Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Diskussion
5.4 Bindungsstudien von IPSE und Immunglobulin mit Hilfe
affinitätschromatographischer Methoden
Die Ergebnisse der Größenausschlusschromatographie zur Untersuchung der
Bindungsstöchiometrie sowie Komplexbildung von IPSE und IgG bzw. IgE zeigten, dass die
Bindung schwach ist, wenn beide Partner in Lösung vorliegen, wobei die Bindungsaffinität zu
IgE höher ist als zu IgG. Da IPSE Basophile durch Bindung an Rezeptor-ständiges, d.h.
gebundenes IgE aktiviert wurde untersucht, ob die Bindungsstärke zwischen IPSE und
Immunglobulin variiert, wenn einer der beiden Bindungspartner immobilisiert ist. Dazu
wurde die Bindung zwischen IPSE und Immunglobulin mittels affinitätschromatographischer
Methoden weiter untersucht. Hierbei wurden IgG oder IPSE an eine feste Phase gekoppelt
und die Bindung des jeweils anderen Moleküls in Lösung untersucht.
5.4.1 Interaktion zwischen löslichem HEK-IPSE und immobilisiertem IgG
Um die Bindung von HEK-IPSE an immobilisiertes IgG zu untersuchen, wurde IgG an
Protein G gebunden, welches über NHS-Gruppen an Agarose gekoppelt vorlag (Amersham
Biosciences). Protein G ist ein Fc-Rezeptor vom Typ III aus Bakterien der Gattung
Streptococcus, welches entweder auf der Oberfläche der Bakterienzellwand oder in
sekretierter Form vorliegt. Protein G bindet an alle humanen IgG-Subklassen und zwar
sowohl an die Fab-Region als auch an die Fc-Region. Erntell et al. (1988) zeigten, dass
Protein G zwei unabhängige und separate Bindungsstellen für IgG-Fc und Fab besitzt. Die
Immunglobulin-bindung durch Protein G wird in der Forschung hauptsächlich zur Reinigung
von IgG genutzt.
Es zeigte sich, dass nur ein sehr kleiner Teil des HEK-IPSE an das immobilisierte IgG bindet.
Der größte Teil von HEK-IPSE befand sich im Effluent und lag daher ungebunden vor. Durch
einen Kontrolllauf wurde ausgeschlossen, dass HEK-IPSE unspezifisch an Protein-G-
Sepharose bindet, die vorher nicht mit IgG beschickt worden war. Somit bindet HEK-IPSE an
immobilisiertes IgG, aber auch hier ist die Bindung nur sehr schwach. Das heißt, dass durch
die Immobilisierung von IgG an Protein G, die Bindungsstärke zwischen IPSE und IgG nicht
erhöht wurde.
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