Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
und T-Zellen) versetzt und für 10 min bei 8 °C inkubiert. Durch Inkubation mit einem
Zweitantikörper (15 min; 8 °C), der gegen das Hapten gerichtet ist und an den magnetische
Beads gekoppelt sind, wurden die Nicht-Basophilen markiert. Das Zellgemisch wurde über
eine Säule mit magnetisierter Matrix gegeben, die die markierten Zellen im Magnetfeld
festhält, während die unmarkierten Basophilen im Durchlauf zu finden sind. Der Durchlauf
wurde über Zentrifugation (10 min; 4 °C, 1800 rpm) eingeengt, in 500 µl kaltem HBSS-
Puffer aufgenommen und erneut die Zellzahl und Basophilenreinheit (s. 3.11.3) bestimmt. Die
Zellen wurden bis zur Stimulation auf Eis aufbewahrt.
3.12 Stimulation der Basophilen zur IL-4-Freisetzung
Für die Stimulation von Basophilen zur IL-4-Freisetzung wurden diese nach der Aufreinigung
in einer Endkonzentration von 50.000 Basophilen/ml in Medium mit HEK-IPSE versetzt in
einem Endvolumen von 100 µl. Von HEK-IPSE wurden 1:5 Verdünnungsreihen angefertigt,
wobei die Anfangskonzentration bei 2500 ng/ml lag. Die Verdünnungsreihen wurden in
Medium mit Zusatz von IL-3 angefertigt. Es ist bekannt, dass die Zugabe von IL-3, einem
Wachstums- und Differenzierungsfaktor von Basophilen, die IgE-vermittelte IL-4-Freisetzung
der Zellen zusätzlich stimuliert (Brunner et al. 1993), somit wurde zu allen
Stimulationsansätzen IL-3 in einer Konzentration von 2,5 ng/ml zugegeben. Von der
jeweiligen Verdünnung wurden dann 50 µl in eine sterile Rundbodenplatte (Firma Nunc)
gegeben und jeweils mit 2500 Basophilen in 50 µl Medium versetzt, so dass pro Well ein
Endvolumen von 100 µl vorhanden ist. Es wurden immer Doppelbestimmungen angefertigt.
Als Kontrollen wurden bei jedem Ansatz folgende Stimulantien mitgeführt:
Medium mit IL-3 (Negativkontrolle): 2,5 ng/ml
Ionomycin (IgE unabhängige Kontrolle): 2 µM
anti-IgE (Positvkontrolle):
50 ng/ml
Die Platten wurden nach Anfertigung der Stimulationsansätze bei 37 °C und 6 % CO 2 -Gehalt
in einem befeuchteten Brutschrank über Nacht inkubiert.
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