Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

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Ergebnisse A) B) C) D) Abbildung 4.7: Untersuchung der Komplexbildung von IgG und HEK-IPSE (1:1) in Lösung mittels Superdex 200. IgG und HEK-IPSE wurden in Lösung 1:1 miteinander vermischt und nachträglich über eine Superdex 200-Säule aufgetrennt. A) Markerlauf . B) Proteinprofil von IgG (blaue Kurve) und HEK-IPSE (grüne Kurve), einzeln aufgetrennt. C) Proteinprofil von IgG (blau) und HEK-IPSE (grün) im Vergleich zu dem Proteinprofil von dem IgG / HEK-IPSE 1:1-Gemisch (rote Kurve). D) Silbergefärbtes SDS-Gel zur Untersuchung der einzelnen Fraktionen von dem Proteinprofil des IgG / HEK-IPSE 1:1-Gemisches. B3 – C2: Fraktionen. 56
Ergebnisse In der Untersuchung der einzelnen Fraktionen in der SDS-PAGE mit nachträglicher Silberfärbung (Bild D) zeigte sich, wie schon nach dem Ergebnis des Säulenlaufes vermutet, das kein HEK-IPSE zusammen mit IgG in den Fraktionen B2 – B11 enthalten ist. Es sind nur die Banden von IgG im oberen Bereich des Trenngeles sichtbar. In den Fraktionen B12 – C2 sind die Banden des glykosylierten HEK-IPSE, das hier ungebunden vorliegt, in ihren unterschiedlichen Größen aufgetrennt zu sehen. Ganz schwach zeigen sich hier auch Banden von IgG. Dies ist vermutlich durch Interaktionen mit der Matrix der Säule zu erklären, wobei wenig IgG erst später, zusammen mit HEK-IPSE, von der Säule gespült wird. Es deutet nicht auf eine Bindung von IgG und HEK-IPSE hin, da die sonst entstandenen größeren Komplexe als erstes von der Säule hätten kommen müssen (s. 3.9). Da bekannt ist, dass das B-Zell-Superantigen Protein L mit hoher Affinität an alle humanen Immunglobulinklassen bindet und dieses Molekül auch erfolgreich in Gelpräzipiationsversuchen in der Arbeit von Silke Blindow (2004) und Maren Wodrich (2006) als Positivkontrollen mit IgG eingesetzt wurde, wurde hier zusätzlich die Bindung von Protein L und IgG in Lösung als Kontrollversuch untersucht, um mögliche Bildungen von großen Komplexen vergleichen zu können. Protein L besitzt eine ähnliche molekulare Größe (38,5 kDa) wie HEK-IPSE (34 – 39 kDa). IgG und Protein L wurden in einem 1:1-Verhältnis miteinander vermischt und 30 min inkubiert. Während der Inkubation traten nach kurzer Zeit Präzipitate von großen Komplexen auf, die vor dem Auftragen der Säule abzentrifugiert wurden. Solche Präzipitate waren mit IgG und HEK-IPSE nicht sichtbar. In Abbildung 4.8 B) sind die Proteinprofile von IgG (blaue Kurve) und Protein L (braune Kurve) getrennt nebeneinander aufgezeichnet und zusätzlich das Proteinprofil von der Auftrennung des Gemisches (rote Kurve). Im Gegensatz zu IgG und HEK-IPSE ist eine Bindung von IgG und Protein L erkennbar. Der IgG-Peak ist kleiner geworden, von ca. 140 mAUs auf ca. 70 mAUs, und ein Anstieg der Peaks im Bereich der aggregierten IgG-Moleküle (Fraktionen B2 – B8) ist zu sehen. Die Bildung von größeren Komplexen ist hier nicht sichtbar, da diese vorher präzipitierten und abzentrifugiert wurden. Das Silbergel zur Untersuchung der Fraktionen von der Auftrennung des IgG / Protein L-Gemisches (Bild B) zeigt Banden von Protein L zusammen mit Banden von IgG in den Fraktionen B2 – B10, was eine Bindung beider Moleküle bestätigt. 57
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Aus dem Forschungszentrum Borstel L
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