Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Diskussion
5.2 E. coli-IPSE ist nicht in der Lage zwei Moleküle IgG-Fab im
Sandwich-Blot zu binden
Frühere Sandwich-Blot-Versuche zur Untersuchung der Quervernetzung von
Immunglobulinen durch IPSE konnten keine Quervernetzung nachweisen (Schramm,
unveröffentlicht). Hierfür wurde unmarkiertes IgE auf eine Nitrozellulosemembran gedottet
und im ersten Schritt mit IPSE und anschließend mit biotinyliertem IgE inkubiert. Dabei war
eine Bindung des biotinylierten IgE an IPSE nicht nachweisbar. Nachdem mit diesem
Versuch gezeigt wurde, dass IPSE nicht in der Lage ist das IgE-Gesamtmolekül
querzuvernetzen, wurde dieser Versuch mit IgG-Fab-Fragmenten anstelle kompletten IgE‘s
wiederholt.
Die direkte Bindung von E. coli-IPSE an das immobilisierte IgG-Fab konnte hier wieder
bestätigt werden, aber eine weitere Bindung von biotinyliertem IgG-Fab an das gebundene E.
coli-IPSE fand nicht statt. Mit den Positivkontrollen (anti- onnte
dagegen deutlich eine Quervernetzung dargestellt werden. Somit zeigt auch dieser Versuch,
dass IPSE ein anderes Bindungsverhalten besitzt als ein konventionelles B Zellsuperantigen
und auch Immunglobulin-Fragmente nicht quervernetzen kann.
5.3 Bestimmung der Bindungsstöchiometrie von IPSE und Immunglobulin
Falls IPSE Immunglobuline quervernetzt, sollte ein Molekül IPSE zwei oder mehrere
Moleküle Immunglobulin binden (Immunglobulin / IPSE = 2:1). Erfolgt die Interaktion ohne
Quervernetzung, sollte dagegen jedes Immunglobulin-Molekül ein oder mehrere IPSE-
Moleküle binden (Immunglobulin / IPSE = 1:1, 1:2, 1:4,…).
In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass verschiedene Methoden zu unterschiedlichen
Ergebnissen hinsichtlich der Bindungsstöchiometrie führen können, wie das Beispiel von
Chapman et al. (1999) zeigt. Stöchiometriebestimmungen der Bindung des Fc-Rezeptor von
HSV-1 (gE-gI Heterodimers) an IgG mittels Größenausschlusschromatographie zeigten eine
1:1-Stöchiometrie, obwohl der Rezeptor zwei potentielle Bindungsstellen für IgG besitzt.
Spätere weitere Untersuchungen in der analytischen Ultrazentrifugation (Sprague et al., 2004)
ergaben dagegen eine 2:1-Stöchiometrie, mit der Bindung von zwei gE-gI-Heterodimeren an
ein IgG-Fc, wie auch für IPSE anhand früherer Biacore-Daten (Blindow, 2004; s. auch 1.8)
vermutet. Dieses Beispiel zeigt, dass eine exakte Bestimmung der Stöchiometrie schwierig ist
und durch mehrere Experimente bestätigt werden sollte.
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