Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Diskussion
5.3.1 Sandwich-Blot-Versuche zur Untersuchung der Stöchiometrie – Binden
zwei Moleküle IPSE an ein Immunglobulin-Molekül?
Nachdem Sandwich-Blot-Versuche gezeigt haben, dass ein IPSE-Molekül weder zwei
komplette Immunglobulin-Moleküle (Schramm, unveröffentlicht) noch zwei Fab-Fragmente
binden kann (s. 5.2), sollte mit diesem Verfahren nun der umgekehrte Fall, die Bindung von
zwei Molekülen IPSE an ein IgG-Molekül, untersucht werden. Wie bereits erwähnt (s. 1.8),
ließen frühere Biacore-Ergebnisse vermuten, dass ein IgG zwei IPSE in Form einer positivkooperativen
Bindung bindet (Blindow, 2004).
Für die Untersuchung wurde rekombinantes E. coli- oder HEK-IPSE auf eine
Nitrozellulosemembran gedottet und in einem ersten Inkubationsschritt mit IgG inkubiert. Der
zweite Inkubationsschritt erfolgte dann mit biotinyliertem rekombinanten IPSE. Für die
Negativkontrolle wurde im ersten Inkubationsschritt lediglich Puffer eingesetzt. Leider zeigte
sich bei den Dots ohne IgG (Negativkontrolle) eine ähnliche Signalstärke wie bei den Dots
mit IgG, das heißt IPSE zeigte eine so starke Bindung an sich selbst, dass diese vom
eigentlichen Bindungssignal nicht unterschieden werden konnte. Dies galt für beide
rekombinante IPSE-Präparationen (E. coli- und HEK-IPSE). Ob diese Eigenbindung ein
Artefakt der rekombinanten Herstellung ist oder ob natürliches IPSE ein ähnliches Verhalten
zeigt, ist bislang nicht bekannt, da natürliches IPSE in den benötigten Mengen leider nicht zur
Verfügung steht.
5.3.2 Untersuchung der Stöchiometrie sowie Komplexbildung von IPSE und
IgG mittels chemischer Quervernetzung
Nachdem der Sandwich-Blot zu keiner Klärung geführt hatte, sollte die Bindung von IgG und
E. coli-IPSE in Lösung durchgeführt werden und die Stöchiometrie nach anschließender
Fixierung der Komplexe durch chemische Quervernetzung ermittelt werden. Mit dieser
Methode werden funktionelle Gruppen von Aminosäuren entweder intramolekular innerhalb
eines Proteins oder intermolekular zwischen interagierenden Proteinen mittels chemischer
Reagenzien kovalent miteinander verknüpft (Schulz und Sinz, 2004; Hermanson, 1996;
Wong, 1991). Um E. coli-IPSE und IgG chemisch kovalent zu vernetzen, wurde in dieser
Arbeit EDC und Sulfo-NHS eingesetzt und nach der Methode von Schulz et al. (2004)
vorgegangen (s. 3.8). Hierbei wurde die Bindung von IgG / E. coli-IPSE im 1:1-, 1:2- und
1:3-Verhältnis untersucht. Die kovalente Verknüpfung verhindert, dass Komplexe z.B. durch
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