Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Diskussion
5.5 Rekombinante IPSE-Moleküle
Natürliches IPSE liegt im SmEA in nur sehr geringen Konzentrationen vor. Für die
Untersuchungen des Wirkungsmechanismus von IPSE werden aber häufig höhere
Proteinkonzentrationen bzw. mehr Material benötigt. Aus diesem Grund wurde IPSE
rekombinant sowohl in E. coli- als auch in humanen 293 HEK-Zellen hergestellt. Da E. coli-
IPSE in einem bakteriellen Expressionssystem exprimiert wird, liegt es unglykosyliert vor
und kann aufgrund seiner schlechten Löslichkeit nur bis zu einer Konzentration von 0,15
mg/ml konzentriert werden. Eukaryotische Expressionssysteme, wie HEK-Zellen, sind
dagegen in der Lage posttranslationale Modifikationen wie z. B. Glykosylierungen,
Phosphorylierungen und Acetylierungen durchzuführen (Fernandez and Hoeffler, 1999).
HEK-IPSE liegt in der SDS-PAGE als Dimer in vier unterschiedlichen
Glykosylierungsformen vor (Wodrich, 2006). Glykosyliertes HEK-IPSE ist gut löslich im
Gegensatz zum nicht-glykosyliertem E. coli-IPSE und kann bis zu 20 mg/ml konzentriert
werden. Natürliches IPSE ist ebenfalls glykosyliert. Seine Glykostruktur wurde von Wuhrer
et al. (2006) massenspektroskopisch aufgeklärt. Für die Wirkung von IPSE auf Basophile
spielt die Glykosylierung keine Rolle, da auch nicht-glykosyliertes E. coli-IPSE funktionell
aktiv ist. Wodrich (2006) zeigte in ihrer Arbeit, dass sich rekombinantes und natürliches IPSE
hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Basophilenaktivierung weitgehend gleichen und die
rekombinanten IPSE-Moleküle voll funktionstüchtig und daher mit großer Wahrscheinlichkeit
korrekt gefaltet vorliegen und.
5.5.1 E. coli-IPSE und HEK-IPSE neigen zur Selbstaggregation
Die Sandwich-Blot-Versuche (s. 5.3.1) zeigten deutlich, dass sowohl E. coli-IPSE als auch
HEK-IPSE die Tendenz zur Eigenaggregation besitzen. Offensichtlich wird durch die
Glykosylierung die Tendenz zur Autoaggregation nicht aufgehoben. Weiterhin konnte auch
bei der chemischen Quervernetzung zur Analyse der Bindungsstöchiometrie von E. coli-IPSE
und IgG eine Selbstaggregation von E. coli-IPSE beobachtet werden. Hierbei wurde zur
Kontrolle E. coli-IPSE alleine, ohne IgG, mit den chemischen Reagenzien (EDC und Sulfo-
NHS) versetzt. Dabei waren in der SDS-PAGE neben der Dimer-Bande von E. coli-IPSE
auch Banden im höheren Molekularbereich bei ca. 60 kDa und 70 kDa sowie bei ca. 150 kDa
sichtbar. Die Banden in der Höhe von 60-70 kDa könnten die Bildung von Tetrameren
darstellen. Sie besitzen ungefähr das doppelte Molekulargewicht des Dimers, welches für E.
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