Untersuchung eines neuartigen Mechanismus der Aktivierung ...
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Methoden<br />
3.11 Aufreinigung humaner basophiler Granulozyten<br />
Die Aufreinigung <strong>der</strong> humanen basophilen Granulozyten (Basophile) erfolgte nach <strong>der</strong><br />
Methode von Haisch et al. (1999). Das Verfahren besteht aus einer Dichtegradienten-<br />
Zentrifugation mit Ficoll / Percoll, einer Gegenstrom-Elutriation und einer negativen<br />
Selektion mit immunomagnetischen Beads. Die Basophilen wurden aus Frischblut von<br />
freiwilligen, gesunden Spen<strong>der</strong>n gewonnen. Eine Zustimmung <strong>der</strong> Ethikkommision <strong>der</strong><br />
Medizinischen Fakultät <strong>der</strong> Universität zu Lübeck lag vor (Aktenzeichen 03-003). Das Blut<br />
wurde direkt bei <strong>der</strong> Abnahme mit 10 % (v/v) einer 100 mM EDTA-Lösung (pH 7,4) als<br />
Antikoagulanz vermischt.<br />
3.11.1 Ficoll / Percoll Dichtegradienten-Zentrifugation<br />
Eine 100:6 Ficoll / Percoll-Mischung (Dichte = 1080 g/l) wurde langsam mit dem frischen<br />
Blut-EDTA-Gemisch überschichtet (30 ml Blut auf 15 ml Ficoll / Percoll) und 25 min bei 4<br />
°C und 1800 rpm zentrifugiert. Der Rotor wurde nach Beendigung <strong>der</strong> Zentrifugation nicht<br />
gebremst son<strong>der</strong>n langsam auslaufen gelassen, um eine Vermischung <strong>der</strong> Phasen zu<br />
vermeiden. Die leukozytenreiche Interphase wurde abgenommen und in einem 50 ml<br />
Reaktionsgefäß gesammelt (2 Interphasen / Reaktionsgefäß). Diese wurden dann mit kalter,<br />
physiologischer Kochsalzlösung gewaschen (10 min Zentrifugation bei 4 °C; 1800 rpm) und<br />
die Zellpellets zusammen in 50 ml kaltem HBSS-Puffer aufgenommen.<br />
HBSS-Puffer (pH 7,4)<br />
10x HBSS-Lösung (Firma PAA) 1:10 mit aqua dest (Firma Braun) verdünnt<br />
4,2 mM NaHCO 3<br />
0,25 % (w/v) BSA<br />
3.11.2 Gegenstrom-Elutriation<br />
Bei <strong>der</strong> Gegenstrom-Elutriation ist eine Zentrifuge an eine Peristaltikpumpe angeschlossen,<br />
und ein Zellgemisch wird bei konstanter niedriger Fließgeschwindigkeit in die Zentrifuge<br />
eingespeist. Die Fließrichtung <strong>der</strong> Zellen und die Zentrifugalkraft sind einan<strong>der</strong><br />
entgegengesetzt, so dass die Zellen entsprechend ihrer Größe sortiert werden. Durch<br />
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