westernblot werden die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf eine<br />
Nitrocellulosemembran transferiert und anschließend über spezifische Antikörper sichtbar gemacht.<br />
Der Transfer erfolgte in der vorliegenden Arbeit mittels Elektroblotting nach dem Semi-Dry-Blotting-<br />
Prinzip von Khyse-Andersen (1984). Dabei werden die Proteine aus der Polyacrylamidmatrix über das<br />
senkrecht zum Gel angelegte elektrische Feld eluiert und in derselben Anordnung von der Membran<br />
adsorbiert.<br />
50
Methoden<br />
Für den luftblasenfreien Aufbau <strong>des</strong> Blots werden auf die Anode zwei Filterpapiere gelegt, die mit<br />
Anodenpuffer I getränkt sind, dann ein Filterpapier, das mit Anodenpuffer II getränkt ist und<br />
schließlich die Nitrocellulosemembran (Protran ® , Firma Schleicher & Schüll) und das Gel, die beide in<br />
Anodenpuffer II äquilibriert worden sind. Abschließend folgen drei in Kathodenpuffer getränkte<br />
Filterpapiere und die Kathode. Der Aufbau wird mit einem 2 kg-Gewicht beschwert und der<br />
Blotvorgang erfolgt für 30 min bei 0,8 mA/cm 2 . Nach erfolgtem Blotting wird das Gel entfernt und die<br />
Membran trockengefönt. Zur Blockierung freier Bindungsstellen wird die Membran für min<strong>des</strong>tens<br />
1 h in TBST auf einem Schüttler inkubiert und wieder getrocknet.<br />
Anodenpuffer I (pH 10,0) Kathodenpuffer (pH 9,4)<br />
300 mM Tris-HCl 25 mM Tris-HCl<br />
20 % (v/v) Methanol 10 % (v/v) Methanol<br />
20 mM 6-Aminohexansäure<br />
Anodenpuffer II (pH 10,4)<br />
25 mM Tris-HCl<br />
20 % (v/v) Methanol<br />
3.7.5.1 Proteinnachweis im Westernblot über India Ink-Färbung (Hancock und Tsang, 1983)<br />
Proteine, zum Beispiel Markerproteine, können auf Westernblotmembranen unspezifisch über eine<br />
India Ink-Färbung mit einer Nachweisgrenze von 80 bis 200 ng/Bande angefärbt werden (Hancock<br />
und Tsang, 1983). Dafür wird die India Ink-Lösung 1:1000 in TBST verdünnt und die Membran darin<br />
1 h inkubiert. Überschüssige Farbpartikel werden durch mehrmaliges Waschen mit TBST entfernt und<br />
die Membran getrocknet.<br />
3.7.5.2 Spezifischer Proteinnachweis und Antikörperbindung im Westernblot<br />
Als Detektionssystem für den Westernblot wurde das Alkalische Phosphatase-System verwendet. Die<br />
Alkalische Phosphatase (AP) spaltet von einem Substrat-Chromogengemisch einen Phosphatrest ab,<br />
wobei ein Farbstoff freigesetzt wird. In der vorliegenden Arbeit wurde 5-Bromo-4-chloro-3-<br />
indolylphosphat (BCIP) als Substrat eingesetzt, welches durch Dephosphorylierung und Oxidation in<br />
einen blauen Farbstoff umgewandelt wird. Als Oxidationsmittel dient Nitroblautetrazoliumchlorid<br />
(NBT), welches nach der Reaktion ebenfalls einen blauen Farbstoff ergibt und somit farbverstärkend<br />
wirkt. Die Alkalische Phosphatase ist entweder an Sekundärantikörper gekoppelt oder liegt als an<br />
Streptavidin gebundenes Fusionsprotein vor (Streptavidin-Alkalische Phosphatase = SavAP).<br />
Der blockierte Blot wird in 3 mm breite Streifen geschnitten und in einer Kanalschale mit dem<br />
Primärantikörper über Nacht inkubiert. Der Primärantikörper wird durch dreimaliges Waschen mit<br />
51
Methoden<br />
TBST für jeweils 10 min entfernt und die Blots werden für 2 h mit dem AP-konjugierten<br />
Sekundärantikörper behandelt. Nach einem erneuten Waschzyklus, wird die Membran in TBS pH 9,5<br />
äquilibriert und die Bindung der Antikörper durch Reaktion der Alkalischen Phosphatase mit<br />
zugesetztem NBT/BCIP visualisiert. Die Reaktion wird durch Waschen mit aqua <strong>des</strong>t. gestoppt.<br />
Sämtliche Inkubationsschritte finden in einem Inkubationsvolumen von 1 ml bei Raumtemperatur auf<br />
einem Schüttler statt und alle Verdünnungen werden mit TBST hergestellt.<br />
BCIP-Stammlösung<br />
5 mg/ml BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat)<br />
gelöst in TBS-Puffer pH 9,5<br />
NBT-Stammlösung<br />
33 mg/ml NBT (Nitroblautetrazoliumchlorid)<br />
gelöst in TBS-Puffer pH 9,5<br />
Chromogenlösung für Alkalische Phosphatase<br />
1 ml BCIP-Stammlösung wird mit 30 ml NBT-Stammlösung vereinigt und auf 37 °C angewärmt.<br />
3.7.6 Biotinylierung von Proteinen<br />
Biotin kann über N-Hydroxysuccinimid (NHS) unter milden alkalischen Bedingungen an<br />
Amingruppen von Proteinen gekoppelt werden. Biotin besitzt eine sehr hohe natürliche Affinität zu<br />
Streptavidin mit einer Dissoziationskonstante von K D = 10 -15 M. Mit an Streptavidin (Sav) gekoppelter<br />
Alkalischen Phosphatase (AP) können biotinylierte Proteine im Westernblot nachgewiesen werden. In<br />
der vorliegenden Arbeit wurde biotinyliertes HEK-IPSE ebenfalls dazu verwendet die Bindung von<br />
IPSE an Basophile in FACS-Analysen zu untersuchen. Als Nachweissystem diente dabei an<br />
Phycoerythrin (PE) gekoppeltes Streptavidin (SavPE).<br />
Für die Biotinylierung werden 22 mg (+)-Biotin-N-hydroxysuccinimi<strong>des</strong>ter in DMSO gelöst und das<br />
zu biotinylierende Protein im Verhältnis 3 Teile Protein zu 1 Teil Biotinlösung damit vermischt. Nach<br />
4 h Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Rollenmischer wird das nicht gebundene Biotin durch<br />
Dialyse entfernt.<br />
52
Methoden<br />
3.8 Methoden zur Untersuchung von IPSE<br />
3.8.1 Doppelimmunodiffusionsassay nach Ouchterlony<br />
Die zweidimensionale Immunodiffusion nach Ouchterlony, auch Agar-Gel-Doppeldiffusion genannt,<br />
dient der Identitätsuntersuchung und semiquantitativen Bestimmung von Antigenen. Dabei werden<br />
zwei Proteinlösungen in vorgestanzte Löcher in ein Agarosegel eingebracht, so dass die Proteine frei<br />
in dem Gel diffundieren können. Sofern beide Reaktionspartner bivalent füreinander sind und in<br />
äquimolarer Menge vorliegen, bilden sich Präzipitate, die durch Färbemethoden, wie zum Beispiel der<br />
Coomassie-Färbung, sichtbar gemacht werden können.<br />
Die Agarose wird in Barbitalpuffer unter Kochen gelöst und 5 ml davon auf 7,5 cm x 2,5 cm große<br />
GelBond ® -Folie (Firma Biozym) pipettiert. Nach dem Abkühlen werden mit einer Stanze Löcher in<br />
die Agarosegele gestanzt. Von den Reaktionspartnern werden Verdünnungsreihen angelegt und wie in<br />
Abbildung 3.1 angegeben in die Löcher pipettiert. In einer wasserdampfgesättigten Metallschale<br />
werden die Gele für 48 h inkubiert. Nach der Inkubation werden die Gele zunächst gepresst und freie<br />
Proteine durch Waschen entfernt (2 x für 30 min mit Kochsalzlösung, 2 x für 10 min mit aqua <strong>des</strong>t.).<br />
Nach erneutem Pressen und Trocknen werden die Gele zur Färbung für 10 min in Coomassie-Lösung<br />
überführt und anschließend mehrmals mit Entfärberlösung entfärbt, wobei zunächst ein Mal<br />
Entfärbelösung I verwendet wird und bis zur vollständigen Entfärbung <strong>des</strong> Hintergrun<strong>des</strong><br />
Entfärbelösung II eingesetzt wird. Durch Trocknen werden die Gele konserviert.<br />
Abbildung 3.1: Schematischer Aufbau eines Doppelimmunodiffusionsassays nach Ouchterlony. In das<br />
Agarosegel werden Vertiefungen in der dargestellten Anordnung gestanzt. Lösung A (z. B. Antigen) wird in die<br />
Mitte platziert, Verdünnungsstufen der Lösung B (z. B. Antikörper) werden in die umgebenden Löcher gegeben.<br />
Beide Lösungen können im Gel diffundieren. Sofern beide Reaktionspartner bivalent füreinander sind, ergibt<br />
sich an der Stelle an der beide in der gleichen Konzentration vorliegen ein Präzipitat, dass über Färbemethoden<br />
visualisiert werden kann. Auf der rechten Seite <strong>des</strong> Gels, wird der Versuch in umgekehrter Anordnung<br />
durchgeführt.<br />
53
Methoden<br />
Barbitalpuffer<br />
2,5 mM 5,5-Diethylbarbitursäure-Natriumsalz<br />
0,7 mM 5,5-Diethylbarbitursäure (bei 95 °C im Wasserbad lösen)<br />
0,015 % (w/v) Merthiolat<br />
keine pH-<strong>Ei</strong>nstellung, pH-Wert sollte bei 8,3 liegen<br />
Coomassie-Färbelösung<br />
0,5 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R-250<br />
40 % (v/v) Ethanol<br />
10 % (v/v) <strong>Ei</strong>sessig<br />
Entfärbelösung I<br />
15 % (v/v) Ethanol<br />
5 % (v/v) <strong>Ei</strong>sessig<br />
Entfärbelösung II<br />
18 % (v/v) Isopropanol<br />
9 % (v/v) <strong>Ei</strong>sessig<br />
3.8.2 Deglycosylierung von Proteinen<br />
PNGase F, eine Amidase aus Flavobacterium meningosepticum, spaltet N-glycosidische Bindungen<br />
zwischen dem Asparagin <strong>des</strong> Glycoproteins und der Kohlenhydratseitenkette. Endo H spaltet dagegen<br />
zwischen den beiden ß-(1→4) gebundenen N-Acetylglucosaminresten, so dass nach der Spaltung an<br />
dem Protein ein N-Acetylglucosaminrest verbleibt.<br />
Für die Deglycosylierung werden 12 µg Protein in einem Volumen von 20 µl mit 5 U <strong>des</strong> jeweiligen<br />
Enzyms versetzt und 24 h bei 37 °C inkubiert. Da das Enzym Endo H bei pH 7,4 nicht aktiv ist, wird<br />
der pH-Wert bei dieser Probe auf pH 5,5 abgesenkt. Der Erfolg der Deglycosylierung wird in der<br />
SDS-PAGE und im Westernblot untersucht.<br />
3.8.3 Massenspektrometrische Untersuchung mit MALDI-TOF-MS<br />
Die MALDI-TOF-MS (Matrix-assistierte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeit-Massenspektroskopie)<br />
dient der Molekulargewichtsbestimmung von Biomolekülen. In diesem Fall wurde die<br />
Methode zur Molekulargewichtsbestimmung von HEK-IPSE eingesetzt. Proteine lassen sich unter<br />
54
Methoden<br />
normalen Umständen nicht in die Gasphase überführen und sind somit nicht für die<br />
Massenspektroskopie verwendbar. Bei der MALDI-TOF-MS wird dieses Problem gelöst, indem die<br />
Proben in Kristalle einer Matrix, häufig eine niedermolekulare organische Säure, eingelagert werden.<br />
Werden diese Analyt-Matrix-Kristalle mit einem Laser beschossen, wird die Probe mit Hilfe der<br />
Matrix ionisiert und zusammen mit ihr in die Gasphase überführt. Die Ionen werden dann in einem<br />
elektrischen Feld beschleunigt und ihre Flugzeit am Detektor bestimmt. Durch <strong>Ei</strong>chung <strong>des</strong><br />
Instrumentes mit Molekülen bekannter Masse werden aus den Flugzeiten der Analyt-Ionen die<br />
Massen-Ladungsverhältnisse m/z ermittelt.<br />
Die Arbeiten wurden von PD Dr. B. Lindner (LG Biophysik, Forschungszentrum Borstel)<br />
durchgeführt.<br />
3.8.4 Kristallisation<br />
Voraussetzung für die Strukturaufklärung von Proteinen über Röntgenbeugungsmuster ist das<br />
Vorhandensein eines Proteinkristalls. Bei der Proteinkristallisation wird einer konzentrierten<br />
Proteinlösung langsam Wasser entzogen. Unter bestimmten Bedingungen lagern sich die Moleküle bei<br />
dieser Konzentrierung in einer gleichmäßigen Anordnung an, so dass ein Kristall wachsen kann.<br />
Welche Bedingungen zu dieser Kristallisation führen, kann nicht vorhergesagt werden und ist<br />
proteinabhängig. Die zwei am häufigsten verwendeten Kristallisationsverfahren sind das Batch-<br />
Verfahren und die Dampfdiffusionsmethode.<br />
In dieser Arbeit wurde die Dampfdiffusionsmethode verwendet, da hier im Gegensatz zum Batch-<br />
Verfahren in einem Experiment ein weiter Konzentrationsbereich untersucht werden kann. Man<br />
unterscheidet die Dampfdiffusionsmethode im „hängenden Tropfen“ und im „sitzenden Tropfen“<br />
(beide sind in Abbildung 3.2 dargestellt), wobei beide Arten der Durchführung auf demselben Prinzip<br />
beruhen. <strong>Ei</strong>n Tropfen mit einem Gemisch aus wässriger Proteinlösung und Fällungsmittel wird hierbei<br />
in den Kopfraum einer Mikrotiterplatte platziert. Die eigentliche Vertiefung wird mit einer deutlich<br />
größeren Menge Fällungsmittel gefüllt und dicht verschlossen. Im Kopfraum entsteht so eine<br />
gesättigte Fällungsmittel-Atmosphäre, wodurch das Wasser langsam aus dem proteinhaltigen Tropfen<br />
diffundiert. Durch diese Diffusion steigt die Fällungsmittel- und Proteinkonzentration im sitzenden<br />
oder hängenden Tropfen während <strong>des</strong> Versuchs kontinuierlich an.<br />
Um möglichst viele Konditionen untersuchen zu können, wurde das JBScreen Crystallization Kit der<br />
Firma Jena Biosciences verwendet. In dem Kit sind 240 Ampullen mit unterschiedlichen<br />
Pufferbedingungen und Fällungsmittelkonzentrationen enthalten (genaue Zusammensetzung siehe<br />
Herstellerangaben), die nach Literaturrecherche schon häufig zur erfolgreichen Kristallisation geführt<br />
haben. Der Inhalt einer Ampulle (700 µl) wird in die große Vertiefung einer 24-Loch-Cloverplate<br />
(Firma Jena Biosciences) gefüllt. 2 µl der Proteinlösung (HEK-IPSE 13 mg/ml in 100 mM MES-<br />
Puffer pH 6,5) und 2 µl der jeweiligen Kondition werden vorsichtig in die kleine Vertiefung der Platte<br />
55
Methoden<br />
pipettiert, so dass sich die beiden Tropfen gerade eben vereinigen können. Abschließend wird die<br />
Platte gut verschlossen und waagerecht in einem klimatisiertem Raum bei 25 °C gelagert. Der<br />
Krisallisationsprozess wird in Abständen unter dem Mikroskop beobachtet und dokumentiert.<br />
<strong>Ei</strong>n zweites Kristallisationsexperiment wurde mit HEK-IPSE in der Hochdurchsatz-Kristallisationsanlage<br />
<strong>des</strong> Europäischen Laboratoriums für Molekularbiologie (EMBL) in Hamburg von<br />
Dr. J. Müller-Dieckmann durchgeführt.<br />
Abbildung 3.2: Prinzipielle Durchführungsarten der Dampfdiffusionsmethode zur Proteinkristallisation:<br />
„hängender Tropfen“ und „sitzender Tropfen“. <strong>Ei</strong>n Gemisch aus Protein und Fällungsmittel wird in den<br />
Kopfraum einer Mikrotiterplatte gegeben. Beim „hängenden Tropfen“ wird das Gemisch an der Abdeckung<br />
angebracht, beim „sitzenden Tropfen“ auf einem Vorsprung in der Vertiefung. <strong>Ei</strong>n großer Überschuss an<br />
Fällungsmittel wird in die große Vertiefung pipettiert und die Platte luftdicht verschlossen, so dass sich eine<br />
Fällungsmittel gesättigte Atmosphäre im Kopfraum einstellt.<br />
56
Methoden<br />
3.9 Methoden zur Untersuchung der Wirkung von IPSE auf basophile<br />
Granulozyten<br />
3.9.1 Aufreinigung humaner basophiler Granulozyten<br />
Die Aufreinigung der humanen basophilen Granulozyten (Basophilen) erfolgte nach einem<br />
dreistufigen Verfahren nach der Methode von Haisch et al. (1999). Das Verfahren besteht aus einer<br />
Dichtegradienten-Zentrifugation, einer Gegenstrom-Elutriation und einer negativen Selektion mit<br />
immunomagnetischen Beads. Die Basophilen wurden aus Frischblut von freiwilligen, gesunden<br />
Spendern gewonnen. <strong>Ei</strong>ne Zustimmung Ethikkommission der Medizinischen Falkultät der Universität<br />
zu Lübeck lag vor (Aktenzeichen 03-319). Direkt bei der Abnahme wurde das Blut mit 10 % (v/v)<br />
einer 100 mM EDTA-Lösung (pH 7,4) als Antikoagulanz vermischt.<br />
3.9.1.1 Ficoll/Percoll Dichtegradienten-Zentrifugation<br />
<strong>Ei</strong>ne 100:6 Ficoll-Percoll-Mischung (Dichte = 1080 g/l) wird mit dem frischen Blut-EDTA-Gemisch<br />
überschichtet und 30 min bei 4 °C und 600 x g zentrifugiert. Die leukozytenreiche Interphase wird<br />
abgenommen, mit kalter, physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in HBSS-Puffer<br />
aufgenommen.<br />
HBSS-Puffer (pH 7,4)<br />
10x HBSS-Lösung (Firma PAA) 1:10 mit aqua <strong>des</strong>t. verdünnt<br />
4,2 mM NaHCO 3<br />
0,25 % (w/v) BSA<br />
3.9.1.2 Gegenstrom-Elutriation<br />
Bei der Gegenstrom-Elutriation ist eine Zentrifuge an eine Peristaltikpumpe angeschlossen und ein<br />
Zellgemisch wird bei konstanter niedriger Fließgeschwindigkeit in die Zentrifuge eingespeist. Die<br />
Fließrichtung der Zellen und die Zentrifugalkraft sind einander entgegengesetzt, so dass die Zellen<br />
entsprechend ihrer Kompaktheit bzw. Größe sortiert werden. Durch stufenweise Erhöhung der<br />
Fließgeschwindigkeit können die Zellen nacheinander eluiert werden.<br />
Die Anlage wird mit HBSS-Puffer gespült und das Zellgemisch aus der Dichtegradienten-<br />
Zentrifugation wird bei 3500 U/min und 30 ml/min in das System eingespeist. 200 ml <strong>des</strong><br />
Durchflusses bei dieser Fließgeschwindigkeit werden verworfen. Danach wird die<br />
Fließgeschwindigkeit auf 33 ml/min erhöht und weitere 300 ml werden verworfen. Frühere<br />
Untersuchungen haben ergeben, dass Basophile bei einer Fließgeschwindigkeit von 36 bis 45 ml/min<br />
57
Methoden<br />
eluieren. Aus diesem Grund werden 200 ml bei 42 ml/min gesammelt, über Zentrifugation eingeengt<br />
und die Zellzahl und Basophilenreinheit bestimmt.<br />
3.9.1.3 Bestimmung von Zellzahl und Basophilenreinheit<br />
Durch Anfärbung der Zellen mit Trypanblau werden in der Neugebauer-Kammer Zellzahl und<br />
Zellviabilität ermittelt. Zur Bestimmung der Reinheit werden Zytospin-Präparate mit<br />
150.000 Zellen/Objektträger (500 U/min; 1 min) angefertigt und 3 min mit May-Grünwald-Lösung<br />
gefärbt. Im Lichtmikrokop können basophile Granulozyten von kontaminierenden Zellen differenziert<br />
und die Basophilenreinheit bestimmt werden.<br />
3.9.1.4 Negative Selektion mit immunomagnetischen Beads<br />
Zur weiteren Aufreinigung der Fraktion aus der Gegenstrom-Elutriation wurde das MACS Basophil<br />
Isolation Kit (Firma Miltenyi) nach Angaben <strong>des</strong> Herstellers eingesetzt. Die Zellen werden dabei mit<br />
einem Gemisch aus monoklonalen, Hapten-gekoppelten Antikörpern gegen Epitope von<br />
verunreinigenden Zellen versetzt und inkubiert. Durch Inkubation mit einem Zweitantikörper, der<br />
gegen das Hapten gerichtet ist und an den magnetische Beads gekoppelt sind, werden die Nicht-<br />
Basophilen markiert. Das Zellgemisch wird über eine Säule mit magnetisierter Matrix gegeben, die die<br />
markierten Zellen im Magnetfeld festhält, während die unmarkierten Basophilen im Effluent zu finden<br />
sind. Das Effluent wird über Zentrifugation eingeengt, in 500 µl HBSS-Puffer aufgenommen und<br />
erneut die Zellzahl und Basophilenreinheit (siehe 3.9.1.3) bestimmt.<br />
3.9.2 Stimulation der Basophilen zur <strong>IL</strong>-4-Freisetzung<br />
Zur Stimulation werden die aufgereinigten Basophilen in einer Endkonzentration von<br />
25.000 Basophilen/ml in Medium in sterilen Rundbodenplatten (Firma Nunc) bei 37 °C und 6 % CO 2 -<br />
Gehalt in einem befeuchteten Brutschrank über Nacht inkubiert. Da bekannt ist, dass Stimulation mit<br />
<strong>IL</strong>-3, einem Wachstums- und Differenzierungsfaktor von Basophilen, die IgE-vermittelte <strong>IL</strong>-4-<br />
Freisetzung der Zellen potenziert (Brunner et al. 1993), wird zu allen Stimulationsansätzen <strong>IL</strong>-3 in<br />
einer Konzentration von 2,5 ng/ml zugesetzt.<br />
Es wurden jeweils Doppelbestimmungen der zu untersuchenden Substanz in Verdünnungsreihen in<br />
100 µl Endvolumen angefertigt. Als Kontrollen wurden bei jedem Ansatz folgende Stimulatien<br />
mitgeführt:<br />
<strong>IL</strong>-3 (Negativkontrolle)<br />
2,5 ng/ml<br />
Ionomycin (IgE unabhängige Kontrolle) 2 µM<br />
anti-IgE (Positivkontrolle)<br />
50 ng/ml<br />
58
Methoden<br />
Medium zur Stimulation der Basophilen<br />
Protectomed basal Iscoves Medium (IMDM 1x) versetzt mit<br />
50 µg/ml Transferrin<br />
5 µg/ml Insulin<br />
100 U/ml Penicillin G<br />
100 µg/ml Streptomycin-Sulfat<br />
3.9.3 Stripping und Resensibilisierung von Basophilen<br />
Um das an die Fcε-Rezeptoren der Basophilen gebundene IgE zu entfernen, wurde in dieser Arbeit ein<br />
IgE-Stripping in Anlehnung an die Methode von Pruzansky et al. (1983) durchgeführt. Dafür werden<br />
die aufgereinigten Basophilen (0,5 x 10 6 Zellen) mit 200 µl Lactatpuffer versetzt und auf <strong>Ei</strong>s inkubiert,<br />
wobei nach jeweils 1 min die Zellen kräftig gemischt werden. Nach 3 min Inkubation werden die<br />
Proben auf 4 ml mit HBSS-Puffer aufgefüllt und die Zellen rasch abzentrifugiert (600 x g, 4 °C,<br />
5 min), um eine erneute Bindung <strong>des</strong> IgE an die Rezeptoren zu verhindern. Der Überstand wird<br />
verworfen, die Zellen in 400 µl Stimulationsmedium resuspendiert und auf zwei Eppendorf-<br />
Reaktionsgefäße aufgeteilt. Für die Resensibilisierung wird den Zellen in einem der Eppendorf-<br />
Reaktionsgefäße aufgereinigtes polyklonales IgE (10 µg/ml) zugesetzt. Die anderen Zellen werden<br />
gestrippt belassen. Als weitere Option werden 0,25 x 10 6 Basophile, die bis zu diesem Zeitpunkt auf<br />
<strong>Ei</strong>s gehalten werden, ebenfalls in 200 µl Stimulationsmedium verdünnt und von diesem Zeitpunkt an<br />
parallel behandelt. Um einen ausreichenden Gasaustausch zu gewährleisten, werden die Deckel der<br />
Eppendorf-Reaktionsgefäße durchstochen und die Proben für 60 min im Brutschrank bei 37 °C und<br />
6 % CO 2 inkubiert.<br />
Lactat-Puffer (pH 3,9)<br />
10 mM Milchsäure<br />
5 mM KCl<br />
140 mM NaCl<br />
3.9.4 <strong>IL</strong>-4-ELISA<br />
Die <strong>IL</strong>-4-Konzentration im Überstand der Basophilen wurde mit Hilfe <strong>des</strong> Sandwich-ELISAs <strong>IL</strong>-4<br />
Elipair der Firma Diaclone bestimmt. Leichte Abweichungen vom Herstellerprotokoll wurden zur<br />
optimalen Ausnutzung <strong>des</strong> Kits etabliert. Zur Beschichtung der 96-Loch Maxisorp-Platte (Firma<br />
Nunc) wird der im Kit enthaltene anti-human-<strong>IL</strong>-4-Antikörper 1:1000 in TBS verdünnt und die Platte<br />
damit über Nacht bei 4 °C inkubiert. Anschließend werden verbleibende Bindungsstellen für 2 h mit<br />
5 % (w/v) BSA blockiert und die Platte getrocknet. Die Platte wird mit den Proben aus der<br />
59
Methoden<br />
Basophilenstimulation bzw. mit dem in Medium verdünnten Standard beschickt und 90 min inkubiert.<br />
Anschließend wird die Platte nacheinander mit folgenden Reagenzien inkubiert: 60 min biotinylierter<br />
Detektionsantikörper (1:100 verdünnt), 60 min Streptavidin-HRP (Horseradish peroxidase, 1:8000<br />
verdünnt), 2 h TMB (Tetramethylbenzidin, Substrat der HRP). Alle Inkubationen werden auf einem<br />
Schüttler in einer feuchten Metallkammer durchgeführt. Nach jeder Inkubation wird die Platte sieben<br />
Mal mit TBST gewaschen. Zum Abschluss wird die Enzymreaktion mit 1 M H 2 SO 4 abgestoppt und<br />
die Absorption bei 450 nm im ELISA Reader gemessen.<br />
3.9.5 Anfertigung von Zytospinpräparaten<br />
Die Degranulation der Basophilen nach Stimulation mit IPSE oder anderen Stimulantien kann über<br />
Anfertigung von Zytospinpräparaten der Zellen mit anschließender May-Grünwald-Färbung<br />
visualisiert werden.<br />
Für die Zytospins werden 0,3 x 10 6 Basophile in 200 µl Medium mit den unterschiedlichen Stimuli<br />
versetzt und über Nacht in Eppendorf-Reationsgefäßen bei 37 °C und 6 % CO 2 -Gehalt in einem<br />
befeuchteten Brutschrank inkubiert. 100 µl der Basophilenlösung werden in einer Zytospinzentrifuge<br />
bei 500 U/min für 1 min zentrifugiert, mit May-Grünwald-Lösung 10 min gefärbt und mit 100facher<br />
Vergrößerung fotografiert.<br />
3.9.6 Durchflusszytometrie (FACS)<br />
Die fluoreszensaktivierte Zellanalyse (FACS-Analyse) ist ein Verfahren zur quantitativen<br />
Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen. Die Zellen werden mit<br />
Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Antikörpern, die gegen das zu untersuchende Oberflächenmolekül<br />
gerichtet sind, inkubiert und anschließend in einer <strong>Ei</strong>nzelzellsuspension durch hydrodynamische<br />
Fokussierung an einem gebündelten Laserstrahl geeigneter Wellenlänge vorbeigeleitet.<br />
Die FACS-Analyse wurde zum Nachweis von CD203c auf der Oberfläche der Basophilen und der<br />
Bindung von IPSE an Basophile eingesetzt. Als Positivkontrolle diente in beiden Fällen anti-IgE.<br />
3.9.6.1 Nachweis der Bindung von IPSE an Basophile<br />
Für den Nachweis der Bindung von IPSE an native und gestippte Basophile werden native und<br />
gestrippte Basophile, wie unter 3.9.1 beschrieben, präpariert. 0,1 x 10 6 dieser Basophilen werden pro<br />
Kondition eingesetzt und mit unterschiedlichen Konzentrationen an biotinyliertem HEK-IPSE bzw.<br />
biotinyliertem IgE für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Zellen werden mit 1 ml Waschpuffer<br />
gewaschen, pelletiert (800 x g, 5 min) und zur Färbung mit PE-gekoppeltem Streptavidin für 15 min<br />
bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zufügen von 300 µl Waschpuffer werden die Zellen im<br />
Durchflusszytometer (FACScalibur, Firma BD Biosciences) vermessen.<br />
60
Methoden<br />
3.9.6.2 Nachweis von CD203c auf der Oberfläche von Basophilen<br />
Für den Nachweis von CD203c werden pro Kondition 0,15 x 10 6 Basophile eingesetzt. <strong>Ei</strong>n Teil dieser<br />
Basophilen wird für 20 min bei Raumtemperatur in 1 ml Fixierungspuffer fixiert, die andere Hälfte in<br />
Waschpuffer inkubiert. Anschließend werden die Zellen pelletiert (800 x g, 5 min) und<br />
100 µl HEK-IPSE bzw. anti-IgE für 30 min bei 37 °C zugefügt. Den fixierten Zellen wird 1 ml<br />
Waschpuffer zugesetzt, den unfixierten Zellen wird 1 ml Fixierungspuffer zugesetzt, um einen<br />
<strong>Ei</strong>nfluss der Fixierung auf die Bindung <strong>des</strong> Antikörpers auszuschließen. Abschließend werden die<br />
Zellen für 20 min bei Raumtemperatur mit PE-gekoppeltem anti-CD203c-Antikörper (1:20 verdünnt)<br />
inkubiert, mit 600 µl Färbepuffer versetzt und im Durchflusszytometer (FACScalibur, Firma BD<br />
Biosciences) vermessen.<br />
Waschpuffer<br />
0,5 % (w/v) BSA<br />
Fixierungspuffer<br />
0,5 % (w/v) BSA<br />
2 % (v/v) Formaldehyd<br />
Färbepuffer<br />
1 % (w/v) BSA<br />
1 % (w/v) Natriumazid<br />
61
Ergebnisse<br />
4 Ergebnisse<br />
4.1 <strong>Expression</strong> von IPSE in E. coli<br />
Nach Isolierung und Klonierung der cDNA von IPSE in den <strong>Expression</strong>svektor pPROEX-Htb konnte<br />
das Protein bereits erfolgreich in E. coli DH5α als His-getaggtes Fusionsprotein exprimiert werden (im<br />
Folgenden E. coli-IPSE genannt). Dabei wird IPSE jedoch unlöslich in Form von inclusion bodies im<br />
Zytoplasma abgelegt. Die inclusion bodies werden unter denaturierenden Bedingungen in Lösung<br />
gebracht. Nach Aufreinigung über IMAC kann ein Teil <strong>des</strong> exprimierten Proteins durch chemische<br />
Rückfaltung in eine lösliche und aktive Form überführt werden. Das heißt, das so gewonnene<br />
rekombinante IPSE bindet an Immunglobuline und induziert die <strong>IL</strong>-4-Freisetzung aus basophilen<br />
Granulozyten wie das natürliche IPSE. Jedoch ist es sehr schlecht löslich und lässt sich nur bis zu<br />
einer Konzentration von 0,15 mg/ml konzentrieren. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit<br />
zunächst versucht, durch Modifizierung der <strong>Expression</strong>svektoren und -bedingungen IPSE in löslicher<br />
Form in E. coli-Zellen zu exprimieren, um eine Rückfaltung zu umgehen.<br />
4.1.1 Klonierung der Sequenz von IPSE in unterschiedliche <strong>Expression</strong>svektoren<br />
4.1.1.1 pET26-IPSE<br />
Bei dem Vektor pET26(+) handelt es sich um einen kommerziellen <strong>Expression</strong>svektor der Firma<br />
Novagen. Als wichtigste <strong>Ei</strong>genschaft verfügt der Vektor über eine pelB-Leadersequenz, worüber die<br />
exprimierten Proteine in den periplasmatischen Raum transportiert werden. Das dort herrschende<br />
Milieu ist nicht so reduzierend wie das Zytoplasma und begünstigt somit die Bildung von<br />
Disulfidbrücken und die Faltung von Proteinen. Wie alle Vektoren der pET-Reihe zeichnet sich dieser<br />
Vektor durch einen niedrigen basalen <strong>Expression</strong>shintergrund aus. Dies kommt dadurch zustande, dass<br />
das zu exprimierende Gen hinter einen T7-Promotor kloniert wird. Die DNA-Sequenz für die<br />
T7-RNA-Polymerase liegt in dem E. coli-Stamm BL21(DE3) genomisch vor und ist hinter einen mit<br />
IPTG induzierbaren lac-Promotor geschaltet. Das bedeutet, dass im nicht-induzierten Zustand keine<br />
RNA-Polymerase zum Ablesen <strong>des</strong> gewünschten Gens vorliegt und so das Protein auch nicht<br />
exprimiert werden kann.<br />
Der Vektor verfügt über einen C-terminalen His 6 -Tag zur Aufreinigung <strong>des</strong> rekombinanten Proteins.<br />
Die IPSE-Sequenz wurde zunächst wie auch bei allen folgenden Klonierungen in der PCR amplifiziert<br />
und in einen TA-Klonierungsvektor zwischenkloniert. Anschließend wurde das Insert aus dem<br />
Klonierungsvektor über BamHI und HindIII ausgeschnitten und in den Vektor pET26(+) ligiert. Der<br />
Erfolg der Klonierung wurde über Restriktion überprüft und ist in Abbildung 4.1 dargestellt.<br />
62
Ergebnisse<br />
A) B)<br />
Abbildung 4.1: Klonierung von pET26-IPSE. A) Vektorkarte von pET26-IPSE. KanR: Kanamycinresistenzgen, lacI:<br />
Lactoserepressorgen, MCS: Multi cloning site, pelB-SP: pelB-Signalpeptid für die Translokation in das Periplasma. B)<br />
Restriktion von pET26-IPSE mit BamHI und HindIII. Der Restriktionsansatz wurde im 1 %igen Agarosegel aufgetrennt.<br />
4.1.1.2 pBM1.1-IPSE<br />
Das Plasmid pBM1.1 leitet sich von dem kommerziellen <strong>Expression</strong>svektor pET27b der Firma<br />
Novagen ab und ist von Matthey et al. (1999) modifiziert worden. Es wurde freundlicherweise von<br />
Dr. D. Wicklein (LG Molekulare und klinische Allergologie, Forschungszentrum Borstel) zur<br />
Verfügung gestellt. Wie auch bei dem pET26(+)-Vektor handelt es sich bei dem pBM1.1-Vektor um<br />
einen periplasmatischen Vektor, bei dem die exprimierten Proteine über das pelB-Signalpeptid in den<br />
periplasmatischen Raum transloziert werden. Im Unterschied zum pET26(+)-Vektor befindet sich der<br />
His 10 -Tag bei diesem Vektor am N-Terminus.<br />
Dieses Plasmid wurde eingesetzt um rekombinantes lösliches Phl p 1, ein Allergen aus dem<br />
Lieschgras Phleum pratense, zu exprimieren. Aus diesem Grund lag der Vektor als pBM1.1-Phlp1<br />
vor. Die Sequenz <strong>des</strong> Phl p 1 wurde über die Restriktionsenzyme HindIII und EcoRI entfernt. Die<br />
IPSE-Sequenz wurde mit den gleichen Restriktionsenzymen aus dem TA-Klonierungsvektor<br />
geschnitten und mit dem gereinigten pBM1.1 ligiert. Der Erfolg der Klonierung wurde über<br />
Restriktion verifiziert und ist in Abbildung 4.2 dargestellt.<br />
63
Ergebnisse<br />
A) B)<br />
Abbildung 4.2: Klonierung von pBM1.1-IPSE. A) Vektorkarte von pBM1.1-IPSE. KanR: Kanamycinresistenzgen, lacI:<br />
Lactoserepressorgen, MCS: Multi cloning site, pelB-SP: pelB-Signalpeptid für die Translokation in das Periplasma. B)<br />
Restriktion von pBM1.1-IPSE mit HindIII und EcoRI. Der Restriktionsansatz wurde im 1 %igen Agarosegel aufgetrennt.<br />
4.1.1.3 pMalC-IPSE und pMalP-IPSE<br />
Bei den Vektoren pMalC und pMalP der Firma New England Biolabs wird die DNA-Sequenz <strong>des</strong> zu<br />
exprimierenden Proteins hinter das malE-Gen von E. coli kloniert, welches für das<br />
Maltosebindeprotein (MBP) kodiert. Bei der <strong>Expression</strong> wird das gewünschte Protein als MBP-<br />
Fusionsprotein exprimiert. Während bei der <strong>Expression</strong> <strong>des</strong> Vektors pMalP das Fusionsprotein über<br />
das malE-Signalpeptid in den periplasmatischen Raum transportiert, besitzt der Vektor pMalC in<br />
dieser Sequenz eine Mutation, so dass das Fusionsprotein im Zytoplasma verbleibt. Durch eine<br />
Faktor Xa-Schnittstelle kann nach der Reinigung bei beiden Vektoren der MBP-Anteil <strong>des</strong><br />
Fusionsproteins wieder abgespalten werden.<br />
Die IPSE-Sequenz wurde aus dem TA-Klonierungsvektor über BamHI und HindIII ausgeschnitten<br />
und sowohl in den zytoplasmatischen pMalC-Vektor als auch in den periplasmatischen pMalP-Vektor<br />
eingefügt. Der Erfolg der Ligation wurde über Restriktion überprüft und ist für den Vektor<br />
pMalP-IPSE in Abbildung 4.3 dargestellt.<br />
64
Ergebnisse<br />
A) B)<br />
Abbildung 4.3: Klonierung von pMalP-IPSE. A) Vektorkarte von pMalP-IPSE. AmpR: Ampicillinresistenzgen, lacI:<br />
Lactoserepressorgen, malE: Gen für das Maltosebindeprotein, malE-SP: Signalpeptid <strong>des</strong> Maltosebindeproteins für die<br />
Translokation ins Periplasma, MCS: Multi cloning site, B) Restriktion von pMalP-IPSE mit BamHI und HindIII. Der<br />
Restriktionsansatz wurde im 1 %igen Agarosegel aufgetrennt.<br />
4.1.2 Optimierung der <strong>Expression</strong> von IPSE in E. coli durch Variation der<br />
<strong>Expression</strong>sparameter<br />
4.1.2.1 Periplasmatische <strong>Expression</strong> von IPSE<br />
Zur Optimierung der IPSE-<strong>Expression</strong> in E. coli wurde zunächst der periplasmatische Vektor pET26-<br />
IPSE in BL21(DE3)-Zellen eingesetzt, um die Möglichkeit der Disulfidbrückenbildung zu<br />
gewährleisten. Bei der <strong>Expression</strong> ist in der Coomassie-gefärbten SDS-PAGE jedoch keine<br />
<strong>Expression</strong>sbande erkennbar, lediglich im Westernblot kann mit dem monoklonalen anti-IPSE-<br />
Antikörper eine sehr schwache <strong>Expression</strong> nachgewiesen werden (nicht dargestellt). Aufgrund der<br />
sehr geringen <strong>Expression</strong>srate wurden mit diesem Vektor keine weiteren Versuche durchgeführt.<br />
4.1.2.2 <strong>Ei</strong>nfluss der Temperatur auf die IPSE-<strong>Expression</strong><br />
Das <strong>Expression</strong>sprotokoll für E. coli-IPSE sieht eine <strong>Expression</strong>stemperatur von 37 °C vor. Durch<br />
Variation der <strong>Expression</strong>stemperatur wurde der <strong>Ei</strong>nfluss dieses Parameters auf die Faltung und damit<br />
auf die Löslichkeit <strong>des</strong> exprimierten Proteins untersucht. Für diese Untersuchung wurden zum einen<br />
DH5α-Zellen mit dem zytoplasmatischen Vektor pPROEX-Htb-IPSE (wie zur <strong>Expression</strong> von E. coli-<br />
IPSE) und zum anderen BL21(DE3)-Zellen mit einem weiteren periplasmatischen Vektor - dem<br />
pBM1.1-IPSE-Vektor - eingesetzt. Wie in Abbildung 4.4 zu sehen ist, nimmt bei der<br />
65
Ergebnisse<br />
zytoplasmatischen <strong>Expression</strong> die Menge an exprimiertem Protein mit sinkender Temperatur ab und es<br />
sind keine signifikanten Mengen an löslichem IPSE im Überstand <strong>des</strong> Zellaufschlusses nachweisbar.<br />
Im Gegensatz zum pET26-IPSE-Vektor zeigt der periplasmatische pBM1.1-IPSE-Vektor gute<br />
<strong>Expression</strong>sraten. Die <strong>Expression</strong>srate bei 20 °C liegt leicht über der bei 37 °C und es ist auch hier<br />
kein lösliches IPSE im Überstand nachweisbar.<br />
Abbildung 4.4: <strong>Ei</strong>nfluss von unterschiedlichen <strong>Expression</strong>stemperaturen auf die <strong>Expression</strong> von IPSE. 20 ml LB-<br />
Medium wurden mit DH5α/pPROEX-Htb-IPSE (zytoplasmatische <strong>Expression</strong>) bzw. BL21(DE3)/pBM1.1-IPSE<br />
(periplasmatische <strong>Expression</strong>) angeimpft und die <strong>Expression</strong> durch Zugabe von 300 µM IPTG induziert. Die <strong>Expression</strong><br />
wurde über 18 h bei unterschiedlichen <strong>Expression</strong>stemperaturen (20 °C bis 37 °C) durchgeführt. Die lösliche und unlösliche<br />
Fraktion <strong>des</strong> Zellaufschlusses wurden in der SDS-PAGE (12 % Trenngel, 10 µl Probe/cm) aufgetrennt und auf<br />
Nitrocellulosemembran geblottet. Streifen <strong>des</strong> Blots wurden über einen monoklonalen anti-IPSE-Antikörper (anti-IPSE) auf<br />
Anwesenheit von IPSE untersucht. C: Negativkontrolle für den Sekundärantikörper; P: Pellet <strong>des</strong> Zellaufschlusses; SN:<br />
Überstand <strong>des</strong> Zellaufschlusses.<br />
4.1.2.3 <strong>Ei</strong>nfluss von Salzstress auf die IPSE-<strong>Expression</strong><br />
Der periplasmatische Vektor pBM1.1 wurde erfolgreich von Barth et al. (2000) zur <strong>Expression</strong> von<br />
rekombinanten Immuntoxinen eingesetzt. Dabei wurde die <strong>Expression</strong> unter Salzstress<br />
(4 % (w/v) NaCl und 0,5 M Sorbitol) in TB-Medium mit Zusatz von kompatiblen Soluten<br />
(10 mM Glycinbetain) durchgeführt. Auch rekombinantes Phl p 1, ein Allergen <strong>des</strong> Lieschgrases<br />
Phleum pratense, konnte über diese Methode löslich exprimiert werden (Dr. D. Wicklein,<br />
LG Molekulare und klinische Allergologie, Forschungszentrum Borstel, persönliche Mitteilung).<br />
Phl p 1 besitzt genau wie IPSE ebenfalls eine ungerade Anzahl an Disulfidbrücken. Dies stellt generell<br />
ein Problem bei der <strong>Expression</strong> in E. coli dar, weil bakterielle Zellen keine Disulfidbrücken knüpfen<br />
können. Für die <strong>Expression</strong> von IPSE wurden diese Salzstress-<strong>Expression</strong>sbedingungen übernommen.<br />
Wie Abbildung 4.5 zeigt, wird IPSE auch unter Salzstressbedingungen nicht in löslicher Form<br />
exprimiert. Hinzu kommt, dass IPSE bei diesen Bedingungen als Doppelbande exprimiert wird.<br />
66
Ergebnisse<br />
Abbildung 4.5: <strong>Ei</strong>nfluss von unterschiedlichen <strong>Expression</strong>smedien auf die <strong>Expression</strong> von IPSE. 20 ml LB-Medium<br />
bzw. TB-Medium wurden mit BL21(DE3)/pBM1.1-IPSE angeimpft. Vor der <strong>Expression</strong>sinduktion mit 1,5 mM IPTG wurde<br />
dem TB-Medium erst 500 mM Sorbitol und 40 mM Glycin-Betain zugefügt und nach 30 min Inkubation 4 % (w/v) NaCl und<br />
0,5 mM ZnCl 2 zugesetzt. Die <strong>Expression</strong> wurde über 18 h bei unterschiedlichen <strong>Expression</strong>stemperaturen (20 °C und 37 °C)<br />
durchgeführt. Die lösliche und unlösliche Fraktion <strong>des</strong> Zellaufschlusses wurden in der SDS-PAGE (12 % Trenngel,<br />
10 µl Probe/cm) aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembran geblottet. Streifen <strong>des</strong> Blots wurden über einen monoklonalen<br />
anti-IPSE-Antikörper (anti-IPSE) auf Anwesenheit von IPSE untersucht. C: Negativkontrolle für den Sekundärantikörper;<br />
P: Pellet <strong>des</strong> Zellaufschlusses; SN: Überstand <strong>des</strong> Zellaufschlusses.<br />
4.1.2.4 <strong>Ei</strong>nfluss der IPTG-Konzentration auf die IPSE-<strong>Expression</strong><br />
Als weiterer Parameter wurde die IPTG-Konzentration zur Induktion der <strong>Expression</strong> variiert. Die<br />
normalerweise eingesetzte Konzentration liegt bei 300 µM IPTG. Bei der Untersuchung wurden<br />
IPTG-Konzentrationen zwischen 100 pM und 100 µM eingesetzt. Die <strong>Expression</strong> wurde mit dem<br />
pBM1.1-IPSE Vektor in BL21(DE3)-Zellen in LB-Medium bei 25 °C durchgeführt. Wie in<br />
Abbildung 4.6 zu sehen ist, kann die <strong>Expression</strong> auch durch eine IPTG-Konzentration, die um den<br />
Faktor 10 6 niedriger ist, als die ursprünglich eingesetzte, induziert werden. Die <strong>Expression</strong>srate ist<br />
jedoch geringer. Auffällig ist auch, dass bei IPTG-Konzentrationen zwischen 100 pM und 1 µM IPSE<br />
als Doppelbande exprimiert wird. Bei 100 µM IPTG sind zwar auch zwei Banden sichtbar, jedoch ist<br />
die obere wesentlich stärker ausgeprägt. In der Coomassie-gefärbten SDS-PAGE ist auch im<br />
Überstand <strong>des</strong> Zellaufschlusses eine Doppelbande im gleichen Molekulargewichtsbereich sichtbar<br />
(nicht dargestellt), die im Westernblot jedoch nicht als IPSE zu identifizieren ist.<br />
67
Ergebnisse<br />
Abbildung 4.6: <strong>Ei</strong>nfluss von unterschiedlichen IPTG-Konzentrationen auf die <strong>Expression</strong> von IPSE. 20 ml LB-<br />
Medium wurden mit BL21(DE3)/pBM1.1-IPSE angeimpft und die <strong>Expression</strong> durch Zugabe von unterschiedlichen IPTG-<br />
Konzentrationen (100 pM bis 100 µM) induziert. Die <strong>Expression</strong> wurde über 18 h bei 25 °C durchgeführt. Die lösliche und<br />
unlösliche Fraktion <strong>des</strong> Zellaufschlusses wurden in der SDS-PAGE (12 % Trenngel, 10 µl Probe/cm) aufgetrennt und auf<br />
Nitrocellulosemembran geblottet. Streifen <strong>des</strong> Blots wurden über einen monoklonalen anti-IPSE-Antikörper (anti-IPSE) auf<br />
Anwesenheit von IPSE untersucht. C: Negativkontrolle für den Sekundärantikörper; P: Pellet <strong>des</strong> Zellaufschlusses;<br />
SN: Überstand <strong>des</strong> Zellaufschlusses.<br />
4.1.3 Optimierung der <strong>Expression</strong> von IPSE in E. coli durch <strong>Expression</strong> als<br />
Fusionsprotein<br />
4.1.3.1 <strong>Expression</strong> von IPSE als MBP-Fusionsprotein<br />
Die Sequenz von IPSE wurde erfolgreich in den Vektor pMalC kloniert, so dass IPSE als MBP-<br />
Fusionsprotein exprimiert wird. MBP ist ein E. coli-eigenes Protein, welches in löslicher Form<br />
exprimiert wird. Wird ein solches Protein um einen Fremdproteinanteil, der ansonsten unlöslich ist,<br />
erweitert, so kann das resultierende Fusionsprotein als Ganzes löslich sein. MBP dient daher zum<br />
einen als Löslichkeitsvermittler, zum anderen wird der MBP-Anteil zur einfachen Aufreinigung über<br />
eine Amylose-Affinitätschromatographie genutzt. Durch eine Faktor Xa-Schnittstelle kann nach der<br />
Reinigung der MBP-Anteil <strong>des</strong> Fusionsproteins wieder abgespalten werden.<br />
Die <strong>Expression</strong> mit dem pMalC-IPSE-Vektor wurde in E. coli-Zellen <strong>des</strong> Stammes JM109 in LB-<br />
Medium (mit Zusatz von 0,2 % (w/v) Glucose) bei 20 °C durchgeführt. IPSE wird mit diesem Vektor<br />
tatsächlich in löslicher Form als MBP-Fusionsprotein (im Folgenden MBP-IPSE genannt) mit einer<br />
guten <strong>Expression</strong>srate exprimiert. Vor der Aufreinigung ist in dem Überstand <strong>des</strong> Zellaufschlusses<br />
neben vielen weiteren E. coli-Proteinen eine deutliche <strong>Expression</strong>sbande von MBP-IPSE bei 50 kD zu<br />
sehen (Abbildung 4.7). Das Molekulargewicht setzt sich zusammen aus der Größe von MBP (42,4 kD)<br />
und dem IPSE-Monomer (13,2 kD). Während MBP-IPSE an die Säule bindet, werden die E. coli-<br />
Proteine über das Effluent und die Waschfraktionen entfernt. MBP-IPSE wird durch Elution mit<br />
maltosehaltigem Laufpuffer von der Säule gelöst. In den Elutionsfraktionen ist jedoch neben MBP-<br />
IPSE ein geringer Anteil an kontaminierenden Proteinen enthalten. Die Ausbeute aus einem Liter<br />
<strong>Expression</strong>sansatz liegt bei ungefähr 20 mg MBP-IPSE.<br />
68
Ergebnisse<br />
Abbildung 4.7: Aufreinigung von MBP-IPSE über Amyloseaffinitätschromatographie. <strong>Ei</strong>n Liter LB-Medium wurde mit<br />
JM109/pMalC-IPSE angeimpft und die <strong>Expression</strong> durch Zugabe von 300 µM IPTG induziert. Die <strong>Expression</strong> wurde für 6 h<br />
bei 20 °C durchgeführt. Nach 6 Stunden wurden die Zellen über French Press aufgeschlossen. Der lösliche Überstand <strong>des</strong><br />
Zellaufschlusses wurde über IMAC aufgereinigt. Die Fraktionen der Aufreinigung wurden in der SDS-PAGE unter<br />
reduzierenden Bedingungen (12 % Trenngel, 10 µl Probe) aufgetrennt und das Gel über Coomassie gefärbt. W1-W2:<br />
Waschfraktionen à 50 ml, E1-E8: Elutionsfraktionen à 3 ml.<br />
Im Basophilenassay wurde MBP-IPSE auf <strong>IL</strong>-4-induzierende Aktivität im Vergleich zu E. coli-IPSE<br />
untersucht (Abbildung 4.8). E. coli-IPSE führt zu einer <strong>IL</strong>-4-Freisetzung aus Basophilen mit einem<br />
Maximum bei 4 ng E. coli-IPSE/ml. Die Kurve zeigt den charakteristischen glockenförmigen Verlauf,<br />
wie er für IPSE typisch ist. MBP-IPSE führt in sehr hohen Konzentrationen zu einer sehr starken <strong>IL</strong>-4-<br />
Freisetzung. Die Kurve zeigt keinen glockenförmigen Verlauf. Die <strong>IL</strong>-4-Freisetzung ist somit nicht<br />
mit der von E. coli-IPSE zu vergleichen.<br />
12 mg <strong>des</strong> auf diese Weise exprimierten IPSEs wurden über eine Gelfiltration mit einer Superdex-200-<br />
Säule weiter aufgereinigt (Abbildung 4.9). Dabei erscheint jedoch fast die gesamte Proteinmenge im<br />
Ausschlussvolumen der Säule mit einer Peakhöhe von 750 mAU. Das bedeutet, dass das MBP-IPSE in<br />
Form von hochmolekularen Aggregaten vorliegt. Diese Aggregate haben sich gebildet, obwohl zur<br />
Verminderung der Aggregatbildung dem Laufpuffer 1 mM DTT zugesetzt worden sind. Im trennbaren<br />
Bereich der Säule sind lediglich vier Peaks mit einer Höhe zwischen 20 und 40 mAU zu finden. Falls<br />
es sich bei diesen Peaks um MBP-IPSE handeln sollte, so ist die Ausbeute für weitere Arbeiten zu<br />
gering.<br />
69
Ergebnisse<br />
Abbildung 4.8: Basophilenstimulationsassay mit natürlichem MBP-IPSE und E. coli-IPSE. Gereinigte Basophile<br />
wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an MBP-IPSE und E. coli-IPSE versetzt und über Nacht inkubiert. Die <strong>IL</strong>-4-<br />
Konzentration im Überstand wurde im ELISA bestimmt. <strong>IL</strong>-3: Negativkontrolle; anti-IgE: Positivkontrolle.<br />
Abb. 4.9: Aufreinigung von MBP-IPSE über Gelfiltration. 12 mg MBP-IPSE (in 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl,<br />
1 mM DTT, pH 7,4) wurden in einer Konzentration von 12 mg/ml über eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200 16/60 prep<br />
grade, Firma Amersham biosciences) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min aufgetrennt.<br />
70
Ergebnisse<br />
Des Weiteren wurde IPSE auch in den Vektor pMalP kloniert. Dieser Vektor verfügt über das malE-<br />
Signalpeptid. Dadurch wird das MBP-Fusionsprotein in den periplasmatischen Raum transportiert. Die<br />
<strong>Expression</strong> mit diesem Vektor war sehr gering, so dass von weiteren Untersuchungen abgesehen<br />
wurde, da auch hier eine spätere Aggregatbildung nicht ausgeschlossen werden konnte.<br />
4.1.3.2 <strong>Expression</strong> von IPSE als Thioredoxin-Fusionsprotein<br />
Weiterhin wurde IPSE in den pET32-Vektor der Firma Invitrogen kloniert und anschließend als<br />
Thioredoxin-Fusionsprotein in Origami(DE3) -Zellen exprimiert (im Folgenden TRX-IPSE genannt).<br />
Die Origami(DE3) -Zellen verfügen über eine Mutation sowohl in der Thioredoxinreduktase und als<br />
auch der Glutathionreduktase. Aus diesem Grund ist es in diesen Zellen möglich, dass auch im<br />
Zytoplasma der Zellen Disulfidbrücken gebildet werden können. Über eine Enterokinase-Schnittstelle<br />
kann der TRX-Fusionsproteinanteil von dem zu exprimierenden Protein entfernt werden.<br />
Für die <strong>Expression</strong> lag der Vektor bereits mit integrierter IPSE-Sequenz in der Arbeitsgruppe vor. Die<br />
<strong>Expression</strong> wurde mit Origami(DE3) -Zellen in LB-Medium bei 30 °C durchgeführt und durch<br />
Zugabe von 5 µM IPTG induziert. Diese geringe IPTG-Konzentration zeigte in Vorarbeiten einen<br />
höheren Anteil an löslichem Protein. In Abbildung 4.10 sieht man bereits nach zwei Stunden<br />
<strong>Expression</strong> eine <strong>Expression</strong>sbande bei 32 kD. Dieses Molekulargewicht setzt sich zusammen aus dem<br />
IPSE-Anteil von 13,2 kD und dem TRX-Anteil von 12 kD. Den verbleibenden Rest von ca. 7 kD<br />
machen der His-Tag und S-Tag sowie die Enterokinase- und Thrombin-Schnittstelle aus. Der<br />
überwiegende Teil <strong>des</strong> exprimierten IPSEs ist unlöslich und ist nach dem Zellaufschluss im Pellet zu<br />
finden. Jedoch zeigt sich im löslichen Überstand <strong>des</strong> Zellaufschlusses eine Bande auf der Höhe der<br />
<strong>Expression</strong>sbande. Dieser lösliche Anteil wurde über eine IMAC aufgereinigt, da TRX-IPSE über<br />
einen C-terminalen His 6 -Tag verfügt. Tatsächlich ist der ersten Elutionsfraktion eine prominente<br />
Bande auf der Höhe <strong>des</strong> TRX-IPSE zu sehen, die nur noch mit wenigen weiteren Proteinen<br />
kontaminiert ist. Das bedeutet, dass auch bei TRX-IPSE wie bei MBP-IPSE der Fusionsproteinanteil<br />
zu einem löslichen Gesamtprotein führt.<br />
Zur Abspaltung <strong>des</strong> TRX-Anteils mit Hilfe der Enterokinase müssen für das Enzym die optimalen<br />
Reaktionsbedingungen herrschen. Die Enterokinase hat ihre höchste Aktivität bei einem pH-Wert von<br />
7,0 bis 8,0 (Fonseca und Light 1983). Die Elutionsfraktion mit TRX-IPSE wurde daher gegen<br />
50 mM Tris-Puffer (pH 7,5) dialysiert. Jedoch fällt bei der Dialyse das gesamte Protein irreversibel<br />
aus der Lösung aus. TRX-IPSE lässt sich somit löslich exprimieren, der Fusionsproteinanteil kann<br />
allerdings nicht abgespalten werden.<br />
71
Ergebnisse<br />
Abbildung 4.10: TRX-IPSE: <strong>Expression</strong>skinetik und Aufreinigung über IMAC. Zwei Liter LB-Medium wurden mit<br />
Origami(DE3)/pET32-IPSE angeimpft und die <strong>Expression</strong> durch Zugabe von 5 µM IPTG induziert. Die <strong>Expression</strong> wurde<br />
für 18 h bei 30 °C durchgeführt. Danach wurden die Zellen über French Press aufgeschlossen und der lösliche Überstand <strong>des</strong><br />
Zellaufschlusses über IMAC aufgereinigt. Die Fraktionen der <strong>Expression</strong> und der Aufreinigung wurden in der SDS-PAGE<br />
unter reduzierenden Bedingungen (12 % Trenngel, 10 µl Probe) aufgetrennt und das Gel über Coomassie gefärbt. W1-W2:<br />
Waschfraktionen der IMAC à 30 ml; E1-E3: Elutionsfraktionen der IMAC à 10 ml.<br />
72
Ergebnisse<br />
4.2 <strong>Expression</strong> von IPSE in eukaryotischen Zellen<br />
4.2.1 <strong>Expression</strong> und Reinigung von IPSE aus 293 HEK-Zellen (HEK-IPSE)<br />
4.2.1.1 IPSE wird von 293 HEK-Zellen exprimiert und ins Medium sekretiert<br />
Für die <strong>Expression</strong> von IPSE in 293 HEK-Zellen wurde zunächst der <strong>Expression</strong>svektor pMSII mit der<br />
IPSE-Sequenz kloniert. Dieser Vektor wurde von Dr. Stöcker konstruiert und leitet sich von dem<br />
kommerziellen Vektor pSecTag2 ab (Stöcker et al. 2003). Die über PCR amplifizierte IPSE-Sequenz<br />
wurde zunächst in einen TA-Klonierungsvektor zwischenkloniert und aus diesem über die<br />
Restriktionsenzyme SfiI und CelII ausgeschnitten. Der Vektor wurde ebenfalls mit den Enzymen<br />
restringiert und mit dem Insert ligiert. E. coli-Zellen wurden mit dem Ligationsansatz transformiert.<br />
Der Erfolg der Ligation und Transformation wurde über Restriktion überprüft und konnte bestätigt<br />
werden (Abbildung 4.11). Zur Selektion in E. coli verfügt der Vektor über eine Ampicillin-Resistenz.<br />
Aus den positiv transformierten Zellen wurde der Vektor aufgereinigt und für die Transfektion von<br />
293 HEK-Zellen eingesetzt. Für die <strong>Expression</strong> in diesem Zellsystem ist dem exprimierten Protein<br />
eine murine Signalsequenz für die Igκ-Kette vorgeschaltet, so dass das Protein unter Abspaltung der<br />
Signalsequenz in das umgebende Medium sekretiert werden und aus diesem über einen C-terminalen<br />
His 6 -Tag aufgereinigt werden kann. Gegenüber dem pSecTag2-Vektor enthält der pMSII-Vektor<br />
zusätzlich eine interne ribosomale <strong>Ei</strong>ntrittssequenz (IRES) in Kombination mit dem Reportergen für<br />
das verstärkt grünfluoreszierende Protein (EGFP). Über diese Fluoreszenz kann die<br />
Transfektionseffizienz beurteilt werden, allerdings war diese nach erfolgter Transfektion mit dem<br />
kationischen Lipotransfektionsreagenz Transfast nur sehr schwach ausgeprägt.<br />
A) B)<br />
Abbildung 4.11: Klonierung von pMSII-IPSE. A) Vektorkarte von pMSII-IPSE. AmpR: Ampicillinresistenzgen, EGFP:<br />
enhanced green fluorescent protein, Igκ-SP: Igκ-Signalpeptid füf die Sekretion, MCS: Multi cloning site, ZeoR:<br />
Zeocinresistenzgen. B) Restriktion von pMSII-IPSE mit SfiI und CelII. Der Restriktionsansatz wurde im 1 %igen Agarosegel<br />
aufgetrennt.<br />
73
Ergebnisse<br />
Drei Tage nach der erfolgreichen Transfektion der 293 HEK-Zellen mit dem pMSII-IPSE-Vektor<br />
wurde der Kulturüberstand über IMAC aufgereinigt und auf Anwesenheit von exprimiertem IPSE (im<br />
folgenden HEK-IPSE genannt) über einen Westernblot überprüft. Da dies bestätigt werden konnte,<br />
wurden die Zellen mit Zeocin selektioniert, um eine stabil transfizierte Zelllinie zu etablieren.<br />
4.2.1.2 Das <strong>Expression</strong>soptimum für HEK-IPSE liegt bei 10 bis 11 Tagen<br />
Über den Cytomegalovirus-Promotor (CMV) exprimieren die 293 HEK-Zellen IPSE konstitutiv. Mit<br />
Hilfe einer <strong>Expression</strong>skinetik sollte herausgefunden werden, nach wie vielen Tagen <strong>Expression</strong> nach<br />
der Teilung der Zellen die höchste IPSE-Konzentration im Medium erreicht werden kann. So wurden<br />
der Kultur im <strong>Expression</strong>szeitraum zwischen 0 und 13 Tagen in Abständen Proben entnommen.<br />
Gereinigte Basophile wurden mit diesen Proben stimuliert und die <strong>IL</strong>-4-Freisetzung als relatives Maß<br />
für die IPSE-Aktiviät untersucht. Der Basophilenassay bietet sich für diese Untersuchung an, da er so<br />
sensitiv ist, dass eine Aufreinigung der Proben umgangen werden kann.<br />
In Abbildung 4.12 ist die <strong>Expression</strong>skinetik für HEK-IPSE dargestellt, dabei ist die Menge an<br />
freigesetztem <strong>IL</strong>-4 ein Maß für den relativen HEK-IPSE-Gehalt in dem <strong>Expression</strong>smedium.<br />
Demzufolge wird in den ersten 5 Tagen nur wenig HEK-IPSE synthetisiert. Diese Phase ist vor allem<br />
durch Zellwachstum gekennzeichnet. Ab dem 5. bis 6. Tag erreichen die Zellen das Stadium der<br />
Konfluenz und der HEK-IPSE-Gehalt im Kulturüberstand steigt stark an, bis er ab dem 12. Tag auf<br />
einem Niveau stagniert. Ab diesem Zeitpunkt fangen die Zellen an zu sterben und die Produktivität<br />
nimmt folglich ab. Das bedeutet, dass nach 10 bis 11 Tagen die höchste Zellviabilität mit dem<br />
gleichzeitig höchsten HEK-IPSE-Gehalt zu erwarten ist. Aus diesem Grund wurden die Zellen für<br />
weitere <strong>Expression</strong>en alle 10 bis 11 Tage im Verhältnis 1:5 geteilt und aus dem Überstand das Protein<br />
aufgereinigt.<br />
1200<br />
<strong>IL</strong>-4 [pg / 10 6 Basophile]<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
200<br />
0<br />
0 2 4 6 8 10 12 14<br />
<strong>Expression</strong>sdauer [Tage]<br />
Abbildung 4.12: <strong>Expression</strong>skinetik der HEK-IPSE-Kultur. Von einer HEK-IPSE-Kultur wurden im Zeitraum von<br />
14 Tagen Proben abgenommen und im Basophilenassay auf den relativen IPSE-Gehalt untersucht. Die Basophilen wurden<br />
mit 0,01 µl Probe stimuliert und die <strong>IL</strong>-4-Konzentration im ELISA bestimmt.<br />
74
Ergebnisse<br />
4.2.1.3 HEK-IPSE kann über zwei Schritte aus dem <strong>Expression</strong>smedium aufgereinigt werden<br />
HEK-IPSE wird mit einem C-terminalen His 6 -Tag exprimiert. Die hohe Affinität von Histidin zu<br />
zweiwertigen Kationen wie Ni 2+ oder Zn 2+ wird in der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie<br />
(IMAC) ausgenutzt, indem nur His-getaggte Proteine an die Agarosematrix binden.<br />
Diese werden durch Kompetition mit dem Histidinanalogon Imidazol eluiert.<br />
In Abbildung 4.13 sind die Fraktionen aus einer charakteristischen IMAC mit HEK-IPSE-<br />
Kulturüberstand in der silbergefärbten SDS-PAGE und im Westernblot dargestellt. Der Westernblot,<br />
der mit einem monoklonalem anti-IPSE-Antikörper inkubiert worden ist, zeigt die Lage der HEK-<br />
IPSE-Banden in den einzelnen Fraktionen an. Demzufolge lassen sich in den Elutionsfraktionen vier<br />
Banden im Bereich von 40 bis 50 kD und drei Banden im Bereich von 20 bis 30 kD identifizieren. Der<br />
Kulturüberstand weist nur eine sehr schwache Bande auf, da das HEK-IPSE in dieser Fraktion sehr<br />
verdünnt vorliegt. Die silbergefärbte SDS-PAGE gibt Auskunft über den Kontaminationsgrad der<br />
Fraktionen. Der Kulturüberstand weist eine Hauptproteinbande bei 67 kD auf. Da im Kulturmedium<br />
10 % FBS enthalten sind, repräsentiert diese Bande das im FBS hauptsächlich enthaltene Albumin.<br />
Diese Bande ist jedoch mit annähernd gleicher Intensität auch im Effluent und in geringerem Maße in<br />
den Waschfraktionen zu finden. Das bedeutet, dass die größte Kontamination über diesen<br />
Reinigungsschritt entfernt werden konnte. Tatsächlich sind in den Elutionsfraktionen hauptsächlich<br />
die über den Westernblot identifizierten HEK-IPSE-Banden zu finden. Lediglich im höhermolekularen<br />
Bereich sind noch kontaminierende Proteine zu sehen. Aus diesem Grund ist ein weiterer<br />
Aufreinigungsschritt notwendig, um eine reine HEK-IPSE-Proteinfraktion zu erhalten. Die HEK-IPSE<br />
enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und dialysiert, um das enthaltene Imidazol zu entfernen.<br />
Anschließend wurde diese Probe affinitätschromatographisch weiter aufgereinigt. Dazu wurden<br />
monoklonale anti-IPSE-Antikörper an eine Sepharosesäule mit NHS-aktivierten Gruppen gekoppelt.<br />
Die an die Säule gekoppelten monoklonalen anti-IPSE-Antikörper binden das HEK-IPSE spezifisch<br />
aus der Proteinlösung. Gebundenes HEK-IPSE wurde über Absenkung <strong>des</strong> pH-Wertes von der Säule<br />
eluiert. In Abbildung 4.14 sind die Chromatogramme <strong>des</strong> Probenauftrags und der Elution dargestellt,<br />
sowie die silbergefärbte SDS-PAGE der einzelnen Fraktionen. Das Effluent weist eine Absorption bei<br />
280 nm von 25 mAU auf. Wie in der silbergefärbten SDS-PAGE zu sehen ist, handelt es sich bei den<br />
nicht gebundenen Proteinen allerdings nicht um HEK-IPSE, sondern nur um kontaminierende<br />
Proteine. HEK-IPSE ist ausschließlich in den Elutionsfraktionen A4-A11 zu finden mit einer<br />
maximalen Peakhöhe von 1700 mAU. Die Elutionsfraktionen wurden vereinigt, gegen PBS-Puffer<br />
dialysiert und eingeengt. Wie in Abbildung 4.14 zu sehen ist, resultiert dies in reinem HEK-IPSE.<br />
75
Ergebnisse<br />
A)<br />
B)<br />
Abbildung 4.13: Fraktionen der IMAC-Aufreinigung von HEK-IPSE in der silbergefärbten SDS-PAGE (A) und im<br />
Westernblot (B). Zwei Liter HEK-IPSE-Kulturüberstand nach 10 Tagen <strong>Expression</strong> wurden über IMAC aufgereinigt und<br />
die einzelnen Fraktionen in der SDS-PAGE untersucht (15 % Trenngel, nicht-reduzierende Bedingungen, 2,5 µl Probe).<br />
SN: Kulturüberstand; W1-W3: Waschfraktionen à 15 ml; E1-E10: Elutionsfraktionen à 1,5 ml.<br />
76
Ergebnisse<br />
A) B)<br />
C)<br />
Abbildung 4.14: Reinigung von HEK-IPSE mittels Affinitätschromatographie über eine anti-IPSE-Säule.<br />
A) Chromatogramm <strong>des</strong> Probenauftrags auf eine anti-IPSE-Säule bei 280 nm. B) Chromatogramm der Elution von HEK-<br />
IPSE von der anti-IPSE-Säule durch Absenkung <strong>des</strong> pH-Wertes. Absorption bei 280 nm in mAU, Leitfähigkeit<br />
in mS/cm. C) Silbergefärbte SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen (15 % Trenngel, 10 µl Probe, von Fraktion<br />
A6 und A7 nur 2,5 µl Probe) mit Fraktionen der Aufreinigung von HEK-IPSE über eine anti-IPSE-Säule.<br />
77
Ergebnisse<br />
4.2.1.4 Bilanzierung der Aufreinigung von HEK-IPSE<br />
Das Kulturmedium, in dem HEK-IPSE exprimiert wird, enthält FBS. Aus diesem Grund nimmt HEK-<br />
IPSE nur einen sehr geringen Proteinanteil in dem Kulturüberstand ein und muss von den übrigen<br />
Proteinen getrennt werden. In Tabelle 4.1 ist eine exemplarische Bilanzierung der<br />
Proteinkonzentration von einer HEK-IPSE-Aufreinigung aus 6,8 Litern Kulturüberstand angegeben.<br />
<strong>Ei</strong>ne Berechnung <strong>des</strong> spezifischen IPSE-Anteils in den jeweiligen Reinigungsschritten ist nicht<br />
möglich, da ein Nachweissystem für diese Berechnung fehlt.<br />
Der Kulturüberstand hat eine Proteinkonzentration von 2,4 mg/ml. Bei einem Gesamtvolumen von<br />
6,8 Litern entspricht dies 16,3 g. Die Konzentration von HEK-IPSE ist dabei so gering, dass HEK-<br />
IPSE selbst im Westernblot nicht nachweisbar ist. Im Durchfluss und in den Waschfraktionen der<br />
IMAC sind 16,2 g Gesamtprotein enthalten. Das bedeutet, dass bei diesem Schritt über 99 % der<br />
kontaminierenden Proteine entfernt werden, während HEK-IPSE an die Säulenmatrix bindet. In dem<br />
Eluat der IMAC sind 1,9 mg. Diese 1,9 mg bestehen hauptsächlich aus HEK-IPSE, jedoch ist noch ein<br />
geringer Anteil an kontaminierenden Proteinen vorhanden (siehe Abbildung 4.13 A), die in der<br />
Affinitätschromatographie entfernt werden. Nach dem finalen Reinigungsschritt enthält das Eluat<br />
1,65 mg HEK-IPSE und 0,25 mg an kontaminierenden Proteinen werden von der HEK-IPSE-Lösung<br />
entfernt, indem sie nicht an die Säule binden. Demzufolge werden in einem Liter Kulturüberstand<br />
0,24 mg HEK-IPSE exprimiert. In verschiedenen Aufreinigungschargen wurden Ausbeuten zwischen<br />
0,2 und 0,5 mg/l Kulturüberstand gewonnen je nach Alter der Kultur.<br />
Tabelle 4.1: Bilanzierung der HEK-IPSE-Aufreinigung. n.n. = nicht nachweisbar<br />
Reinigungsschritt<br />
Fraktion Volumen<br />
[ml]<br />
Proteinkonz.<br />
[µg/ml]<br />
Gesamtproteingehalt<br />
[mg]<br />
HEK-IPSE-<br />
Anteil<br />
Kulturüberstand 6800 2400 16300 n.n.<br />
IMAC Effluent 8100 2000 16200 n.n.<br />
Waschfraktion 90 160 14,4 n.n.<br />
Eluat 43 44 1,9 ~ 70-80 %<br />
Affinitätschromtographie<br />
Effluent 42 6 0,25 n.n.<br />
Eluat 7 235 1,65 ~ 100<br />
%<br />
78
Ergebnisse<br />
4.2.2 Strukturelle Untersuchungen von HEK-IPSE<br />
4.2.2.1 HEK-IPSE ist ein Dimer<br />
Natürliches IPSE aus Schistosoma mansoni wird als Homodimer von den <strong>Ei</strong>ern <strong>des</strong> Wurmes sekretiert<br />
und auch rekombinantes E. coli-IPSE, das aus inclusion bodies gereinigt und chemisch zurückgefaltet<br />
wurde, bildet bei pH 8,5 größtenteils Dimere. Zur Untersuchung, ob HEK-IPSE ebenfalls dimerisiert<br />
vorliegt, wurde gereinigtes HEK-IPSE in der SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden<br />
Bedingungen aufgetrennt (Abbildung 4.15). Unter nicht-reduzierenden Bedingungen<br />
werden vier Banden im Bereich von 40 bis 50 kD angefärbt, die auch schon bei der Aufreinigung im<br />
Westernblot als HEK-IPSE-Banden identifiziert wurden. Durch Reduktion werden aus den vier<br />
Banden drei Banden im Bereich von 20 bis 30 kD, die auch im nicht-reduzierenden Gel schwach zu<br />
sehen sind. Das bedeutet, dass HEK-IPSE vorwiegend als Dimer synthetisiert wird und nur ein sehr<br />
geringer Teil als Monomer vorliegt.<br />
Abbildung 4.15: Silbergefärbte SDS-PAGE zur Untersuchung der Dimerbildung von HEK-IPSE. Gereinigtes HEK-<br />
IPSE wurde in der SDS-PAGE (15 % Trenngel, 2 µg HEK-IPSE) unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen<br />
aufgetrennt.<br />
4.2.2.2 Auftrennung von gereinigtem HEK-IPSE in der Gelfiltration<br />
Um die vier Dimerbanden von den drei Monomerbanden weiter voneinander abzutrennen, wurde eine<br />
Gelfiltration durchgeführt. Über eine Kalibrierung der Säule kann die Gelfiltration zusätzlich zur<br />
Molekulargewichtsbestimmung dienen. Für die Kalibrierung der Säule wurde eine Mischung aus<br />
Kalibrierungsproteinen (Albumin 67 kD, Ovalbumin 43 kD, Chymotrypsinogen 25 kD und<br />
79
Ergebnisse<br />
A)<br />
Kav<br />
B)<br />
1.8<br />
1.7<br />
1.6<br />
1.5<br />
1.4<br />
1.3<br />
1.2<br />
1.1<br />
1<br />
Ribonuklease<br />
y = -0.3117Ln(x) + 4.7104<br />
R 2 = 0.9953<br />
Chymotrypsinogen<br />
Ovalbumin<br />
Albumin<br />
10000 100000<br />
log Molekulargewicht<br />
C)<br />
D)<br />
Abbildung 4.16: Auftrennung und Molekulargewichtsbestimmung von HEK-IPSE über Gelfiltration. A) Elutionsprofil<br />
der Kalibrierungsproteine nach Auftrennung über eine Superdex-75-Säule. B) logarithmische Darstellung <strong>des</strong><br />
Verteilungsquotientens K av der jeweiligen Kalibrierungsproteine in Abhängigkeit vom Molekulargewicht zur Ermittlung der<br />
Kalibrierungsgeraden. C) Elutionsprofil von 90 µg HEK-IPSE nach Auftrennung über eine Superdex-75-Säule. Das<br />
Elutionspeakmaximum liegt bei 10,303 ml. Die Pfeile zeigen die Fraktionen an, die in der SDS-PAGE (D) eingesetzt worden<br />
sind. D) Silbergefärbte SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen (15 % Trenngel, 10 µl Probe) der Fraktionen aus<br />
der Auftrennung von HEK-IPSE über Gelfiltration.<br />
Ribonuklease 13,7 kD) aufgetragen und bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,02 ml/min auf die Säule<br />
aufgetragen (Abbildung 4.16 A). Aus dem so genannten Verteilungsquotienten K av von<br />
Elutionsvolumen <strong>des</strong> jeweiligen Proteins (V e ) und dem Ausschlussvolumen der Säule (V 0 = 7,7 ml),<br />
lässt sich in Abhängigkeit <strong>des</strong> Molekulargewichtes eine Kalibriergerade mit entsprechender<br />
Geradengleichung ermitteln (Abbildung 4.16 B). Für jeden weiteren Lauf, der unter denselben<br />
80
Ergebnisse<br />
Bedingungen durchgeführt worden ist, lässt sich so für jeden Peak das dazugehörige<br />
Molekulargewicht ermitteln.<br />
HEK-IPSE zeigt nach der Gelfiltration einen Peak von 50 mAU bei einem Elutionsvolumen von<br />
10,303 ml (Abbildung 4.16 C). Dies entspricht nach der Geradengleichung einem Molekulargewicht<br />
von 48,5 kD. Dies passt zu dem über die SDS-PAGE bestimmten Molekulargewicht von 40 bis 50 kD.<br />
Des Weiteren weist der Peak drei Schultern auf. In der silbergefärbten SDS-PAGE konnte gezeigt<br />
werden, dass es sich bei diesen Schultern um eine partielle Auftrennung der einzelnen vier Banden<br />
handelt (Abbildung 4.16 D). In Fraktion B3 und B5 sind nur die oberen beiden Banden zu sehen,<br />
wohingegen Fraktion B7 im Wesentlichen nur die unteren beiden Banden aufweist. Die einzelnen<br />
Banden können somit über eine Superdex-75-Säule nicht zufrieden stellend aufgetrennt werden. <strong>Ei</strong>ne<br />
Auftrennung in einem so engen Molekulargewichtsbereich ist bei dieser Säule allerdings auch nicht zu<br />
erwarten, möglicherweise könnte über eine Reversed Phase-Chromatographie eine bessere<br />
Auftrennung erzielt werden.<br />
4.2.2.3 Molekulargewichtsbestimmung von HEK-IPSE über MALDI-TOF-MS<br />
Für die Molekulargewichtsbestimmung liefert die SDS-PAGE ein nur scheinbares Molekulargewicht.<br />
Gerade Glycoproteine zeigen in der SDS-PAGE häufig ein verändertes Laufverhalten, so dass ihre<br />
genaue Masse nur schwer zu bestimmen ist. Aus diesem Grund wurde HEK-IPSE<br />
massenspektroskopisch im MALDI-TOF-MS untersucht (Arbeiten sind von PD Dr. B. Lindner,<br />
LG Biophysik, Forschungszentrum Borstel, durchgeführt worden). Die Probe wird dabei in eine leicht<br />
zu kristallisierende Matrix eingebracht und die daraus resultierenden Kristalle werden anschließend<br />
mit einem Laser beschossen. Über dieses Verfahren können Proteine in die Gasphase überführt<br />
werden und in einem elektrischen Feld beschleunigt werden. <strong>Ei</strong>n Detektor misst die Flugzeit <strong>des</strong><br />
Proteins und kann darüber das Masse-Ladungsverhältnis bestimmen.<br />
Das MALDI-TOF-Massenspektrum von HEK-IPSE ist in Abbildung 4.17 dargestellt. Es zeigt zwei<br />
Dreifach-Peaks im Bereich von 17300 und 19400 D bzw. von 34400 bis 38400 D. Da somit der<br />
größere Dreifachpeak in etwa die doppelte Masse <strong>des</strong> kleineren besitzt, handelt es sich bei dem<br />
kleineren wahrscheinlich um die doppeltprotonierte Form <strong>des</strong> HEK-IPSE-Dimers. Festzustellen ist,<br />
dass das Molekulargewicht für das Dimer mit 34 bis 39 kD stark von dem apparenten<br />
Molekulargewichten aus der SDS-PAGE abweicht. Da es sich bei der Massenspektroskopie aber um<br />
eine wesentlich genauere Methode zur Ermittlung <strong>des</strong> Molekulargewichtes handelt, werden im<br />
Weiteren diese Resultate verwendet.<br />
81
Ergebnisse<br />
Abbildung 4.17: MALDI-TOF Massenspektrum von HEK-IPSE. Gereinigtes HEK-IPSE (10 µmol) wurde im<br />
MALDI-TOF massenspektroskopisch untersucht.<br />
4.2.2.4 HEK-IPSE ist glycosyliert<br />
IPSE besitzt zwei potentielle N-Glycosylierungsstellen. Daher lag die Vermutung nahe, dass die vier<br />
verschiedenen HEK-IPSE-Banden in der SDS-PAGE auf unterschiedliche Glycoformen<br />
zurückzuführen sind. Um diese Vermutung zu bestätigen, wurde HEK-IPSE mit PNGase F und<br />
Endo H deglycosyliert.<br />
Wie in Abbildung 4.18 (A) zu sehen ist, können die vier HEK-IPSE-Banden durch PNGase F-<br />
Behandlung auf zwei Banden reduziert werden. Das bedeutet, dass die vier Banden tatsächlich<br />
unterschiedliche Glycoformen repräsentieren. Da aber noch zwei Banden und nicht nur eine<br />
homogene Bande vorhanden sind, ist das Protein nicht vollständig deglycosyliert. PNGase F spaltet<br />
spezifisch N-glycosidisch gebundene Zucker direkt am Asparagin <strong>des</strong> Proteinrückgrats. Unter<br />
Umständen ist min<strong>des</strong>tens die obere der beiden Banden noch O-glycosyliert und konnte durch diese<br />
Behandlung nicht deglycosyliert werden. Die Endo H-Behandlung hatte keinen <strong>Ei</strong>nfluss auf die<br />
Bandenstruktur.<br />
82
Ergebnisse<br />
A) B)<br />
Abbildung 4.18: Deglycosylierung von HEK-IPSE mit PNGase F bzw. Endo H. A) HEK-IPSE wurde mit 5 U PNGase F<br />
bzw. Endo H deglycosyliert 24 h bei 37 °C deglycosyliert. Als Negativkontrolle dient eine Inkubation mit aqua <strong>des</strong>t. statt<br />
Enzym. Die Proben wurden anschließend in der SDS-PAGE (15 % Trenngel, 2,5 µg HEK-IPSE) aufgetrennt. Der Pfeil<br />
deutet die Position der PNGase F an. B) Die Proben aus der Deglycosylierung mit PNGase F wurden unter<br />
nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen in der SDS-PAGE aufgetrennt (15 % Trenngel) und auf<br />
Nitrocellulosemembran geblottet. Die Streifen wurden entweder mit dem Lektin PSA oder dem monoklonalen anti-IPSE-<br />
Antikörper (anti-IPSE) inkubiert. C = Negativkontrolle für den Sekundärantikörper.<br />
Zur genaueren Untersuchung der Glycosylierung von HEK-IPSE wurden die Proben nach<br />
Deglycosylierung mit PNGase F in der SDS-PAGE sowohl unter reduzierenden wie auch nichtreduzierenden<br />
Bedingungen aufgetragen und anschließend auf Nitrocellulosemembran geblottet.<br />
<strong>Ei</strong>nzelne Streifen dieses Blots wurden mit biotinyliertem Lektin PSA (Pisum sativum Agglutinin) bzw.<br />
mit monoklonalem anti-IPSE-Antikörper inkubiert (Abbildung 4.18 B). Das Lektin PSA bindet<br />
spezifisch an terminale α-D-Mannose-Reste und in geringerem Maße an α-D-Glucose-Reste und an<br />
die fucosylierte Kernregion von bi- und triantennären N-Glycanen.<br />
Unter nicht-reduzierenden Bedingungen sieht man bei dem glycosylierten Dimer, dass die untere der<br />
vier mit dem anti-IPSE-Antikörper gefärbten Banden bei dem mit PSA inkubiertem Streifen nur sehr<br />
schwach ist. Diese Glycoform wird vom Lektin nur sehr schwach gebunden. Nach der<br />
Deglycosylierung ist diese Bande in beiden Fällen stärker ausgeprägt. Die beiden oberen Banden, die<br />
hier fehlen, scheinen in diese Glycoform umgewandelt zu werden.<br />
83
Ergebnisse<br />
Unter reduzierenden Bedingungen bindet das Lektin an alle drei Banden <strong>des</strong> glycosylierten Proteins,<br />
die auch in der SDS-PAGE zu sehen sind (vgl. Abbildung 4.15), wohingegen der spezifische<br />
Antikörper nur die beiden unteren Banden erkennt. Beim deglycosyliertem HEK-IPSE erkennt das<br />
Lektin nur noch zwei Banden der ursprünglich drei Banden. Die oberste Glycoform ist folglich<br />
vollständig deglycosyliert worden. Der spezifische Antikörper gegen IPSE erkennt nur noch eine<br />
Bande. Da dieser Antikörper gegen E. coli-IPSE gerichtet ist, welches nicht glycosyliert ist, ist es<br />
möglich, dass die Bindung <strong>des</strong> Antikörpers durch die Glycosylierung sterisch behindert ist.<br />
4.2.2.5 Kristallisation von HEK-IPSE<br />
Aufgrund der guten Löslichkeit von HEK-IPSE war es mit diesem rekombinanten Material möglich,<br />
zwei Kristallisations-Screening-Experimente durchzuführen. In einem ersten Kristallisationsexperimient<br />
wurde HEK-IPSE in einer Konzentration von 13 mg/ml und einem Volumen von 2 µl<br />
eingesetzt. Über ein Screening-Kit (JBScreen, Firma Jena Biosciences) wurden 240 verschiedenen<br />
Konditionen im „sitzenden-Tropfen-Verfahren“ über Dampfdiffusion ausgetestet. Die einzelnen<br />
Konditionen wurden im Mikroskop in Abständen auf Kristallisationsbildung hin untersucht. Jedoch<br />
hat keine der Konditionen innerhalb von 5 Monaten zu einem Kristall geführt. In 74 Fällen konnte<br />
eine Phasentrennung beobachtet werden. Phasentrennungen sind in der Kristallisation häufig<br />
Vorstufen von Kristallen. Sie stellen Proteintropfen mit einer sehr hohen Proteinkonzentration dar, aus<br />
denen sich potenziell Kristalle bilden können. In 119 Konditionen konnten lediglich Präzipitate von<br />
ausgefallenem Protein beobachtet werden und in 36 Konditionen ist die Lösung klar geblieben. Bei<br />
11 Konditionen konnte keine Beurteilung durchgeführt werden, da sich ein Niederschlag auf der<br />
Abdeckung gebildet hatte, so dass die Sicht durch das Mikroskop getrübt war.<br />
<strong>Ei</strong>n zweites Kristallisationsexperiment wurde mit HEK-IPSE in der Hochdurchsatz-Kristallisationsanlage<br />
<strong>des</strong> Europäischen Laboratoriums für Molekularbiologie (EMBL) in Hamburg von<br />
Dr. J. Müller-Dieckmann durchgeführt. In der Hochdurchsatzanlage wird über einen Roboter das<br />
Protein mit den jeweiligen Kristallisationskonditionen vermischt. Durch den Roboter ist es möglich<br />
mit sehr kleinen Volumina zu arbeiten. So wurden für jeden Ansatz 200 nl HEK-IPSE mit einer<br />
Konzentration von 22 mg/ml eingesetzt. Es wurden 816 verschiedene Konditionen ausgetestet. Die<br />
Ansätze werden automatisch in regelmäßigen Abständen fotografiert. In Abbildung 4.19 sind<br />
exemplarisch sechs Fotos aus diesem Ansatz gezeigt.<br />
84
Ergebnisse<br />
Abbildung 4.19: Kristallisation von HEK-IPSE. 200 nl HEK-IPSE (22 mg/ml in 50 mM MES-Puffer, pH 6,5) wurden in<br />
der Hochdurchsatz-Kristallisationsanlage mit 200 nl Präzipitans versetzt. Dargestellt sind sechs charakteristische Tropfen<br />
nach drei Wochen Inkubation. 1) klarer Tropfen, 2) Proteinpräzipitat, 3) tropfenartige Phasentrennung, 4) Phasentrennung,<br />
5) mikrokristalliner Niederschlag, 6) mikrokristalliner Niederschlag.<br />
85
Ergebnisse<br />
4.2.3 <strong>Expression</strong> und Reinigung von IPSE aus High Five-Zellen (High Five-IPSE)<br />
4.2.3.1 IPSE wird von High Five-Zellen exprimiert und ins Medium sekretiert<br />
Für die <strong>Expression</strong> von IPSE in Insektenzellen wurde die IPSE-Sequenz über PCR amplifiziert und<br />
mit HindIII und XhoI in den Insektenzellexpressionsvektor pIB/V5-His der Firma Invitrogen kloniert.<br />
Da dieser Vektor nicht über eine eigene Signalsequenz verfügt, wurde die IPSE-Sequenz mit dem<br />
Schistosoma mansoni-spezifischen Signalpeptid in den Vektor kloniert, so dass das Protein zur<br />
leichteren Aufreinigung in den Kulturüberstand sekretiert wird. Über die IPSE-spezifischen Primer<br />
wurden zwei unterschiedliche Konstrukte hergestellt: <strong>Ei</strong>n Vektor verfügte über den C-terminalen<br />
V5-His 6 -Tag (pIB/V5-His-IPSE), bei dem anderen Vektor wurde IPSE durch <strong>Ei</strong>nfügen von<br />
Stopp-Codons ohne weiteres Tag exprimiert (pIB-IPSE). Der Erfolg der Klonierung wurde über<br />
Restriktion überprüft (Abbildung 4.20). Anschließend wurden High Five -Insektenzellen über das<br />
Transfektionsreagenz Cellfectin mit den Vektoren transfiziert. Zusätzlich wurden die Insektenzellen<br />
mit dem Vektor pIZT/V5-His transfiziert. Dieser Vektor dient als Transfektionskontrolle, da das<br />
Zeocinresistenz-Protein als Fusionsprotein mit GFP exprimiert wird und transfizierte Zellen so grün<br />
leuchten. Nach zwei Tagen konnte über einen Basophilenassay sekretiertes IPSE im Überstand<br />
nachgewiesen werden. Die erfolgreich transfizierten Zellen wurden durch Zugabe von Blasticidin<br />
selektioniert und eine stabile Zelllinie etabliert.<br />
A) B)<br />
Abbildung 4.20: Klonierung von pIB/V5-His-IPSE. A) Vektorkarte von pIB/V5-His-IPSE. AmpR:<br />
Ampicillinresistenzgen, BlaR: Blasticidinresistenzgen, IPSE-SP: IPSE-spezifisches Signalpeptid, MCS: Multi cloning site.<br />
B) Restriktion von pIB/V5-His-IPSE mit HindIII und XhoI. Der Restriktionsansatz wurde im 1 %igen Agarosegel<br />
aufgetrennt.<br />
86
Ergebnisse<br />
4.2.3.2 Das <strong>Expression</strong>soptimum für High Five-IPSE liegt bei 8 Tagen<br />
Nach Etablierung von stabilen Zelllinien wurde für beide Konstrukte eine <strong>Expression</strong>skinetik<br />
durchgeführt, um den optimalen Zeitpunkt für die Abnahme <strong>des</strong> Kulturüberstan<strong>des</strong> zu ermitteln. Dafür<br />
wurden wie auch bei HEK-IPSE im Zeitraum von 0 bis 13 Tagen beiden Kulturen Proben entnommen<br />
und diese im Basophilenassay eingesetzt. Die Menge an freigesetztem <strong>IL</strong>-4 ist dabei ein Maß für den<br />
IPSE-Gehalt im Kulturüberstand.<br />
Wie in Abbildung 4.21 zu sehen ist, wird das Konstrukt High Five-IPSE ohne V5-His-Tag besser<br />
exprimiert als High Five-IPSE mit V5-His-Tag. Die <strong>Expression</strong> steigt nach bereits 3 Tagen stark an<br />
und fängt nach 6 Tagen an ein Plateau zu erreichen. Das Konstrukt mit V5-His-Tag exprimiert IPSE<br />
zwar langsamer, erreicht aber in etwa dieselbe IPSE-Konzentration im Überstand dies jedoch erst nach<br />
8 Tagen. Der Übergang in die Plateauphase ist auch bei High Five-IPSE mit dem Absterben der Zellen<br />
korreliert. Ab dem 9. Tag sind in der Kultur vermehrt tote Zellen zu beobachten. Aus diesem Grund<br />
wurden der Überstand von beiden Kulturen nach 7 bis 8 Tagen abgenommen und weiter aufgereinigt.<br />
1400<br />
1200<br />
<strong>IL</strong>-4 [pg / 10 6 Basophile]<br />
1000<br />
800<br />
600<br />
400<br />
High Five-IPSE ohne V5-His-Tag<br />
200<br />
High Five-IPSE mit V5-His-Tag<br />
0<br />
0 2 4 6 8 10 12 14<br />
<strong>Expression</strong>sdauer [Tage]<br />
Abbildung 4.21: <strong>Expression</strong>skinetik der High Five-IPSE-Kultur. Von den beiden unterschiedlichen High Five-IPSE-<br />
Kulturen (High Five-IPSE mit und ohne V5-His-Tag) wurden im Zeitraum von 13 Tagen Proben abgenommen und im<br />
Basophilenassay auf den relativen IPSE-Gehalt untersucht. Die Basophilen wurden mit 1 µl Probe stimuliert und die<br />
<strong>IL</strong>-4-Konzentration im ELISA bestimmt.<br />
87
Ergebnisse<br />
4.2.3.3 High Five-IPSE kann über zwei Schritte aufgereinigt werden<br />
High Five-IPSE wurde nach derselben Reinigungsstrategie aufgereinigt wie HEK-IPSE. Als erster<br />
Reinigungsschritt wurde der Überstand über eine IMAC aufgereinigt. Hierfür konnte nur der<br />
Überstand aus der <strong>Expression</strong> von High Five-IPSE mit V5-His-Tag eingesetzt werden, da High Five-<br />
IPSE ohne den Histidin-Tag nicht an die Ni 2+ -Ionen binden kann. Für die IMAC wurde der<br />
Kulturüberstand gegen PBS dialysiert, da nach Herstellerangaben in dem serumfreien Insektenzell-<br />
Medium nicht näher bestimmte Komponenten enthalten sind, die ein Auswaschen der Ni 2+ -Ionen von<br />
der Säulenmatrix bewirken würden.<br />
In Abbildung 4.22 sind die Fraktionen der Aufreinigung in der silbergefärbten SDS-PAGE und im<br />
Westernblot zu sehen. Der Westernblot, der mit dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper inkubiert<br />
worden ist, zeigt die Lage der High Five-IPSE-Banden an. In den ersten beiden Elutionsfraktionen<br />
sind drei eng beieinander liegende Banden bei ca. 40 kD zu sehen sowie auch zwischen 18 und 23 kD.<br />
Diese Banden sind auch im silbergefärbten Gel zu sehen, jedoch sind zusätzlich noch<br />
Kontaminationen ersichtlich. Das bedeutet, dass das Material weiter aufgereinigt werden muss.<br />
Zur weiteren Aufreinigung wurden die High Five-IPSE enthaltenden Fraktionen vereinigt und über<br />
eine anti-IPSE-Säule affinitätschromatographisch aufgetrennt. Die Chromatogramme der<br />
Aufreinigung sowie die Fraktionen in der silbergefärbten SDS-PAGE sind in Abbildung 4.23<br />
dargestellt. Die beiden Hauptkontaminationsbanden aus der IMAC binden nicht an die Säulenmatrix<br />
und verbleiben im Effluent. In den Elutionsfraktionen sind nur die High Five-IPSE-Banden zu<br />
erkennen. Lediglich eine sehr schwache Bande bei ca. 50 kD verunreinigt noch die High Five-IPSE-<br />
Lösung. Wie auch bei HEK-IPSE reichen diese zwei Reinigungsstufen aus, um reines IPSE-Material<br />
zu erhalten.<br />
Auch der Überstand aus der High Five-IPSE-<strong>Expression</strong> ohne V5-His-Tag wurde über die<br />
Affinitätschromatographie aufgereinigt. Da hier jedoch durch den fehlenden His-Tag keine<br />
Vorreinigung durchgeführt werden konnte, waren die Elutionsfraktionen nach diesem<br />
Reinigungsschritt noch deutlich verunreinigt. Aus diesem Grund wurde für weitere <strong>Expression</strong>en<br />
lediglich High Five-IPSE mit V5-His-Tag verwendet.<br />
Die <strong>Expression</strong>srate der Insektenzellen ist jedoch deutlich geringer als die der HEK-Zellen. Nach<br />
Aufreinigung von zwei Litern Kulturüberstand nach der optimalen <strong>Expression</strong>szeit konnten 100 µg<br />
High Five-IPSE gewonnen werden.<br />
88
Ergebnisse<br />
A)<br />
B)<br />
Abbildung 4.22: Fraktionen der IMAC-Aufreinigung von High Five-IPSE in der silbergefärbten SDS-PAGE (A) und<br />
im Westernblot (B). 500 ml High Five-IPSE-Kulturüberstand nach 7 Tagen <strong>Expression</strong> wurden dialysiert und über IMAC<br />
aufgereinigt. Die einzelnen Fraktionen wurden in der SDS-PAGE untersucht (15 % Trenngel, nicht-reduzierende<br />
Bedingungen, 10 µl Probe). SN: Kulturüberstand; W1-W2: Waschfraktionen à 15 ml; E1-E5: Elutionsfraktionen à 1,5 ml<br />
89
Ergebnisse<br />
A)<br />
B)<br />
C)<br />
Abbildung 4.23: Reinigung von High Five-IPSE mittels Affinitätschromatographie über eine anti-IPSE-Säule.<br />
A) Chromatogramm <strong>des</strong> Probenauftrags auf eine anti-IPSE-Säule bei 280 nm. B) Chromatogramm der Elution von High<br />
Five-IPSE von der anti-IPSE-Säule durch Absenkung <strong>des</strong> pH-Wertes. Absorption bei 280 nm in mAU, Leitfähigkeit<br />
in mS/cm. C) Silbergefärbte SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen (15 % Trenngel, 10 µl Probe) mit<br />
Fraktionen der Aufreinigung von High Five-IPSE über eine anti-IPSE-Säule.<br />
90
Ergebnisse<br />
4.2.3.4 High Five-IPSE ist ein Dimer<br />
Ähnlich wie bei HEK-IPSE weist auch das High Five-IPSE drei Banden im höhermolekularen Bereich<br />
und drei in einem niedermolekularen Bereich auf. In der SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden<br />
Bedingungen konnte gezeigt werden, dass es sich bei diesen Banden um dimerisiertes<br />
High Five-IPSE und um monomeres High Five-IPSE handelt (Abbildung 4.24). Unter reduzierenden<br />
Bedingungen werden aus den Dimeren ebenfalls Monomere. In den High Five-Zellen wird IPSE zwar<br />
größtenteils als Dimer exprimiert, der Anteil von monomerem IPSE ist jedoch höher als in den HEK-<br />
Zellen.<br />
Abbildung 4.24: Silbergefärbte SDS-PAGE zur Untersuchung der Dimerbildung von High Five-IPSE. Gereinigtes<br />
High Five-IPSE wurde in der SDS-PAGE (15 % Trenngel, 2 µg High Five-IPSE) unter nicht-reduzierenden und<br />
reduzierenden Bedingungen aufgetrennt.<br />
91
Ergebnisse<br />
4.3 Funktionelle Untersuchungen von rekombinantem IPSE<br />
Im Folgendem werden die Ergebnisse zu den funktionellen Untersuchungen von HEK-IPSE und High<br />
Five-IPSE dargestellt. Da High Five-IPSE nur in sehr geringer Menge vorlag, konnten nicht alle<br />
Experimente mit diesem Material durchgeführt werden.<br />
4.3.1 HEK-IPSE und High Five-IPSE führen zur <strong>IL</strong>-4-Freisetzung aus Basophilen<br />
Die vorausgehenden Versuche zeigen, dass HEK-IPSE und High Five-IPSE von dem monoklonalen<br />
anti-IPSE-Antikörper erkannt werden und somit wahrscheinlich in korrekter Faltung vorliegen. Zur<br />
Untersuchung ob dieses Material auch tatsächlich funktionell aktiv ist und somit zu einer <strong>IL</strong>-4-<br />
Freisetzung aus humanen Basophilen führt, wurden alle IPSE-Präparationen im Basophilenstimulationsassay<br />
eingesetzt. Gereinigte Basophile wurden dafür über Nacht mit verschiedenen<br />
Konzentrationen an IPSE (natürliches IPSE (nIPSE), HEK-IPSE, E. coli-IPSE und High Five-IPSE)<br />
inkubiert und die <strong>IL</strong>-4-Konzentration im ELISA bestimmt. Abbildung 4.25 zeigt für alle IPSE-Arten<br />
den charakteristischen glockenförmigen Verlauf. Die Kurven von nIPSE, HEK-IPSE und E. coli-IPSE<br />
verlaufen parallel und weisen ein Maximum von 20 ng IPSE/ml auf. High Five-IPSE zeigt maximale<br />
Aktivität bei 100 ng IPSE/ml und weist somit eine geringere Aktivität auf. Jedoch führen alle IPSE-<br />
Präparationen zu einer <strong>IL</strong>-4-Freisetzung und sind daher funktionell aktiv.<br />
+ <strong>IL</strong>-3<br />
Abbildung 4.25: Basophilenstimulationsassay mit nIPSE, HEK-IPSE, E. coli-IPSE und High Five-IPSE. Gereinigte<br />
Basophile wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen an nIPSE, HEK-IPSE, E. coli-IPSE und High Five-IPSE versetzt<br />
und über Nacht inkubiert. Die <strong>IL</strong>-4-Konzentration im Überstand wurde im ELISA bestimmt. Dargestellt ist ein<br />
repräsentatives Ergebnis von drei Experimenten. <strong>IL</strong>-3: Negativkontrolle; anti-IgE: Positivkontrolle.<br />
92
Ergebnisse<br />
4.3.2 Die <strong>IL</strong>-4-Freisetzung der Basophilen nach Stimulation mit HEK-IPSE ist<br />
IgE-abhängig<br />
Wird das FcεRI-gebundene IgE auf der Oberfläche von Basophilen quervernetzt, beispielsweise durch<br />
anti-IgE oder B-Zell-Superantigene, so werden die Basophilen zur <strong>IL</strong>-4-Freisetzung aktiviert. Auch<br />
für natives IPSE aus Schistosoma mansoni und rekombinantes E. coli-IPSE konnte die IgE-<br />
Abhängigkeit der Aktivierung nachgewiesen werden (Schramm et al. 2003), auch wenn die<br />
Aktivierung der Basophilen hier wahrscheinlich nicht auf einer Quervernetzung beruht (Blindow<br />
2004).<br />
Zur weiteren funktionellen Charakterisierung <strong>des</strong> HEK-IPSEs wurde untersucht, ob auch die durch<br />
HEK-IPSE bewirkte Aktivierung der Basophilen IgE-abhängig ist. Dafür wurde ein Stripping-<br />
Experiment durchgeführt, bei dem das rezeptorgebundene IgE durch Absenkung <strong>des</strong> pH-Wertes von<br />
der Oberfläche der Basophilen entfernt worden ist. Anschließend wurden die Zellen mit IgE-haltigem<br />
Patientenserum bzw. mit reinem polyklonalem IgE resensibilisiert. Die nativen, gestrippten und<br />
resensibilisierten Basophilen wurden dann mit anti-IgE, SmEA, E. coli-IPSE und HEK-IPSE<br />
stimuliert und die <strong>IL</strong>-4-Freisetzung gemessen.<br />
Wie in Abbildung 4.26 zu sehen ist, führen alle Stimulantien bei den nativen Basophilen zu einer <strong>IL</strong>-4-<br />
Freisetzung. Bei gestrippten Basophilen geht das Signal fast auf das Niveau der Negativkontrolle<br />
zurück. Mit IgE resensibilisierte Basophile zeigen wieder eine erhöhte <strong>IL</strong>-4-Freisetzung, die teilweise<br />
über das ursprüngliche Signal hinausgeht. Das bedeutet, dass auch die Aktivierung über HEK-IPSE<br />
IgE-abhängig ist.<br />
Abbildung 4.26: Basophilenassay mit nativen, gestrippten und resensibilisierten Basophilen. Native ( ), gestrippte ( )<br />
und mit Patientenserum ( ) bzw. reinem IgE ( ) resensibilisierte Basophile wurden in Anwesenheit von <strong>IL</strong>-3 mit anti-IgE<br />
(als Positivkontrolle), SmEA, E. coli-IPSE und HEK-IPSE über Nacht stimuliert und die <strong>IL</strong>-4-Freisetzung im ELISA<br />
gemessen.<br />
93
Ergebnisse<br />
In FACS-Experimenten wurde die Bindung von HEK-IPSE an Basophile untersucht (Abbildung 4.27).<br />
Werden die Basophilen mit biotinyliertem HEK-IPSE inkubiert (gefüllte Kurve) so zeigen sie eine<br />
deutlich höhere mittlere Fluoreszenz gegenüber Basophilen, die nicht mit HEK-IPSE inkubiert worden<br />
sind (graue offene Kurve), ersichtlich über eine Rechtsverschiebung der Kurve. Folglich binden die<br />
Basophilen HEK-IPSE. Wird das rezeptorgebundene IgE von den Basophilen entfernt, so binden sie<br />
deutlich weniger HEK-IPSE (schwarze offene Kurve). Dies unterstützt die Ergebnisse der<br />
Strippingexperimente, dass die Aktivierung der Basophilen IgE-abhängig ist. Die Positivkontrolle mit<br />
biotinyliertem anti-IgE zeigt dasselbe Ergebnis, nur dass die mittlere Fluoreszenz bei anti-IgE deutlich<br />
höher ist.<br />
Abbildung 4.27: Histogramme der FACS-Untersuchung zur Untersuchung der Bindung von HEK-IPSE oder anti-IgE<br />
an native und gestrippte Basophile. Native und gestrippte Basophile wurden entweder mit biotinyliertem HEK-IPSE oder<br />
mit biotinyliertem anti-IgE inkubiert. Der Nachweis im FACS erfolgte über Bindung von PE-gekoppeltem Streptavidin.<br />
4.3.3 Basophile degranulieren nach Stimulation mit HEK-IPSE und High Five-IPSE<br />
Neben der Freisetzung von <strong>IL</strong>-4 schütten Basophile auch noch weitere Mediatoren wie Histamin,<br />
<strong>IL</strong>-13 und Leukotriene aus. Während <strong>IL</strong>-4 und <strong>IL</strong>-13 de novo synthetisiert werden, werden Histamin<br />
und Leukotriene durch Degranulation freigesetzt. Die Granulierung bzw. die Degranulation kann<br />
durch Anfärbung von Zytospinpräparaten nach Stimulation der Basophilen visualisiert werden.<br />
94
Ergebnisse<br />
Die Basophilen wurden über Nacht mit den verschiedenen Stimuli (SmEA, E. coli-IPSE, HEK-IPSE<br />
und High Five-IPSE) in <strong>IL</strong>-3-haltigem Medium inkubiert. Als Negativkontrolle wurden die Zellen nur<br />
in Medium bzw. in <strong>IL</strong>-3-haltigem Medium inkubiert.<br />
Die Effekte der einzelnen Stimuli sind in Abbildung 4.28 zu sehen. Die in Medium inkubierten<br />
Basophilen sind stark granuliert. Die Granula sind dabei gleichmäßig über die Zelle verteilt. Durch<br />
Zusatz von <strong>IL</strong>-3 bei der Inkubation kommt es zu einer Polarisierung der Granula auf der einen Seite<br />
der Zelle während der Kern die andere Hälfte einnimmt. SmEA, welches natürliches IPSE enthält,<br />
bewirkt eine Degranulation der Basophilen. Es sind kaum mehr Granula sichtbar, statt<strong>des</strong>sen kann<br />
man in einigen Basophilen Granulakavitäten erkennen. Das gleiche Bild zeigt sich auch bei den<br />
rekombinant exprimierten IPSE-Präparationen. Sowohl E. coli-IPSE wie auch HEK-IPSE und<br />
High Five-IPSE führen zu einer Degranulation der Basophilen. Auch wenn für HEK-IPSE und<br />
High Five-IPSE keine Histaminbestimmung durchgeführt worden ist, so kann man durch die<br />
Degranulation davon ausgehen, dass auch diese IPSE-Arten zu einer Histaminfreisetzung führen.<br />
Abbildung 4.28: Degranulation humaner basophiler Granulozyten nach Stimulation mit IPSE aus verschiedenen<br />
<strong>Expression</strong>ssystemen. Basophile wurden mit SmEA, E. coli-IPSE, HEK-IPSE und High Five-IPSE über Nacht bei 37 °C<br />
stimuliert. Von den Zellen wurden Zytospinpräparate angefertigt, mit May-Grünwald-Lösung gefärbt und unter dem<br />
Mikroskop bei 1000x Vergrößerung fotografiert. Als Negativkontrollen dienen Zellen, die nur in Medium bzw. in <strong>IL</strong>-3<br />
haltigem Medium inkubiert worden sind.<br />
95
Ergebnisse<br />
4.3.4 Inkubation mit HEK-IPSE führt zu einer allgemeinen Aktivierung der<br />
Basophilen<br />
Bei der Aktivierung von Basophilen wird der Oberflächenmarker CD203c hochreguliert (Bühring et<br />
al. 2004). In FACS-Experimenten wurde untersucht, ob dies auch für die Aktivierung der Basophilen<br />
durch IPSE der Fall ist. Dafür wurde ein Teil der gereinigten Basophilen in 2 % Formaldehyd fixiert,<br />
der andere Teil wurde nativ belassen. Beide Konditionen wurden mit HEK-IPSE für eine halbe Stunde<br />
bei 37 °C inkubiert. Die Menge an CD203c wurde im FACS mit einem PE-gekoppelten anti-CD203c-<br />
Antikörper auf der Oberfläche der Basophilen nachgewiesen. Wie in dem Histogramm in Abbildung<br />
4.29 zu sehen ist, zeigen native Basophile sowohl mit HEK-IPSE als auch mit anti-IgE eine deutlich<br />
höhere Fluoreszenz. Sie haben folglich mehr CD203c an ihrer Oberfläche als die fixierten Basophilen,<br />
das während der Inkubationszeit von Basophilen auf der Oberfläche exprimiert worden ist. Das<br />
bedeutet, dass Basophile nicht nur durch anti-IgE sondern auch durch HEK-IPSE aktiviert werden.<br />
Abbildung 4.29: Histogramme der FACS-Experimente zur Untersuchung der <strong>Expression</strong> von CD203c auf fixierten<br />
und nativen Basophilen nach Stimulation mit HEK-IPSE und anti-IgE. <strong>Ei</strong>n Teil der gereinigten Basophilen wurde mit<br />
2 % Formaldehyd fixiert, der andere Teil wurde nativ belassen. Beide Konditionen wurden mit HEK-IPSE oder anti-IgE für<br />
30 min bei 37 °C inkubiert und die <strong>Expression</strong> von CD203c auf der Oberfläche über einen PE-gekoppelten anti-CD203c-<br />
Antikörper im FACS nachgewiesen. Offene Kurven: fixierte Basophile, gefüllte Kurven: native Basophile.<br />
96
Ergebnisse<br />
4.3.5 HEK-IPSE und High Five-IPSE binden Immunglobuline<br />
Wie bereits erwähnt ist die Aktivierung der Basophilen durch IPSE IgE-abhängig. In Arbeiten von<br />
Blindow (2004) konnte gezeigt werden, dass E. coli-IPSE jedoch nicht nur IgE sondern auch IgG, IgM<br />
und IgA bindet. IPSE ist folglich ein Immunglobulin-bindender Faktor. Daher wurde untersucht ob<br />
diese funktionelle <strong>Ei</strong>genschaft auch auf HEK-IPSE und High Five-IPSE zutrifft.<br />
Als Positivkontrollen wurden aufgereinigtes natürliches IPSE und Schistosoma mansoni-<strong>Ei</strong>-Antigen<br />
(SmEA), welches nIPSE enthält, in der SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen<br />
aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembran geblottet. Streifen dieses Blots wurden mit IgE, IgG, dem<br />
Lektin Aleuria aurantia Agglutinin (welches spezifisch α1→6 oder α1→3 gebundene Fucose bindet)<br />
und dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper inkubiert. Die Bindung wurde über AP-gekoppelte<br />
Sekundärantikörper nachgewiesen (Abbildung 4.30).<br />
Der monoklonale anti-IPSE-Antikörper gibt die Lage der Banden von IPSE an. Natürliches IPSE zeigt<br />
eine Doppelbande bei ca. 40 kD. Diese Banden sind auch bei Streifen, die mit IgE, IgG und dem<br />
Lektin inkubiert worden sind, zu sehen. Natürliches IPSE bindet demzufolge nach die ausgetesteten<br />
Immunglobuline und ist fucosyliert. Das SmEA enthält neben IPSE viele weitere Proteine. Der<br />
Streifen, der mit dem Lektin inkubiert worden ist, zeigt zahlreiche Banden. Dies ist dadurch zu<br />
erklären, dass über die Bindung <strong>des</strong> Lektins die fucosylierten Proteine <strong>des</strong> SmEAs angezeigt werden.<br />
Der monoklonale anti-IPSE-Antikörper zeigt wieder die Doppelbande <strong>des</strong> natürlichen IPSE bei 40 kD.<br />
Auch IgE und IgG binden an diese Doppelbande wenn auch nur sehr schwach. Da aus dem<br />
Proteingemisch jedoch nur diese Doppelbande erkannt wird, handelt es sich um eine spezifische<br />
Bindung und keinen Artefakt.<br />
Abbildung 4.30: Bindung von natürlichem IPSE an Immunglobuline. Natürliches aufgereinigtes IPSE (5 µg/cm) und<br />
SmEA (67 µg/cm) wurden in der SDS-PAGE (15 % Trenngel) unter nicht-redzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf<br />
Nitrocellulosemembran geblottet. Streifen dieses Blots wurden mit IgE (3 µg/ml von Diatec), IgG (3 µg/ml), dem APgekoppelten<br />
Lektin AAA (0,1 µg/ml) und dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper (1:50) inkubiert. Die Bindung wurde<br />
über AP-gekoppelte immungloblulin-spezifische Antikörper nachgewiesen. C: Kontrolle für den Sekundärantikörper.<br />
97
Ergebnisse<br />
Abbildung 4.31: Bindung von rekombinantem IPSE an Immunglobuline. E. coli-IPSE (0,5 µg/cm), HEK-IPSE<br />
(3 µg/cm) und High Five IPSE (2,5 µg/cm) wurden in der SDS-PAGE (12 % Trenngel für E. coli-IPSE und HEK-IPSE;<br />
15 % Trenngel für High Five-IPSE) unter nicht-redzierenden Bedingungen aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembran<br />
geblottet. Streifen dieses Blots wurden mit IgE (3 µg/ml von Tago), IgG (3 µg/ml), dem AP-gekoppelten Lektin AAA<br />
(0,1 µg/ml) und dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper (1:50) inkubiert. Die Bindung wurde über AP-gekoppelte<br />
immungloblulin-spezifische Antikörper nachgewiesen. C: Kontrolle für den Sekundärantikörper.<br />
Die rekombinant hergestellten IPSE-Proteine - E. coli-IPSE, HEK-IPSE und High Five-IPSE - wurden<br />
in gleicher Weise wie das natürliche IPSE und das SmEA in der SDS-PAGE aufgetrennt und im<br />
Streifentest untersucht (Abbildung 4.31). E. coli-IPSE zeigt mit dem monoklonalen anti-IPSE-<br />
Antikörper eine Doppelbande bei 33 kD. Diese Bande bindet sowohl IgE als auch IgG, jedoch nicht<br />
AAA. Da Bakterien Proteine nicht glycosylieren können, kann dieser Streifen auch nicht weiter<br />
gefärbt sein.<br />
Die vier von dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper identifizierten HEK-IPSE-Banden werden<br />
ebenfalls sowohl von IgE als auch von IgG gebunden. Des Weiteren bindet auch das Lektin AAA an<br />
alle vier Banden, was bedeutet, dass alle vier Banden fucosyliert sind.<br />
Bei High Five-IPSE erkennt der monoklonale Antikörper die drei Banden <strong>des</strong> Dimers und auch zwei<br />
Monomerbanden. Die drei Dimerbanden binden - wie auch alle anderen IPSE-Arten - IgE, IgG und<br />
auch AAA.<br />
98
Ergebnisse<br />
4.3.6 HEK-IPSE führt nicht zu einer Quervernetzung von Immunglobulinen<br />
Nach Metzger (1992) werden bei einer Allergie Basophile durch eine Quervernetzung <strong>des</strong><br />
rezeptorgebundenen allergenspezifischen IgEs über das Allergen aktiviert. Quervernetzungen können<br />
über Bindung großer Komplexe im Äquivalenzbereich im Doppelimmunodiffusionsassay nach<br />
Ouchterlony nachgewiesen werden. Für E. coli-IPSE sind diese Versuche jedoch immer negativ<br />
ausgefallen. Das bedeutet, dass IPSE IgE und IgG zwar bindet, jedoch nicht quervernetzt<br />
(Blindow 2004). E. coli-IPSE ist jedoch schlecht löslich und bildet im Ouchterlony im Auftragsloch<br />
Präzipitate, so dass die tatsächlich ins Gel diffundierte Proteinmenge erheblich niedriger ist als die<br />
aufgetragene. Möglicherweise können über dieses Material keine so hohen Proteinkonzentrationen im<br />
Gel erreicht werden, die mit den Immunglobulinen Präzipitate bilden könnten.<br />
Aus diesem Grund wurden die Versuche mit dem gut löslichen HEK-IPSE wiederholt. Die Ergebnisse<br />
sind in Abbildung 4.32 dargestellt. Wie in der Kontrolle mit dem anti-IPSE-Antikörper zu sehen ist,<br />
bildet HEK-IPSE keine Präzipitate direkt im Auftragsloch wie es bei E. coli-IPSE der Fall ist. Auch<br />
die Präzipitatslinien sind bei diesem Material sehr viel deutlicher ausgeprägt. Das heißt, dass mehr<br />
HEK-IPSE in das Gel diffundieren konnte.<br />
Jedoch sind auch bei HEK-IPSE weder mit IgG noch mit IgE Präzipitatbanden zu erkennen. Die<br />
Versuche sind über einen weiten Konzentrationsbereich durchgeführt worden. In Abbildung 4.32<br />
dargestellt sind die Ergebnisse der Diffusion der Immunglobuline und HEK-IPSE in äquimolarer<br />
Menge und in zehnfachem Immunglobulin-Überschuss. Werden HEK-IPSE und Immunglobulin in<br />
äquimolarer Menge aufgetragen, so wird das Gel vollständig entfärbt. Es zeigen sich keine<br />
Präzipitatlinien. Das bedeutet, dass es zu keiner Quervernetzung kommt. Wenn die Immunglobuline in<br />
zehnfachem Überschuss zugegeben werden, zeigen sich um die Auftragslöcher <strong>des</strong> Immunglobulins<br />
konzentrische Proteinfärbungen. Diese sind jedoch nicht auf eine Quervernetzung mit HEK-IPSE<br />
zurückzuführen, da diese Präzipitate auch auftreten, wenn statt HEK-IPSE nur Puffer in die Löcher<br />
aufgetragen wird. Diese unspezifische Anfärbung ist auf Aggregatbildung der Immunglobuline bei<br />
hohen Proteinkonzentrationen zurückzuführen.<br />
Somit ist selbst mit dem gut löslichen HEK-IPSE im Ouchterlony keine Quervernetzung zwischen<br />
Immunglobulinen und IPSE nachweisbar.<br />
99
Ergebnisse<br />
Abbildung 4.32: Doppelimmunodiffusionsassays nach Ouchterlony zur Untersuchung der Quervernetzung von IPSE<br />
mit Immunglobulinen. Von den beiden Reaktionspartnern ist der erstgenannte auf der linke Seite <strong>des</strong> Gels in der Mitte<br />
platziert und der letztgenannte in den Löchern außen herum in 2er-Verdünnungsstufen von unverdünnt bis 1: 32<br />
(im Uhrzeigersinn). Auf der rechten Seite wurde das Experiment reziprok durchgeführt. Bei dem anti-IPSE-Antikörper<br />
handelt es sich um ein polyklonales Kaninchenserum gegen IPSE. Dieses wurde in dem mit * gekennzeichneten Experiment<br />
zuvor über eine Protein-G-Säule aufgereinigt und <strong>des</strong>halb in einer anderen Konzentration eingesetzt als in Experiment 9).<br />
100
Diskussion<br />
5 Diskussion<br />
Das von den <strong>Ei</strong>ern <strong>des</strong> Pärchenegels Schistosoma mansoni sekretierte Protein IPSE bewirkt eine <strong>IL</strong>-4-<br />
Freisetzung aus humanen Basophilen und stellt somit einen wichtigen potenziellen Immunmodulator<br />
in Richtung der Th2-Induktion dar. IPSE ist ein Immunglobulin-bindender Faktor und die Aktivierung<br />
der Basophilen ist IgE-abhängig. Zur weiteren Aufklärung <strong>des</strong> Wirkungsmechanismus auf zellulärer<br />
Ebene und für strukturelle Untersuchungen wird IPSE in rekombinanter Form benötigt, da natürliches<br />
IPSE nur in sehr geringer Menge im SmEA vorliegt. In dieser Arbeit wurden daher verschiedene<br />
<strong>Expression</strong>ssysteme untersucht, mit dem Ziel eine größtmögliche Menge an funktionell aktivem und<br />
löslichem IPSE zu erhalten. Als <strong>Expression</strong>ssysteme wurden E. coli mit unterschiedlichen<br />
<strong>Expression</strong>svektoren, humane 293 HEK-Zellen und Insektenzellen gewählt.<br />
5.1 <strong>Expression</strong> von IPSE in E. coli<br />
5.1.1 Proteingewinnung über in vitro-Rückfaltung<br />
Bakterielle <strong>Expression</strong>ssyteme haben den generellen Vorteil, dass schnell große Mengen an<br />
rekombinantem Protein unter relativ einfachen und kostengünstigen Laborbedingungen gewonnen<br />
werden können. Dies wird unter anderem in der pharmazeutischen Biotechnologie ausgenutzt und so<br />
seit 1982 große Mengen an rekombinantem Insulin hergestellt (Folkers et al. 2005).<br />
Auch IPSE wurde nach Aufklärung der DNA-Sequenz im Vorfeld dieser Arbeit in den<br />
<strong>Expression</strong>svektor pPROEX-Htb kloniert und in E. coli-Zellen <strong>des</strong> Stammes DH5α überexprimiert. Bei<br />
dieser <strong>Expression</strong> wird E. coli-IPSE jedoch nicht in löslicher Form exprimiert, sondern in so<br />
genannten inclusion bodies in der Zelle abgelegt. Inclusion bodies sind unlösliche Proteinaggregate,<br />
die nicht korrekt gefaltet und somit biologisch inaktiv sind. Diese bilden sich bei hohen intrazellulären<br />
Konzentrationen von falsch gefalteten Proteinen oder Faltungsintermediaten (Sørensen und Mortensen<br />
2005). Über in vitro Rückfaltungsstrategien können aus solchen Proteinaggregaten dennoch biologisch<br />
aktive Proteine gewonnen werden (Chaudhuri 1994). Die Rückfaltung von Proteinen ist ein<br />
zweistufiger Prozess, bei dem zunächst die inclusion bodies unter starken denaturierenden<br />
Bedingungen gelöst und anschließend in einem physiologischen Puffer zurückgefaltet werden. Die<br />
Rückfaltung von gelöstem Protein zu gefaltetem Protein verläuft über einen Übergangszustand, der<br />
sich durch partielle Faltungsstrukturen mit einem geringen Anteil von Sekundärstruktur auszeichnet.<br />
Der kritische Schritt bei der Rückfaltung ist die Entstehung von nativem, gefaltetem Protein aus<br />
diesem Übergangszustand, denn auch hier können sich statt nativem Protein erneut Aggregate bilden.<br />
Wichtig dabei ist, dass die Konzentration an denaturiertem Protein möglichst gering gehalten wird.<br />
101
Diskussion<br />
Die Bedingungen, die zu nativem Protein führen, müssen für je<strong>des</strong> Protein systematisch ausgetestet<br />
werden. Bei E. coli-IPSE werden die inclusion bodies zunächst gewaschen und in 8 M Harnstoff<br />
solubilisiert, um im denaturierten Zustand über IMAC aufgereinigt zu werden. Das gereinigte E. coli-<br />
IPSE wird gegen einen Refoldingpuffer dialysiert. Dieser enthält ein Redoxsystem, das die<br />
Disulfidbrückenbildung ermöglicht. Anschließend wird der Refoldingpuffer durch Dialyse gegen<br />
einen PBS-Puffer pH 8,5 ersetzt (Schramm et al. 2003). Dieses E. coli-IPSE führt bei Basophilen zu<br />
einer <strong>IL</strong>-4-Freisetzung, bindet Immunglobuline und wird von polyklonalem Antikörper gegen nIPSE<br />
sowie monoklonalem Antikörper gegen E. coli-IPSE erkannt. Daher kann davon ausgegangen werden,<br />
dass es sich bei diesem Protein um zumin<strong>des</strong>t größtenteils korrekt gefaltetes IPSE handelt. In diesen<br />
Präparationen überwiegt der Anteil an dimerisiertem IPSE, jedoch ist immer auch eine gewisse Menge<br />
an monomerem IPSE enthalten, das sich nicht weiter abtrennen lässt. <strong>Ei</strong>n weiterer Nachteil dieser<br />
Präparationsart ist, dass sich das zurückgefaltete E. coli-IPSE nur bis zu einer Konzentration von<br />
0,15 mg/ml konzentrieren lässt, da es andernfalls aus der Lösung präzipitiert.<br />
Mit Hilfe einer anderen Rückfaltungsstrategie kann die Löslichkeit verbessert werden. Dabei wird<br />
denaturiertes IPSE nicht gegen PBS-Puffer sondern gegen einen Acetat-Puffer bei pH 4,0<br />
zurückgefaltet. Das auf diese Weise gewonnene E. coli-IPSE (pH 4,0) besteht überwiegend aus<br />
monomerem IPSE mit einem geringen Anteil an IPSE-Dimer und lässt sich auf bis zu 8 mg/ml<br />
einengen. Die bessere Löslichkeit lässt sich unter Umständen auf die höhere Nettoladung <strong>des</strong> Proteins<br />
an der Oberfläche zurückführen, da der isoelektrische Punkt (pI) von His-getaggtem E. coli-IPSE bei<br />
8,43 liegt. In der Nähe <strong>des</strong> pI weist das Protein keine Nettoladung auf und die Aggregation<br />
hydrophober Bereiche ist begünstigt. Für Experimente bei physiologischem pH-Wert ist das bei<br />
pH 4,0 zurückgefaltete Material nicht geeignet, da unbestimmte Mengen an Protein aus der Lösung<br />
ausfallen können und somit keine klare Aussage über die tatsächlich eingesetzte Konzentration<br />
getroffen werden.<br />
Für eine Vielzahl von Fragestellungen sind die beiden über in vitro-Rückfaltung gewonnenen IPSE-<br />
Proteine einsetzbar. So wurde beispielsweise die Immunglobulinbindung mit diesem Material näher<br />
untersucht und über ein Epitopmapping potentielle Bindungsstellen auf dem IPSE-Molekül sowie auf<br />
dem IgG-Molekül identifiziert (Blindow 2004). Dennoch ist für einige Untersuchungen wie z. B. der<br />
Ultrazentrifugation zur Aufklärung der Bindungsstöchiometrie und der Kristallisation eine hohe<br />
Proteinkonzentration bei physiologischem pH-Wert notwendig. Aus diesem Grund wurde versucht,<br />
über verschiedene Strategien die Bildung von inclusion bodies zu umgehen und lösliches IPSE in<br />
E. coli zu gewinnen.<br />
102
Diskussion<br />
5.1.2 Strategien zur Gewinnung von löslichem IPSE in E. coli<br />
5.1.2.1 Variation der <strong>Expression</strong>stemperatur<br />
<strong>Ei</strong>ne sehr einfache Methode die Löslichkeit von exprimierten Proteinen in E. coli zu erhöhen ist die<br />
Herabsetzung der <strong>Expression</strong>stemperatur. Für eine Vielzahl von Proteinen wie z. B. humanes<br />
Interferon α-2, β-Lactamase und bakterielle Luciferase konnte eine erhöhte Löslichkeit bei niedrigeren<br />
<strong>Expression</strong>stemperaturen nachgewiesen werden (Übersicht in Vasina und Baneyx 1997). Durch die<br />
geringere Temperatur ist die Replikation, Transkription und Translation herabgesetzt. Auch die<br />
Effektivität von den gewöhnlicherweise eingesetzten Promotoren ist erniedrigt. Dies resultiert in einer<br />
geringeren <strong>Expression</strong>srate und einer geringeren zellulären Proteinkonzentration, welches die Faltung<br />
von Proteinen begünstigt. Bei höheren Temperaturen ist die Aggregationsreaktion, die zu inclusion<br />
bodies führt, verstärkt, da die Interaktion zwischen hydrophoben Bereichen stark temperaturabhängig<br />
ist (Kiefhaber et al. 1991). Des Weiteren werden bei niedrigeren Temperaturen eine Vielzahl von<br />
Chaperonen vermehrt exprimiert, die für die Stabilität und korrekte Faltung der exprimierten Proteine<br />
verantwortlich sind (Ferrer et al. 2003). Bei der <strong>Expression</strong> von IPSE konnte allerdings durch<br />
Herabsetzung der <strong>Expression</strong>stemperatur kein positiver Effekt auf die <strong>Expression</strong> von löslichem<br />
Protein nachgewiesen werden, weder bei der zytoplasmatischen noch bei der periplasmatischen<br />
<strong>Expression</strong>. Das bedeutet, dass die Variation dieses Parameters einen zu geringen <strong>Ei</strong>nfluss auf die<br />
Faltung von IPSE hat, da die Aggregationsreaktion zu schnell verläuft, als dass sich korrekt gefaltetes<br />
Protein bilden könnte.<br />
5.1.2.2 Periplasmatische <strong>Expression</strong><br />
Gleiches scheint auch für die periplasmatische <strong>Expression</strong> von IPSE zu gelten. Bei der<br />
periplasmatischen <strong>Expression</strong> werden die Proteine im Zytoplasma synthetisiert und anschließend im<br />
ungefalteten Zustand in das Periplasma transloziert (Pugsley 1993). Das Periplasma zeichnet sich<br />
durch ein weniger reduzieren<strong>des</strong> Redoxpotenzial aus als das Zytoplasma und verfügt über eine<br />
Vielzahl von Proteinen, die die Faltung katalysieren oder begünstigen. So ist es über die<br />
Disulfidbrückenoxidasen bzw. -reduktasen DsbA und DsbB möglich Disulfidbrücken in einem Protein<br />
zu bilden, was im Zytoplasma nicht möglich ist (Bardwell 1994) und Peptidyl-Prolyl-cis-trans-<br />
Isomerasen (PPIs) katalysieren die Isomerisierung von Peptidbindungen. Chaperone scheinen bei der<br />
Faltung von Proteinen im Periplasma keine Rolle zu spielen, da diese ATP-abhängig arbeiten, welches<br />
im Periplasma nicht vorkommt. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene periplasmatische<br />
<strong>Expression</strong>svektoren verwendet. Beide verfügen über das pelB-Signalpeptid, welches für die<br />
Pektatlyase B codiert und die Translokation in den periplasmatischen Raum gewährleistet. Bei dem<br />
pET26(+)-IPSE-<strong>Expression</strong>svektor zeigte sich keine sichtbare <strong>Expression</strong>sleistung. Lediglich im<br />
Westernblot konnten geringen Mengen von IPSE nachgewiesen werden. Der Grund für die geringe<br />
103
Diskussion<br />
<strong>Expression</strong> ist unklar, da durch eine erfolgte Sequenzierung ein Klonierungsfehler ausgeschlossen<br />
werden konnte.<br />
Die <strong>Expression</strong>sleistung mit dem pBM1.1-IPSE-<strong>Expression</strong>svektor war dagegen gut (allerdings nur in<br />
Form von inclusion bodies). Dieser Vektor unterscheidet sich vor allem von dem pET26(+)-Vektor<br />
durch den N-terminalen His 10 -Tag. Trotz der guten <strong>Expression</strong>sleistung unter jeglichen ausgetesteten<br />
<strong>Expression</strong>sbedingungen konnte allerdings auch hier nicht einmal im Westernblot im Überstand <strong>des</strong><br />
Zellaufschlusses IPSE in löslicher Form nachgewiesen werden. Es war in diesem Fall notwendig,<br />
diese Westernblots mit dem monoklonalen anti-IPSE-Antikörper durchzuführen, da in der Coomassiegefärbten<br />
SDS-PAGE eine Vielzahl von Banden zu sehen sind und so geringe Mengen von<br />
exprimiertem IPSE überdeckt werden würden. Für die Translokation ins Periplasma muss das zu<br />
translozierende Protein im ungefalteten Zustand vorliegen (Randall et al. 1990). Dies wird von einer<br />
Reihe von Proteinen, die zum Translokationapparat gehören, und von der Signalsequenz selbst<br />
gewährleistet (Park et al. 1988). Ob sich die inclusion bodies bereits bei der Translation im<br />
Zytoplasma gebildet haben oder erst im Periplasma, konnte nicht geklärt werden.<br />
Mit dem pBM-1.1-IPSE-Vektor wurde zusätzlich die <strong>Expression</strong> unter Salzstressbedingungen und<br />
unter <strong>Ei</strong>nsatz von kompatiblen Soluten durchgeführt. Kompatible Solute wie z. B. Glycinbetain,<br />
Sorbitol und Hydroxyectoin sind gut lösliche osmotisch wirksame Substanzen mit<br />
proteinstabilisierender Wirkung, die von halophilen und halotoleranten Bakterien akkumuliert werden,<br />
um in einer salzhaltigen Umgebung das Überleben zu ermöglichen (Galinski 1995). Der osmotische<br />
Stress durch den hohen Salzgehalt bewirkt in den Zellen die Induktion von Hitzeschockproteinen und<br />
Chaperonen, die bei der korrekten Faltung eine große Rolle spielen, sowie deren Löslichkeit und<br />
Stabilität erhöhen. Neben den Chaperonen wird auch eine Vielzahl von weiteren Proteinen induziert,<br />
die das Wachstum unter den gegebenen Umständen sichern und möglicherweise auch <strong>Ei</strong>nfluss auf die<br />
exprimierten Proteine haben können. Des Weiteren wird ein direkter positiver <strong>Ei</strong>nfluss der<br />
kompatiblen Solute auf die exprimierten Proteine diskutiert, da die kompatiblen Solute über das proP<br />
und proU-Transportsystem in die Zelle aufgenommen werden können (Csonka et al. 1996). Die<br />
Interaktionen sind jedoch bis dato unerforscht. Diese Methode wurde von Barth et al. (2000) zur<br />
<strong>Expression</strong> von Immuntoxinen angewandt. Die Immuntoxine werden wie auch IPSE unter normalen<br />
<strong>Expression</strong>sbedingungen als inclusion bodies exprimiert. Durch Zusatz von kompatiblen Soluten unter<br />
Salzstress konnten 1,1 mg lösliches Protein aus einer 200 ml-Kultur gewonnen werden. Auch für<br />
Ferritin (van Wuytswinkel 1995) und DMAPP/AMP-Transferase (Blackwell und Horgan 1991)<br />
konnte über diese Methode lösliches aktives rekombinantes Protein generiert werden. Auch wenn es<br />
sich bei der <strong>Expression</strong> unter Salzstressbedingungen um einen viel versprechenden Ansatz handelt,<br />
konnte für IPSE keine positive Wirkung auf die <strong>Expression</strong> von löslichem Protein nachgewiesen<br />
werden. Jegliches exprimiertes IPSE war in der unlöslichen Fraktion <strong>des</strong> Zellaufschlusses zu finden.<br />
Möglicherweise haben gerade die hohen Salzkonzentrationen bei dieser <strong>Expression</strong> einen<br />
Aussalzungseffekt auf IPSE, da in der Zwischenzeit in mehreren experimentellen Ansätzen beobachtet<br />
104
Diskussion<br />
wurde, dass der Proteinanteil von IPSE sehr hydrophob ist (persönliche Mitteilung A. Mewes und Dr.<br />
G. Schramm, LG Zelluläre Allergologie, Forschungszentrum Borstel).<br />
5.1.2.3 Erniedrigung der Induktorkonzentration<br />
Wie schon erwähnt, kann eine Erniedrigung der Proteinsyntheserate zur Erhöhung der<br />
Proteinlöslichkeit in E. coli-<strong>Expression</strong>ssystemen führen. Dies lässt sich nicht nur durch Herabsetzung<br />
der <strong>Expression</strong>stemperatur erreichen (siehe 5.1.2.1), sondern auch durch Erniedrigung der<br />
Induktorkonzentration [3]. Wie die meisten E. coli-<strong>Expression</strong>ssysteme verfügen alle in dieser Arbeit<br />
verwendeten Vektoren über den IPTG-induzierbaren lac-Operator. Durch Zugabe <strong>des</strong> Lactose-<br />
Analogs Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) wird die <strong>Expression</strong> gestartet. Die<br />
Induktionskonzentrationen liegen im Bereich zwischen 0,05 bis 2 mM und typischerweise bei 0,1 bis<br />
1 mM [4].<br />
Mit dem periplasmatischen Vektor pBM1.1-IPSE in BL21(DE3)-Zellen sind IPTG-Konzentrationen<br />
zwischen 100 pM und 100 µM ausgetestet worden. Dabei zeigt sich, dass sogar Spuren von IPTG zu<br />
einer relativ hohen <strong>Expression</strong>srate führen. Die Induktion durch IPTG ist somit als ein „Alles-oder-<br />
Nichts-Signal“ für die Zelle zu verstehen. Die Herabsetzung der IPTG-Konzentration ist insofern nicht<br />
geeignet, um die <strong>Expression</strong>srate zu regulieren. Für die Regulation der <strong>Expression</strong> wurden von<br />
Bhandari und Gowrishankar (1997) salzinduzierbare E. coli-Zellen (GJ1158) beschrieben, die den<br />
salzinduzierbaren proU-Promotor besitzen. Bei diesen Zellen lässt sich die <strong>Expression</strong> tatsächlich über<br />
die Induktorkonzentration (NaCl) regulieren und für eine Reihe von Proteinen konnte über diese<br />
Methode lösliches Protein gewonnen werden (Donahue und Bebee 1999). Dies stellt somit einen<br />
weiteren möglichen Ansatz zur <strong>Expression</strong> von E. coli-IPSE dar.<br />
Interessanterweise zeigt sich auch hier, dass IPSE unter niedrigen IPTG-Konzentrationen als<br />
Doppelbande exprimiert wird, wie es auch schon unter Salzstressbedingungen der Fall war. Da E. coli-<br />
Zellen Proteine nicht glycosylieren können, kann die Doppelbande nicht auf unterschiedliche<br />
Glycosylierungsvarianten zurückgeführt werden. Auch unterschiedliche Faltungsvarianten scheiden<br />
als Grund für die Doppelbande aus, da die SDS-PAGE unter denaturierenden und reduzierenden<br />
Bedingungen durchgeführt wurde. Demzufolge scheint bei dem pBM1.1-IPSE-Vektor IPSE unter<br />
diesen Bedingungen, die für die Zelle möglicherweise eine Stresssituation darstellen, als vollständiges<br />
Protein und in einer verkürzten Variante exprimiert zu werden. Ob dies primär durch Kettenabbruch<br />
bei der Translation oder sekundär durch proteolytischen Abbau zustande kommt, ist nicht geklärt.<br />
Über einen Westernblot mit einem anti-His-Tag-Antikörper könnte nachgewiesen werden, ob sich die<br />
Verkürzung am N- oder C-Terminus befindet. Da es sich aber ohnehin um unlösliches IPSE handelt,<br />
das nicht weiter verwendet werden konnte, wurde dieser Fragestellung nicht weiter nachgegangen.<br />
105
Diskussion<br />
5.1.2.4 <strong>Expression</strong> von IPSE als Fusionsprotein<br />
Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen, dass es nicht möglich ist, IPSE nur durch Variation der<br />
<strong>Expression</strong>sbedingungen in löslicher Form zu exprimieren. <strong>Ei</strong>ne weitere Strategie, um lösliches<br />
rekombinantes Protein in E. coli zu erhalten, ist die <strong>Expression</strong> als Fusionsprotein mit einem<br />
Löslichkeitsvermittler. Als Löslichkeitsvermittler werden dabei häufig Affinitäts-Tags eingesetzt, die<br />
zusätzlich die Aufreinigung und Detektion <strong>des</strong> exprimierten Fusionsproteins erleichtern. Dazu zählen<br />
der GST-Tag (Glutathion-S-Transferase aus Schistosoma japonicum, 26 kD, Smith 2000), der MBP-<br />
Tag (Maltosebindeprotein aus E. coli, 40 kD, Sachdev und Chirgwin 2000), der TRX-Tag<br />
(Thioredoxin aus E. coli, 12 kD, La Vallie et al. 2000) und der NusA-Tag (N utilization substance A,<br />
54 kD, Harrison 2000). Für den GST-, MBP- und NusA-Tag konnte in einer vergleichenden<br />
Untersuchung von 40 Proteinen im Bereich zwischen 9 und 100 kD eine deutliche Verbesserung in<br />
Bezug auf die Löslichkeit erzielt werden, wohingegen der vergleichsweise kleine TRX-Tag kaum<br />
Auswirkungen zeigte (Shih et al. 2002). In dieser Arbeit wurde für die <strong>Expression</strong> von IPSE der MBP-<br />
Tag und der TRX-Tag verwendet.<br />
In dem MBP-System konnte IPSE zytoplasmatisch in größeren Mengen löslich als MBP-IPSE<br />
gewonnen werden. Über eine Amylose-Affinitätschromatographie konnte das exprimierte<br />
Fusionsprotein gut aufgereinigt werden. Die restlichen kontaminierenden Proteine sollten dann über<br />
eine Gelfiltration abgetrennt werden. Dabei zeigte sich jedoch, dass bei der erwarteten Größe für das<br />
Monomer von 50 kD kein Protein eluierte, sondern jegliches aufgetragenes Protein im<br />
Ausschlussvolumen der Superdex-200-Säule zu finden war. Diese Säule trennt Proteine im Bereich<br />
von 10 bis 600 kD. Das bedeutet, dass sich bei der Aufarbeitung oder während der Gelfiltration<br />
Aggregate von mehr als 600 kD gebildet haben müssen. Diese waren auch durch <strong>Ei</strong>nsatz von milden<br />
reduzierenden Bedingungen (1 mM DTT) nicht zu verhindern. In der Bachelorarbeit von Jessen<br />
(2003), in der Fragmente von IPSE als MBP-Fusionsproteine exprimiert wurden, zeigte sich ebenfalls<br />
eine Aggregationstendenz bei der Gelfiltration. Des Weiteren konnte der MBP-Fusionsanteil nicht<br />
über Faktor Xa abgespalten werden. Für weitere Untersuchungen von IPSE ist dies aber notwendig, da<br />
der MBP-Anteil ca. 80 % <strong>des</strong> gesamten Proteins ausmacht und es bei Bindungsstudien zu artefiziellen<br />
sterischen Behinderungen kommen könnte. Das bedeutet, dass trotz der hohen Ausbeuten an zunächst<br />
löslichem Fusionsprotein, eine weitere Aufarbeitung von IPSE sehr schwierig ist.<br />
Bei dem TRX-System dient der Thioredoxin-Anteil nicht nur als Löslichkeitsvermittler, sondern<br />
katalysiert wahrscheinlich auch die Disulfidbrückenbildung (Prinz et al. 1997). Dies ist nur in<br />
Origami-Zellen möglich, da in anderen Bakterienzellen das Zytoplasma ein reduzieren<strong>des</strong> Milieu<br />
aufweist, welches die Bildung von Disulfidbrücken verhindert. Das reduzierende Milieu wird durch<br />
zwei unabhängige Systeme aufrechterhalten: das Thioredoxin/Thioredoxin-Reduktase-System und das<br />
Glutathion/Glutaredoxin-System (Stewart et al. 1998). Die Origami-Zellen besitzen in den Genen<br />
trxB, das für die Thioredoxin-Reduktase codiert, und gor, das für die Glutathion Oxido-Reduktase<br />
codiert, eine Mutation und haben dadurch ein verändertes zytoplasmatisches Redoxpotential. Aus<br />
106
Diskussion<br />
diesem Grund wurde der TRX-Tag auch für die <strong>Expression</strong> von IPSE ausgetestet, da die<br />
Disulfidbrückenbildung für IPSE essentiell ist. Tatsächlich führt dies im Falle von IPSE auch zu<br />
einem Teil löslichem Protein, welches sich über IMAC bis zu einem guten Reinheitsgrad aufreinigen<br />
lässt. In dem Elutionspuffer der IMAC, welcher 250 mM Imidazol enthält, ist das eluierte Protein<br />
stabil. Bei einer Umpufferung gegen einen Tris-Puffer (50 mM, pH 7,5) präzipitiert das gesamte<br />
Protein jedoch irreversibel aus der Lösung. Diese Umpufferung ist aber nötig, um den TRX-Anteil<br />
über die Enterokinase-Schnittstelle abzuspalten. Aus diesem Grund schienen weitere Experimente mit<br />
diesem Material aussichtslos. In späteren Versuchen, z. B. bei der Kristallisation, zeigte sich, dass<br />
IPSE - unabhängig von dem <strong>Expression</strong>ssystem - in Tris-haltigen Puffern nicht löslich ist. Durch den<br />
<strong>Ei</strong>nsatz von 50 mM MES-Puffer (pH 7,5) könnte dieses Problem umgangen werden und der TRX-<br />
Anteil abgespalten werden. Ob das restliche IPSE ohne den Fusionsproteinanteil weiterhin löslich ist,<br />
ist fraglich, da häufig nach dem Abspalten <strong>des</strong> Affinitäts-Tags das gewünschte Protein zu großen<br />
Teilen präzipitiert (Baneyx 1999). Dennoch stellt die <strong>Expression</strong> von TRX-IPSE unter den<br />
untersuchten E. coli-<strong>Expression</strong>ssystemen den viel versprechensten Ansatz dar.<br />
Für die Kristallisation eines Proteins kann ein großer Affinitäts-Tag sowohl von Nutzen als auch<br />
hinderlich sein. Die 3D-Strukturen von MBP und TRX konnten bereits aufgeklärt werden (Spurlino et<br />
al. 1991, Jeng et al. 1994). Durch Modifizierung der Kristallisationsbedingungen, die bereits zu einem<br />
Kristall geführt haben, kann das Kristallisations-Screening vereinfacht werden. Für MBP konnte dies<br />
jedoch nur für kleine Peptide von 5-42 Aminosäuren nachgewiesen werden (Bucher et al. 2002). Auf<br />
der anderen Seite führen große Affinitäts-Tags, die mit dem gewünschten Protein fusioniert sind,<br />
durch die flexible Linkerregion, über die sie miteinander verbunden sind, zu einer größeren<br />
konformationellen Heterogenität, was die Kristallisation behindert. Dennoch ist es gelungen die ersten<br />
Kristalle von fünf Proteinen mit MBP-Tag zu erlangen (Übersicht in Smyth et al. 2003). Bei allen<br />
wurde die flexible Linkerregion auf drei bis fünf Aminosäuren - meist Alaninreste - verkürzt. Da<br />
sowohl MBP-IPSE als auch TRX-IPSE eine längere Linkerregeion besitzen, sind sie in ihrer jetzigen<br />
Form mit dem Fusionsanteil nicht für die Kristallisation einsetzbar und müssen zunächst gentechnisch<br />
modifiziert werden.<br />
107
Diskussion<br />
5.2 <strong>Expression</strong> von IPSE in eukaryotischen Zellen<br />
Eukaryotische <strong>Expression</strong>ssysteme wie Insektenzellen und humane Zelllinien zeichnen sich gegenüber<br />
bakteriellen <strong>Expression</strong>ssystemen durch eine größtenteils korrekte Faltung <strong>des</strong> exprimierten Proteins<br />
aus. Des Weiteren sind sie in der Lage posttranslationale Modifikationen, wie z. B. Glycosylierungen,<br />
Phosphorylierungen und Acetylierungen durchzuführen (Fernandez und Hoeffler 1999). Neben diesen<br />
Vorteilen ist jedoch die Ausbeute an exprimiertem Protein deutlich geringer, das Zellwachstum<br />
langsamer, die Kosten <strong>des</strong> Mediums und die Laboranforderungen höher. Da IPSE in E. coli-Zellen<br />
nicht löslich exprimiert werden konnte, wurden zwei eukaryotische <strong>Expression</strong>ssysteme ausgetestet:<br />
humane 293 HEK-Zellen und High Five-Insektenzellen.<br />
5.2.1 <strong>Expression</strong> von IPSE in 293 HEK-Zellen<br />
5.2.1.1 <strong>Expression</strong><br />
Das HEK-Zellsystem hat sich nach der ersten Beschreibung von Graham et al. (1977) zu einem weit<br />
verbreiteten <strong>Expression</strong>ssystem entwickelt. Graham transformierte humane embryonale Nierenzellen<br />
mit gescherter Adenovirus-DNA vom Typ 5 und erhielt eine Zelllinie, die sensitiv für Adenoviren<br />
war. Neben der virusbasierten Transfektion sind diese Zellen auch über Elektroporation,<br />
Lipotransfektion, Phosphatpräzipitation und Mikroinjektion transfizierbar. Der gereinigte pMSII-<br />
IPSE-Vektor wurde über das kationische Lipotransfektionsreagenz Transfast in die Zellen eingebracht,<br />
da dies die einfachste Transfektionsmethode mit einer hohen Effizienz darstellt. Der pMSII-Vektor hat<br />
gegenüber seinem Ausgangsvektor pSecTag2 den Vorteil, dass sich die Transfektionseffizienz<br />
theoretisch über grüne Fluoreszenz der Zellen ermitteln lässt, da der Vektor über eine bicistronische<br />
mRNA gleichzeitig mit dem rekombinanten Protein eGFP produziert. Auch wenn die grüne<br />
Fluoreszenz nur sehr schwach ausgeprägt war, kann von einer ausreichenden Transfektionsrate<br />
ausgegangen werden, da nach Zugabe <strong>des</strong> Selektionsmittels Zeocin viele Zellen überlebten und nach<br />
drei Tagen bereits erstmals HEK-IPSE im Kulturüberstand nachgewiesen werden konnte. Aus diesem<br />
Kulturansatz konnte eine stabile Zelllinie etabliert werden, die kontinuierlich HEK-IPSE exprimiert<br />
und in das Medium sekretiert.<br />
5.2.1.2 Reinigung<br />
Für die Aufreinigung <strong>des</strong> Kulturüberstan<strong>des</strong> konnte ein zweistufiges Reinigungsprotokoll - bestehend<br />
aus einer IMAC und einer Affinitätschromatographie - etabliert werden. Dieses resultierte in<br />
hochreinem rekombinantem Protein. Der erste Reinigungsschritt - die IMAC - entfernt den größten<br />
108
Diskussion<br />
Teil der kontaminierenden Proteine (im Wesentlichen FBS). Serumfreies Medium zeichnet sich durch<br />
eine geringe Proteinkonzentration aus. Insofern wäre es vorteilhaft auf den teuren Zusatz von FBS zu<br />
verzichten, der die Reinigung erschwert. Stöcker et al. (2003) beschreiben, dass der Kulturüberstand<br />
einer serumfreien 293 HEK-Zellkultur fast nur rekombinantes Protein enthält, so dass dieser schon für<br />
Bindungsstudien im FACS eingesetzt werden kann. In einem kommerziellen HEK-Zell-<br />
<strong>Expression</strong>smedium (HEK 293 Express der Firma PAA) starben die transfizierten Zellen jedoch nach<br />
langsamer Adaptation ab, sobald kein FBS mehr enthalten war. In einem weiteren Versuch wurden die<br />
Zellen auf ein weiteres serumfreies Medium (Dulbecco´s modified Medium + HAM´s Medium zu<br />
gleichen Teil unter Zusatz von Albumin, Insulin, Transferrin, Thiotyronin, Selen und Ethanolamin)<br />
adaptiert. In diesem Fall überlebten die Zellen zwar, sofern dem Kulturüberstand bei der Aufreinigung<br />
der Inkubationspuffer für die IMAC zugesetzt wird, bilden sich Präzipitate, die das Gelmaterial der<br />
IMAC verstopfen und eine Aufreinigung somit erschweren. Aus diesen Gründen wurde FBS-haltiges<br />
Medium für die <strong>Expression</strong> verwendet. In dem zweiten Reinigungsschritt - der<br />
Affinitätschromatographie - können auch letzte Verunreinigungen abgetrennt werden. Wird die<br />
Affinitätschromatographie als einzige Reinigungsprozedur durchgeführt, so verbleiben noch<br />
kontaminierende Proteine im Eluat. Der Reinheitsgrad entspricht in etwa dem nach der IMAC. Das<br />
zweistufige Reinigungsprotokoll ist somit für reines Material unumgänglich.<br />
5.2.1.3 Ausbeute<br />
Aus einem Liter Kulturüberstand wurden zwischen 0,2 und 0,5 mg HEK-IPSE isoliert. Die Ausbeute<br />
aus einem <strong>Expression</strong>ssystem ist zwar immer abhängig von dem zu exprimierenden Protein, für<br />
vergleichbare 293 HEK-Zell-<strong>Expression</strong>ssysteme sind jedoch ähnliche <strong>Expression</strong>sraten ermittelt<br />
worden: ~ 0,5 mg/l Kreatintransporter (West et al. 2005), 2 mg/l humanes Cathepsin E (Cappiello et<br />
al. 2004), 0,5 mg/l bovine pregnancy associated glycoprotein (Patel et al. 2003) und 0,3 mg/l humaner<br />
Faktor X (Rudolph et al. 1997). Für den in dieser Arbeit verwendeten pMSII-Vektor sind zwei<br />
unterschiedliche <strong>Expression</strong>en und Aufreinigungen von rekombinanten Immuntoxinen beschrieben<br />
(Stöcker et al. 2003, Brüll 2004), jedoch ist lediglich die <strong>Expression</strong> von anti-CD30-Angiogenin<br />
bilanziert. Hier wurden ähnliche Ausbeuten wie in dieser Arbeit erhalten (0,1 bis 0,5 mg/l).<br />
Um dennoch die Ausbeute zu optimieren, wurden erste Versuche mit einem Minifermenter<br />
(miniPERM der Firma Greiner Bio-One) unternommen (Kultivierung der Zellen durchgeführt von PD<br />
Dr. J. van der Bosch, LG Zelluläre Allergologie, Forschungszentrum Borstel). Im miniPERM<br />
Bioreaktor ist der Kulturraum durch eine Dialysemembran in einen Produktions- und einen<br />
Versorgungsraum aufgeteilt. Zellen und hochmolekulare Produkte werden durch diese zurückgehalten,<br />
Nährstoffe, physikalisch gelöste Gase und Metabolite können jedoch passieren. Hierdurch ist eine<br />
starke Anreicherung von Zellen und Zellprodukten möglich. Es wurden zwei verschiedene Systeme<br />
ausgetestet: eine Suspensionskultur und eine adhärent wachsende Kultur. Die Suspensionskultur zeigte<br />
109
Diskussion<br />
gegenüber der adhärenten Kultur geringere Wachstumsraten und somit auch geringere<br />
Produktionsraten. In der adhärenten Kultur konnten während der optimalen Produktionsphase<br />
innerhalb von zwei Tagen aus 40 ml Kulturüberstand bis zu 0,3 mg HEK-IPSE gereinigt werden.<br />
Wenn dieses Ergebnis in Langzeitversuchen bestätigt werden kann, so würde dies einer deutlichen<br />
Verbesserung im Arbeitsaufwand und Materialeinsatz entsprechen.<br />
5.2.1.4 Dimerisierung<br />
HEK-IPSE wird von den 293 HEK-Zellen als Dimer gebildet. Nur ein sehr geringer Teil liegt als<br />
Monomer vor. Auch im natürlichen IPSE sind zwei IPSE-Monomere über eine Disulfidbrücke<br />
zwischen dem C 39 und C 73 kovalent miteinander verbunden (Wuhrer et al., Paper eingereicht).<br />
Experimente im Basophilen-Assay zeigen, dass sehr wahrscheinlich nur dimeres IPSE zu einer<br />
Aktivierung der Basophilen führt, wohingegen monomeres IPSE keinen <strong>Ei</strong>nfluss besitzt (A. Gronow,<br />
LG Zelluläre Allergologie, persönliche Mitteilung). Nach dem von Blindow (2004) entwickelten<br />
Modell der Bindung von IPSE an Immunglobuline, kann nur dimerisiertes IPSE zu einer<br />
Konformationsänderung <strong>des</strong> rezeptorgebundenen IgE´s an der Oberfläche der Basophilen führen und<br />
diese darüber aktivieren. Die Bildung von dimerem IPSE ist aus diesem Grund für die Gewinnung von<br />
funktionell aktivem Material essentiell.<br />
5.2.1.5 Molekulargewicht<br />
In der SDS-PAGE wurde für dimeres HEK-IPSE ein apparentes Molekulargewicht von 40 bis 50 kD<br />
ermittelt. HEK-IPSE liegt dabei in vier unterschiedlichen Glycosyslierungsformen vor. Gerade<br />
Glycoproteine zeigen in der SDS-PAGE häufig ein verändertes Laufverhalten, so dass ihre<br />
Wanderungsgeschwindigkeit nicht mehr proportional zum dekadischen Logarithmus ihres<br />
Molekulargewichts ist (Rehm 2002). Aus diesem Grund wurde das Molekulargewicht für HEK-IPSE<br />
zusätzlich im MALDI-TOF Massenspektrum ermittelt (durchgeführt von PD Dr. B. Lindner,<br />
LG Biophysik, Forschungszentrum Borstel). Tatsächlich zeigt sich hier eine deutliche Abweichung zu<br />
dem in der SDS-PAGE ermittelten Molekulargewicht. Dimeres HEK-IPSE hat demzufolge 34 bis<br />
39 kD. Da die Peaks durch die Glycosylierung sehr breit sind, lässt sich das Molekulargewicht nicht<br />
genauer bestimmen. Das aus der Aminosäuresequenz für monomeres HEK-IPSE abgeleitete<br />
Molekulargewicht ist 16,679 kD. Die Differenz zwischen dem kalkulierten und gemessenen<br />
Molekulargewicht beruht auf der Glycosylierung. Demzufolge nimmt der Glycoanteil 2 bis 14 % <strong>des</strong><br />
Molekulargewichtes ein. Neben dem Peak bei 34 bis 39 kD ist zusätzlich mit gleicher Intensität noch<br />
ein Peak bei 17 bis 19 kD zu sehen, bei dem es sich um die doppelt protonierte Form <strong>des</strong> HEK-IPSE-<br />
Dimers in der MALDI-TOF-MS handelt. Das Massenspektrum von natürlichem IPSE sieht sehr<br />
ähnlich aus (Wuhrer et al., Paper eingereicht): Es zeigt ebenfalls zwei breite Peaks, welche die einfach<br />
110
Diskussion<br />
und die zweifach protonierte Form von nIPSE darstellen. Demzufolge hat natürliches IPSE ein<br />
Molekulargewicht von 32 bis 38 kD mit einem Kohlenhydratanteil von ungefähr 25 %.<br />
5.2.1.6 Glycosylierung<br />
Die vier Banden, die das HEK-IPSE-Dimer in der SDS-PAGE zeigt, sind auf unterschiedliche<br />
Glycosylierung zurückzuführen. Dies konnte in Experimenten mit der Endoglycosidase PNGase F, die<br />
spezifisch am Asparagin von N-glycosidisch gebundenen Zuckern spaltet, gezeigt werden, da die<br />
beiden höhermolekularen Banden durch diese Behandlung verschwanden. Da nach der<br />
Deglycosylierung nicht nur eine Bande sondern zwei zu sehen sind, ist das Protein nicht vollständig<br />
deglycosyliert. Dies kann zum einen daran liegen, dass HEK-IPSE neben N-glycosidisch gebundenen<br />
Zuckern auch noch O-glycosidisch gebundene Zucker aufweist, welche von der PNGase F nicht<br />
erkannt werden. Beim natürlichen IPSE können allerdings keine O-glycosidischen Zucker<br />
nachgewiesen werden (Wuhrer et al., Paper eingereicht). Zum anderen können dies N-glycosidische<br />
Zucker sein, die von der PNGase F durch unvollständigen Abbau nicht komplett entfernt wurden. Die<br />
Deglycosylierungseffizienz der PNGase F kann nach Herstellerangaben durch Zugabe von SDS und<br />
reduzierenden Agenzien gesteigert werden, da die Angriffsstellen für das Enzym freier zugänglich<br />
sind. Dies führt jedoch zur Denaturierung und Inaktivierung <strong>des</strong> Proteins, daher wurde von diesen<br />
Maßnahmen abgesehen.<br />
Die Deglycosylierung mit dem Enzym Endo H hatte keinen <strong>Ei</strong>nfluss auf die Bandenstruktur. Die<br />
Endo H spaltet die β(14)-Bindung zwischen den ersten beiden N-Acetylglucosaminresten<br />
(Chitobiose) N-glycosidisch gebundener Zucker, wobei ein N-Acetylglucosaminrest am Protein<br />
verbleibt. Die Spezifität der Endo H beschränkt sich auf Mannose-reiche Oligosaccharide, komplexe<br />
Oligosaccharide können von dem Enzym nicht gespalten werden. Möglicherweise ist dies der Grund<br />
für die fehlgeschlagene Deglycosylierung.<br />
In Westernblots mit dem Lektin PSA (bindet spezifisch an terminale α-D-Mannosereste,<br />
α-D-Glucosereste und fucosylierte Kernregion von bi- und triantennären N-Glycanen) und dem<br />
monoklonalen anti-IPSE-Antikörper wurde die Glycosylierung <strong>des</strong> HEK-IPSE-Monomers und<br />
-Dimers näher untersucht. Aus diesen Ergebnissen lässt sich folgen<strong>des</strong> Modell für die Glycosylierung<br />
ableiten wie es in Abbildung 5.1 dargestellt ist. Betrachtet man nur das HEK-IPSE-Monomer, so ist<br />
dieses an bis zu drei Stellen glycosyliert. Da die Aminosäuresequenz von IPSE nur zwei potentielle<br />
N-Glycosylierungsstellen aufweist, müsste eine Glycosylierung O-glycosidisch gebunden sein. Da in<br />
der SDS-PAGE keine Bande zu sehen ist, die zwar von dem monoklonalen Antikörper erkannt wird<br />
aber nicht von dem Lektin, ist davon auszugehen, dass kein Monomer unglycosyliert vorliegt. Aus<br />
diesen drei verschieden bezuckerten Monomeren (einfach, zweifach oder dreifach glycosyliert) lassen<br />
sich theoretisch sechs verschiedene Dimere mit fünf unterschiedlichen Bezuckerungsgraden bilden.<br />
Tatsächlich sind in der SDS-PAGE die üblichen vier Banden zu erkennen, das Lektin erkennt jedoch<br />
111
Diskussion<br />
Abbildung 5.1: Modell zur potentiellen Glycosylierung von HEK-IPSE<br />
112
Diskussion<br />
auch noch schwach eine höhermolekulare Form, so dass alle Bezuckerungsgrade auch nachweisbar<br />
sind. Durch die unterschiedlichen Glycosylierungsformen sind auch die breiten Peaks im MALDI-<br />
TOF-Massenspektrum zu erklären.<br />
Natürliches IPSE ist ebenfalls glycosyliert. Die Glycostruktur wurde von Wuhrer et al. (Paper<br />
eingereicht) über massenspektroskopische Methoden aufgeklärt. Demzufolge nach sind in 70 % der<br />
Homodimere alle vier N-Glycosylierungsstellen besetzt und in den restlichen sind drei Stellen besetzt.<br />
Wie auch HEK-IPSE ist natürliches IPSE ebenfalls gut löslich. Dies beruht wahrscheinlich auf dem<br />
hydrophilen Charakter der Glycosylierungen. Dies erklärt auch die Tatsache, warum nicht<br />
glycosyliertes E. coli-IPSE sehr schlecht löslich ist.<br />
Für die Funktion von IPSE bezüglich der Basophilenaktivierung spielen Glycosylierungen keine<br />
Rolle, da auch nicht glycosyliertes E. coli-IPSE zu einer <strong>IL</strong>-4-Freisetzung führt. Dennoch ist für<br />
weitere Untersuchungen zu berücksichtigen, dass Glycosylierungen einen <strong>Ei</strong>nfluss z. B. auf andere<br />
Immunzellen haben können. So wurde beschrieben, dass die Kohlenhydrate im SmEA, wie die Lacto-<br />
N-fucopentaose III (LNFP III), für eine Th2-Induktion in vivo verantwortlich sein können (Okano et<br />
al. 2001).<br />
5.2.1.7 Kristallisation<br />
Die Glycosylierung eines Proteins ist bei der Kristallisation eher hinderlich, da durch die<br />
Glycostrukturen zusätzliche Heterogenität entsteht, die die Ordnung eines Kristalls stört. Dennoch ist<br />
die Kristallisation von Glycoproteinen prinzipiell möglich (Huang et al. 2005). Daher und weil die<br />
Behandlung mit PNGase F nur zu einer partiellen Deglycosylierung geführt hat, wurde zunächst<br />
glycosyliertes HEK-IPSE eingesetzt. Für die Kristallisation ist der Punkt der Übersättigung<br />
ausschlaggebend, bei dem sich Kristalle formen können. Diese Übersättigung wird beeinflusst von der<br />
Proteinkonzentration, der Art und der Konzentration <strong>des</strong> Fällungsmittels, der Ionenstärke, der<br />
Temperatur und dem pH-Wert. Die Proteinkonzentration sollte möglichst hoch sein, damit die<br />
Übersättigung erreicht werden kann. Aus diesem Grund war die gute Löslichkeit von HEK-IPSE für<br />
diese Art der Untersuchung vorteilhaft. HEK-IPSE wurde in einer Konzentration von 13 mg/ml und<br />
22 mg/ml eingesetzt. Die weiteren Parameter wurden in den unterschiedlichen Konditionen variiert,<br />
lediglich die Temperatur wurde konstant gehalten.<br />
<strong>Ei</strong>n Kristallisationsexperiment konnte im Laufe der Arbeit abgeschlossen werden, ohne dass ein<br />
Kristall gewachsen ist. Aus den unterschiedlichen Konditionen lassen sich folgende Tendenzen<br />
ablesen: Die meisten präkristallinen Formen in Form von Phasentrennungen konnten in Konditionen<br />
mit Polyethylenglycol (PEG) 4000, PEG 8000 und PEG 10000 als Präzipitans gefunden werden;<br />
HEK-IPSE präzipiert in fast allen Konditionen in denen Tris-HCl verwendet wird; mit<br />
Ammoniumsulfat als Präzipitans sind sehr große Proteinpräzipitate beobachtet worden; in Salz- und<br />
Alkohol-basierten Konditionen ist es größtenteils zu kleineren Präzipitaten gekommen oder die<br />
113
Diskussion<br />
Lösung ist klar geblieben; <strong>des</strong> Weiteren wurden eine Reihe von präkristallinen Formen in Konditionen<br />
mit 2-Methyl-2,4-pentadiol (MPD) als Fällungsmittel gefunden. Da PEG auch selbst zu<br />
Phasentrennungen führen kann (Dr. J. Müller-Dieckmann, EMBL Hamburg, persönliche Mitteilung),<br />
ist in diesen Konditionen unklar, ob die präkristallinen Formen tatsächlich auf das Protein<br />
zurückzuführen sind. E. coli-IPSE, das bei pH 4,0 zurückgefaltet worden und sehr gut löslich ist,<br />
wurde in einem parallel angesetzten Kristallisationsexperiment mit den gleichen Konditionen versetzt<br />
(durchgeführt von A. Gronow, LG Zelluläre Allergologie, Forschungszentrum Borstel). Hier zeigten<br />
sich in lediglich vier Konditionen Phasentrennungen, während in den übrigen das Protein aus der<br />
Lösung präzipitiert ist. Dies ist ein weiteres Indiz dafür, dass E. coli-IPSE sobald es in Lösungen mit<br />
neutralem pH-Wert gebracht wird, sehr schlecht löslich ist und für die Kristallisation nur bedingt<br />
geeignet ist.<br />
In einem zweiten Kristallisationsexperiment werden zurzeit 816 weitere Konditionen im<br />
Hochdurchsatzverfahren untersucht (durchgeführt von Dr. J. Müller-Dieckmann am EMBL,<br />
Hamburg). Die Ergebnisse hierfür stehen noch aus. Als Tendenz lässt sich jedoch wieder feststellen,<br />
dass E. coli-IPSE sehr leicht aus den Lösungen präzipitiert und somit nicht mehr für die Kristallisation<br />
einsetzbar ist.<br />
5.3.1 <strong>Expression</strong> von IPSE in High Five-Zellen<br />
5.3.1.1 <strong>Expression</strong><br />
Neben den CHO-Zellen und 293 HEK-Zellen zählen Insektenzellen mit zu den wichtigsten<br />
eukaryotischen <strong>Expression</strong>ssystemen. Ursprünglich wurden die Insektenzellen mit rekombinanten<br />
Baculoviren, die die DNA für das gewünschte Protein tragen, infiziert und somit auch transfiziert. Der<br />
Nachteil dieser virus-basierten <strong>Expression</strong>ssysteme ist, dass die Insektenzellen durch die Infektion<br />
lysieren. Somit ist keine kontinuierliche <strong>Expression</strong> <strong>des</strong> rekombinanten Proteins möglich (Garon<br />
1999). Durch die Lyse werden verstärkt Proteasen freigesetzt, die das exprimierte Protein degradieren<br />
können. Des Weiteren sind während der Lyse einige intrazelluläre Stoffwechselwege inhibiert, z. B.<br />
die Sekretion, so dass die Ausbeute <strong>des</strong> rekombinanten Proteins herabgesetzt und die<br />
posttranslationalen Modifikationen unvollständig sein können. Dennoch können über diese Prozedur<br />
abhängig von dem jeweiligen Protein Ausbeuten von mehreren Milligramm pro Liter Kulturansatz<br />
erzielt werden (Taylor et al. 2006, Cody et al. 2005). Die virusfreie Transfektion umgeht diese<br />
Nachteile und den hohen Arbeitsaufwand der Virusamplifikation. Daher wurden in der vorliegenden<br />
Arbeit High Five-Zellen mit den Vektoren pIB/V5-His-IPSE (High Five-IPSE mit V5-His-Tag) und<br />
pIB-IPSE (High Five-IPSE ohne V5-His-Tag) über das Lipotransfektionsmittel Cellfectin transfiziert.<br />
High Five-Zellen sind eine Zellline von <strong>Ei</strong>zellen von Trichoplusia ni, die sich gegenüber den<br />
üblicherweise verwendeten Sf9- und Sf21-Zelllinien von Spodoptera frugiperda durch höhere<br />
114
Diskussion<br />
<strong>Expression</strong>sraten auszeichnet. Die Transfektionrate wurde über einen parallelen Transfektionsansatz<br />
mit dem pIZT/V5-His-Plasmid ermittelt, bei dem transfizierte Zellen durch die <strong>Expression</strong> von GFP<br />
unter dem Fluoreszenzmikroskop grün leuchten. Demzufolge konnte zwar eine gute<br />
Transfektionseffizienz erreicht werden, dennoch war nach vier Tagen im Kulturüberstand und in den<br />
Zellen über einen Westernblot kein IPSE nachweisbar. In dem sensitiveren Basophilenassay konnte<br />
jedoch bereits nach zwei Tagen in den Kulturüberständen eine <strong>IL</strong>-4-induzierende Aktivität<br />
nachgewiesen werden, die auf Anwesenheit von IPSE in den Kulturüberständen zurückzuführen ist.<br />
Die transfizierten Zellen wurden über Zugabe von Blasticidin selektioniert und stabile Zelllinien<br />
etabliert.<br />
5.3.1.2 Aufreinigung<br />
Es wurden zwei unterschiedliche IPSE-Konstrukte exprimiert: High Five-IPSE mit V5-His-Tag und<br />
High Five-IPSE ohne V5-His-Tag. Das Konstrukt ohne den Fusionsanteil zeigte eine leicht bessere<br />
<strong>Expression</strong>srate. Da es ohne den His-Tag nicht für die IMAC einsetzbar ist, wurde es nur über einen<br />
Reinigungsschritt aufgereinigt. Dies führte wie auch bei HEK-IPSE zu einem nicht befriedigenden<br />
Ergebnis. Aus diesem Grund wurde lediglich High Five-IPSE mit V5-His-Tag weiter kultiviert. Dies<br />
führt über das für HEK-IPSE etablierte Aufreinigungsprotokoll zu reinem Material. Lediglich im<br />
Bereich von 60 kD ist noch eine weitere schwache Bande identifizierbar. Im Gegensatz zu HEK-IPSE<br />
werden die High Five-Zellen in einem serumfreien Medium kultiviert. Das bedeutet, dass der<br />
Fremdproteinanteil in diesem Medium deutlich geringer ist und der spezifische Proteinanteil somit vor<br />
der Reinigung deutlich höher ist. Der Nachteil dieses Mediums liegt darin, dass in dem Medium<br />
Komponenten enthalten sind, die zu einer Auswaschung der Ni 2+ -Ionen von der Agarosematrix führen<br />
würden. Diese müssen vor der Aufreinigung durch Dialyse entfernt werden. Dieser zusätzliche Schritt<br />
macht ein upscaling der Kultur sehr aufwändig.<br />
5.3.1.3 Ausbeute<br />
Die Ausbeute aus dem High Five-Zellsystem liegt mit ca. 50 µg pro Liter Kulturüberstand deutlich<br />
unter der <strong>des</strong> 293 HEK-Zellexpressionssystems. In den 293 HEK-Zellen konnte vier bis zehn Mal<br />
mehr rekombinantes Protein gewonnen werden. Auch verglichen mit den Literaturdaten, in den<br />
Ausbeuten von mehreren Milligramm aus einem Liter Kulturüberstand erzielt worden sind (z. B.<br />
1-5 mg humanes <strong>IL</strong>-6, Garon 1999; 9 mg humanes GM2-Aktivatorprotein, Wendeler et al. 2003) ist<br />
die Ausbeute sehr gering. Dies könnte unter Umständen daran liegen, dass anstelle eines Insektenspezifischen<br />
das IPSE-eigene Signalpeptid für die Sekretion <strong>des</strong> Proteins in den Kulturüberstand<br />
verwendet worden ist. Signalpeptide weisen zwar keine konservierte Konsensussequenz auf, zeichnen<br />
sich aber durch ähnliche <strong>Ei</strong>genschaften aus (13 bis 36 Aminosäuren Länge, eine positive Aminosäure<br />
115
Diskussion<br />
am N-Terminus, hydrophober Kern) und sind größtenteils selbst zwischen Bakterien und humanen<br />
Zellen übertragbar (Baker et al. 1996). Dass selbst ein wurmspezifisches Signalpeptid von<br />
Insektenzellen erkannt wird, zeigt sich dadurch, dass IPSE in den Kulturüberstand sekretiert wurde<br />
und nur geringe Mengen im Zelllysat nachzuweisen waren (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise ist<br />
die Effizienz der <strong>Expression</strong> aber durch das zellfremde Signalpeptid herabgesetzt. Dies könnte durch<br />
die Verwendung eines Sekretionsvektor mit einem Insekten-Signalpeptid umgangen werden, z. B.<br />
durch den <strong>Ei</strong>nsatz <strong>des</strong> häufig verwendeten Honigbienen-Melittin-Sekretionssignals.<br />
5.3.1.4 Struktur<br />
High Five-IPSE wird von den Insektenzellen in etwa gleichen Teilen als Dimer und als Monomer<br />
exprimiert. Wie bereits erwähnt ist wahrscheinlich nur das Dimer funktionell aktiv. Um reines<br />
funktionelles Protein zu gewinnen, müsste bei diesem IPSE-Molekül nach der Reinigung noch das<br />
Dimer von dem Monomer abgetrennt werden. Dies stellt einen zusätzlichen Aufreinigungsschritt dar<br />
und würde die Ausbeute weiter verringern. Das Dimer zeigt in der SDS-PAGE ein apparentes<br />
Molekulargewicht von ca. 35 kD und weist drei unterschiedliche Glycosylierungsbanden auf.<br />
Verglichen mit HEK-IPSE scheint der Glycoanteil bei High Five-IPSE geringer zu sein. Aufgrund der<br />
geringen Ausbeute konnte jedoch weder das genaue Molekulargewicht über MALDI-TOF-MS<br />
ermittelt noch die Glycostruktur genauer untersucht werden.<br />
5.4 Funktionelle Charakterisierung<br />
Für die weitere Verwendung <strong>des</strong> in 293 HEK-Zellen und High Five-Zellen exprimierten IPSE, ist es<br />
von entscheidender Bedeutung, ob dieses Material auch die gleiche Aktivität zeigt, wie natürliches<br />
IPSE und das E. coli-IPSE. Erste Hinweise, dass sowohl HEK-IPSE als auch High Five-IPSE zu einer<br />
<strong>IL</strong>-4-Freisetzung aus humanen Basophilen führen, konnten über die <strong>Expression</strong>skinetiken <strong>des</strong><br />
jeweiligen Materials gewonnen werden. Da dieses Material nicht rein vorlag, konnten keine<br />
Rückschlüsse auf den Konzentrationsbereich geschlossen werden, in dem HEK-IPSE bzw. High Five-<br />
IPSE aktiv sind. In vergleichenden Untersuchungen von aufgereinigtem Material zeigte sich jedoch,<br />
dass die Kurven von HEK-IPSE und natürlichem IPSE parallel verlaufen und somit die gleiche <strong>IL</strong>-4-<br />
Freisetzungskapazität besitzen. Auch die Kurve von E. coli-IPSE weist einen ähnlichen Verlauf auf.<br />
Lediglich High Five-IPSE zeigte in allen Experimenten eine nach rechts verschobene Kurve. Das<br />
bedeutet, dass die Aktivität in etwa um den Faktor fünf niedriger als die der übrigen IPSE-Proteine ist.<br />
Dieser Aktivitätsunterschied könnte zum Teil darauf zurückzuführen sein, dass High Five-IPSE<br />
ungefähr zu gleichen Teilen aus Monomer und Dimer besteht. Da der Monomeranteil nach bisherigen<br />
116
Diskussion<br />
Erkenntnissen inaktiv ist, ist ein Teil <strong>des</strong> eingesetzten Materials somit nicht aktiv. Dennoch erklärt<br />
dies nicht den relativ großen Aktivitätsunterschied. Unter Umständen weist das High Five-IPSE in<br />
einigen Bereichen nicht die richtige Faltung auf oder durch die Glycosylierung ist die Bindungsstelle<br />
für Immunglobuline sterisch nicht zugänglich.<br />
In Zytospinpräparaten konnte gezeigt werden, dass es durch Stimulation mit HEK-IPSE, High Five-<br />
IPSE und E. coli-IPSE nicht nur zur <strong>IL</strong>-4-Freisetzung kommt, sondern die Basophilen dabei in<br />
gleicher Weise degranulieren wie nach Stimulation mit SmEA, das natürliches IPSE enthält. Die<br />
Degranulation und damit die Histamin-Freisetzung ist ein Vorgang der normalerweise nach 30 bis<br />
45 Minuten abgeschlossen ist (Kagey-Sobotka et al. 1981). Auch in der vorliegenden Arbeit konnte<br />
bereits nach 45 Minuten eine Degranulation in den stimulierten Ansätzen beobachtet werden. Da die<br />
Granula sich in frisch präparierten Basophilen häufig nur schlecht anfärben lassen, wurden auch<br />
längere Stimulationszeiten eingesetzt, um den Unterschied zwischen granulierten und degranulierten<br />
Zellen deutlicher hervorzuheben.<br />
Auch die IgE-Abhängigkeit der Basophilenaktivierung durch IPSE konnte für HEK-IPSE in<br />
Strippingexperimenten bestätigt werden. Dabei konnte erstmals über FACS-Experimente mit<br />
gestrippten und nativen Basophilen gezeigt werden, dass IPSE tatsächlich an die Oberfläche der<br />
Basophilen bindet. Die Bindung <strong>des</strong> biotinylierten HEK-IPSEs bzw. <strong>des</strong> biotinylierten anti-IgEs<br />
wurde über PE-konjugiertes Streptavidin nachgewiesen. Anhand der Fluoreszenz ist der Unterschied<br />
der Bindung von HEK-IPSE zwischen gestrippten und nativen Basophilen zwar nicht so ausgeprägt<br />
wie bei der Positivkontrolle mit anti-IgE. Dies kann jedoch entweder auf ein unterschiedliches<br />
Ausmaß an Biotinylierung oder auf unterschiedliche Affinitäten von HEK-IPSE und anti-IgE<br />
zurückzuführen sein.<br />
Ebenfalls in FACS-Experimenten konnte gezeigt werden, dass sowohl durch anti-IgE wie auch HEK-<br />
IPSE der Aktivierungsmarker CD203c für Basophile hochreguliert wird. CD203c ist die<br />
Ektonukleotid-Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 3 (E-NPP 3), die in Basophilen sowohl<br />
intrazellulär wie auch an der Oberfläche lokalisiert ist (Bühring et al. 2003). Bei Aktivierung der<br />
Basophilen durch Quervernetzung <strong>des</strong> membranständigen IgEs durch anti-IgE oder Allergene wird die<br />
Menge an membranständigem CD203c von den Zellen hochreguliert (Hauswirth et al. 2002). Die<br />
Hochregulierung korreliert dabei mit der Mediatorfreisetzung. Verglichen mit CD63, einem weiteren<br />
häufig eingesetzten Aktivierungsmarker für Basophile, zeichnet sich CD203c durch eine deutlich<br />
höhere Sensitivität aus (Boumiza et al. 2003). Mit HEK-IPSE wurde die Hochregulierung von<br />
CD203c erstmals für IPSE nachgewiesen. Es ist aber davon auszugehen, dass auch natürliches IPSE<br />
und die weiteren rekombinanten IPSEs die gleiche <strong>Ei</strong>genschaft zeigen, da auf den Basophilen alle<br />
IPSE-Proteine zu einer Mediatorfreisetzung führen. Um ausschließen zu können, dass die Fixierung<br />
der Basophilen <strong>Ei</strong>nfluss auf die Bindung <strong>des</strong> PE-konjugierten anti-CD203c-Antikörpers hat, wurde ein<br />
Teil der nativen Basophilen, die mit HEK-IPSE inkubiert worden sind, anschließend fixiert und im<br />
117
Diskussion<br />
FACS vermessen. Diese Kurve verläuft parallel zu der Kurve der nativen Basophilen. Das bedeutet,<br />
die Fixierung hat keinen <strong>Ei</strong>nfluss auf die Bindung <strong>des</strong> Antikörpers.<br />
Neben der <strong>IL</strong>-4-<strong>induzierenden</strong> Aktivität zeichnet sich IPSE dadurch aus, dass es ein Immunglobulinbindender<br />
Faktor ist. Zwar verläuft die Aktivierung der Basophilen über Bindung an IgE, dennoch<br />
bindet IPSE auch an IgG, IgM und IgA (Blindow 2004). Diese <strong>Ei</strong>genschaft konnte auch für HEK-<br />
IPSE und High Five-IPSE im Westernblot in Bezug auf IgE und IgG nachgewiesen werden. Im<br />
Westernblot scheint IgE eine höhere Affinität zu HEK-IPSE zu haben und IgG eine höhere Affinität<br />
zu High Five-IPSE. Da jedoch unterschiedliche Nachweissysteme verwendet werden mussten, kann<br />
über Bindungsaffinitäten keine Aussage gemacht werden.<br />
Bei der Untersuchung der Funktionalität von HEK-IPSE und High Five-IPSE konnten keine<br />
gravierenden Unterschiede zu natürlichem IPSE und E. coli-IPSE festgestellt werden, da es in gleicher<br />
Weise Basophile aktiviert, so dass diese degranulieren und <strong>IL</strong>-4 freisetzen, lediglich High Five-IPSE<br />
zeigt eine schwächere <strong>IL</strong>-4-Freisetzungskapazität. Des Weiteren binden beide rekombinanten<br />
eukaryotischen IPSE-Präparationen an Immunglobuline.<br />
Der Mechanismus der Basophilenaktivierung durch IPSE ist noch nicht geklärt. Nach dem bisherigen<br />
Kenntnisstand scheint IPSE die Basophilen jedoch anders als anti-IgE und Allergene nicht über eine<br />
Quervernetzung <strong>des</strong> FcεRI-gebundenen IgEs zu aktivieren, sondern vielmehr über Bindung von<br />
wahrscheinlich zwei IPSE-Molekülen an ein IgE-Molekül. Durch eine Konformationsänderung könnte<br />
so ein Signal in das Innere der Zelle geleitet werden (Blindow 2004). <strong>Ei</strong>n wichtiger Bestandteil für die<br />
Hypothese, dass es sich nicht um eine Quervernetzung handelt, waren neben BIACORE-Daten<br />
Ergebnisse aus Doppelimmunodiffusions-Assays. Bei diesem Assay liegen im Gegensatz zu<br />
Sandwich-Blot-Experimenten beide Reaktionspartner in gelöster Form vor und können frei im<br />
Agarosegel diffundieren. Da E. coli-IPSE schlecht löslich ist, ist eine erhebliche Menge an IPSE im<br />
Auftragsloch präzipitiert. Aus diesem Grund konnte keine Aussage über die tatsächlich im Gel<br />
diffundierende Menge gemacht werden. Dieses Experiment wurde daher mit dem gut löslichen HEK-<br />
IPSE nachvollzogen. Tatsächlich zeigen sich keine Präzipitate im Auftragsloch. Aber obwohl ein sehr<br />
weiter Konzentrationsbereich sowohl von HEK-IPSE als auch von IgE bzw. IgG ausgetestet worden<br />
ist, konnten keine Präzipitatlinien beobachtet werden, die auf eine Quervernetzung hätten schließen<br />
lassen. Wird IgE bzw. IgG in sehr hohen Konzentrationen eingesetzt, so zeigen sich zwar<br />
wolkenartige Präzipitate, diese sind aber nur auf Präzipitate <strong>des</strong> Immunglobulins selbst<br />
zurückzuführen, da diese Präzipitate auch zu sehen sind, wenn statt HEK-IPSE nur Puffer aufgetragen<br />
wird.<br />
Das bedeutet, dass auch mit HEK-IPSE keine Quervernetzung der Immunglobuline nachgewiesen<br />
werden kann. Dies untermauert die Hypothese, dass die Aktivierung der Basophilen durch IPSE auf<br />
einen neuartigen Mechanismus zurückzuführen ist, der ohne Quervernetzung der IgE-Moleküle<br />
funktioniert.<br />
118
Diskussion<br />
5.5 Vergleich der <strong>Expression</strong>ssysteme<br />
Ziel dieser Arbeit war es, ein <strong>Expression</strong>ssystem zu finden, in dem IPSE rekombinant in ausreichender<br />
Menge exprimiert wird, um die Struktur von IPSE aufzuklären und den Mechanismus der Wirkung<br />
von IPSE auf Basophile weiter untersuchen zu können. Über E. coli-IPSE konnten schon viele<br />
wichtige Erkenntnisse über das Bindungsverhalten gewonnen werden (Blindow 2004), doch viele<br />
Untersuchungen, wie zum Beispiel Ultrazentrifugation und titrative Mikrokalorimetrie zur Aufklärung<br />
der Stöchiometrie, scheiterten an der geringen Konzentration <strong>des</strong> Materials. Gerade für die<br />
Strukturaufklärung über Kristallisation wäre E. coli theoretisch ein geeignetes <strong>Expression</strong>ssystem, da<br />
durch die fehlende Glycosylierung sehr homogenes Material gewonnen werden kann. Dennoch wird<br />
IPSE in E. coli unter jeglichen ausgetesteten <strong>Expression</strong>sbedingungen in inclusion bodies in der Zelle<br />
abgelegt. Wilkinson und Harrison (1991) haben einen Algorithmus für die Vorhersage der Löslichkeit<br />
eines Proteins bei der Überexpression in E. coli entwickelt. In diesen Algorithmus gehen die<br />
Nettoladung, der Anteil an turn-bildenden Aminosäuren, der Anteil an Cysteinen und Prolinen, die<br />
Hydrophobizität und die Gesamtanzahl der Aminosäuren ein, wobei die ersten beiden Parameter den<br />
größten <strong>Ei</strong>nfluss auf die inclusion body-Bildung haben. IPSE bildet nach diesem Algorithmus bei der<br />
Überexpression mit einer Wahrscheinlichkeit von 83 % inclusion bodies [5]. Dies unterstützt den<br />
Befund, dass E. coli kein geeignetes <strong>Expression</strong>ssystem für die <strong>Expression</strong> von IPSE ist. Der einzige<br />
vielversprechende Ansatz ist die <strong>Expression</strong> von TRX-IPSE, wenn sich in zukünftigen<br />
Untersuchungen herausstellen sollte, dass TRX-IPSE in MES-Puffer nicht präzipitiert und sich der<br />
TRX-Anteil über die Enterokinase entfernen ließe.<br />
In den Insektenzellen konnte IPSE hingegen löslich und in aktiver Form gewonnen werden. Dieses<br />
System hat jedoch mehrere Nachteile. Zum einen ist die Ausbeute sehr gering und der Anteil an nicht<br />
dimerisiertem IPSE ist relativ groß. Zum anderen ist das Medium zur Kultivierung sehr teuer und ein<br />
upscaling der Kultur ist dadurch erschwert, dass der Kulturüberstand vor der Aufreinigung dialysiert<br />
werden muss.<br />
Die 293 HEK-Zellen exprimieren dagegen IPSE mit einer guten Ausbeute, die möglicherweise noch<br />
gesteigert werden kann. Die Handhabung der Zellen ist einfach und das Medium ist kostengünstiger<br />
als das für High Five-Zellen. Wie auch High Five-IPSE kann HEK-IPSE über ein zweistufiges<br />
Reinigungsprotokoll aufgereinigt werden. Da HEK-IPSE fast ausschließlich in dimerisierter Form<br />
exprimiert wird, entfällt hier ein weiterer Reinigungsschritt, der das inaktive Monomer von dem<br />
aktiven Dimer trennt. HEK-IPSE zeigt die gleiche Funktionalität wie natürliches IPSE, d. h. es bindet<br />
Immunglobuline und aktiviert Basophile zur <strong>IL</strong>-4-Freisetzung. Aus diesem Grund ist es geeignet<br />
natürliches IPSE in weiteren Untersuchungen zu ersetzen. HEK-IPSE kann in ausreichender Menge<br />
gewonnen werden, so dass es möglich ist auch in vivo-Studien damit zu betreiben. Zurzeit wird die<br />
Wirkung von HEK-IPSE in vivo in zwei unterschiedlichen Mausmodellen untersucht. In dem einen<br />
119
Diskussion<br />
Modell wird die Th2-Induktion in so genannten 4get/KN2 <strong>IL</strong>-4 Doppelreporter-Mäusen untersucht.<br />
Bei diesen Mäusen hat das eine Allel von <strong>IL</strong>-4 bicistronisch IRES-GFP und exprimiert intaktes <strong>IL</strong>-4,<br />
das andere Allel besitzt eine Insertion von humanem CD2, das statt <strong>IL</strong>-4 exprimiert wird. Mit diesem<br />
System kann sowohl die Transkription wie auch die Translation von <strong>IL</strong>-4 nach Stimulation mit IPSE<br />
untersucht werden (Mohrs et al. 2005). Das zweite Mausmodell ist ein Modell zur Untersuchung von<br />
Multipler Sklerose. Die murine Form der Multiplen Sklerose ist die Experimentelle Autoimmun-<br />
Encephalomyelitis (EAE). Multiple Sklerose und auch EAE sind durch eine starke Th1-Induktion<br />
geprägt. In diesem Modell wird untersucht, ob IPSE als Th2-Induktor die Krankheit abschwächen<br />
kann. Bei allen in vivo-Untersuchungen muss jedoch bedacht werden, dass auch Kohlenhydrate einen<br />
<strong>Ei</strong>nfluss auf das Ergebnis haben können und sich die Glycosylierung von HEK-IPSE von der <strong>des</strong><br />
natürlichen IPSEs unterscheidet.<br />
Für die Kristallisation wäre es zwar wünschenswert, wenn die Zellen HEK-IPSE nicht glycosylieren<br />
würden, damit das Ausgangsmaterial homogener ist. Dennoch ließen sich aufgrund der guten<br />
Löslichkeit bereits Kristallisationsexperimente ansetzen.<br />
Zur weiteren Untersuchung der Stöchiometrie von IPSE und Immunglobulin wird HEK-IPSE derzeit<br />
in Ultrazentrifugationsexperimenten eingesetzt (durchgeführt von Dr. R. Beavil, King´s College,<br />
London). Auch hierfür werden hohe Konzentrationen an IPSE benötigt, so dass diese Untersuchungen<br />
mit E. coli-IPSE bislang nicht möglich waren.<br />
120
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6.2 Zitierte Internetseiten<br />
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http://www.aerzte-zeitung.de/docs/2005/06/22/113a0502.asp?cat=/medizin/allergien<br />
(Stand 19.2.2006)<br />
[2] Expasy - ProtParam<br />
http://www.expasy.org/tools/protparam.html<br />
(Stand 19.2.2006)<br />
[3] EMBL Heidelberg - Improving protein solubility<br />
http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/protein_unit/draft_frames/flowchart/exp_e_coli/<br />
Ecoli_solubility.html<br />
(Stand 19.2.06)<br />
[4] EMBL Heidelberg - <strong>Expression</strong> in E. coli<br />
http://www.embl-heidelberg.de/ExternalInfo/protein_unit/draft_frames/flowchart/exp_e_coli/<br />
<strong>Expression</strong>_Ecoli.html<br />
(Stand 19.2.06)<br />
[5] University of Oklahoma - Recombinant Protein Solubiliy Prediction<br />
http://www.biotech.ou.edu/<br />
(Stand 19.2.06)<br />
132
Veröffentlichungen<br />
7 Veröffentlichungen<br />
1. Poster und Abstract auf der Tagung „Molecular and cellular biology of helminth parasites“,<br />
Hydra (Griechenland); 6.-11. September 2005:<br />
Manske M, Schramm G, Gronow A, Wicklein D, van der Bosch J, Lindner B, Mamat U, Blindow<br />
S, Kennedy MW, Doenhoff MJ und Haas H (2005). <strong>Expression</strong> of recombinant glycosylated<br />
IPSE (<strong>IL</strong>-4-inducing principle of Schistosoma mansoni eggs) in 293 HEK cells.<br />
2. Vortrag und Abstract auf der Tagung „18. Mainzer Allergie Workshop“, Mainz; 10.-11. März<br />
2006:<br />
Wodrich M, Schramm G, Blindow S, Gronow A, Sutton BJ, Weimar T, Gibbs BJ, van der Bosch J,<br />
Wicklein D, Stöcker M und Haas H (2006). <strong>Rekombinante</strong> <strong>Expression</strong> <strong>des</strong> <strong>IL</strong>-4-<strong>induzierenden</strong><br />
<strong>Schistosomen</strong>-<strong>Ei</strong>-Proteins IPSE zur Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der<br />
Basophilenaktivierung.<br />
3. Veröffentlichung:<br />
Wicklein D, Stöcker M, Klockenbring T, Huhn M, Wodrich M, Haas H, Becker WM, Barth S,<br />
Petersen A (Paper eingereicht). In contrast to specific B cells, human basophils are uneffected by<br />
the toxic activity of an allergen-toxin due to lack of internalization of IgE-bound allergen. Clin<br />
Exp Allergy.<br />
133
Danksagung<br />
8 Danksagung<br />
Bei Herrn Prof. Dr. O. Holst möchte ich mich herzlich für die Bereitschaft bedanken, die<br />
Schirmherrschaft für diese Arbeit zu übernehmen.<br />
Herrn PD Dr. H. Haas danke ich für die Betreuung, die interessante Themenstellung, die<br />
Ermöglichung der Teilnahme an Kongressen und die Diskussionsbereitschaft.<br />
Ganz besonderer Dank gilt Frau Dr. G. Schramm für die hervorragende Betreuung, die <strong>Ei</strong>nweisung in<br />
die molekularbiologischen Techniken, die Korrektur dieser Arbeit und die freundliche Atmosphäre,<br />
die sie verbreitet.<br />
Herrn A. Gronow danke ich für die die Hilfe und Unterstützung bei den vielen kleinen Dingen im<br />
Laboralltag und bei der <strong>Ei</strong>nführung in die Basophilenaufreinigung.<br />
Herrn Dr. D. Wicklein und Frau M. Böttger danke ich sehr für die Hilfe und das bereitgestellte<br />
Material bei der Bakterien- und 293 HEK-Zellkultur und für die freundliche Atmosphäre. Zusätzlich<br />
möchte ich mich auch bei allen anderen Mitarbeitern der LG Klinische und Molekulare Allergologie<br />
bedanken für die vielen kleinen Hilfestellungen.<br />
Bei Herrn PD Dr. J. van der Bosch bedanke ich mich für die <strong>Ei</strong>nführung in die FACS-Analyse und die<br />
Optimierung der 293 HEK-Zellkultivierung sowie den vielen guten Ratschlägen.<br />
Herrn PD Dr. B. Lindner danke ich für die Durchführung der MALDI-TOF-MS-Experimente.<br />
Herrn Dr. P. Zimmermann danke ich für die schnelle und unkomplizierte Hilfestellung bei der<br />
Insektenzellkultur sowie der Bereitstellung der Insektenzellen und Vektoren.<br />
Herrn Dr. J. Müller-Dieckmann danke ich sehr für den engagierten <strong>Ei</strong>nsatz bei der Kristallisation in<br />
der Hochdurchsatz-Kristallisationsanlage und seine kompetenten Ratschläge.<br />
Bei allen Mitarbeitern der LG Zelluläre Allergologie, sowie allen Auszubildenden, Bachelorstudenten<br />
und Gastwisschenschaftlern, die mich während meiner Doktorarbeit begleitet haben, möchte ich mich<br />
für die Fröhlichkeit bedanken, die sie im Labor verbreitet haben.<br />
134
Danksagung<br />
Bei allen Mitgliedern <strong>des</strong> Graduiertenkollegs 288 möchte ich mich für den Erfahrungsaustausch und<br />
die vielen netten Stunden bedanken, die wir zusammen hatten, bedanken. Ganz besonderer Dank gilt<br />
Frau Dr. C. Blume, die mich mein ganzes Studium über mit guten Ratschlägen und Hilfe begleitet hat.<br />
Bei allen Blutspendern möchte ich mich für ihre unkomplizierte Spontaneität und natürlich für ihr Blut<br />
bedanken.<br />
Ganz großer Dank gilt meiner Familie für die stete Unterstützung während <strong>des</strong> gesamten Studiums<br />
und der Anfertigung dieser Arbeit.<br />
Mein ganz besonderer Dank gilt Alex, der in allen Lebenslagen für mich da war, und so zu einem<br />
großen Teil zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.<br />
135
Lebenslauf<br />
9 Lebenslauf<br />
Persönliche Daten<br />
Name:<br />
Maren Wodrich, geb. Manske<br />
Geburtsdatum: 14. November 1977<br />
Geburtsort:<br />
Hamburg<br />
Nationalität: deutsch<br />
Familienstand: verheiratet<br />
Schulausbildung<br />
1984-1988 Grundschule Lehmkuhlenweg, Hamburg<br />
1988-1997 Gymnasium Willhöden, Hamburg<br />
Schulabschluss: Allgemeine Hochschulreife<br />
Studium<br />
10/1997-12/2002 Studium der Biologie an der Universität Hamburg<br />
Prüfungsfächer: Angewandte Botanik, Biochemie, Mikrobiologie<br />
02/2002-12/2002 Diplomarbeit am Institut für Angewandte Botanik unter der Leitung<br />
von Prof. Dr. R. Lieberei zu dem Thema:<br />
„Charakterisierung der Polyphenoloxidase aus den Blättern von<br />
Theobroma cacao“<br />
Promotion<br />
03/2003-heute<br />
Promotion am Forschungszentrum Borstel in der Laborgruppe<br />
Zelluläre Allergologie unter der Leitung von Dr. H. Haas im Rahmen<br />
<strong>des</strong> Graduiertenkollegs 288<br />
136