Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

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Diskussion mechanische oder elektrische Scherkräfte getrennt werden. Das heißt, mögliche Komplexe von IgG und IPSE sollten z. B. bei einem gelelektrophoretischen Lauf erhalten bleiben und als Banden im hohen Molekularbereich sichtbar sein. Nach den Ergebnissen dieser Arbeit sprechen sowohl das Fehlen von Banden im höheren Molekularbereich als auch die gleich bleibende Stärke der IgG-Banden gegen eine Quervernetzung beider Moleküle. Die Abschwächung der E. coli-IPSE-Banden deutet auf eine Bindung an IgG hin, doch sind in jedem eingesetztem Verhältnis (1:1, 1:2, 1:3) die Dimer-Banden von E. coli-IPSE noch deutlich zu erkennen. Ein großer Teil des IPSE liegt also noch ungebunden vor, was darauf hinweist, dass zumindest keine starke Interaktion zwischen IPSE und IgG in Lösung stattgefunden hat. 5.3.3 Untersuchung der Stöchiometrie sowie Komplexbildung von IPSE und IgG bzw. IgE mittels der Größenausschlusschromatographie Nachdem, im Gegensatz zu den Dot-Blots, durch chemische Quervernetzung keine deutliche Bindung von IPSE an IgG in Lösung nachgewiesen werden konnte, wurde die Komplexbildung zwischen IgG bzw. IgE und IPSE mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie weiter untersucht, wobei Immunglobulin und IPSE vor dem Säulenlauf in verschiedenen Verhältnissen (1:1, 1:4 und 2:1) inkubiert wurden. 5.3.3.1 Bindungsuntersuchung von IgG und HEK-IPSE im Verhältnis 1:1 Überraschenderweise zeigte die Größenausschlusschromatographie im Gegensatz zum Western-Blot (Wodrich, 2006), keine Bindung zwischen HEK-IPSE und IgG. Beide Moleküle kamen komplett getrennt von der Säule. Ebenso zeigten Untersuchungen der Fraktionen des IgG-Peaks in der SDS-PAGE, dass kein HEK-IPSE zusammen mit IgG in diesen Fraktionen enthalten ist. Nachdem aber bekannt ist, dass IPSE und IgG eine Bindung eingehen können, weist dieser Versuch darauf hin, dass diese Bindung in Lösung sehr schwach ist und durch die mechanischen Scherkräfte während des Säulenlaufes wieder gelöst wird. Des Weiteren entsteht während der Chromatographie auch eine signifikante Verdünnung, so dass die Konzentration der Probe immer weiter herabgesetzt wird, wodurch schwache Bindungen wieder dissoziieren können. Auffällig war, dass während der Inkubation von IgG und HEK-IPSE in Lösung keine sichtbare Präzipitatbildung auftrat, wie sie die Kontrolle mit IgG und Protein L deutlich 84
Diskussion zeigte. Protein L besteht aus fünf homologen Ig-bindende Domänen (B1-B5), die mit hoher Affinität an die et al., 1992) und diese quervernetzen. Die maximale Bindung wurde bei pH 7 – 10 gemessen (Akerstrom and Bjorck, 1989), so dass der von uns eingesetzte Puffer mit pH 7,4 im optimalen Bereich lag, was durch die Präzipitatbildung sichtbar gemacht wurde. Das fehlende Auftreten von Komplexen in der Gelchromatographie und die fehlende Bildung von sichtbaren Präzipitaten weisen auf eine schwache Bindungsaffinität zwischen IgG und HEK- IPSE hin. 5.3.3.2 Bindungsuntersuchung von IgE und HEK-IPSE im 1:1-, 1:4- und 2:1- Verhältnis Die Untersuchung der Komplexbildung von HEK-IPSE mit IgE ergab ein anderes Ergebnis als mit IgG. Hier ist deutlich eine Interaktion zwischen den beiden Molekülen eingetreten. In Anwesenheit von IPSE war im Chromatogramm eine Linksverschiebung des monomeren IgE-Peaks zu beobachten. Diese war im IgE-Überschuss (2:1) sehr gering und nahm mit zunehmender HEK-IPSE-Konzentration (1:1 und 1:4) weiter zu, was darauf hindeutet, dass mehr als ein Molekül IPSE an ein Molekül IgE binden kann. Des Weiteren zeigte das Chromatogramm sowohl beim 2:1- als auch beim 1:1-Verhältnis ein deutliches Abnehmen des HEK-IPSE-Peaks, während beim Verhältnis 1 Teil IPSE + 4 Teile IgE noch ungebundenes HEK-IPSE als Peak sichtbar war. Bei diesem Verhältnis herrscht also offensichtlich ein IPSE-Überschuss, woraus folgt, dass keine vier Moleküle IPSE pro IgE binden können. Auch die Untersuchung der einzelnen Fraktionen in der SDS-PAGE zeigte, dass HEK-IPSE mit IgE interagiert hat. Die Fraktionen des IgE-Peaks wiesen neben IgE auch HEK-IPSE auf. Weiterhin wurde in der SDS-PAGE sichtbar, dass in jedem eingesetzten Verhältnis, also auch bei 2:1 und 1:1, noch ungebundenes HEK-IPSE vorliegt, was auch hier auf eine relativ schwache Bindung zwischen IPSE und IgE hinweist. Das Proteinprofil der Komplexe aus IgE und Protein L, als Kontrolle, gibt Aufschluss über eine mögliche Linksverschiebung nach der Ausbildung eines großen Komplexes, der durch eine Quervernetzung entsteht. Die leichte Linksverschiebung des IgE-Peaks nach Komplexierung mit IPSE ist jedoch zu gering, um mit einer Quervernetzung von IgE kompatibel zu sein. Außerdem gab es ebenfalls hier, wie schon bei IgG beschrieben, keine Ausbildung von sichtbaren Präzipitaten, wie sie mit Protein L und IgG zu sehen waren (s. 5.3.3.1; s. auch als Beispiel Abbildung 5.1). 85
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Aus dem Forschungszentrum Borstel L
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Zusammenfassung Zusammenfassung Die
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Einleitung 1 Einleitung Der Begriff
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Einleitung differenzieren zu antik
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Einleitung Abbildung 1.1: Schematis
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Einleitung 1.4 Humane basophile Gra
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Einleitung Es sind zwei Verlaufsfor
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