Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Ergebnisse
4.6 Bindungsuntersuchung zwischen Immunglobulin und IPSE mittels
Affinitätschromatographie
Da die Ergebnisse der Größenausschlusschromatographie auf eine schwache Affinität
zwischen IPSE und Immunglobulin hinwiesen, sollte die Bindung zwischen IPSE und
Immunglobuline mit Hilfe von affinitätschromatographischen Methoden weiter untersucht
werden. Es wurde auch hier wieder hauptsächlich mit IgG gearbeitet.
4.6.1 Untersuchung der Bindung von IgG an HEK-IPSE mittels einer HEK-
IPSE Säule
Hierfür wurde HEK-IPSE kovalent an eine NHS-aktivierte Sepharose-Säule gekoppelt und
IgG im gleichen Verhältnis aufgetragen. Das gebundene IgG wurde anschließend mit
niedrigem pH-Wert von der Säule eluiert (s. 3.9.2.1).
Abbildung 4.14 zeigt das Proteinprofil des nichtgebundenen (Effluent; Bild A) und des
eluierten IgG (Bild B). Die Höhe der beiden Kurven zeigt deutlich, dass sehr wenig IgG an
HEK-IPSE gebundenen hat. Die Kurve des nichtgebundenen IgG liegt bei ca. 3000 mAUs,
was auf viel IgG im Durchlauf schließen lässt, während die Kurve des eluierten IgG knapp
über 120 mAUs liegt und somit wenig IgG enthält. Auch die Bestimmung der Konzentration
des nicht gebundenen IgGs zeigte einen Wert von 5,27 mg/ml (zusammen aus zwei
Fraktionen (A3; A4) à 500 µl) und liegt dabei nur knapp unter der insgesamt eingesetzten
Menge von 6 mg IgG. Abbildung 4.14 C zeigt die Untersuchungen der Fraktionen beider
Kurven in einem silbergefärbten SDS-Gel. Wie schon aus der Kurve des Durchlaufes
vermutet (Bild A), ist sehr viel IgG im Durchlauf enthalten. Die im Effluent enthaltene IgG-
Konzentration ist sehr hoch, erkennbar an der hohen Bandenintensität (bei den
niedermolekularen Banden handelt es sich vermutlich um IgG-Bruchstücke). In den
Eluatfraktionen ist wesentlich weniger IgG enthalten, was die deutlich schwächeren IgG-
Banden im Gel zeigen.
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