Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Ergebnisse
4.4.2 Chemische Quervernetzung von HEK-IPSE
Nachdem E. coli-IPSE ohne IgG nach Zusatz von EDC und Sulfo-NHS zusätzliche Banden
im höheren Molekularbereich zeigte, die auf aggregiertes E. coli-IPSE hinweisen (s.
Abbildung 4.5 A), stellte sich die Frage, ob der gleiche Effekt auch bei HEK-IPSE zu
beobachten ist. Hierfür wurde HEK-IPSE in Aktivierungspuffer auf eine Konzentration von 6
µM verdünnt und mit den chemischen Reagenzien versetzt (s. 3.8).
Abbildung 4.6: Silbergefärbtes SDS-Gel zur Untersuchung der chemischen Quervernetzung von HEK-
IPSE. HEK-IPSE wurde mit EDC und Sulfo-NHS versetzt und für 5 min, 15 min, 30 min, 60 min und 120 min
inkubiert. Ø: ohne Zusatz der Reagenzien (Kontrolle); +: mit Zusatz der Reagenzien; HM: High Marker
Nach 5 min, 15 min, 30 min, 60 min und 120 min wurde die Reaktion gestoppt und die
Proben in einem SDS-Gel mit anschließender Silberfärbung untersucht (s. Abbildung 4.6).
Die Kontrollen mit PBS-Puffer und Aktivierungspuffer zeigen die Banden des glykosylierten
HEK-IPSE im Bereich von 45 kDa. Es macht keinen Unterschied, ob HEK-IPSE in PBS-
Puffer oder in dem Aktivierungspuffer verdünnt wird. Nach der Inkubation mit EDC und
Sulfo-NHS zeigt sich deutlich eine zusätzliche Bande knapp über 66 kDa, die mit hoher
Wahrscheinlichkeit von komplexiertem HEK-IPSE stammt. Die Inkubationszeit ist hier nicht
von Bedeutung. Es gibt keinen Unterschied in der Bandenbildung. Es ist weiterhin noch
54