Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Ergebnisse
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die rekombinanten IPSE-Moleküle die
Eigenschaft im Sandwich-Blot besitzen an sich selber zu binden. Eine Quervernetzung von
IgG durch IPSE konnte mit diesem Verfahren nicht gezeigt werden.
4.3 Quervernetzung von IgG-Fab durch E. coli-IPSE im Sandwich-Blot
Wie bereits gezeigt, bindet E. coli-IPSE an IgG und dessen Fragmente IgG-Fab und IgG-Fc
(s. 4.1 und Blindow, 2004). Frühere Versuche (Blindow, 2004; Schramm, unveröffenlicht)
zeigen, dass IPSE offenbar nicht in der Lage ist, komplette Moleküle von IgE bzw. IgG
querzuvernetzen. In diesem Versuch sollte untersucht werden, ob ein Molekül IPSE an zwei
Moleküle IgG-Fab binden kann. Dafür wurde wieder das Verfahren des Sandwich-Blots
angewendet. Hierfür wurde IgG-Fab in einer Konzentrationsreihe (33 – 0,1 pmol/Dot) auf
eine Nitrozellulosemembran gedottet. Die Membranstreifen mit dem darauf enthaltenen IgG-
Fab wurden im ersten Schritt entweder mit E. coli-IPSE (50 pmol/ml; 500 pmol/ml) inkubiert
oder mit anti-B-Zellsuperantigen, als
Positivkontrollen und TBST als Negativkontrolle. Im zweiten Schritt wurde dann mit
biotinyliertem IgG-Fab (50 pmol/ml) inkubiert und die Bindung über SAVAP (1:15000)
nachgewiesen. Ein zusätzlicher Streifen, der im ersten Schritt mit E. coli-IPSE (50 pmol/ml)
inkubiert wurde, wurde im zweiten Schritt mit anti-IPSE-Antiserum (942Y) inkubiert und die
Bindung über AP-anti-Kaninchen IgG (1:10000) nachgewiesen. In Abbildung 4.4 ist deutlich
die Bindung von E. coli-IPSE an IgG-Fab zusehen (1. Streifen), wenn IgG-Fab vorher auf die
Membran gedottet wurde. Ebenso kann eine Quervernetzung von IgG-Fab durch seinen
Antikörper und Protein L gezeigt werden, die Dots sind sichtbar angefärbt, wenn auch
schwächer mit Protein L. Eine Quervernetzung durch E. coli-IPSE ist dagegen nicht sichtbar.
Hier ist nur eine sehr schwache Anfärbung zu erkennen, die nicht über den Hintergrund
(Negativkontrolle mit TBST-Puffer in der Mitte) hinausgeht. Der letzte Streifen mit 500 pmol
E.coli-IPSE zeigt zudem eine hohe Hintergrundfärbung auf der Membran zwischen den Dots,
was durch die hohe Konzentration des eingesetzten E.coli-IPSE zu erklären ist. Die
Negativkontrolle zeigt deutlich ein negatives Signal (keine Anfärbung der Dots).
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