Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Inhaltsverzeichnis
4.5 Untersuchung der Komplexbildung von Immunglobulin (IgG, IgE) und HEK-IPSE
in Lösung mittels Größenausschlusschromatographie......................................................... 55
4.5.1 Untersuchung der Komplexbildung von IgG und HEK-IPSE in Lösung mittels
Superdex 200 10/300 GL................................................................................................. 55
4.5.2 Untersuchung der Komplexbildung von IgE und HEK-IPSE in Lösung mittels
Superdex 200 10/300 GL................................................................................................. 59
4.5.3 Untersuchung der Komplexbildung von monomerem IgE und HEK-IPSE in
Lösung mittels Superdex 200 PC 3.2/30 ......................................................................... 64
4.6 Bindungsuntersuchung zwischen Immunglobulin und IPSE mittels
Affinitätschromatographie ................................................................................................... 67
4.6.1 Untersuchung der Bindung von IgG an HEK-IPSE mittels einer HEK-IPSE Säule....... 67
4.6.2 Untersuchung der Bindung von IgG / IgE an IPSE mittels IMAC.................................. 68
4.6.3 Untersuchung der Bindung von HEK-IPSE an IgG mittels einer Protein G-Säule......... 72
4.7 Untersuchung der Eigenaggregation von HEK-IPSE mittels Dynamischer Lichtstreuung
(DLS) ................................................................................................................................... 76
4.7.1 Untersuchung der IL-4-Freisetzung aus humanen Basophilen durch zentrifugiertes
bzw. nicht-zentrifugiertes HEK-IPSE ............................................................................. 77
5 Diskussion ....................................................................................................................... 79
5.1 E. coli-IPSE bindet im Dot Blot mit unterschiedlicher Intensität an das IgG-Gesamtmolekül
und dessen Fab- und Fc-Fragmente ..................................................................................... 81
5.2 E. coli-IPSE ist nicht in der Lage zwei Moleküle IgG-Fab im Sandwich-Blot zu binden... 82
5.3 Bestimmung der Bindungsstöchiometrie von IPSE und Immunglobulin ............................ 82
5.3.1 Sandwich-Blot-Versuche zur Untersuchung der Stöchiometrie – Binden zwei
Moleküle IPSE an ein Immunglobulin-Molekül?............................................................ 83
5.3.2 Untersuchung der Stöchiometrie sowie Komplexbildung von IPSE und IgG
mittels chemischer Quervernetzung ................................................................................ 83
5.3.3 Untersuchung der Stöchiometrie sowie Komplexbildung von IPSE und IgG
bzw. IgE mittels der Größenausschlusschromatographie................................................ 84
5.3.3.1 Bindungsuntersuchung von IgG und HEK-IPSE im Verhältnis 1:1....................... 84
5.3.3.2 Bindungsuntersuchung von IgE und HEK-IPSE im 1:1-, 1:4- und 2:1-Verhältnis 85
5.4 Bindungsstudien von IPSE und Immunglobulin mit Hilfe affinitätschromatographischer
Methoden ............................................................................................................................. 87
5.4.1 Interaktion zwischen löslichem HEK-IPSE und immobilisiertem IgG ........................... 87
5.4.2 Interaktion zwischen löslichem IgG/IgE und immobilisiertem IPSE.............................. 88
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