Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Ergebnisse
auffällig, das sich die Bandenform von HEK-IPSE nach Zugabe der chemischen Reagenzien
verändert hat. Statt vier einzelne Banden, zeigt sich nun eher eine stark verschmierte Bande.
4.5 Untersuchung der Komplexbildung von Immunglobulin (IgG, IgE)
und HEK-IPSE in Lösung mittels Größenausschlusschromatographie
Wie schon vorher erwähnt konnte bisher eine Quervernetzung von Immunglobulin und IPSE
nicht nachgewiesen werden. Mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie sollte die
mögliche Bildung von großen Komplexen zwischen IgG oder IgE und HEK-IPSE in Lösung
untersucht werden. Hierfür wurden die Immunglobuline mit HEK-IPSE in einem bestimmten
Verhältnis miteinander in Lösung vermischt und nachträglich über eine Tricorn-Säule
(Superdex 200) gegeben. Es wurde in diesem Versuch nur HEK-IPSE verwendet, da E. coli-
IPSE an der Matrix der Superdex-Säulen (Superdex 200 und 75) unspezifisch bindet.
4.5.1 Untersuchung der Komplexbildung von IgG und HEK-IPSE in Lösung
mittels Superdex 200 10/300 GL
IgG und HEK-IPSE wurde in einem 1:1-Verhältnis miteinander vermischt und das Gemisch
für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das Gemisch über die
Superdex 200 10/300 GL aufgetrennt (s. 3.9.1.1). Abbildung 4.7 B zeigt die Proteinprofile
beider Moleküle aus separaten Läufen nebeneinander aufgetragen. IgG, welches mit ca. 150
kDa das größere Molekül ist, läuft schneller durch die Säule (blaue Kurve). Neben dem IgG-
Hauptpeak (ca. Fraktionen B7 – B11) sind davor noch zwei kleine Peaks in Fraktion A15, B1
und B4, B5 zu erkennen, was auf aggregierte IgG-Komplexe hindeutet. Das kleinere HEK-
IPSE mit 34 – 39 kDa läuft langsamer durch die Säule (grüne Kurve). Bild C in Abbildung
4.7 zeigt die Auftrennung der Einzelmoleküle (blaue und grüne Kurve) zusammen mit der
Auftrennung des IgG / HEK-IPSE-Gemisches im 1:1-Verhältnis (rote Kurve). Es ist zu
erkennen, dass HEK-IPSE und IgG aus dem Gemisch an derselben Position wieder von der
Säule kommen, wie die vorher einzeln aufgetrennten Moleküle. Es haben sich somit keine
stabilen Komplexe von IgG und HEK-IPSE gebildet.
55