Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
Medium zur Stimulation der Basophilen
Protectomed basal Iscoves Medium (IMDM 1x) versetzt mit
50 µg/ml Transferrin
5 µg/ml Insulin
100 U/ml Penicillin G
100 µg/ml Streptomycin-Sulfat
3.13 IL-4 ELISA
Die IL-4- Konzentration im Überstand der Basophilenansätze (s. 3.12) wurde mit Hilfe des
Sandwich-ELISAs IL-4 Elipair (Firma Diaclone) bestimmt. Leichte Abweichungen vom
Herstellerprotokoll wurden zur optimalen Ausnutzung des Kits etabliert. Zur Beschichtung
der 96-Loch Maxisorp-Platte (Firma Nunc) wurde der im Kit enthaltene anti-human IL-4-
Antikörper 1:1000 in PBS pH 7,4 verdünnt und die Platte über Nacht bei 8 °C in einer
feuchten Metallkammer inkubiert. Anschließend wurden verbleibende Bindungsstellen für 2 h
mit 5 % (w/v) BSA in PBS pH 7,4 blockiert und die Platte 24 h getrocknet. Die Platte wurde
dann mit den Proben aus der Basophilenstimulation bzw. mit dem in Medium verdünntem
Standard beschichtet und 90 min inkubiert. Anschließend wurde die Platte nacheinander mit
folgenden Reagenzien inkubiert: 60 min mit biotinyliertem Detektionsantikörper (1:100 in
PBS + 1 % (w/v) BSA verdünnt; 60µl/well), 60 min mit Streptavidin-HRP (1:1800 in PBS +
1 % (w/v) BSA verdünnt; 60 µl/well), 2 h TMB (Tetramethylbenzidin, gebrauchsfertig; 100
µl/well). Alle Inkubationen wurden auf einem Schüttler in einer feuchten Metallkammer
durchgeführt. Nach jeder Inkubation wurde die Platte mit PBS pH 7,4 + 0,05 % (v/v) Tween
gewaschen. Zum Abschluss wurde die Enzymreaktion mit 1 M H 2 SO 4 gestoppt und die
Absorption bei 450 nm im ELISA Reader gemessen.
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