Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

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Ergebnisse anschließender Analyse in einem Tris-Acetat-Gel untersucht werden. Mit dieser Methode ist es gleichzeitig möglich größere Komplexe von IgG und IPSE sichtbar zu machen, um damit auf die Fragestellung hinsichtlich der .Quervernetzung von IPSE und Immunglobulin weitere Aussagen treffen zu können. Als chemische Reagenzien wurden EDC und Sulfo-NHS eingesetzt (s. 3.8). IgG und E. coli- IPSE wurden in einem 1:1, 1:2 und 1:3-Verhältnis in dem Aktivierungspuffer miteinander vermischt und inkubiert (25 min). Danach wurden EDC und Sulfo-NHS zugegeben und nach 2 min und 15 min Aliquots abgenommen und die Reaktion abgestoppt. IgG und E. coli-IPSE wurden zusätzlich jeweils alleine mit den Reagenzien versetzt, um mögliche Eigenbindungen auszuschließen. Die Proben wurden zur Untersuchung auf ein Tris-Acetat-Gel aufgetragen mit anschließender Silberfärbung (s. 3.8). Abbildung 4.5 A zeigt IgG und E. coli-IPSE getrennt nebeneinander aufgetragen. A) B) Abbildung 4.5: Silbergefärbte Tris-Acetat Gele zur Untersuchung der chemischen Quervernetzung von IgG und E. coli-IPSE. A) IgG und E. coli-IPSE mit und ohne Zusatz von EDC und Sulfo-NHS. B) IgG und E. coli-IPSE wurden zusammen gemischt (1:1; 1:2; 1:3), mit und ohne Zusatz von EDC und Sulfo-NHS. Ø: ohne Zusatz (Kontrolle); +: mit Zusatz; HM: High Marker Beide Moleküle wurden entweder mit EDC und Sulfo-NHS versetzt (15 min) oder im natürlichen Zustand beibehalten. Die eingesetzte IgG-Präparation bandet über einen relativ 52
Ergebnisse weiten Bereich. Es ist kein großer Unterschied zwischen IgG ohne und mit Zusatz zu erkennen. Am Boden der Auftragstasche von IgG, das mit den Reagenzien versetzt wurde, findet sich vermutlich als Ausdruck von IgG-Komplexen eine zusätzliche Bande. Die Banden des E. coli-IPSE-Dimers (32 kDa) (ohne Zusatz) sind gut zu erkennen. Zusätzlich zeigt sich auch eine Bande im niedrigeren Molekularbereich, was höchstwahrscheinlich monomeres E. coli-IPSE (16 kDa) darstellt. Daneben ist aber bei 20µM und 30 µM (E. coli-IPSE ohne Zusatz) deutlich eine Bande bei ungefähr 97 kDa zu erkennen. Diese entstand vermutlich durch Verunreinigungen der Probe. Wird E. coli-IPSE mit den Reagenzien versetzt, zeigt sich eine Abschwächung der Anfärbung der E. coli-IPSE-Banden, besonders deutlich bei 10 µM E. coli-IPSE zu erkennen. Zusätzlich treten weitere Banden im Bereich von ca. 60 kDa und 70 kDa bei der eingesetzten Menge von 20 µM und 30 µM auf, und noch eine weitere Bande verschwommen in der Höhe von IgG (also ca. 150 kDa) ebenfalls bei 30 µM. Diese Banden lassen auf Aggregationen von E. coli-IPSE-Molekülen schließen, die auf Grund der chemischen Quervernetzung nicht wieder durch SDS gelöst wurden. In Abbildung 4.5 B sind die IgG / E. coli-IPSE-Gemische (1:1; 1:2; 1:3) mit und ohne Zusatz von EDC und Sulfo- NHS aufgetragen. Trotz Zusatz der Reagenzien sind IgG und E. coli-IPSE noch deutlich getrennt von einander zu sehen. Es ist auch kein Unterschied zwischen der Inkubation von 2 min und 15 min zu erkennen. Die Banden von E. coli-IPSE scheinen aber schwächer zu sein im Vergleich zu der Bandenstärke ohne Zusatz der Reagenzien. Es könnte auf eine Bindung an IgG hindeuten. Aber es treten keine weiteren Banden auf, die auf Komplexe zwischen den beiden Molekülen schließen lassen. Wie bereits bei IgG mit Zusatz der quervernetzenden Agenzien, zeigt sich auch hier wieder eine Proteinanfärbung in den Auftragstaschen des Gels bei allen IgG / E. coli-IPSE-Verhältnissen. Diese könnten somit von IgG-Komplexen oder von IgG / E. coli-IPSE-Komplexen stammen. Die zusätzlichen Banden, die bei E. coli-IPSE alleine ohne IgG auftraten (im Bild A), sind unter diesen Umständen nicht zu erkennen. Die schwächere Anfärbung der Banden könnte auch durch eine schlechtere Anfärbbarkeit der Proteine, durch Zusatz der chemischen Reagenzien, herrühren. Es ist aber auffällig, dass nur die Banden von E. coli-IPSE eine schwächere Färbung zeigen. Zusammenfassend ist nach Zusatz der chemischen Crosslinker zwar eine mäßige Aggregation von E. coli-IPSE alleine bzw. IgG alleine zu beobachten, nicht jedoch eine eindeutige Komplexbildung zwischen beiden Molekülen. 53
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