Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...

Methoden
3.11 Aufreinigung humaner basophiler Granulozyten
Die Aufreinigung der humanen basophilen Granulozyten (Basophile) erfolgte nach der
Methode von Haisch et al. (1999). Das Verfahren besteht aus einer Dichtegradienten-
Zentrifugation mit Ficoll / Percoll, einer Gegenstrom-Elutriation und einer negativen
Selektion mit immunomagnetischen Beads. Die Basophilen wurden aus Frischblut von
freiwilligen, gesunden Spendern gewonnen. Eine Zustimmung der Ethikkommision der
Medizinischen Fakultät der Universität zu Lübeck lag vor (Aktenzeichen 03-003). Das Blut
wurde direkt bei der Abnahme mit 10 % (v/v) einer 100 mM EDTA-Lösung (pH 7,4) als
Antikoagulanz vermischt.
3.11.1 Ficoll / Percoll Dichtegradienten-Zentrifugation
Eine 100:6 Ficoll / Percoll-Mischung (Dichte = 1080 g/l) wurde langsam mit dem frischen
Blut-EDTA-Gemisch überschichtet (30 ml Blut auf 15 ml Ficoll / Percoll) und 25 min bei 4
°C und 1800 rpm zentrifugiert. Der Rotor wurde nach Beendigung der Zentrifugation nicht
gebremst sondern langsam auslaufen gelassen, um eine Vermischung der Phasen zu
vermeiden. Die leukozytenreiche Interphase wurde abgenommen und in einem 50 ml
Reaktionsgefäß gesammelt (2 Interphasen / Reaktionsgefäß). Diese wurden dann mit kalter,
physiologischer Kochsalzlösung gewaschen (10 min Zentrifugation bei 4 °C; 1800 rpm) und
die Zellpellets zusammen in 50 ml kaltem HBSS-Puffer aufgenommen.
HBSS-Puffer (pH 7,4)
10x HBSS-Lösung (Firma PAA) 1:10 mit aqua dest (Firma Braun) verdünnt
4,2 mM NaHCO 3
0,25 % (w/v) BSA
3.11.2 Gegenstrom-Elutriation
Bei der Gegenstrom-Elutriation ist eine Zentrifuge an eine Peristaltikpumpe angeschlossen,
und ein Zellgemisch wird bei konstanter niedriger Fließgeschwindigkeit in die Zentrifuge
eingespeist. Die Fließrichtung der Zellen und die Zentrifugalkraft sind einander
entgegengesetzt, so dass die Zellen entsprechend ihrer Größe sortiert werden. Durch
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