Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...
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Methoden<br />
stufenweise Erhöhung <strong>der</strong> Fließgeschwindigkeit können die Zellen nacheinan<strong>der</strong> eluiert<br />
werden.<br />
Die Anlage wurde zuerst mit aqua dest. und nachträglich mit eisgekühltem HBSS-Puffer<br />
gespült, und dann das aus <strong>der</strong> Dichtegradienten-Zentrifugation erhaltene Zellgemisch bei<br />
3500 U/min und 30 ml/min in das System eingespeist. Als Laufpuffer diente <strong>der</strong> HBSS-<br />
Puffer. 200 ml des Durchflusses wurde bei dieser Fließgeschwindigkeit verworfen und die<br />
Fließgeschwindigkeit auf 33 ml/min erhöht und weitere 300 ml verworfen. Frühere<br />
<strong>Untersuchung</strong>en haben ergeben, dass Basophile bei einer Fließgeschwindigkeit von 36 bis 45<br />
ml/min eluieren. Aus diesem Grund wurden 4 x 50 ml bei 42 ml/min gesammelt und über<br />
Zentrifugation (10 min; 4 °C; 1800 rpm) eingeengt. Die Zellpellets wurde in insgesamt 5 ml<br />
HBSS-Puffer aufgenommen und vereinigt und die Zellzahl und Basophilenreinheit bestimmt.<br />
3.11.3 Bestimmung <strong>der</strong> Zellzahl und Basophilenreinhheit<br />
Für die Bestimmung <strong>der</strong> Zellzahl wurden 10 µl Zellen mit 10 µl Trypanblau gemischt und die<br />
Zellen in <strong>der</strong> Neugebauer-Kammer gezählt. Die Zellzahl wurde mit folgen<strong>der</strong> Formel<br />
ermittelt:<br />
Formel:<br />
(ausgezählte Zellen x Verdünnung / mm 2 <strong>der</strong> ausgezählten Quadrate x Kammertife) x 10 3 = Zellen/ml<br />
Quadratgröße: 0,25 mm<br />
Kammertiefe: 0,1 mm<br />
Für die Bestimmung <strong>der</strong> Reinheit wurden Zytospin-Präparate mit 150.000 Zellen/Objekträger<br />
angefertigt (500 U/min; 1 min) und 3 min mit May-Grünwald-Lösung gefärbt. Unter dem<br />
Lichtmikroskop konnte dann die Reinheit bestimmt werden, wobei 100 Zellen ausgezählt<br />
wurden.<br />
3.11.4 Negative Selektion mit immunomagnetischen Beads<br />
Für die weitere Aufreinigung <strong>der</strong> Fraktion aus <strong>der</strong> Gegenstrom-Elutriation wurde das MACS<br />
Basophil Isolationskit (Firma Miltenyi) nach Angaben des Herstellers eingesetzt. Die vorher<br />
abzentrifugierten Zellen (10 min; 4 °C; 1800 rpm) wurden dafür mit einem Gemisch aus<br />
monoklonalen Hapten-gekoppelten Antikörpern gegen Epitope von verunreinigenden Zellen<br />
(B-Zellen, Monozyten, dendritische Zellen, NK-Zellen, Plättchen, Neutrophile, Eosinophile<br />
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