Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

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Ergebnisse In beiden Gelen ist kein Unterschied in der IgG-Bindung zu erkennen. Das Effluent und die erste Waschfraktion (W1) zeigen deutlich eine stark angefärbte IgG-Bande bei ca 150 kDa, während die Eluatfraktionen nur wenig IgG aufweisen. Die Banden sind wesentlich schwächer als im Effluent und auch im Vergleich zu den Banden von HEK-IPSE (hier bei ca. 45 kDa), was mit dem IgG zusammen von der Säule eluiert wurde. Bild C zeigt den Kontrollversuch mit IgG, ohne das HEK-IPSE vorher an die Matrix gebunden wurde. In den Eluatfraktionen ist eindeutig kein IgG nachweisbar. Somit ist die sichtbare Bindung in den Eluatfraktionen mit HEK-IPSE keine unspezifische Bindung an die Ni-NTA-Agarose, sondern eine Bindung an das HEK-IPSE direkt. Es ist bekannt, dass die IL-4-Freisetzung aus den Basophilen durch IPSE IgE-abhängig ist (Haisch et al., 2001; Schramm et al., 2003). Zusätzlich konnten frühere Dot-Blotting- Versuche (Blindow 2004) als auch die Ergebnisse der Größenausschlusschromatographie zeigen, dass IPSE an IgE mit höherer Affinität bindet als an IgG. Die oben abgebildeten Ergebnisse (s. Abbildung 4.15) zeigen, dass nur sehr wenig IgG an das HEK-IPSE bindet. Aus diesem Grund wurde hier auch die Bindungseigenschaft von IgE an HEK-IPSE im 1:1- Verhältnis im Vergleich zu IgG mittels IMAC untersucht. Abbildung 4.16 zeigt die Silbergele aus beiden Versuchen. Bild A zeigt die Bindung von IgE an HEK-IPSE und Bild B die Bindung von IgG an HEK-IPSE. Es ist deutlich in Bild A zu erkennen das hier ebenfalls viel IgE im Effluent und in der ersten Waschfraktion (W) enthalten ist. Es ist jeweils eine sehr dicke Bande, die bei ca. 180 kDa liegen sollte, zu erkennen. Nur wenig IgE ist dagegen in den Eluatfraktionen enthalten. D. h. es bindet ebenfalls nur wenig IgE an HEK-IPSE. Ein Vergleich zeigt, dass die IgE-Banden gegenüber den IgG-Banden in den Eluatfraktionen stärker hervortreten. Vergleicht man aber auch die Bandenstärke von HEK-IPSE in beiden Gelen, scheinen die Banden von HEK-IPSE in Bild A ebenfalls stärker angefärbt zu sein. Somit liegt diese stärkere Bandenfärbung vermutlich an der Silberfärbung selbst. 70
Ergebnisse A) B) Abbildung 4.16: Untersuchung der Bindung von IgE / IgG an HEK-IPSE (1:1) mittels IMAC (SDS-PAGE, Silberfärbung). HEK-IPSE wurde an Ni-NTA-Agarose gebunden und IgE oder IgG jeweils in äquimolarem Verhältnis zum immobilisierten HEK-IPSE zugegeben Das Gemisch wurde in eine Säule gegeben und gewaschen. Die anschließende Elution erfolgte mit 250 mM Imidazol. A) HEK-IPSE / IgE im 1:1-Verhältnis. B) HEK-IPSE / IgG im 1:1-Verhältnis. HM: High Marker; W: Waschfraktionen; E: Eluatfraktionen. Wie oben erwähnt, besitzt HEK-IPSE einen C-terminalen His-Tag. Um auszuschließen, dass die schwache Bindung von IgG an HEK-IPSE nach dessen Bindung an Ni-NTA-Agarose auf einer sterischen Behinderung beruht, wurde der Versuch mit E.coli-IPSE, das an Stelle des C- terminalen einen N-terminalen His-Tag besitzt und somit vermutlich in einer anderen Orientierung an die Ni-NTA-Agarose bindet, wiederholt. Hierbei wurden IgG und E.coli- IPSE im Verhältnis 1:1 untersucht (s. Abbildung 4.17). 71
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Aus dem Forschungszentrum Borstel L
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Zusammenfassung Zusammenfassung Die
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Einleitung 1 Einleitung Der Begriff
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Einleitung differenzieren zu antik
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