Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Diskussion
coli-IPSE bei 32 kDa liegt. Die 150 kDa Bande ist nur bei der höchsten Konzentration (30
µM) des eingesetzten E. coli-IPSE sichtbar und könnte oktameres IPSE darstellen. Da HEK-
IPSE ebenfalls die Eigenschaft besitzt unspezifisch an sich selber zu binden, wurde die
Selbstaggregation von HEK-IPSE ebenfalls mittels chemischer Quervernetzung untersucht,
wobei hier neben der Dimer-Bande ebenfalls eine zusätzliche Bande bei knapp über 66 kDa
auftrat. Diese Bande könnte tetrameres HEK-IPSE darstellen, da sie mit 66 kDa ca. das
doppelte Molekulargewicht des Dimers aufweist, welches für HEK-IPSE bei 34 – 39 kDa
liegt. In der analytischen Ultrazentrifugation, die ebenfalls zur Bestimmung der
Bindungsstöchiometrie von IPSE und Immunglobulin im Labor von B. Sutton (King’s
College London) durchgeführt wurde, zeigte sich, dass HEK-IPSE möglicherweise als
Tetramer vorliegt (persönliche Mitteilung, R. Beavil), was mit den Ergebnissen der
chemischen Quervernetzung übereinstimmt.
Dies veranlasste uns, die Selbstaggregation von HEK-IPSE zusätzlich in Lösung mittels
dynamischer Lichtstreuung weiter zu untersuchen. Es zeigte sich, dass HEK-IPSE in Lösung
hauptsächlich komplexiert vorliegt und in der Lage ist, große Komplexe mit einem Radius bis
zu 100 nm zu bilden, die abzentrifugiert werden können. Die zentrifugierte HEK-IPSE Probe
sowie die nicht-zentrifugierte Probe, die noch große Komplexe aufweist, wurden hinsichtlich
möglicher Unterschiede in der Fähigkeit, die Freisetzung von IL-4 aus Basophilen zu
induzieren, untersucht, wobei beide Proben eine sehr ähnliche funktionelle Aktivität auf den
Basophilen aufweisen. Dieser Befund deutet zunächst darauf hin, dass die großen Komplexe
von HEK-IPSE für eine Aktivierung der Basophilen nicht notwendig sind. Es ist hierbei aber
nicht auszuschließen, dass nach Abzentrifugation der großen Komplexe sich nach einiger Zeit
erneut IPSE-Komplexe gebildet haben.
Die Beobachtung, dass komplexiertes HEK- bzw. E. coli-IPSE nur nach Einführung
kovalenter Bindungen oder mittels dynamischer Lichtstreuung dargestellt werden konnte,
während in der Größenausschlusschromatographie und in der SDS-PAGE jeweils nur das
Dimer nachweisbar war, weist deutlich daraufhin, dass es sich hier um schwache reversible
Bindungen handelt, die schon durch geringe mechanische und elektrische Scherkräfte wieder
gelöst werden können.
Nichtsdestotrotz liegen die rekombinanten IPSE-Moleküle in Lösung komplexiert vor, so dass
sich die Frage stellt, ob natürliches IPSE ebenfalls in komplexierter Form vorliegt oder ob
dieses Phänomen nur auf die rekombinanten Moleküle begrenzt ist. Aufgrund der geringen
Mengen des uns zur Verfügung stehenden natürlichen IPSE war eine Prüfung dieser Frage
leider nicht möglich.
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