Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

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Diskussion coli-IPSE bei 32 kDa liegt. Die 150 kDa Bande ist nur bei der höchsten Konzentration (30 µM) des eingesetzten E. coli-IPSE sichtbar und könnte oktameres IPSE darstellen. Da HEK- IPSE ebenfalls die Eigenschaft besitzt unspezifisch an sich selber zu binden, wurde die Selbstaggregation von HEK-IPSE ebenfalls mittels chemischer Quervernetzung untersucht, wobei hier neben der Dimer-Bande ebenfalls eine zusätzliche Bande bei knapp über 66 kDa auftrat. Diese Bande könnte tetrameres HEK-IPSE darstellen, da sie mit 66 kDa ca. das doppelte Molekulargewicht des Dimers aufweist, welches für HEK-IPSE bei 34 – 39 kDa liegt. In der analytischen Ultrazentrifugation, die ebenfalls zur Bestimmung der Bindungsstöchiometrie von IPSE und Immunglobulin im Labor von B. Sutton (King’s College London) durchgeführt wurde, zeigte sich, dass HEK-IPSE möglicherweise als Tetramer vorliegt (persönliche Mitteilung, R. Beavil), was mit den Ergebnissen der chemischen Quervernetzung übereinstimmt. Dies veranlasste uns, die Selbstaggregation von HEK-IPSE zusätzlich in Lösung mittels dynamischer Lichtstreuung weiter zu untersuchen. Es zeigte sich, dass HEK-IPSE in Lösung hauptsächlich komplexiert vorliegt und in der Lage ist, große Komplexe mit einem Radius bis zu 100 nm zu bilden, die abzentrifugiert werden können. Die zentrifugierte HEK-IPSE Probe sowie die nicht-zentrifugierte Probe, die noch große Komplexe aufweist, wurden hinsichtlich möglicher Unterschiede in der Fähigkeit, die Freisetzung von IL-4 aus Basophilen zu induzieren, untersucht, wobei beide Proben eine sehr ähnliche funktionelle Aktivität auf den Basophilen aufweisen. Dieser Befund deutet zunächst darauf hin, dass die großen Komplexe von HEK-IPSE für eine Aktivierung der Basophilen nicht notwendig sind. Es ist hierbei aber nicht auszuschließen, dass nach Abzentrifugation der großen Komplexe sich nach einiger Zeit erneut IPSE-Komplexe gebildet haben. Die Beobachtung, dass komplexiertes HEK- bzw. E. coli-IPSE nur nach Einführung kovalenter Bindungen oder mittels dynamischer Lichtstreuung dargestellt werden konnte, während in der Größenausschlusschromatographie und in der SDS-PAGE jeweils nur das Dimer nachweisbar war, weist deutlich daraufhin, dass es sich hier um schwache reversible Bindungen handelt, die schon durch geringe mechanische und elektrische Scherkräfte wieder gelöst werden können. Nichtsdestotrotz liegen die rekombinanten IPSE-Moleküle in Lösung komplexiert vor, so dass sich die Frage stellt, ob natürliches IPSE ebenfalls in komplexierter Form vorliegt oder ob dieses Phänomen nur auf die rekombinanten Moleküle begrenzt ist. Aufgrund der geringen Mengen des uns zur Verfügung stehenden natürlichen IPSE war eine Prüfung dieser Frage leider nicht möglich. 90
Diskussion 5.6 IPSE – ein unkonventionelles B-Zellsuperantigen? Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen dieser und vorangegangener Arbeiten sagen, dass IPSE wie ein „klassisches“ B-Zellsuperantigen basophile Granulozyten IgEvermittelt über die Bindung an Fab- und Fc-Fragmente aktiviert. Im Gegensatz dazu ist es aber nicht in der Lage, lösliche oder immobilisierte Immunglobuline querzuvernetzen. Ein Grund dafür könnte sein, dass die Bindungsaffinität von IPSE an lösliches oder an Matrix-immobilisiertes Immunglobulin zu gering ist, um eine Quervernetzung oder die Ausbildung größerer Präzipitate hervorzurufen. Dafür sprechen die Ergebnisse, dass zwar eine Bindung von IPSE an Immunglobulin in Western- und Dot Blots nachgewiesen werden kann, demgegenüber aber keine Reaktivität in Sandwich-Blots, Doppelimmunodiffusions- Gelen oder affinitätschromatographisch zu beobachten ist. Ein Befund, der für niedrig-affine, nicht-präzipitierende Antikörper typisch ist. Die Ergebnisse der Größenausschlusschromatographie sprechen ebenfalls in diese Richtung, wobei die Affinität zu IgG sogar noch geringer ist als zu IgE. Es stellt sich daher die Frage: Wie kann ein Molekül mit so geringer Bindungsaffinität Basophile aktivieren? Eine denkbare Erklärung läge in der besonderen Konformation, die IgE nach Bindung an den FcεRI-Rezeptor einnimmt. Untersuchungen der Kristallstruktur der konstanten Region von IgE (IgE-Fc) (Wan et al., - -Region asymmetrisch stark gekrümmt vorliegt (s. Abbildung 5.2 b1). Die Bindung von IgE an diesen Rezeptor erfolgt durch Interaktion der -Domäne des IgE-Moleküls mit der - - terminale Region des IgE-Moleküls bindet an die zweite Domäne der -Kette des Rezeptors wobei eine Konformationsänderung eintritt und die C-Domäne sich von der C-Dömäne entfernt und das IgE etwas aufklappt (Sutton and Gould, 1993; Wan et al., 2002) (s. Abbildung 5.2 b). Diese Konformationsänderung von IgE ist verantwortlich für eine langsame Dissoziationsrate des IgE--Komplexes und für die Fähigkeit einer beständigen Zellaktivierung (Mastzellen und Basophile) und Aufrechterhaltung der Allergiesymptome (McDonnell et al., 2001; Wan et al., 2002). 91
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Aus dem Forschungszentrum Borstel L
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Einleitung Abbildung 1.1: Schematis
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Einleitung 1.4 Humane basophile Gra
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Seite 85 und 86: Diskussion 5.3.1 Sandwich-Blot-Vers
Seite 87 und 88: Diskussion zeigte. Protein L besteh
Seite 89 und 90: Diskussion 5.4 Bindungsstudien von
Seite 91: Diskussion 5.5 Rekombinante IPSE-Mo
Seite 95 und 96: Diskussion IgE-Quervernetzung der F
Seite 97 und 98: Literatur Brunner T, Heusser CH and
Seite 99 und 100: Literatur Florio G, Petraroli A, Pa
Seite 101 und 102: Literatur Kagey-Sobotka A, Dembo M,
Seite 103 und 104: Literatur Min B, Prout M, Hu-Li J,
Seite 105 und 106: Literatur Romagnani S (1991). Human
Seite 107 und 108: Literatur Williams ME, Montenegro S
Seite 109 und 110: Eigene Vorträge 7 Eigene Vorträge
Seite 111 und 112: Danksagung Karo und Ulrike, Euch da
Seite 113: 10 Eidesstattliche Erklärung Hierm
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